CN112618800A - 一种下颌骨髁突骨软骨修复支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了下颌骨髁突骨软骨修复支架材料及其制备方法，该支架材料由软骨表层、软骨深层和骨层组成，所述软骨表层由交联巯基‑透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的骨髓间充质干细胞组成，软骨深层由交联巯基‑透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的软骨细胞组成，骨层为多孔双相磷酸钙陶瓷，软骨深层位于软骨表层与骨层之间以及骨层的多孔结构中将软骨表层与骨层连接为一体。体内实验证实该支架材料对下颌骨髁突骨软骨缺损具有优异的修复能力，可解决现有治疗下颌骨髁突骨软骨损伤的方法及材料无法无法修复下颌骨髁突骨软骨缺损的问题，为下颌骨髁突骨软骨损伤的治疗提供了新的可能性。
Description
技术领域
本发明属于下颌骨修复材料领域，涉及下颌骨髁突骨软骨修复支架材料及其制备方法。
背景技术
颞下颌关节紊乱症在临床上十分常见，常常伴随下颌骨髁突的骨软骨缺损，导致患者出现关节疼痛、下颌运动受限，伴发骨关节炎，甚至张口受限，严重影响患者的生活质量。下颌骨髁突缺乏直接的血液供应和神经支配，自身修复能力极差，颞下颌关节紊乱症导致的髁突骨软骨缺损几乎不能完全修复。目前，临床应用的治疗下颌骨髁突骨软骨损伤的方法都存在明显的缺点：(1)口服药物、理疗等无创治疗只能起到缓解症状、延缓病情的作用，不能修复已有的下颌骨髁突骨软骨缺损；(2)关节腔内注射透明质酸及营养因子等微创治疗手术主要用于缓解关节区疼痛，增加关节内润滑度进而改善下颌运动功能，但不具备修复下颌骨髁突骨软骨缺损的功能；(3)颞下颌关节区开放性手术治疗主要为严重影响下颌骨功能的患者进行髁突置换手术，亦无法修复下颌骨髁突骨软骨缺损。
对于骨软骨损伤，理想的治疗效果是在损伤部位形成与周围正常组织结构类似、具有良好生物学性能的新生软骨层及骨层，与周围正常组织紧密结合。组织工程技术，可利用异体细胞复合到多层具有良好生物学性能的支架上构建出大小及形状合适的组织工程骨软骨复合体，有效克服了自体骨软骨移植中供体不足及供体部位损伤、细胞扩增能力欠佳的限制，为下颌骨髁突骨软骨损伤的修复提供了新的希望。多数滑膜关节软骨主要由透明软骨构成，而下颌骨髁突软骨由纤维软骨组成，其组织构成及分层与多数滑膜关节软骨存在较大差异，这就造成了现有的适用于滑膜关节软骨修复的材料对下颌骨髁突软骨修复的适用性较为有限。国内外目前对一般滑膜关节组织工程骨软骨复合组织的构建研究比较深入，但对下颌骨髁突的骨软骨修复尚处于初探阶段。如何开发出理想的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，以解决目前临床应用的治疗下颌骨髁突骨软骨损伤的方法存在的问题，成了支架材料今后主要的研究方向之一。
发明内容
针对现有技术中尚无专门针对下颌骨髁突的骨软骨修复的支架材料，临床应用的治疗下颌骨髁突骨软骨损伤的方法及材料无法实现对下颌骨髁突骨软骨缺损修复的问题，本发明提供了一种下颌骨髁突骨软骨修复支架材料及其制备方法，以实现对下颌骨髁突骨软骨缺损的修复。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，由软骨表层、软骨深层和骨层组成，所述软骨表层由交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的骨髓间充质干细胞组成，软骨深层由交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的软骨细胞组成，骨层为多孔双相磷酸钙陶瓷，软骨深层位于软骨表层与骨层之间以及骨层的多孔结构中将软骨表层与骨层连接为一体，所述交联巯基-透明质酸水凝胶是由结构式如式(I)所示的巯基-透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～60％，
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，所述软骨表层中，交联巯基-透明质酸的含量为5～30mg/mL，I型胶原的含量为15～25mg/mL；所述软骨深层中，交联巯基-透明质酸的含量为5～30mg/mL，I型胶原的含量为15～25mg/mL。进一步地，软骨表层和软骨深层中，I型胶原的含量为交联巯基-透明质酸的含量的0.5～3倍，优选为2～3倍。软骨表层和软骨深层中，交联巯基-透明质酸的含量优选为6～20mg/mL，更优选为6～10mg/mL，I型胶原的含量优选为15～20mg/mL。更进一步地，软骨表层与软骨深层中的交联巯基-透明质酸的含量最好是相同，软骨表层与软骨深层中的I型胶原的含量也最好是相同。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，所述多孔双相磷酸钙陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，多孔双相磷酸钙陶瓷中，羟基磷灰石的含量为10wt％～40wt％，优选为20wt％～40wt％。进一步地，所述多孔双相磷酸钙陶瓷的孔隙率为60％～80％。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，所述软骨表层、软骨深层以及骨层的厚度比为1:(1.5～2):(2～3)。实际应用中，根据实际修复对象来确定软骨表层、软骨深层以及骨层的具体厚度以及骨层的形状，通常，所述软骨表层的厚度为0.2～1mm，进一步地，软骨表层的厚度可以为0.2～0.5mm。所述软骨深层的厚度是指软骨深层处于软骨表层与骨层之间的厚度。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，软骨深层中的软骨细胞组为异体来源或自体来源的原代软骨细胞，软骨表层中的骨髓间充质干细胞为异体来源或自体来源的原代骨髓间充质干细胞。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，巯基-透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱氨改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量优选为0.1MDa～4.0MDa，进一步优选地，作为改性基础的透明质酸的分子量优选为0.2MDa～0.5MDa。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的技术方案中，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率优选为30％～40％。
本发明还提供了上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将成型多孔双相磷酸钙陶瓷置于模具中；
(2)将巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀，调节pH值至7.3～7.5，然后加入软骨细胞悬液并混匀，将所得含细胞的混合液注射至成型多孔双相磷酸钙陶瓷的上方，静置至凝胶状态即形成软骨深层；
(3)将巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀，调节pH值至7.3～7.5，然后加入骨髓间充质干细胞悬液并混匀，将所得含细胞的混合液注射至软骨深层的上方，静置至凝胶状态即形成软骨表层，从模具中取出，得到下颌骨髁突骨软骨修复支架材料；
步骤(2)～(3)的操作在冰浴条件下进行，将巯基-透明质酸用α-MEM培养基溶解即得巯基-透明质酸，将I型胶原用醋酸溶液溶解即得I型胶原溶液，巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀所形成的混合液中，交联巯基-透明质酸的浓度为5～30mg/mL，I型胶原的浓度为15～25mg/mL。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法的技术方案中，步骤(2)中软骨细胞悬液的加入量应使步骤(2)所得含细胞的混合液中，软骨细胞的含量至少达到1×105cells/mL，例如可以是1×106～5×108cells/mL；步骤(3)中骨髓间充质干细胞悬液的加入量应使步骤(2)所得含细胞的混合液中，骨髓间充质干细胞的含量至少达到1×105cells/mL，例如可以是1×106～5×108cells/mL。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法的技术方案的步骤(2)～(3)中，巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀所形成的混合液中，交联巯基-透明质酸的浓度优选为6～20mg/mL，更优选为6～10mg/mL，I型胶原的浓度优选为15～20mg/mL。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法的技术方案中，若步骤(3)制备的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料无法立即使用，则将下颌骨髁突骨软骨修复支架材料置于软骨诱导培养基进行体外培养，体外培养期间每隔2～3天更换一次软骨诱导培养基，待使用时取出。进一步地，采用的软骨诱导培养基是在D-MEM培养基的基础上添加转化生长因子β1、非必须氨基酸、L-脯氨酸、地塞米松、抗坏血酸2-磷酸盐，以及青霉素-链霉素混合液得到的。进一步地，在37℃、5％CO2的条件下进行体外培养。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法的技术方案中，在配制I型胶原溶液时，采用的醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L。
上述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法的技术方案中，所述I型胶原可以是从牛蹄筋中提取得到的。
与现有技术相比，本发明的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，由软骨表层、软骨深层和骨层组成，通过分层设计、软骨表层和软骨深层的高分子材料的选择以及在软骨表层和软骨深层负载不同的细胞来仿生下颌骨髁突骨软骨结构，软骨表层与软骨深层通过负载细胞为缺损部位提供原始细胞，并且，通过设计骨层与软骨层，并在软骨表层与软骨深层中负载不同种类的细胞来实现目标部位的分层修复，同时，交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及多孔双相磷酸钙陶瓷可有效促进细胞的黏附、增殖和分化。本发明提供的支架材料可以解决目前临床应用的治疗下颌骨髁突骨软骨损伤的方法存在的无法修复下颌骨髁突骨软骨缺损的问题，为下颌骨髁突骨软骨损伤的治疗提供了新的可能性。
2.细胞毒性测试试验表明，本发明提供的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料无细胞毒性。通过对该支架材料中的细胞形态、软骨表层及软骨深层间的分层状态检测，发现该支架材料在体外培养时，随培养时间的增加，软骨表层的骨髓间充质干细胞成梭型，软骨深层的软骨细胞呈现圆形，在体外培养至第14天时，软骨表层的骨髓间充质干细胞及软骨深层的软骨细胞分层明显，良好地仿生了天然下颌骨髁突骨软骨层的结构。这种分层结构与天然的下颌骨髁突骨软骨的天然结构吻合，可解决现有用于滑膜关节软骨修复的支架材料因结构差异而不适用于下颌骨髁突骨软骨修复的问题。
3.通过体外成软骨能力测试进一步发现，软骨表层及软骨深层包载细胞中的软骨相关基因AGG、ACAN、SOX9、COL1A2、COL2A1及COL10A1的表达均随培养时间的延长而增加，且软骨表层材料包裹的骨髓间充质干细胞高表达COL1A2，软骨深层包载的软骨细胞高表达COL2A1及COL10A1，这有利于其分层对应修复天然髁突软骨的纤维层、增值层(高表达I型胶原)和成熟层、肥大层(高表达II型及X型胶原)，同时，随体外培养时间的增加，软骨表层、软骨深层所包载的细胞分泌GAG含量增加，其中软骨深层包载的软骨细胞分泌了更多的GAG，并且组织学染色显示软骨表层包载的骨髓间充质干细胞成梭型，软骨深层包载的软骨细胞呈现肥大的类圆形，软骨表层与软骨深层具有明显的分层。以上这些进一步表明本发明提供的支架材料可良好地仿生下颌骨髁突骨软骨的分层结构，并且具有良好的促进成软骨能力。
4.体内骨再生能力修复实验表明，本发明提供的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，在植入体内6周时，基本填满缺损区域，在植入体内24周时，支架材料可良好仿生天然下颌骨髁突骨软骨结构，分层构建了髁突软骨表层及软骨深层。支架材料在植入体内6周及24周时表现出良好的软骨修复能力，分别良好仿生了修复软骨表层的I型胶原及软骨深层的II型胶原。体内再生能力修复实验进一步证实了本发明提供的支架材料对下颌骨髁突骨软骨具有优异的修复能力，非常适用于下颌骨髁突骨软骨缺损的修复，弥补了现有技术尚无专门针对下颌骨髁突骨软骨缺损修复的支架材料报道的空白。
附图说明
图1为实施例1中HA-SH与HA的核磁谱图。
图2为实施例2中HA-SH、Col I及HA-SH/Col I混合液形成凝胶后的照片。
图3为实施例2制备的支架材料的照片、支架材料以及多孔BCP陶瓷体外培养骨髓间充质干细胞组后的扫描电镜图，其中，a图为支架材料的照片，b图为支架材料纵剖面的扫描电镜图，c图为多孔BCP陶瓷体外培养骨髓间充质干细胞组后的扫描电镜图，d-e图分别为支架材料的软骨深层及软骨表层的扫描电镜图。
图4为HA-SH水凝胶、Col I水凝胶以及HA-SH/Col I复合水凝胶的流变力学性能、溶胀速率、降解速率以及力学性能测试结果，其中，a图为流变力学性能图、b图为溶胀速率图，c图为降解速率图，d图为储能模量曲线，e图为损耗模量曲线。
图5为实施例4中体外培养1、3、7天后的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的骨层、软骨深层、软骨表层活死染色后的激光共聚焦扫描显微镜照片。
图6为实施例5中支架材料的软骨深层、软骨表层中的软骨细胞和骨髓间充质干细胞培养不同时间后的细胞骨架激光共聚焦扫描显微镜照片。
图7为实施例6中成型多孔BCP培养人骨髓间充质干细胞14天后进行ALP及ARS染色的照片。
图8为实施例7中体外培养7、14和21天的支架材料的软骨表层和软骨深层的软骨相关基因表达情况，体外培养7天和21天的支架材料的软骨表层和软骨深层的糖胺聚糖(GAG)/DNA值，体外培养28天的支架材料的组织学染色结果，其中，a图为支架材料的软骨深层、软骨表层中的软骨细胞和骨髓间充质干细胞培养不同时间得到的PCR定量检测分析图，b图为GAGs定量检测分析图，a图和b图中，深色的条形图代表软骨表层，浅色的条形图代表软骨深层，c图为支架材料的软骨深层、软骨表层样本在培养28天后切片的组织学染色结果。
图9是实施例8中支架材料在植入6周、24周后的体内的骨再生能力测试结果，其中，a图为空白对照组、空载支架组、实验组的兔下颌骨髁突骨软骨缺损处的修复大体观图及Micro CT分析结果，b图为缺损处的切片组织学染色结果，c图为缺损处的切片免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料及其制备方法作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例中制备巯基-透明质酸(HA-SH)，步骤如下：
(1)将分子量为0.3MDa的透明质酸钠(HA)2g溶解于去离子水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)10mmol，在室温条件下于去离子水中搅拌至完全溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)25mmol，充分溶解，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75～5.0，在室温反应2h，然后加入半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)25mmol，在室温反应24h，之后将溶液转移至截留分子量8000-14000KDa的透析袋中，室温下透析72h，最后将透析液冻干获得固态HA-SH。
使用核磁共振波谱仪检测HA与HA-SH，核磁谱图如图1所示，由图1可知，与HA相比，HA-SH的新共振峰出现在2.45ppm及2.63ppm处，这证明了HA-SH的成功合成。
采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度，该HA-SH中半胱氨的接枝率约为30％。
采用改进的Ellman法测定HA-SH中的巯基取代度发现，通过改变EDCI与CSA·HCl的摩尔比，HA的分子量，可改变HA-SH中巯基的取代度，即改变HA-SH中半胱氨的接枝率，随着EDCI与CSA·HCl的摩尔比增加，巯基取代度逐渐升高，而HA的分子量越高，巯基取代度越低，通过调整EDCI与CSA·HCl的摩尔比以及HA的分子量，可以调整HA-SH中半胱氨的接枝率为30％～60％范围内。
实施例2
本实施例中，制备下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，步骤如下：
(1)将成型多孔双相磷酸钙陶瓷(多孔BCP陶瓷)置于内径8mm、高3mm的一端封闭的圆筒状模具内，多孔BCP陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为3:7，孔隙率约为75％，成型多孔BCP陶瓷是直径为8mm、高度为1.5mm的圆柱状块体，成型多孔BCP陶瓷采用与模具同轴线的方式置于圆筒状模具的封闭端。
(2)获取原代培养骨髓间充质干细胞及软骨细胞：选取5日龄乳兔，注射戊巴比妥钠处死，将双侧股骨骨髓腔抽取物离心富集获得骨髓间充质干细胞，使用α-MEM培养基培养。将膝关节部位软骨组织剪碎后胰蛋白酶消化30min，在37℃下使用2.5mg/mL的II型胶原酶处理4h，之后用70mm细胞过滤器后将悬液离心富集获得软骨细胞，使用α-MEM培养基培养。
(3)用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，得到浓度为25mg/mL的HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解I型胶原(Col I)，得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。
在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以3:7的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，即得到HA-SH/Col I混合液，然后加入软骨细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中软骨细胞的含量为5×106cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具内的成型多孔BCP陶瓷上方，静置至凝胶状态，即形成软骨深层，软骨深层高出成型BCP陶瓷上表面约1mm。
(4)用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，得到浓度为25mg/mL的HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。
在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以3:7的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后加入骨髓间充质干细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中骨髓间充质干细胞的含量为5×106cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具软骨深层上方，静置至凝胶状态，即形成软骨表层，软骨表层高出软骨深层上表面约0.5mm，将其从模具中取出，得到下颌骨髁突骨软骨修复支架材料。
(5)由于步骤(4)制备的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料不立即使用，因此将下颌骨髁突骨软骨修复支架材料浸没于软骨诱导培养基中，在37℃、5％CO2的条件下进行体外培养，体外培养期间每隔2～3天更换一次软骨诱导培养基，待使用时取出。
软骨诱导培养基为是在D-MEM培养基的基础上添加转化生长因子β1、非必须氨基酸、L-脯氨酸、地塞米松、抗坏血酸2-磷酸盐，以及青霉素-链霉素混合液得到的，其中，转化生长因子β1的添加量为10ng/mL、非必须氨基酸的添加量为0.1mmol/L、L-脯氨酸的添加量为40μg/mL、地塞米松的添加量为100nmol/L、抗坏血酸2-磷酸盐的添加量为91.5μg/mL、青霉素-链霉素混合液的添加量为1％。
上述HA-SH、Col I及HA-SH/Col I混合液形成凝胶后的照片分别如图2的(A)(B)(C)三图所示，HA-SH水凝胶透明基本无色，Col I水凝胶不透明呈奶白色，HA-SH/Col I水凝胶半透明呈淡奶白色。
使用相机和扫描电镜对本实施例制备的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料进行表征，同时向单独的多孔BCP陶瓷中加入骨髓间充质干细胞进行体外培养，培养一段时间后采用扫描电镜进行表征。使用相机拍摄支架材料的侧面，结果如图3的a图所示，由图可知，该支架材料的各层紧密相连，结构稳定。使用扫描电镜对支架材料的纵向剖面进行观察，结果如图3的b图所示，由该图也可以看出支架材料的骨层与软骨层紧密相连。使用扫描电镜对加入骨髓间充质干细胞进行体外培养的多孔BCP陶瓷的表层进行观察，结果如图3的c图所示，由图可见骨髓间充质干细胞黏附于多孔BCP陶瓷的表层生长，这有利于其发挥成骨作用。使用扫描电镜对支架材料的骨层的软骨深层进行观察，结果如图3的d图所示，由图可见软骨细胞于材料间增殖，且分泌出大量细胞外基质，有利于新生软骨的形成。用扫描电镜对支架材料的骨层的软骨表层进行观察，结果如图3的e图所示，由图可见骨髓间充质干细胞于材料间良好增殖。
对比例1
本实施例中，制备未负载任何细胞的支架材料，步骤如下：
(1)与实施例2的步骤(1)相同。
(2)用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，得到浓度为25mg/mL的HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。
在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以3:7的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后注射至模具内的成型多孔BCP陶瓷上方，静置至凝胶状态，即形成软骨深层，软骨深层高出成型BCP陶瓷上表面约1mm。
在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以3:7的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，然后注射至模具软骨深层上方，静置至凝胶状态，即形成软骨表层，软骨表层高出软骨深层上表面约0.5mm，得到未负载任何细胞的支架材料。
实施例3
本实施例中，测试交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶(HA-SH/Col I)的理化性能，同时以单独的HA-SH水凝胶和Col I水凝胶作为对照进行比较。
用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，得到浓度为25mg/mL的HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到浓度为25mg/mL的Col I溶液。用注射器分别吸取HA-SH溶液和Col I溶液，并按照组HA-SH溶液与Col I溶液以3:7的体积比混合均匀，用NaOH溶液调节pH至7.4，在37℃静置一段时间即可形成复合水凝胶HA-SH/Col I。用α-MEM培养基溶解实施例1制备的HA-SH，得到浓度为25mg/mL的HA-SH溶液，用NaOH溶液调节pH至7.4，在37℃静置一段时间即可形成HA-SH水凝胶。在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到浓度为25mg/mL的Col I溶液，用NaOH溶液调节pH至7.4，在37℃静置一段时间即可形成Col I水凝胶。
通过流变仪测定成胶时间，图4的a图为HA-SH/Col I复合水凝胶的流变力学性能图，图中，两条曲线交汇点即代表材料成胶，HA-SH/Col I复合水凝胶的成胶时间约为1分钟。将HA-SH水凝胶、Col I水凝胶以及HA-SH/Col I复合水凝胶冷冻干燥，然后浸入PBS溶液中，定期间隔时间点测量其重量并测量它们的溶胀特性，结果如图4的b图所示，HA-SH/ColI复合水凝胶的溶胀速率处于HA-SH水凝胶与Col I水凝胶之间，符合实验设计要求。将HA-SH水凝胶、Col I水凝胶以及HA-SH/Col I复合水凝胶冷冻干燥，然后置于1mmol/L的二硫苏糖醇溶液中，置于恒温摇床在37℃、90rpm的转速下振荡，每隔一段时间将各水凝胶样品取出、冷冻干燥并称重，测量它们的溶解特性，结果如图4的c图所示，HA-SH/Col I复合水凝胶的溶解速率处于HA-SH水凝胶与Col I水凝胶之间，符合实验设计要求。使用动态力学分析仪测量HA-SH水凝胶、Col I水凝胶以及HA-SH/Col I复合水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G")，结果如图4的d-e图所示，HA-SH/Col I复合水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G")数值均处于HA-SH凝胶与Col I凝胶之间，具有良好的力学性能。
实施例4
本实施例中，对下颌骨髁突骨软骨修复支架材料进行细胞毒性测试。
使用活死染色试剂盒检测实施例2采用软骨诱导培养基体外培养1、3、7天的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的骨层、软骨深层、软骨表层中所载细胞的活死情况。体外培养1、3、7天的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的骨层、软骨深层、软骨表层活死染色后的激光共聚焦扫描显微镜照片如图5所示。其中，绿色代表为存活的骨髓间充质干细胞(骨层和软骨表层)以及软骨细胞(软骨深层)，红的为死亡的骨髓间充质干细胞及软骨细胞，BCP代表骨层。图5中基本全部为绿色细胞，红色细胞罕见，说明细胞在支架材料中的存活率高，支架材料无细胞毒性。
实施例5
本实施例中，对下颌骨髁突骨软骨修复支架材料中的细胞形态、软骨表层及软骨深层间的分层状态进行检测。
分别使用鬼笔环肽及DAPI标记实施例2采用软骨诱导培养基体外培养1、14和21天的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的软骨深层和软骨表层中所载细胞的细胞骨架及细胞核，在不同时间点观察软骨深层和软骨表层层中细胞形态。结果如图6所示，由图6的a图可知，随培养时间的增加，软骨表层的骨髓间充质干细胞成梭型，软骨深层的软骨细胞呈现圆形。由图6的b图可知，培养时间增加至第14天后，观察到软骨表层的骨髓间充质干细胞及软骨深层的软骨细胞分层明显，良好地仿生了天然下颌骨髁突骨软骨层的结构。
实施例6
本实施例中，对实施例2采用的骨层多孔BCP材料单独进行体外培养，验证其体外成骨分化能力。
将骨髓间充质干细胞接种于实施例2采用的成型多孔BCP上(羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为3:7，孔隙率约为75％，成型多孔BCP陶瓷是直径为8mm、高度为1.5mm的圆柱状块体)作为实验组，接种量为每块成型多孔BCP接种1×104cells)。以未接种任何细胞的成型多孔BCP作为对照组。然后，使用成骨诱导培养基体外培养实验组和对照组14天。之后使用碱性磷酸酶表达(ALP)染色及茜素红(ARS)染色检测骨层诱导成骨分化能力。所述成骨诱导培养基是在α-MEM培养基的基础上添加地塞米松、β-甘油磷酸盐、抗坏血酸，以及青霉素-链霉素混合液得到的，其中，地塞米松的添加量为100nmol/L、β-甘油磷酸盐的添加量为10mmol/L、抗坏血酸的添加量为0.05mmol/L、青霉素-链霉素混合液的添加量为1％。
结果如图7所示，由图7可知，实验组的成型多孔BCP陶瓷较对照组显示出更深的蓝色(ALP)和红色(ARS)染色，证明多孔BCP上的骨髓间充质干细胞成骨向分化，表明骨层材料具有良好的成骨诱导特性。
实施例7
本实施例中，对下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的软骨表层及软骨深层的体外成软骨能力进行测试。
对实施例2采用软骨诱导培养基进行体外培养7、14和21天的支架材料，采用聚合酶链反应(PCR)检测软骨表层和软骨深层的软骨相关基因表达情况，对体外培养7天和21天的支架材料，检测其软骨表层和软骨深层的糖胺聚糖(GAG)/DNA值，对体外培养28天的支架材料进行组织学染色。结果如图8所示，其中，a图为支架材料的软骨深层、软骨表层中的软骨细胞和骨髓间充质干细胞培养不同时间得到的PCR定量检测分析图，b图为GAGs定量检测分析图，c图为支架材料的软骨深层、软骨表层样本在培养28天后切片的组织学染色结果，其中，从左至右依次是苏木精-伊红染色结果、番红染色结果、甲苯胺蓝染色结果。
由图8的a图可知，软骨表层及软骨深层包载细胞中的软骨相关基因AGG、ACAN、SOX9、COL1A2、COL2A1及COL10A1的表达均随培养时间的延长而增加。表明HA-SH/Col I复合水凝胶对其中包载的细胞具有良好的促进成软骨能力。且软骨表层材料包裹的骨髓间充质干细胞高表达COL1A2，软骨深层包载的软骨细胞高表达COL2A1及COL10A1，均有利于其分层对应修复天然髁突软骨的纤维层、增值层(高表达I型胶原)和成熟层、肥大层(高表达II型及X型胶原)。由图8的b图可知，随培养时间的增加，软骨表层、软骨深层所包载的细胞分泌GAG含量增加，其中软骨深层包载的软骨细胞分泌了更多的GAG。由图8的c图可知，组织学染色显示软骨表层与软骨深层分层明显，软骨表层包载的骨髓间充质干细胞成梭型，软骨深层包载的软骨细胞呈现肥大的类圆形。
实施例8
本实施例中，对下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的体内骨再生能力进行测试，以实施例2制备的颌骨髁突骨软骨修复支架材料作为实验组，以对比例1制备的未负载任何细胞的支架材料作为空载支架组，空白对照组不植入任何材料至体内。
在新西兰大白兔体内建立下颌骨髁突骨软骨缺损模型，分别将载有细胞和未载细胞的两种支架材料植入缺损中，形成实验组和空载支架组，空白对照组不植入任何材料。在植入6周、24周后取材，对样本进行拍照、Micro CT分析、硬组织切片并行组织学及组织化学染色，比较各组在体内的骨再生能力，结果如图9所示。图9的a图为空白对照组、空载支架组、实验组的兔下颌骨髁突骨软骨缺损处的修复大体观图及Micro CT分析结果，b图为缺损处的切片组织学染色结果，其中，上图为苏木精-伊红染色结果，下图为番红/固绿染色结果，c图为缺损处的切片免疫组织化学染色结果。
由图9的a图可知，相较于空白对照组及空载支架组，实验组的支架材料在植入体内6周及24周时表现出良好的修复外观及骨修复能力。由图9的b图可知，相较于空白对照组及空载支架组，实验组的支架材料在植入体内6周及24周时表现出良好的软骨修复能力，在植入体内6周时，基本填满缺损区域，并且，在植入体内24周时，实验组的支架材料良好仿生天然下颌骨髁突骨软骨结构，分层构建了髁突软骨表层及软骨深层。由图9的c图可知，相较于空白对照组及空载支架组，实验组的支架材料在植入体内6周及24周时表现出良好的软骨修复能力，分别良好仿生了修复软骨表层的I型胶原及软骨深层的II型胶原。
实施例9
本实施例中，制备下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，步骤如下：
(1)采用将分子量为0.5MDa的透明质酸钠，按照实施例1的方法，通过控制EDCI与CSA·HCl的摩尔比，制备得到半胱氨的接枝率约为35％～60％的HA-SH。
(2)将成型多孔BCP陶瓷置于内径8mm、高4.5mm的一端封闭的圆筒状模具内，多孔BCP陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为4:6，孔隙率约为80％，成型多孔BCP陶瓷是直径为8mm、高度为2mm的圆柱状块体，成型多孔BCP陶瓷采用与模具同轴线的方式置于圆筒状模具的封闭端。
(3)同实施例2的步骤(2)。
(4)用α-MEM培养基溶解步骤(1)制备的HA-SH，得到HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到Col I溶液。在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以适当的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，即得到HA-SH/Col I混合液，HA-SH/Col I混合液中HA-SH的浓度为10mg/mL、Col I的浓度为20mg/mL，然后加入软骨细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中软骨细胞的含量为1×106cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具内的成型多孔BCP陶瓷上方，静置至凝胶状态，即形成软骨深层，软骨深层高出成型BCP陶瓷上表面约1.5mm。
(5)用α-MEM培养基溶解步骤(1)制备的HA-SH，得到HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到Col I溶液。在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以适当的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，即得到HA-SH/Col I混合液，HA-SH/Col I混合液中HA-SH的浓度为10mg/mL、Col I的浓度为20mg/mL，然后加入骨髓间充质干细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中骨髓间充质干细胞的含量为1×106cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具软骨深层上方，静置至凝胶状态，即形成软骨表层，软骨表层高出软骨深层上表面约1mm，将其从模具中取出，得到下颌骨髁突骨软骨修复支架材料。
(6)同实施例2的步骤(5)。
实施例10
本实施例中，制备下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，步骤如下：
(1)采用将分子量为0.2MDa的透明质酸钠，按照实施例1的方法，通过控制EDCI与CSA·HCl的摩尔比，制备得到半胱氨的接枝率约为40％的HA-SH。
(2)同实施例2的步骤(1)。
(3)同实施例2的步骤(2)。
(4)用α-MEM培养基溶解步骤(1)制备的HA-SH，得到HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到Col I溶液。在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以适当的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，即得到HA-SH/Col I混合液，HA-SH/Col I混合液中HA-SH的浓度为6mg/mL、Col I的浓度为15mg/mL，然后加入软骨细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中软骨细胞的含量为1×108cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具内的成型多孔BCP陶瓷上方，静置至凝胶状态，即形成软骨深层，软骨深层高出成型BCP陶瓷上表面约1mm。
(5)用α-MEM培养基溶解步骤(1)制备的HA-SH，得到HA-SH溶液；在冰浴下用0.25mol/L的醋酸溶液溶解Col I，得到Col I溶液。在冰浴下将HA-SH溶液与Col I溶液以适当的体积比混合均匀，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，即得到HA-SH/Col I混合液，HA-SH/Col I混合液中HA-SH的浓度为6mg/mL、Col I的浓度为15mg/mL，然后加入骨髓间充质干细胞悬液并混匀，得到含细胞的混合液，其中骨髓间充质干细胞的含量为1×108cells/mL。将该含细胞的混合液注射至模具软骨深层上方，静置至凝胶状态，即形成软骨表层，软骨表层高出软骨深层上表面约1.5mm，将其从模具中取出，得到下颌骨髁突骨软骨修复支架材料。
(6)同实施例2的步骤(5)。
Claims (10)
1.一种下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，由软骨表层、软骨深层和骨层组成，所述软骨表层由交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的骨髓间充质干细胞组成，软骨深层由交联巯基-透明质酸与I型胶原的复合水凝胶以及分布在该复合水凝胶中的软骨细胞组成，骨层为多孔双相磷酸钙陶瓷，软骨深层位于软骨表层与骨层之间以及骨层的多孔结构中将软骨表层与骨层连接为一体，所述交联巯基-透明质酸水凝胶是由结构式如式(I)所示的巯基-透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基-透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～60％，
2.根据权利要求1所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，所述软骨表层中，交联巯基-透明质酸的含量为5～30mg/mL，I型胶原的含量为15～25mg/mL；所述软骨深层中，交联巯基-透明质酸的含量为5～30mg/mL，I型胶原的含量为15～25mg/mL。
3.根据权利要求1所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，所述多孔双相磷酸钙陶瓷由羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成，多孔双相磷酸钙陶瓷中，羟基磷灰石的含量为10wt％～40wt％。
4.根据权利要求3所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，所述多孔双相磷酸钙陶瓷的孔隙率为60％～80％。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，所述软骨表层、软骨深层以及骨层的厚度比为1:(1.5～2):(2～3)。
6.根据权利要求5所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，所述软骨表层的厚度为0.2～1mm。
7.根据权利要求1至4中任一权利要求所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料，其特征在于，软骨深层中的软骨细胞组为异体来源或自体来源的原代软骨细胞，软骨表层中的骨髓间充质干细胞为异体来源或自体来源的原代骨髓间充质干细胞。
8.权利要求1至7中任一权利要求所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将成型多孔双相磷酸钙陶瓷置于模具中；
(2)将巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀，调节pH值至7.3～7.5，然后加入软骨细胞悬液并混匀，将所得含细胞的混合液注射至成型多孔双相磷酸钙陶瓷的上方，静置至凝胶状态即形成软骨深层；
(3)将巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀，调节pH值至7.3～7.5，然后加入骨髓间充质干细胞悬液并混匀，将所得含细胞的混合液注射至软骨深层的上方，静置至凝胶状态即形成软骨表层，从模具中取出，得到下颌骨髁突骨软骨修复支架材料；
步骤(2)～(3)的操作在冰浴条件下进行，将巯基-透明质酸用α-MEM培养基溶解即得巯基-透明质酸，在冰浴下将I型胶原用醋酸溶液溶解即得I型胶原溶液，巯基-透明质酸溶液与I型胶原溶液混匀所形成的混合液中，交联巯基-透明质酸的浓度为5～30mg/mL，I型胶原的浓度为15～25mg/mL。
9.权利要求8所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中软骨细胞悬液的加入量应使步骤(2)所得含细胞的混合液中，软骨细胞的含量至少达到1×105cells/mL；步骤(3)中骨髓间充质干细胞悬液的加入量应使步骤(2)所得含细胞的混合液中，骨髓间充质干细胞的含量至少达到1×105cells/mL。
10.权利要求8或9所述下颌骨髁突骨软骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，若步骤(3)制备的下颌骨髁突骨软骨修复支架材料无法立即使用，则将下颌骨髁突骨软骨修复支架材料置于软骨诱导培养基进行体外培养，体外培养期间每隔2～3天更换一次软骨诱导培养基。
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