CN112684183B - 一种多抗原蛋白组合应用于肺结核的鉴别与诊断 - Google Patents

Abstract

本发明涉及5个抗原蛋白应用于活动性结核病的鉴别与诊断，并提供一种诊断试剂，本发明特别涉及一种新的结核病诊断方法，即采用5个抗原蛋白P22352，Q9P121，P15151，Q13291，Q8NDA2作为生物标志物，检测尿液中5个抗原蛋白的含量，并以特定的含量的量值作为诊断指标，在该正常值范围内则为阴性。任意3个或以上抗原蛋白的浓度超过或低于该正常值范围，判断为阳性结果。

Description

一种多抗原蛋白组合应用于肺结核的鉴别与诊断

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂，特别涉及一种多抗原蛋白应用于活动性结核病的鉴别与诊断。

背景技术

结核病是危害人类健康的主要传染病之一，是当今世界上成年人传染病中的主要杀手，已对国际公共卫生构成严峻挑战。我国是全球结核病高负担国家之一，结核病疫情呈“三高一低”，即患病率高、死亡率高、耐药率高、年递降率低，随着艾滋病合并感染、耐药结核以及流动人口增多等情况的出现，防控形势非常严峻。自结核分枝杆菌发现以来，由于菌体的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、胞内寄生等特点，结核病的早期和快速诊断一直以来灵敏度较低，没有突破性的进展。目前多种诊断手段的联合应用(痰涂片、痰培养和分子诊断技术)仅仅可以诊断出50％左右的结核病患者，仍然有近一半的临床病原学阴性或者痰菌阴性的结核病人无法得到科学、合理和快速的诊断，甚至贻误病情、导致耐药。因此，快速准确诊断出结核病人群，以便后续采取有效的治疗干预措施，降低感染者的发病风险，将是降低结核病发病率的最直接手段。

鉴于很多疾病都在尿液的化学代谢物中有所反映，在尿液中找出疾病的一种或多种特异性的生物标识物，将有助于研究人员利用少量尿液或甚至一滴尿液检测许多疾病。尿液具有收集简单、取材方便、来源丰富、非侵入性等特点，尿液蛋白的种类和数量的变化携带有许多疾病的发生、发展及预后的各种信息，因此在疾病的诊断、监测、预后等方面很有价值，有广阔的应用前景。传统的痰涂片检查虽然是诊断肺结核的金标准，简便易行，结果可信度也较高，但阳性率较低，临床上仅有约20-30％的肺结核患者痰涂片检测阳性。采用痰中分枝杆菌培养的方法，耗时较长，经常需要1-3周甚至4-6周，不能满足快速诊断的需要。目前采用的分子诊断技术，例如GeneXpert MTB/RIF方法，虽然灵敏度较高，常可以在较短时间内(约2小时)直接从病人新鲜痰液或冻存痰液中检测是否存在结核分枝杆菌及对利福平的耐药性，但整个过程需要在密闭环境中进行，需要专业的 GeneXpert检测仪器和标本收集盒，并且需要专业人员来操作，成本高昂，不利于大规模地推广。即便目前多种病原学诊断联合应用(痰涂片、痰培养和分子诊断技术)，也仅仅只能诊断出50％左右的结核病患者，仍然有近一半的临床病原学阴性或者痰菌阴性的结核病人无法得到科学、合理和快速的诊断。近年来以细胞免疫反应为基础的血液中γ干扰素释放试验，如T-SPOT和QuantiFERON-TB Gold检测获得了较快的发展被并广泛应用，但其诊断的敏感性也有待提高，经常会出现无法判定检测结果的情况，而且无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染，并且其成本较为高昂、具有侵入创伤性。因此，在目前的情况下，急需开发适合我国国情的具有自主知识产权、成本低廉、简便快捷的无创诊断产品。

本发明在现有技术的基础上，采用生物标志物方法，意外发现新的生物标志物，即5个抗原蛋白(P 22352,Q9P121,P15151,Q13291和Q8NDA2)，本发明发现通过检测这5个抗原蛋白中的任意3个或以上的组合的含量，可以诊断肺结核且能达到82.7％的诊断灵敏度，能很好地区分结核病人和潜伏感染人群。为此，本发明提供一种新的结核病诊断方法，即采用5个抗原蛋白及其组合作为生物标志物，检测尿液中5个抗原蛋白的含量，并以特定的含量的量值作为诊断指标， 5个蛋白中任意3个或以上抗原蛋白的浓度低于或超过该限度，判断为阳性结果。

发明内容

本发明的目的在于提供5个抗原组合在诊断结核病中的应用。本发明所述的抗原组合能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌潜伏感染的诊断标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。

本发明所述的五个抗原蛋白皆为人体尿液中的蛋白，分别名称为：P22352，Q9P121，P15151，Q13291，Q8NDA2。

本发明的目的在于提供上述5个抗原蛋白作为生物标志物在结核病诊断中的应用。本发明首次发现，5个抗原蛋白能够作为诊断活动性结核或潜伏结核感染的生物标志物，并且进一步发现其具有良好的敏感性和特异性。

本发明更加详细的技术方案描述如下：

本发明提供5个抗原蛋白在制备结核病诊断的试剂中的应用。

本发明进一步提供5个抗原蛋白在制备结核病诊断的医疗器械中的应用。

所述的诊断结核病以5个抗原蛋白作为诊断分子标记物。

本发明提供一种试剂组合，该试剂组合的使用可以直接或间接从尿液中提取分离出谷胱甘肽，进一步检测5个抗原蛋白含量，并将5个抗原蛋白含量作为诊断指标，以确定尿液提供者是否患有结核病，即本发明提供一种试剂组合，该试剂组合以5个抗原蛋白作为检测目标，并以其作为生物标志物用于诊断结核病。

为此，本发明进一步提供本发明所述的试剂组合在制备诊断结核病试剂盒的应用。

本发明所述的生物标志物5个抗原蛋白，为已知化合物，可以根据任何一种现有方法提取或检测，所述方法包括任何一种抗原蛋白的检测方法，如现有文献中报道的方法。

本发明所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

本发明所述的结核病为肺结核或肺外结核。

本发明所述体液为尿液。

具体的，本发明的试剂盒，可以用于从尿液中提取分离5个抗原蛋白的试剂，

本发明的试剂盒包括任何一种现有的检测5个抗原蛋白的试剂盒。

优选的，本发明试剂盒中包括含有5个抗原蛋白标准对照品，还包括检测方法说明书，检测标准的参考数值，有机或无机试剂，溶剂的配制方法等。

本发明所述用5个抗原蛋白作为诊断标志物，是将这5个抗原蛋白作为整体，一同进行检测，即检测其中的5个，也可以检测其中1个，2个，3个，4个，优选检测其中的3个，或4个，或5个。检测其中的3个比检测其中的1个或2 个精确性更高，同理，检测其中的4个比检测其中的1-3个精确性更高，检测其中的5个比检测其中的1-4个精确性更高。所述检测多种，是任选的，没有种类限定，可以是5个抗原蛋白的任意组合。

本发明的技术方案是经过研究得到的，研究方法如下：

1.技术方案

1.1研究对象和方法

1.1.1研究对象

研究对象及纳入标准

研究对象来自深圳第三人民医院的确诊的肺结核住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(WS 288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及X射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；潜伏感染者(有临床接触史，无临床症状，且IGRA阳性)以及非活动性肺结核非潜伏感染者(对照组)。共选用对照组118人，结核病潜伏感染组118人，活动性肺结核组118人，年龄、性别等详细信息见表1，所有研究对象均年龄小于70 岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。样本信息见表1。

1.1.2标本来源

留取入组人群第二次晨尿，上午7-11点的中段尿液约40毫升于干净的尿杯中，转移至无菌收集管中，盖紧管盖，置于冰盒或冰水混合物中。

1.1.3研究方法

利用凝胶电泳/液相色谱和质谱联用技术，鉴定出样本的尿液样本中所有蛋白质的种类与含量等信息。同时采用二维凝胶电泳，选取浓度差异大于2倍的差异表达的蛋白凝胶点，或者在结核病人中出现、而对照样本中没有出现的凝胶点，质谱鉴定获得结核病人和非结核病对照的尿液蛋白的表达差异蛋白。经过数据的挖掘和生物信息学分析，找出结核病尿液中潜在的诊断标识物。采用多反应监测 (MRM)技术、酶联免疫ELISA对筛选出来的诊断标识物在不同疾病背景的结核病人群中进行临床验证。

1.1.3.1尿蛋白的制备

(1)尿液样品立即用提前预冷到4℃的离心机，1500g离心10分钟，小心地将上清转移到新的无菌收集管中，去掉沉淀残渣。

(2)在此收集管中立即每管加入一粒蛋白酶抑制剂片剂(Roche,Germany，此片剂适合40毫升体积的样品收集)，待抑制剂片剂充分溶解后，立即将收集管冻存在-20℃冰箱，在存储期间避免冻融。从尿样采集到最后冰箱冻存，时间控制在4 小时之内。

(3)将收集的尿液样品用50kDa的超滤管在4000转离心20分钟，去除高丰度蛋白以免干扰尿液中低丰度蛋白的鉴定。

(4)将滤出液用3kDa的超滤管离心20分钟，去掉小分子量蛋白，收集3kDa 和50kDa之间的蛋白溶液。

(5)溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为0.015％，室温温育10分钟，之后加入预冷的三氯乙酸，至其终浓度为10％，将溶液在-20℃放置5分钟，之后在4℃放置过夜，充分沉淀蛋白。

(6)溶液在4℃用15000g离心30分钟，离心沉淀用预冷的丙酮清洗两次，沉淀烘干后测定蛋白的浓度。

1.1.3.2尿液蛋白质组的鉴定

(1)制备的蛋白分别进行SDS凝胶电泳和二维液相色谱分离。SDS电泳分离后每份蛋白样品的凝胶分别分成20等份，收集胶块，随后进行脱色、蛋白还原和烷基化、酶解、脱盐。

(2)二维液相色谱分离时，酶解后的蛋白样品溶于0.1％的甲酸，依次经过强阳离子交换柱，采用不同浓度的氯化铵溶液(2,5,10,15,20,25,30,40,50,60,70,80, 100,and500mM)进行洗脱，每一个梯度的洗脱液直接进入反相柱进行分离，依次获得蛋白样品的洗脱肽段。

(3)肽段分别使用串联质谱LTQ Orbitrap Velos进行鉴定，获得每份洗脱肽段的尿液蛋白质组。凝胶电泳和二维液相色谱串联质谱的鉴定结果合并起来构成了结核病人的尿液蛋白质组。

1.1.3.3尿液中差异表达蛋白的鉴定

(1)取制备的结核病人和非结核病对照人群的尿液蛋白各300μg,一维采用等电点3-10的胶条进行等电聚焦电泳，二维采用12％的SDS-PAGE电泳，平行电泳两块凝胶，电泳完毕将其同时固定、染色、脱色，获得结核病人和非结核病对照人群的尿液蛋白的二维凝胶电泳图。

(2)比较两块凝胶中的蛋白染色点，充分脱色后能检测到含量低至0.1μg的蛋白，选取浓度差别大于2倍的差异表达的蛋白点，分别挖取这些差异表达的蛋白对应的凝胶斑点，进行脱色、还原、酶解、脱盐，采用飞行时间质谱MALDI-TOF/TOF 进行鉴定，获得结核病人和非结核病人的尿液蛋白的表达差异蛋白(技术路线参见图1)。此鉴定过程至少重复三次以上，保证结果的可靠性。这些差异表达的蛋白，结合后续的定量蛋白质组学鉴定结果，可以用来作为结核病人尿液分子诊断的潜在标识物。

(3)通过对结核病人和非结核病对照人群的尿液蛋白质组的结果的比较，经过数据挖掘和生物信息学分析，找出结核病人尿液与对照组的蛋白表达在生物统计学上有显著差异，揭示出结核病人尿液中特有的蛋白，结合二维凝胶电泳中鉴定出的差异表达蛋白的结果，初步鉴定出结核病人尿液中的潜在诊断标识物。

1.1.3.4不同疾病背景的人群的临床验证

对筛选出来的潜在标识物，在收集到的不同疾病背景的结核病人和非结核病对照的尿液样本中，分别采用多反应监测质谱技术和免疫印迹进行临床验证。

A.多反应监测质谱技术：

(1)将需要验证的临床样本蛋白按以上的尿液蛋白制备方法制备好，还原/烷基化/ 酶解/脱盐待用；

(2)根据质谱仪LTQ Orbitrap Velos对结核病人尿液样本的蛋白质组学的高分辨鉴定结果，选取需要验证蛋白的相应肽段导入Skyline软件后，提取每条肽段所对应的特异性母离子的信息(包括质荷比、离子信号强度、保留时间)；

(3)将这些信息导入专业分析软件Analyst(version 1.7,Sciex,USA)，建立MRM方法。此方法只对选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，去除其他子离子的干扰，对选定的特异子离子在质谱AB Sciex 5500上进行信号的采集；

(4)数据在Skyline软件进行分析，对选择肽段的特异性母离子进行确认，从而完成蛋白的验证。

B.酶联免疫ELISA进行验证：

(1)加样：试剂盒内分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔，待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(使样品最终稀释度为5 倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(2)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(3)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(4)洗涤：接掉封模板弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静止30s后弃去，重复操作5次后拍干；

(5)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

(6)温育：重复第2步操作；

(7)洗涤：重复第4步操作；

(8)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，震荡混匀，37℃避光显色10min；

(9)终止：每孔加入终止液50μL终止反应；

(10)测定：采用酶标分析仪Rayto RT-6100，以空白孔调零，450nm波长一次测定各孔吸光度(OD值)，测定在终止反应15min内进行。

2.研究结果

经过数据的挖掘和生物信息学分析，初步找出了尿液中5个可用于诊断结核病的蛋白标识，分别是P22352(Glutathione peroxidase 3，谷胱甘肽过氧化物酶 3)，Q9P121(Neurotrimin，神经三胺)，P15151(Poliovirus receptor，脊髓灰质炎病毒受体蛋白)，Q13291(Signaling lymphocytic activation molecule family 1，信号淋巴细胞激活分子家族1)，和Q8NDA2(Hemicentin-2，胞外基质蛋白2)。随后根据这5个蛋白的高分辨质谱鉴定结果，在质谱仪AB Sciex 5500上采用多反应监测(MRM)技术进行了临床验证。此验证过程在验证阶段的52例结核病人、 52例潜伏感染人群、52例非结核病对照的尿液样本中进行。此外，还采用酶联免疫ELISA方法对这5个蛋白在16例结核病人、16例潜伏感染人群、16例非结核对照中进行验证。研究结果表明,选取5个尿液蛋白中的3个进行组合诊断，诊断灵敏度为82.7％，特异性为92.3％。根据文献报道，郭爱珍等从45份结核病人(45份健康人对照)的尿液中鉴定出19个差异表达的蛋白，发现其中的 MBL2(mannose-binding lectin 2)和ITIH4-35k(a 35-kDa fragment of inter-α-trypsin inhibitor H4)这两个蛋白的表达差异最大。随后从构建的蛋白 -microRNA的相互作用网络中，鉴定出11个microRNAs并通过qRT-PCR进行了验证。最终通过二元逻辑回归模式分析发现，miR-625-3p,MBL2和ITIH4-35k 三种分子的组合筛查能使结核病诊断的灵敏度达到85.87％，特异性达到87.50％，但这一结果没有在结核病人以及对照人群的尿液样本中进行临床验证，只是通过数据分析得出理论上的可行性。本研究中5个抗原蛋白P22352，Q9P121,P15151, Q13291和Q8NDA2的组合诊断特异性，明显高于前人的结果。

3.结论：

尿液中P22352,Q9P121,P15151,Q13291和Q8NDA2的组合可明确区分活动性结核病患者与结核潜伏感染和非活动性肺结核非潜伏感染者，具有较高的诊断灵敏度和特异性，可以作为成为诊断活动性结核病的候选诊断标识物。

本发明通过上述研究，得到的结论是，5个抗原蛋白可以作为结核病的生物标志物，但其中的一个或两个蛋白不足以作为诊断标识，三个或三个以上蛋白的组合具有82.7％以上的诊断灵敏度和92.3％以上的特异性，可以作为成为诊断活动性结核病的候选诊断标识物。通过有关的检测方法得到检测结果，该结果可被用于诊断和评估结核病及其严重程度。

本发明根据上述研究，得到一种判断标准，初步确定为，尿液中的P22352,Q9P121,P15151,Q13291和Q8NDA2这5个蛋白，每个蛋白的正常浓度值为 19.4-53.3微克/毫升的范围，任意3个或3个以上抗原蛋白的浓度低于或超过该限度，为阳性结果。蛋白浓度在该正常值范围内则为阴性。

名词解释：

P22352(Glutathione peroxidase 3，GSH-Px3)：谷胱甘肽过氧化物酶3是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。它的作用是能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GSH-Px3的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。

文献出处：Esworthy RS,Chu FF,Paxton RJ,Akman S,Doroshow JH.Characterization and partial amino acid sequence of human plasma glutathioneperoxidase.Arch Biochem Biophys.1991；286(2):330-336.

氨基酸序列:

Q9P121(Neurotrimin)：神经三胺是涉及多种人类疾病的五个细胞表面神经元蛋白家族，以同二聚体和异二聚体相互作用，并且可以跨不同细胞或跨突触间隙反式相互作用。NTRI基因的遗传变异与儿童注意力不足/多动障碍和发育迟缓儿童的侵略性有关。

文献出处：Clark HF,Gurney AL,Abaya E,et al.The secreted proteindiscovery initiative(SPDI),a large-scale effort to identify novel humansecreted and transmembrane proteins:a bioinformatics assessment.Genome Res.2003；13(10):2265-2270.

氨基酸序列:

P15151(Poliovirus receptor，NECL-5)：脊髓灰质炎病毒受体蛋白是免疫球蛋白超家族的成员，含有三个Ig样结构域，最初被鉴定为脊髓灰质炎病毒受体，通常在癌细胞中被上调。Necl-5的胞质区域可以与Tctex-1结合，可能与微管结合参与调节细胞运动。Necl-5增强生长因子诱导的Cdc42和Rac小G蛋白的激活，分别导致丝状伪足和层状脂蛋白形成，最终增强细胞运动；增强 Ras-Raf-MEK-ERK信号的激活，并诱导细胞周期调节剂的上调和下调，缩短细胞G1期的时间。

文献出处：Mendelsohn CL,Wimmer E,Racaniello VR.Cellular receptor forpoliovirus:molecular cloning,nucleotide sequence,and expression of a newmember of the immunoglobulin superfamily.Cell.1989，56(5):855-65.

氨基酸序列:

Q13291(Signaling lymphocytic activation molecule family 1，SLAM)：信号淋巴细胞激活分子家族1属于免疫球蛋白基因超家族，参与T细胞刺激。SLAM 在外周血CD45R高记忆T细胞，T细胞克隆，未成熟胸腺细胞和一定比例的B 细胞上组成性表达，并在激活后迅速在幼稚T细胞上诱导。SLAM的参与增强了携带CD4抗原(CD4+)的T细胞的抗原特异性增殖和细胞因子的产生。以 CD28独立的方式增强T细胞的扩增并诱导Th0/Th1细胞因子的产生。

文献出处：Réthi B,Gogolák P,Szatmari I,et al.SLAM/SLAM interactionsinhibit CD40-induced production of inflammatory cytokines in monocyte-deriveddendritic cells.Blood.2006；107(7):2821-2829.

氨基酸序列:

Q8NDA2(Hemicentin-2，HMCN2)：胞外基质蛋白2是一种参与钙离子结合的保守细胞外蛋白。HMCN2突变与年龄相关的家族性黄斑变性有关。

文献出处：Humphray SJ,Oliver K,Hunt AR,et al.DNA sequence and analysisof human chromosome 9.Nature.2004；429(6990):369-374.

氨基酸序列:

TB：Tuberculosis，结核病

M.tb：Mycobacterium tuberculosis，结核分枝杆菌

TST：tuberculin skin test，结核菌素试验

IGRA：interferon gamma release assays，γ干扰素释放试验

ATB：Active Tuberculosis,活动性结核

LTBI：Latent Tuberculosis Infection，结核潜伏感染者

HC：Health Control，非结核感染对照组

2-DE:two-dimensional gel electrophoresis，二维凝胶电泳

ESI-MS:electrospray ion mass spectrometry，电喷雾离子阱质谱

HPLC:high-performance liquid chromatography，高效液相色谱

MRM:multiple reaction monitoring，多反应监测

参考文献：

1.WHO.Global tuberculosis report 2019.

2.Cui X,Gao L,Cao B:Management of latent tuberculosis infection inChina: Exploring solutions suitable for high-burden countries.Int J InfectDis 2020 Mar；92S:S37-S40.

3.Kerkhoff AD,Lawn SD:A breakthrough urine-based diagnostic test forHIV-associated tuberculosis.Lancet 2016,387(10024):1139-1141.

4.Qi X,Ng KT,Lian Q,Li CX,Geng W,Ling CC,Yeung WH,Ma YY,Liu XB,Liu Het al:Glutathione Peroxidase 3Delivered by hiPSC-MSCs Ameliorated Hepatic IRInjury via Inhibition of Hepatic Senescence.Theranostics 2018,8(1):212-222.

5.Wang J,Zhu X,Xiong X,Ge P,Liu H,Ren N,Khan FA,Zhou X,Zhang L,Yuan Xet al:Identification of potential urine proteins and microRNA biomarkers forthe diagnosis of pulmonary tuberculosis patients.Emerg Microbes Infect 2018,7(1):63.

附图说明

图1.采用二维凝胶电泳方法鉴定结核病人尿液中的表达差异蛋白

图2.结核病人尿液蛋白的差异表达

图3.蛋白Q9P121和P22352在结核病人尿液样本中的质谱多反应监测(MRM) 验证

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

取吴姓受试者第二次晨尿，上午7-11点的中段尿液约40毫升于干净的尿杯中，转移至无菌收集管中，用以下方法进行处理：

(1)尿液样品立即用提前预冷到4℃的离心机，1500g离心10分钟，小心地将上清转移到新的无菌收集管中，去掉沉淀残渣。

(2)在此收集管中立即每管加入一粒蛋白酶抑制剂片剂(Roche,Germany，此片剂适合40毫升体积的样品收集)，待抑制剂片剂充分溶解后，立即将收集管冻存在 -20℃冰箱，在存储期间避免冻融。从尿样采集到最后冰箱冻存，时间控制在4 小时之内。

(3)将收集的尿液样品用50kDa的超滤管在4000转离心20分钟，去除高丰度蛋白以免干扰尿液中低丰度蛋白的鉴定。

(4)将滤出液用3kDa的超滤管离心20分钟，去掉小分子量蛋白，收集3kDa 和50kDa之间的蛋白溶液。

(5)溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为0.015％，室温温育10分钟，之后加入预冷的三氯乙酸，至其终浓度为10％，将溶液在-20℃放置5分钟，之后在4℃放置过夜，充分沉淀蛋白。

(6)溶液在4℃用15000g离心30分钟，离心沉淀用预冷的丙酮清洗两次，沉淀烘干，得到蛋白。

随后，采用酶联免疫ELISA对所得蛋白进行定性和定量测定：

(1)加样：试剂盒内分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔，待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(使样品最终稀释度为5 倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(2)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(3)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(4)洗涤：接掉封模板弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静止30s后弃去，重复操作5次后拍干；

(5)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

(6)温育：重复第2步操作；

(7)洗涤：重复第4步操作；

(8)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，震荡混匀，37℃避光显色10min；

(9)终止：每孔加入终止液50μL终止反应；

(10)测定：采用酶标分析仪Rayto RT-6100，以空白孔调零，450nm波长一次测定各孔吸光度(OD值)，测定在终止反应15min内进行。

根据仪器分析结果，得到5个抗原蛋白定性和定量结果，检测结果如下：

P22352(Glutathione peroxidase 3，谷胱甘肽过氧化物酶3)：86.3微克/毫升

Q9P121(Neurotrimin，神经三胺)：5.3微克/毫升

P15151(Poliovirus receptor，脊髓灰质炎病毒受体蛋白)：21.4微克/毫升

Q13291(Signaling lymphocytic activation molecule family 1，信号淋巴细胞激活分子家族1)：35.5微克/毫升

Q8NDA2(Hemicentin-2，胞外基质蛋白2)：342.2微克/毫升蛋白浓度正常值：19.4-53.3微克/毫升，检测结果中有3个蛋白超过或低于该限度(P22352和Q8NDA2的浓度高于正常值范围，Q9P121的浓度低于正常值范围)，其余2个蛋白的检测结果在限度范围内，达到任意3个抗原蛋白浓度在正常值之外(低于或超过)的诊断标准，因此为阳性结果。

实施例2

取马姓受试者第二次晨尿，上午7-11点的中段尿液约40毫升于干净的尿杯中，转移至无菌收集管中，用以下方法进行处理：

(1)尿液样品立即用提前预冷到4℃的离心机，1500g离心10分钟，小心地将上清转移到新的无菌收集管中，去掉沉淀残渣。

(2)在此收集管中立即每管加入一粒蛋白酶抑制剂片剂(Roche,Germany，此片剂适合40毫升体积的样品收集)，待抑制剂片剂充分溶解后，立即将收集管冻存在 -20℃冰箱，在存储期间避免冻融。从尿样采集到最后冰箱冻存，时间控制在4 小时之内。

(3)将收集的尿液样品用50kDa的超滤管在4000转离心20分钟，去除高丰度蛋白以免干扰尿液中低丰度蛋白的鉴定。

(4)将滤出液用3kDa的超滤管离心20分钟，去掉小分子量蛋白，收集3kDa 和50kDa之间的蛋白溶液。

(5)溶液中加入脱氧胆酸钠至终浓度为0.015％，室温温育10分钟，之后加入预冷的三氯乙酸，至其终浓度为10％，将溶液在-20℃放置5分钟，之后在4℃放置过夜，充分沉淀蛋白。

(6)溶液在4℃用15000g离心30分钟，离心沉淀用预冷的丙酮清洗两次，沉淀烘干，得到蛋白。

随后，采用酶联免疫ELISA对所得蛋白进行定性和定量测定：

(1)加样：试剂盒内分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔，待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(使样品最终稀释度为5 倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(2)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(3)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(4)洗涤：接掉封模板弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静止30s后弃去，重复操作5次后拍干；

(5)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；

(6)温育：重复第2步操作；

(7)洗涤：重复第4步操作；

(8)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，震荡混匀，37℃避光显色10min；

(9)终止：每孔加入终止液50μL终止反应；

(10)测定：采用酶标分析仪Rayto RT-6100，以空白孔调零，450nm波长一次测定各孔吸光度(OD值)，测定在终止反应15min内进行。

检测结果如下：

P22352(Glutathione peroxidase 3，谷胱甘肽过氧化物酶3)：25.2微克/毫升

Q9P121(Neurotrimin，神经三胺)：46.4微克/毫升

P15151(Poliovirus receptor，脊髓灰质炎病毒受体蛋白)：76.6微克/毫升

Q13291(Signaling lymphocytic activation molecule family 1，信号淋巴细胞激活分子家族1)：32.5微克/毫升

Q8NDA2(Hemicentin-2，胞外基质蛋白2)：57.3微克/毫升抗原蛋白浓度正常值：19.4-53.3微克/毫升，检测结果中3个蛋白的检测结果在正常值限度范围内，有2个蛋白(P15151和Q8NDA2)超过该限度，没有达到 3个或3个以上抗原蛋白浓度在正常值之外的要求，因此为阴性结果。

Claims (4)

1.5个抗原蛋白P22352，Q9P121，P15151，Q13291，Q8NDA2中的任意三个或三个以上抗原蛋白组合在制备结核病诊断的试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述结核病诊断是以5个抗原蛋白P22352，Q9P121，P15151，Q13291，Q8NDA2作为诊断分子标记物。

3.根据权利要求1所述的应用，包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的结核病为肺结核或肺外结核。

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