CN112567026B

CN112567026B - Il-31改善用于癌症的基于巨噬细胞的过继性细胞疗法的功效

Info

Publication number: CN112567026B
Application number: CN201980054103.7A
Authority: CN
Inventors: M·C·拉斯特尔
Original assignee: Oncohorst Co
Current assignee: Oncohorst Co
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2024-08-23
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: WO2020016897A1; IL280266A; EP3824076A1; US20200062816A1; AU2019304290A1; CA3106796A1; EP3824076B1; JP2021529552A; CN112567026A; JP7535494B2; US12030922B2

Abstract

本发明提供了经基因修饰以表达IL‑31或IL‑31和嵌合抗原受体(CAR)两者用于治疗癌症的巨噬细胞。其进一步提供了治疗癌症的方法，包括施用IL‑31以及未基因修饰的巨噬细胞或基因修饰以表达CAR的巨噬细胞。

Description

IL-31改善用于癌症的基于巨噬细胞的过继性细胞疗法的功效

技术领域

本发明一般涉及癌症疗法领域，并且更具体地用于通过过继性细胞-转移(ACT)免疫疗法治疗癌症的癌症疗法领域。

背景技术

癌症免疫疗法涉及使用免疫系统的组分治疗癌症，例如，通过人工刺激免疫系统，改善免疫系统对抗癌症的自然能力。

过继性细胞-转移疗法(ACT)代表了一种有前途的癌症免疫疗法，它利用免疫系统消灭肿瘤细胞的固有能力。在ACT中，从患者的肿瘤样品或外周血中提取免疫细胞，离体扩增，然后重新注入患者体内。这些免疫细胞要么天然能够消灭肿瘤细胞，要么已通过基因修饰或用特定细胞因子处理对其进行了重新编程以消灭肿瘤细胞。

T淋巴细胞在免疫监视和肿瘤细胞消灭中起关键作用。它们表达识别肿瘤相关抗原的受体，并且一旦被激活，就会对恶性细胞产生直接的细胞毒性作用。在临床中，肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)的存在与患有各种肿瘤类型的患者的良好预后相关(Fridman etal.,2012)。

TIL疗法代表开发的第一类ACT疗法，并且涉及从切除的肿瘤中分离的天然存在的淋巴细胞的提取、选择和离体扩增。表达对肿瘤抗原具有高抗体亲抗原性的T细胞受体的扩增的TIL随后被注入回体内。在TIL疗法中，通常对患者进行淋巴去除以消除抑制性细胞，诸如T调节细胞和髓样来源的抑制性细胞。患者还接受高剂量的IL-2，这是一种促进转移的TIL的体内扩增的T细胞生长因子(Houot et al.,2015)。TIL疗法已被证明在晚期转移性黑色素瘤中是成功的(Rosenberg et al.,2011)。然而，它有几个局限性：例如，它需要手术切除肿瘤。另外，它不适用于缺乏免疫浸润或其中抗原加工和呈递下调的肿瘤。

已经开发了两种新颖的方法来克服这些障碍，这两种方法均基于外周T细胞的离体基因改造。在第一种方法中，将外周T细胞改造成表达对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体(TCR)。这样的T细胞识别在MHC的情况下表达的加工的肽抗原。

迄今为止，ACT的最突出类型涉及自体T细胞，其已经通过嵌合抗原受体(CAR)的表达被重新编程为靶向肿瘤细胞。CAR-T疗法已在许多临床试验中证明了巨大的成功，尤其是在血液系统恶性肿瘤方面，并已被FDA批准用于某些类型的癌症(Harrer et al.,2018；Jackson et al.,2016)。在第二种方法中，工程改造T细胞以表达包含细胞外单链可变片段(scFv)和细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)。CAR的细胞外部分允许识别特定的肿瘤抗原，而细胞内信号传导结构域则刺激T细胞的活化。因为CAR-T细胞以非MHC限制的方式识别细胞表面抗原，所以CAR-T细胞不依赖抗原的加工和呈递。第一代CAR包括CD3ζ的细胞内信号传导结构域，而第二代和第三代CAR还包括一种或多种共刺激分子的细胞内结构域(诸如CD28、OX40和4-1BB)，以改善注入的T细胞的持久性和增殖(Houot et al.,2015)。针对CD19的CAR-T疗法已显示出对急性成淋巴细胞白血病(ALL)的巨大成功，其中90％的患者获得了完全缓解(Maude et al.,2014)。然而，尽管在血液系统恶性肿瘤中显示出令人鼓舞的应答，但是CAR-T疗法在实体瘤中的功效还是有限的。对此的可能解释包括在敌对肿瘤微环境中的免疫抑制以及CAR-T细胞的归巢和浸润能力差(Beatty et al.,2016)。可以想象，免疫调节细胞因子可以用来克服这些障碍，从而增强CAR-T疗法的抗肿瘤功效。实际上，一些临床前研究已经证明，进一步修饰CAR-T细胞以分泌促炎性细胞因子IL-12提供对抑制性肿瘤微环境的保护并改善抗肿瘤功效。另外，在各种临床前和临床研究中，细胞因子(诸如IL-2、IL-7、IL-12或IL-15)的全身联合施用已经证明了在改善CAR-T疗法的功效中的潜力(在Huang et al.,2017中综述)。

巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞类型之一。具体取决于其活化状态，内源性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可以促进或抑制肿瘤的进展。在早期的肿瘤中，‘经典活化的’巨噬细胞具有炎性的杀肿瘤表型。这种巨噬细胞也被称为抗肿瘤巨噬细胞或M1样巨噬细胞。但是，在已建立的肿瘤中，巨噬细胞会向具有血管生成、抗炎性和免疫抑制特性的‘替代活化’表型极化。这些巨噬细胞也被称为促肿瘤或M2样巨噬细胞(Mantovani和Locati,2013)。因此，已经探索了抗肿瘤巨噬细胞的过继性转移作为癌症的治疗策略。临床前研究表明，在各种鼠类肿瘤模型中施用活化的巨噬细胞显著降低了肿瘤生长和转移(Fidler,1974；Wang et al.,1986)。然而，迄今为止，临床试验仍未成功实现治疗目的(Lee et al.,2016)。基于巨噬细胞的ACT的主要障碍之一是一旦巨噬细胞遇到在肿瘤微环境中产生的信号，就失去了离体诱导的抗肿瘤表型。因此，本领域中需要更有效的组合物和方法以将过继转移的巨噬细胞维持在所需的功能状态。

IL-31是属于IL-6细胞因子家族的免疫调节细胞因子。它主要由Th2表型的活化CD4+T细胞以及肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表达(Dillon et al.,2004；Cornelissen et al.,2011；Niyonsaba et al.,2910)。IL-31通过异源二聚体复合物发出信号，该复合物由普遍表达的制癌蛋白M受体β(OSMRβ)和IL-31受体α(IL-31RA)组成，IL-31受体α(IL-31RA)的表达方式更为严格(Hermanns,2015)。初步研究证明了，过表达IL-31的转基因小鼠或施用IL-31的野生型小鼠发展出特应性皮炎样症状，与皮肤中T细胞介导的促炎性作用一致(Dillon et al.,2004)。在人类中，高水平的IL-31与过敏性病症(诸如特应性皮炎(Neis et al.,2006)、炎性肠病(Dambacher et al.,2007)和哮喘(Lei et al.,2008)强相关。

IL-31在癌症中的作用尚未被很好地表征。只有几篇已发表的研究表明了促-或抗-致瘤作用。例如，临床研究将IL-31与血液系统恶性肿瘤诸如皮肤T细胞淋巴瘤和滤泡性B细胞淋巴瘤联系起来(Ferretti et al.,2015；Ohmatsu et al.,2012)。此外，升高的IL-31和IL-33水平与子宫内膜癌患者预后差有关(Zeng et al.,2016)。最近，IL-31已显示可治疗与血管生成相关的疾病(包括癌症)，并减少或预防转移(WO 2015/173812；Davidi etal.,2017)。

发明内容

停留在肿瘤微环境(TME)中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。它们是具有采用多种功能状态的能力的高度可塑性细胞。抗肿瘤巨噬细胞(通常称为经典活化的巨噬细胞或M1样巨噬细胞)拥有抗肿瘤功能，诸如吞噬作用、细胞毒性和抗原呈递以协调适应性免疫应答。促肿瘤巨噬细胞(通常称为可选活化的巨噬细胞或M2样巨噬细胞)在支持肿瘤的方法(诸如血管生成和免疫抑制)中发挥重要作用。已知的是，来自实体瘤微环境的信号一般导致巨噬细胞极化为促肿瘤表型。因此，保持巨噬细胞的抗肿瘤表型或预防其再编程至促肿瘤表型的方法代表癌症疗法领域中的进步。

根据本发明，现在已经发现，一旦过继转移的巨噬细胞进入癌组织并遇到肿瘤微环境内产生的信号，细胞因子白介素-31(IL-31)能够保持巨噬细胞的体外诱导的抗肿瘤表型，从而保持其抗肿瘤表型和治疗潜力。因此，Il-31在治疗癌症的基于巨噬细胞的过继性细胞疗法中具有益处。

在本发明的一个方面中，基因操纵巨噬细胞，以便表达人IL-31或IL-31和嵌合抗原受体(CAR)两者。

在本发明的另一方面，未基因修饰的巨噬细胞或经基因修饰以便表达CAR的巨噬细胞可以随IL-31的输注被施用给癌症患者。

本发明的这些和其他方面将在之后的本发明的具体实施方式中更详细地描述。

附图说明

图1显示了在对照和表达IL-31的J774细胞中精氨酸酶1(ARG1)和诱导型氧化氮合酶(iNOS)的相对表达水平。使用慢病毒转导系统基因修饰单核细胞-巨噬细胞细胞系J774，以在组成上过表达IL-31。转导有空载体的对照细胞被称为J774-NSPI。转导有编码IL-31的载体的细胞被称为J774-NSPI-IL-31。总RNA提取自J774-NSPI和J774-NSPI-IL-31细胞。进行实时PCR以评估酶——精氨酸酶1(ARG1)和诱导型氧化氮合酶(iNOS)——的相对表达水平。表达水平被标准化为Hsp90。

图2显示了在原发性乳腺肿瘤模型中表达IL-31的过继转移的单核细胞-巨噬细胞的治疗效果。将鼠4T1乳腺癌细胞原位地植入BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤平均尺寸达到75mm³时，或者小鼠保持不治疗(对照)，或者它们接受对照单核细胞-巨噬细胞(J774-NSPI)或表达IL-31的单核细胞-巨噬细胞(J774-NSPI-IL-31)的单次静脉注射。在第19天，从下颌下静脉收集血液样品并制备血浆。通过ELISA测定血浆中IL-31的水平(图2A)。在整个实验过程中定期测量肿瘤体积。图2B显示了与两个对照组(对照和J774-NSPI)相比，在注射表达IL-31的J774单核细胞-巨噬细胞(J774-NSPI-IL-31)的小鼠中，肿瘤生长速率显著更低。显示为均值±SD(n＝6只小鼠/治疗组)，*p<0.05。

图3显示了在原发性乳腺肿瘤模型中过继转移IL-31训练的巨噬细胞的治疗效果。将EMT6乳腺癌细胞(5x10⁵个细胞)原位地植入BALB/c雌性小鼠(8周龄)的乳腺脂肪垫中。植入7天后，将IL-31训练的腹膜巨噬细胞注入至眶后窦中。之后，小鼠按周接受分别在第一、第二、第三和第四次注射中以5x10⁵、3x10⁵、5x10⁵和1.5x10⁶个细胞的剂量的巨噬细胞注射追加剂量(boost)(由箭头指示)。对照小鼠不注射巨噬细胞。图3A：随时间监测肿瘤体积。数据呈现为均值±S.D；n＝6小鼠/组。*p<0.001。图3B：Kaplan-Meier存活分析。

具体实施方式

在描述本发明的产品和方法之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法学和方案。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述本发明的特定实施方式的目的，并且如果没有另外定义，则其非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将在所附权利要求中叙述。

还必须注意到，如本文所使用，以及在所附权利要求中，单形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数指代物，除非上下文明确指定。

为了更好地理解本发明，本文将定义本申请中使用的一些术语。

术语“肿瘤”——在本文中也称为“癌症”，是指组织的异常生长。本发明涉及实体原发性或转移性恶心肿瘤的治疗。如本文所使用，术语“抗肿瘤作用”是指预防、抑制、或停止肿瘤的形成或生长。

术语“单核细胞”是指在血流中发现的一类白细胞，其在进入组织后，分化为巨噬细胞或树突细胞。单核细胞是最大的白细胞类型，并且在适应性免疫过程中起到重要作用。

单核细胞在迁移进入它们变为巨噬细胞或树突细胞的组织之前，通常通过血液循环1-3天。

术语“巨噬细胞”是指大的白细胞，其是我们免疫系统中的重要部分。巨噬细胞是组织驻留的专业吞噬细胞和抗原呈递细胞，其具有响应环境或外部信号而采用一系列功能状态的能力。巨噬细胞起源已经从血流迁移进入身体中任意组织的循环单核细胞，其中巨噬细胞助于吞噬作用以消除有害材料，诸如外来物质、细胞碎片和癌细胞。巨噬细胞还可以在胎儿发育期间独立于单核细胞建立。

巨噬细胞以多种表型存在，表型由巨噬细胞在伤口成熟中起到的作用决定。如本文所使用，术语“幼稚巨噬细胞”是指还没受到环境或外部信号刺激的巨噬细胞。幼稚巨噬细胞，通常称为M0巨噬细胞，具有未定型(或未极化)表型。

如本文所使用，术语“抗肿瘤巨噬细胞”是指活化的巨噬细胞，其拥有抗肿瘤活性，诸如吞噬细胞、细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。抗肿瘤巨噬细胞以活化态的连续体存在。在连续体的极端下，巨噬细胞通常称为“经典活化的巨噬细胞”或M1巨噬细胞。抗肿瘤巨噬细胞特征在于选自但不限于以下的至少一种表面标记物的上调：CD40、CD68、CD80、CD86、HLA-DR、IL1R、SOCS3、TLR2、TLR4、PDL1，以及选自但不限于以下的至少一种表面标记物的下调：CD206和CD163。

如本文所使用，术语“促肿瘤巨噬细胞”是指活化的巨噬细胞，其拥有肿瘤支持活性，诸如血管生成和免疫抑制。促肿瘤巨噬细胞以活化态的连续体存在。在连续体的极端下，巨噬细胞通常称为“可选活化的巨噬细胞”或M2巨噬细胞。促肿瘤巨噬细胞的特征在于选自但不限于以下的至少一种表面标记物的上调：CD206和CD163，以及选自但不限于以下的至少一种表面标记物的下调：CD40、CD68、CD80、CD86、HLA-DR、IL1R、SOCS3、TLR2、TLR4、PDL1。

如本文所使用，术语“基于巨噬细胞的过继性细胞疗法”是指一类过继性细胞疗法，其中自体或同种异体巨噬细胞被施用至受试者，用于治疗目的。“自体”是指源自其在稍后将被再引入的相同个体的任何材料。“同种异体”是指，源自相同物种的不同个体的任何材料。

根据本发明，细胞因子IL-31与基于巨噬细胞的过继性细胞疗法联合使用，其中IL-31的存在用于保持和/或增强施用的细胞的抗肿瘤效果。

在第一方面，本发明涉及经基因修饰以表达以下的巨噬细胞：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽；或(ii)包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列。

如本文所使用，无论何时提到人IL-31，该提及是指具有SEQ ID No.1中叙述的序列的蛋白。

在一个优选实施方式中，本发明的巨噬细胞经基因修饰以表达人IL-31。

在一些实施方式中，巨噬细胞经基因修饰以表达与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽。在一些其他实施方式中，巨噬细胞经基因修饰以表达融合蛋白，其中IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列。

为了制备经基因修饰的巨噬细胞，优选通过经由病毒转导方法将核酸序列(DNA或RNA)引入细胞群(单核细胞、幼稚巨噬细胞、或抗肿瘤巨噬细胞)实现基因修饰。为进行上述步骤，首先通过本领域熟知的分子克隆技术(在Sambrook et al.,2012中描述)将目标多核苷酸插入病毒表达质粒。病毒表达质粒基于病毒的基因组编码病毒基因组或其部分。由于慢病毒质粒允许目标多核苷酸到分化和非分化靶细胞的基因组的稳定整合，所以慢病毒质粒是优选的。慢病毒表达质粒通常与慢病毒包装和包膜质粒结合使用，以产生感染性病毒颗粒(病毒粒子)。然后在称为慢病毒转导的过程中将病毒粒子用于转导靶细胞，从而将一种或多种目标多核苷酸引入靶细胞群。

在本发明的一个实施方式中，为了制备经基因修饰以表达在SEQ ID No.1(WO2015/173812中示出)中叙述的氨基酸序列的人IL-31的巨噬细胞，通过慢病毒转导方法，将编码人IL-31的在SEQ ID No.2(WO 2015/173812中示出)中叙述的核酸序列引入选自以下的细胞群：单核细胞、幼稚巨噬细胞或抗肿瘤巨噬细胞。

用于基因修饰的单核细胞或巨噬细胞获得自受试者，优选地人供体。供体可以是稍后再引入经基因修饰的巨噬细胞的同一受试者(即，自体细胞的供体)或HLA-匹配的供体(即，同种异体细胞的供体)。细胞可以从众多来源分离，包括外周血、骨髓、淋巴结、脾脏组织、脐带、腹水和肿瘤。优选地，外周血收集自人受试者。从外周血样品分离单核细胞的优选方法包括本领域内已知的技术，诸如白细胞提取法随后淘洗。分离的单核细胞可以使用本领域技术人员熟悉的方法在培养物中增殖。单核细胞可以通过在生长因子(诸如GM-CSF)存在下培养单核细胞持续4至8天分化为幼稚巨噬细胞，生长因子刺激单核细胞至巨噬细胞的分化(Andreesen et al.,1990)。幼稚巨噬细胞可以根据本领域已知的“巨噬细胞活化的杀伤细胞”或“MAK”方案被活化为抗肿瘤巨噬细胞，其中巨噬细胞用选自但不限于以下的活化剂进行刺激：干扰素-γ(IFN-γ)、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、米伐木肽(mifamurtide)和脂多糖(LPS)(Lee et al.,2016)。该刺激在向受试者施用抗肿瘤巨噬细胞之前进行18小时。MAK方案通常每周得到高达10⁹个抗肿瘤巨噬细胞/受试者。

本发明进一步涉及包括巨噬细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物，该巨噬细胞经基因修饰以表达以下：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽；或(ii)包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列。在一些实施方式中，药物组合物包括经基因修饰以表达人IL-31的巨噬细胞。

以上药物组合物旨在用于治疗癌症。

在该方面，本发明进一步涉及治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的巨噬细胞，该巨噬细胞经基因修饰以表达以下：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽；或(ii)包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列。

在第二方面，本发明涉及治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的未基因修饰的巨噬细胞连同以下的注入物(infusion)：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽；(ii)包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列；或(iii)包括人IL-31或融合蛋白和非蛋白质的或蛋白质的部分的复合物，该融合蛋白包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽，该非蛋白质的或蛋白质的部分选自：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二乙烯基醚、白蛋白、顺丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)、聚唾液酸(PSA)、聚(苯乙烯共顺丁烯二酸酐)(SMA)、透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚-HEMA)、甘醇二甲醚或聚异丙基丙烯酰胺。

在WO2015/173812中描述了以上提到的SEQ ID No.1的人IL-31、肽、融合蛋白和复合物，其通过引用并入本文，如本文完全公开。

在一些实施方式中，使用融合蛋白，其包括IL-31以及上面描述的延长血浆中IL-31的半衰期、稳定IL-31或保护血流中或组织处的IL-31的一种或多种分子。在一些实施方式中，融合蛋白包括附接至可以包括免疫球蛋白氨基酸序列的异源氨基酸序列的IL-31。在一些实施方式中，融合蛋白包括IL-31和任意分类的IgG，如IgG1、IgG2、IgG3。在一些实施方式中，两个蛋白部分由如4-12个氨基酸的接头分开，其形成用于酶的切割位点。

在一些实施方式中，使用复合物，其包括人IL-31或融合蛋白和上面指出的非蛋白质的或蛋白质的部分，融合蛋白包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ IDNo.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽。复合物可以是脂质体或微团的形式。

在第三方面，本发明涉及经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)(本文中CAR巨噬细胞)的巨噬细胞，该嵌合抗原受体被设计在免疫效应细胞中表达，使得表达CAR的巨噬细胞具有靶向的效应子活性(包括吞噬作用)、靶向的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。

在一些实施方式中，CAR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域，细胞外抗原结合结构域与靶向的效应子活性引导至的靶细胞表面上的抗原结合。

抗原结合结构域与靶细胞上的抗原结合，由此引导靶向的效应子活性针对表达特异性抗原的细胞。例如，抗原是对目标肿瘤或癌症具有特异性的肿瘤抗原。抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、和其任何片段。在一些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域是源自针对抗原(包括CD19、CD22、或HER2)的抗体的单链可变片段(scFv)。

CAR的跨膜结构域将抗原结合结构域连接至细胞内结构域。跨膜结构域可以源自天然来源(诸如任何膜结合或跨膜蛋白的跨膜区)，或来自合成来源，在这种情况下其将主要包括疏水残基。在一些实施方式中，CAR包括CD8、CD28的或CD3ζ的跨膜结构域。

CAR的细胞内结构域代表CAR的胞质部分并且负责其中表达CAR的巨噬细胞的活化。CAR的细胞内结构域可以是表面受体的胞质部分、刺激或共刺激分子、或引发巨噬细胞中信号转导的分子，此类分子包括Megf10(多表皮生长因子样结构域蛋白10)、FcRγ(Fc受体的常见亚基)、CD3ζ的或Dectin-1的细胞内结构域。

为了产生表达CAR的基因修饰的巨噬细胞，如上所述通过慢病毒转导将编码重组受体的核酸序列引入细胞群，其中重组受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

根据该方面，提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的如上所限定的CAR巨噬细胞连同以下的注入物：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽；(ii)包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列；或(iii)包括人IL-31或融合蛋白和非蛋白质的或蛋白质的部分的复合物，该融合蛋白包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽，该非蛋白质的或蛋白质的部分选自：聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二乙烯基醚、白蛋白、顺丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)、聚唾液酸(PSA)、聚(苯乙烯共顺丁烯二酸酐)(SMA)、透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(聚-HEMA)、甘醇二甲醚或聚异丙基丙烯酰胺。

在第四方面，本发明涉及经基因修饰以表达以下两者的巨噬细胞：(i)在SEQ IDNo.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽，或包括在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的肽的融合蛋白，其中在融合蛋白中，人IL-31或肽附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列；和(ii)嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体被设计在免疫效应细胞中表达，使得表达CAR的巨噬细胞具有靶向的效应子活性，和其中CAR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，这些结构域如上面先前所描述。

通过如下方法实现上述段落中限定的表达CAR和IL-31两者的基因修饰的巨噬细胞的制备：通过本领域内熟知的分子克隆技术(在Sambrook et al.中描述)将编码(i)中限定的IL-31蛋白、肽、或融合蛋白的核酸序列和编码CAR(ii)的核酸序列插入慢病毒载体质粒，并通过本领域已知的慢病毒转导方法转导至细胞群中(单核细胞、幼稚巨噬细胞、或抗肿瘤巨噬细胞)。两种多核苷酸的表达可以由两个独立的启动子驱动。可选地，两种目标多核苷酸可以在框(frame)中融合，使得编码CAR的细胞内结构域的序列之后是编码2A自切割肽的序列，之后是编码IL-31蛋白或肽的序列。在另一可选方式中，细胞群可以利用两个慢病毒转导载体进行转导，其中一个载体包括编码(i)的核算序列和另一载体编码CAR多肽(ii)。

根据该方面，本发明提供了包括巨噬细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，其中巨噬细胞经基因修饰以表达以下两者：(i)如上所描述的人IL-31、肽或融合蛋白和(ii)如上所述的CAR多肽。这些药物组合物用于癌症的治疗。

本发明的药物组合物包括细胞——未修饰的巨噬细胞或基因修饰的巨噬细胞、或人IL-31蛋白、与SEQ ID No.1具有至少70％同源性的肽或IL-31融合蛋白，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。它们可以通过本领域内熟知的方法制造，例如在Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest edition中所描述，其通过引用并入本文。

包括的药物组合物可以通过各种合适的途径施用给患者，诸如静脉内、覆膜内和瘤内。在优选实施方式中，静脉内施用组合物。施用的量和频率将由负责患者治疗的医生决定并将取决于患者疾病的类型和严重程度，以及他的年龄和状况。细胞的治疗剂量的实例包括每周给药10⁷至10⁹个细胞(巨噬细胞)/剂量，持续至多8周的时间段。当连同未基因修饰的巨噬细胞或CAR-巨噬细胞一起施用IL-31时，巨噬细胞施用一次或每2-3周一次，而IL-31连续施用(每天)。

根据本发明待治疗的癌症可以是原发性或转移性实体瘤，包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和子宫癌。

将通过以下非限制性实施例说明本发明。

实施例

材料和方法

i)细胞培养

鼠单核细胞-巨噬细胞J774、鼠4T1乳腺癌、鼠EMT6乳腺癌和人293T细胞系购买自美国典型菌种保藏中心(ATCC,USA)。从正宗(authentic)原液解冻后，在培养物中使细胞传代不超过4个月。测试所有细胞为支原体阴性。在37℃下，5％CO₂中，在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠和1％青霉素-链霉素(所有均购买自BiologicalIndustries)的Dulbecco改性eagle培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中培养细胞。

ii)慢病毒生产

将编码鼠IL-31的PCR扩增片段克隆到NSPI-CMV-Myc-His慢病毒载体(Addgene)的多个克隆位点内的BamHI和XhoI位点之间，以产生NSPI-CMV-IL-31-Myc-His构建体。慢病毒是通过使用如下三质粒组合的293T细胞(接种在10cm培养皿中的1.2x10⁶个细胞)的磷酸钙瞬时转染产生的：15μg慢病毒载体(即NSPI-CMV-Myc-His空对照载体或NSPI-CMV-IL-31-Myc-His)；10μg包装质粒δNRF；5μg包膜质粒VSV-G。包装和包膜质粒购自Abm。转染后96小时，收集培养基，过滤并补充聚凝胺(polybrene)(8μg/ml，终浓度)。含有活病毒的培养基立即用于感染J774细胞，如“慢病毒转导”部分所描述。

iii)慢病毒转导

将J774细胞以6x10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔培养板中。第二天通过用含有病毒的培养基代替该培养基来感染细胞。将板在32℃下1100g离心1.5h。第二天以新的慢病毒生产重复感染程序。通过在补充有4μg/ml嘌呤霉素的培养基中培养10天来选择转导的细胞。用空载体转导的对照细胞称为J774-NSPI。用IL-31-编码载体转导的细胞称为J774-NSPI-IL-31。

iv)实时PCR

使用RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek)从J774-NSPI和J774-NSPI-IL-31细胞提取总RNA。使用高容量的cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)将RNA反转录至cDNA。进行实时PCR以评估酶——精氨酸酶1(ARG1)和诱导型氧化氮合酶(iNOS)——的相对表达水平。将表达水平标准化为Hsp90。对于ARG1，引物为CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG(SEQ ID No.3)和AGGAGCTGTCATTAGGGACATC(SEQ ID No.4)。对于iNOS，引物为GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA(SEQ ID No.5)和GTGGACGGGTCGATGTCAC(SEQ ID No.6)。对于Hsp90，引物为TCGTCAGAGCTGATGATGAAGT(SEQ ID No.7)和GCGTTTAACCCATCCAACTGAAT(SEQ ID No.8)。所有样品均一式三份进行分析，并使用ΔΔCT方法进行分析，以评估ARG1和iNOS表达水平的相对倍数变化。

v)腹膜巨噬细胞分离

将8周龄的雌性BALB/c小鼠(Harlan,Israel)腹膜内注射3ml 4％巯基乙醇酸盐(生理盐水中的wt/vol；Sigma-Aldrich)，以在覆膜腔内诱发大量巨噬细胞。48小时后，给小鼠腹膜内注射2x10⁶个EMT6乳腺癌细胞，该细胞已经用60Gy预辐照。该步骤用于使巨噬细胞在体内暴露于肿瘤抗原。24小时后处死小鼠，并如下收集腹膜巨噬细胞。将冰冷的PBS(5ml)注入腹膜腔中。抽出流体并在4℃下以350g离心5分钟以沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于10mlRBC裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)中，并在室温下孵育10分钟以裂解红细胞。将细胞溶液在4℃下以350g的速度重新离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于无血清RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich)中。将腹膜渗出液细胞接种到10cm培养皿中，并在37℃下孵育约2小时，以使细胞贴壁(adhere)。通过用PBS充分洗涤除去非贴壁细胞。剩余的贴壁腹膜细胞(其代表巨噬细胞)在含有10％FBS(Biological Industries)的RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich)中培养过夜，然后进行极化处理(其在“离体巨噬细胞极化”一节中进行描述)。

vi)离体巨噬细胞极化

用20ng/ml IL-4和100ng/ml IL-31鼠重组蛋白(均来自Peprotech)处理培养的腹膜巨噬细胞48小时。IL-4处理用于将巨噬细胞极化为促肿瘤M2样表型(Mantovani和Locati，2013)。进行用IL-31的共同处理以测试IL-31将巨噬细胞从促肿瘤极化为抗肿瘤表型的能力。根据该方案处理的巨噬细胞(即用IL-4和IL-31共同处理的巨噬细胞)在下文中称为IL-31训练的巨噬细胞。通过用accutase(Sigma-Aldrich)消化对IL-31训练的巨噬细胞进行分离，在PBS中洗涤，重悬于无血清RPMI培养基中，并用血细胞计数器计数。通常，每只小鼠从～1x10⁷个腹膜渗出液细胞中获得～5x10⁵个IL-31诱导的巨噬细胞。

vii)肿瘤模型和治疗方案

使用单核细胞-巨噬细胞细胞系J774的过继转移模型：将鼠4T1乳腺癌细胞(5x10⁵)原位植入8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan,Israel)的乳腺脂肪垫中。使用Vernier卡尺使用公式宽²x长x0.5定期评估肿瘤大小。当肿瘤的平均大小达到75mm³时，将小鼠随机分为3个处理组：i)小鼠保持不处理；ii)小鼠(通过尾静脉)单次静脉注射2x10⁶个对照J774-NSPI细胞；iii)小鼠(通过尾静脉)单次静脉注射2x10⁶个J774-NSPI-IL-31细胞；每组n＝6只小鼠。定期评估肿瘤的生长。当肿瘤大小达到～1000mm³时，处死小鼠。

使用IL-31训练的巨噬细胞的过继转移模型：将鼠EMT6乳腺癌细胞(5x10⁵个细胞)原位植入8周龄的BALB/c雌性小鼠(Harlan,Israel)的乳腺脂肪垫中。植入后第7天，当肿瘤的平均大小达到100mm³时，将IL-31训练的巨噬细胞注入眶后窦(每剂量150μl RPMI的体积中5x10⁵个细胞)。此后，小鼠每周接受巨噬细胞注射(每剂量150μl RPMI的体积中0.3-1.5x10⁶个细胞)的追加剂量。对照小鼠未注射巨噬细胞；每组n＝6只小鼠。通过卡尺测量根据公式宽²x长x0.5监测肿瘤体积。在终点(当肿瘤大小达到1500mm³时)处死小鼠。

viii)ELISA

在4T1肿瘤细胞植入后第19天从小鼠收集血液。简要地说，用针刺穿下颌下静脉，并将100-150μl血液收集到含EDTA的管中。将血液样品以2000g离心15分钟，并收集上清液(血浆)。使用小鼠IL-31铂ELISA试剂盒(Invitrogen)测定血浆中IL-31的水平。

ix)统计分析

数据表示为均值±标准偏差(SD)。通过多重t检验评估差的统计显著性。在p值小于0.05时，认为差是显著的。

实施例1.表达IL-31的基因修饰的单核细胞-巨噬细胞细胞系的体外表征

使用慢病毒转导系统对鼠类单核细胞-巨噬细胞细胞系J774进行基因修饰，使其组成上过表达IL-31。为确定IL-31的表达是否影响巨噬细胞的极化，我们使用实时PCR评估了对照和表达IL-31的J774细胞中精氨酸代谢酶——iNOS(其由M1-样巨噬细胞表达)和ARG1(其由M2-样巨噬细胞表达)——的表达水平。图1显示了与对照相比，在表达IL-31的细胞中iNOs的表达水平增加5倍，而与对照相比在表达IL-31的细胞中ARG1的表达水平增加仅2倍。这表明，IL-31使巨噬细胞主要朝向M1-样表型极化。

实施例2.在鼠乳腺癌模型中表达IL-31的单核细胞-巨噬细胞的过继转移抑制肿瘤生长

采用鼠4T1原发乳腺癌模型确定表达IL-31的过继转移的单核细胞-巨噬细胞的治疗潜力。简要的说，将鼠4T1乳腺癌细胞原位植入BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫。当肿瘤大小达到75mm³时，小鼠或者保持不治疗，或者接收单次静脉注射对照或表达IL-31的J774单核细胞-巨噬细胞。图2A说明了，注射表达IL-31的J774单核细胞-巨噬细胞的小鼠展现了IL-31的高血浆水平(2.4ng/ml)。在对照未治疗的小鼠中和在注射对照J774单核细胞-巨噬细胞的小鼠中IL-31的血浆水平在检测阈值以下。另外，如预期，注射表达IL-31的J774单核细胞-巨噬细胞的小鼠展现了皮炎指征，诸如掉发和抓挠行为。在整个实验中监测肿瘤生长，并在组间比较生长速率。图2B显示了，在注射表达IL-31的J774单核细胞-巨噬细胞的小鼠中比两个对照组(即，未处理的小鼠和注射对照J774单核细胞-巨噬细胞的小鼠)，肿瘤生长速率显著更低。数据说明了表达IL-31的过继转移的单核细胞-巨噬细胞对原发性肿瘤生长的抑制作用。

实施例3.在鼠乳腺癌模型中IL-31训练的巨噬细胞的过继转移抑制肿瘤生长

这是显示IL-31增强肿瘤训练的巨噬细胞(即，引导针对肿瘤抗原的巨噬细胞)的抗肿瘤效果的概念实例的证据。

引导针对肿瘤抗原的巨噬细胞的实例包括：暴露于致死性照射的肿瘤细胞的巨噬细胞；表达肿瘤抗原的受体的基因修饰的巨噬细胞；表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的巨噬细胞以及与来自患者的抗原呈递细胞(树突细胞)共培养的巨噬细胞。

在本实施例中，有证据证明可以支持此叙述的可行性。在该实验中，巨噬细胞在体内暴露于致死性照射的肿瘤细胞，分离并用IL-4处理。IL-4处理用于模拟来自肿瘤的信号，该信号通常会将巨噬细胞转变为促肿瘤巨噬细胞(肿瘤相关巨噬细胞)。用IL-31处理巨噬细胞后，发现巨噬细胞受到肿瘤抗原的训练，而IL-31说明了抗肿瘤活性。这强调了巨噬细胞对肿瘤抗原的训练(在该实施例中是致命性照射的细胞，但是可以是确保这种训练的其他方式，如CAR)，连同IL31一起增加了抗肿瘤应答。

为了测试IL-31将巨噬细胞从促肿瘤极化为抗肿瘤表型的能力，进行了以下实验。从巯基乙酸盐刺激的BALB/c小鼠的腹膜腔中收获巨噬细胞。然后用IL-4和IL-31的组合离体处理巨噬细胞。IL-4处理用于将巨噬细胞朝向促肿瘤M2表型极化(Mantovani andLocati,2013)。与IL-31共同治疗测试IL-31将巨噬细胞从促肿瘤极化为抗肿瘤表型的能力。根据该方案处理的巨噬细胞(即，与IL-4和IL-31共同处理的巨噬细胞)在下文中称为IL-31训练的巨噬细胞。随后将IL-31训练的巨噬细胞注入载有EMT6乳腺癌肿瘤的小鼠，并随时间监测肿瘤的生长。图3A表明，与未注射巨噬细胞的对照小鼠相比，施用IL-31训练的巨噬细胞的小鼠的肿瘤生长速率显著降低。在第26天，巨噬细胞处理的小鼠的肿瘤比未处理的小鼠的肿瘤小～3倍。此外，相对于未经处理的小鼠，接受IL-31训练的巨噬细胞的小鼠具有14天的生存获益(图3B)。数据证明了过继转移的IL-31训练的巨噬细胞的治疗效果。

参考文献

Andreesen R,Scheibenbogen C,Brugger W,Krause S,Meerpohl HG,Leser HG,Engler H,Lohr GW:Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generatedin vitro from circulating blood monocytes:a new approach to cancerimmunotherapy.Cancer research 1990,50(23):7450-7456.

Beatty GL,O'Hara M:Chimeric antigen receptor-modified T cells for thetreatment of solid tumors:Defining the challenges and next steps.PharmacolTher 2016,166:30-39.

Cornelissen C,Brans R,Czaja K,Skazik C,Marquardt Y,Zwadlo-KlarwasserG,Kim A,Bickers DR,Luscher-Firzlaff J,Luscher B et al:Ultraviolet B radiationand reactive oxygen species modulate interleukin-31expression in Tlymphocytes,monocytes and dendritic cells.Br J Dermatol 2011,165(5):966-975.

Dambacher,J.,Beigel,F.,Seiderer,J.,Haller,D.,Goke,B.,Auernhammer,C.J.,and Brand,S.(2007).Interleukin 31mediates MAP kinase and STAT1/3activation in intestinal epithelial cells and its expression is upregulatedin inflammatory bowel disease.Gut 56,1257-1265.

Davidi,S.,Fremder,E.,Kan,T.,Raviv,Z.,Timaner,M.,Karin,N.,Hershkovitz,D.,Arohneim,A.,and Shaked,Y.(2017).The antiangiogenic role of the pro-inflammatory cytokine interleukin-31.Oncotarget 8,16430-16444.

Dillon,S.R.,Sprecher,C.,Hammond,A.,Bilsborough,J.,Rosenfeld-Franklin,M.,Presnell,S.R.,Haugen,H.S.,Maurer,M.,Harder,B.,Johnston,J.,et al.(2004).Interleukin 31,a cytokine produced by activated T cells,induces dermatitisin mice.Nat Immunol 5,752-760.

Ferretti,E.,Tripodo,C.,Pagnan,G.,Guarnotta,C.,Marimpietri,D.,Corrias,M.V.,Ribatti,D.,Zupo,S.,Fraternali-Orcioni,G.,Ravetti,J.L.,et al.(2015).Theinterleukin(IL)-31/IL-31R axis contributes to tumor growth in humanfollicular lymphoma.Leukemia 29,958-967.

Fidler,I.J.(1974).Inhibition of pulmonary metastasis by intravenousinjection of specifically activated macrophages.Cancer research 34,1074-1078.

Fridman WH,Pages F,Sautes-Fridman C,Galon J:The immune contexture inhuman tumours:impact on clinical outcome.Nat Rev Cancer 2012,12(4):298-306.

Harrer,D.C.,Dorrie,J.,and Schaft,N.(2018).Chimeric Antigen Receptorsin Different Cell Types:New Vehicles Join the Race.Hum Gene Ther 29,547-558.

Hermanns,H.M.(2015).Oncostatin M and interleukin-31:Cytokines,receptors,signal transduction and physiology.Cytokine Growth Factor Rev 26,545-558.

Houot R,Schultz LM,Marabelle A,Kohrt H:T-cell-based Immunotherapy:Adoptive Cell Transfer and Checkpoint Inhibition.Cancer Immunol Res 2015,3(10):1115-1122.

Huang Y,Li D,Qin DY,Gou HF,Wei W,Wang YS,Wei YQ,Wang W:Interleukin-armed chimeric antigen receptor-modified T cells for cancerimmunotherapy.Gene Ther 2017.

Jackson,H.J.,Rafiq,S.,and Brentjens,R.J.(2016).Driving CAR T-cellsforward.Nature reviews Clinical oncology 13,370-383.

Lee,S.,Kivimae,S.,Dolor,A.,and Szoka,F.C.(2016).Macrophage-based celltherapies:The long and winding road.J Control Release 240,527-540.

Lei,Z.,Liu,G.,Huang,Q.,Lv,M.,Zu,R.,Zhang,G.M.,Feng,Z.H.,and Huang,B.(2008).SCF and IL-31 rather than IL-17 and BAFF are potential indicators inpatients with allergic asthma.Allergy 63,327-332.

Mantovani,A.,and Locati,M.(2013).Tumor-associated macrophages as aparadigm of macrophage plasticity,diversity,and polarization:lessons and openquestions.Arterioscler Thromb Vasc Biol 33,1478-1483.

Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,Chew A,GonzalezVE,Zheng Z,Lacey SF et al:Chimeric antigen receptor T cells for sustainedremissions in leukemia.N Engl J Med 2014,371(16):1507-1517.

Neis,M.M.,Peters,B.,Dreuw,A.,Wenzel,J.,Bieber,T.,Mauch,C.,Krieg,T.,Stanzel,S.,Heinrich,P.C.,Merk,H.F.,et al.(2006).Enhanced expression levels ofIL-31 correlate with IL-4 and IL-13 in atopic and allergic contactdermatitis.J Allergy Clin Immunol 118,930-937.Niyonsaba F,Ushio H,Hara M,Yokoi H,Tominaga M,Takamori K,Kajiwara N,Saito H,Nagaoka I,Ogawa H et al:Antimicrobial peptides human beta-defensins and cathelicidin LL-37induce thesecretion of a pruritogenic cytokine IL-31 by human mast cells.J Immunol2010,184(7):3526-3534.

Ohmatsu,H.,Sugaya,M.,Suga,H.,Morimura,S.,Miyagaki,T.,Kai,H.,Kagami,S.,Fujita,H.,Asano,Y.,Tada,Y.,et al.(2012).Serum IL-31 levels are increasedin patients with cutaneous T-cell lymphoma.Acta Derm Venereol 92,282-283.

Rosenberg SA,Yang JC,Sherry RM,Kammula US,Hughes MS,Phan GQ,CitrinDE,Restifo NP,Robbins PF,Wunderlich JR et al:Durable complete responses inheavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transferimmunotherapy.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 2011,17(13):4550-4557.Sambrook et al.,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY.

Wang,B.S.,Lumanglas,A.L.,and Durr,F.E.(1986).Immunotherapy of amurine lymphoma by adoptive transfer of syngeneic macrophages activated withbisantrene.Cancer research 46,503-506.

Zeng,X.,Zhang,Z.,Gao,Q.Q.,Wang,Y.Y.,Yu,X.Z.,Zhou,B.,and Xi,M.R.(2016).Clinical Significance of Serum Interleukin-31 and Interleukin-33Levels in Patients of Endometrial Cancer:A Case Control Study.Dis Markers2016,9262919.

序列表

<110> 昂科霍斯特公司

M•C•拉斯特尔

<120> IL-31改善用于癌症的基于巨噬细胞的过继性细胞疗法的功效

<130> ONCO-006 PCT

<150> 62/700,507

<151> 2018-07-19

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 164

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys

1 5 10 15

Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu

20 25 30

Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu

35 40 45

Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val

50 55 60

Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro

65 70 75 80

Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg

85 90 95

Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp

100 105 110

Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr

115 120 125

Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe

130 135 140

Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln

145 150 155 160

Gln Ala Thr Thr

<210> 2

<211> 442

<212> DNA

<213> 人

<400> 2

atggcctctc actcaggccc ctcgacgtct gtgctctttc tgttctgctg cctgggaggc 60

tggctggcct cccacacgtt gcccgtccgt ttactacgac caagtggaaa gatgtggagg 120

aagagaaggg cgtgctcgtg tcccagaatt acacgctgcc gtgtctcagc cctgacgccc 180

agccgccaaa caacatccac agcccagcca tccgggcata tctcaagaca atcagacagc 240

tagacaacaa atctgttatt gatgagatca tagagcacct cgacaaactc atatttcaag 300

atgcaccaga aacaaacatt tctgtgccaa cagacaccca tgaatgtaaa cgcttcatcc 360

tgactatttc tcaacagttt tcagagtgca tggacctcgc actaaaatca ttgacctctg 420

gagcccaaca ggccaccact ta 442

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ARG1 引物1

<400> 3

ctccaagcca aagtccttag ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ARG1 引物2

<400> 4

aggagctgtc attagggaca tc 22

<210> 5

<211> 0

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iNOS 引物1

<400> 5

000

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> iNOS 引物2

<400> 6

gtggacgggt cgatgtcac 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hsp90 引物1

<400> 7

tcgtcagagc tgatgatgaa gt 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hsp90 引物2

<400> 8

gcgtttaacc catccaactg aat 23

Claims

1.巨噬细胞，其经基因修饰以表达：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的人IL-31；或(ii)包括在SEQ IDNo.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的人IL-31的融合蛋白，其中在所述融合蛋白中，所述人IL-31附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列。

2.制备根据权利要求1的基因修饰的巨噬细胞的方法，其包括通过转导方法将编码人IL-31的核酸序列、与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的人IL-31、或其中所述IL-31附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列的所述融合蛋白引入选自单核细胞、幼稚巨噬细胞或抗肿瘤巨噬细胞的细胞群。

3.根据权利要求2所述的方法，其用于制备所述巨噬细胞，所述巨噬细胞经基因修饰以表达人IL-31，其中编码人IL-31的核酸序列通过慢病毒转导引入所述细胞。

4.包括根据权利要求1的基因修饰的巨噬细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述巨噬细胞被基因修饰以表达人IL-31。

6.根据权利要求4所述的药物组合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是原发性或转移性实体瘤。

7.根据权利要求5所述的药物组合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是原发性或转移性实体瘤。

8.巨噬细胞，其经基因修饰以表达以下两者：(i)在SEQ ID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的人IL-31，或包括在SEQID No.1中叙述的序列的人IL-31或与SEQ ID No.1中叙述的IL-31序列具有至少约70％同源性的人IL-31的融合蛋白，其中在所述融合蛋白中，所述人IL-31附接至包括IgG的免疫球蛋白氨基酸序列；和(ii)嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体被设计在免疫效应细胞中表达，使得表达所述CAR的所述巨噬细胞具有靶向的效应子活性，并且其中所述CAR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。

9.根据权利要求8所述的巨噬细胞，其中所述CAR包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞外抗原结合结构域与靶向的效应子活性引导至的靶细胞上的抗原结合，所述跨膜结构域将所述抗原结合结构域连接至细胞内结构域，和所述细胞内结构域代表所述CAR的胞质部分并负责表达所述CAR的所述巨噬细胞的活化。

10.根据权利要求9所述的巨噬细胞，其中所述CAR的所述细胞外抗原结合结构域是源自针对抗原的抗体的单链可变片段(scFv)，所述抗原包括CD19、CD22或HER2；所述CAR的所述跨膜结构域包括CD8、CD28的或CD3ζ的跨膜结构域；和所述CAR的所述细胞内结构域可以是表面受体的胞质部分、刺激或共刺激分子、或引发所述巨噬细胞中信号转导的分子，此类分子包括Megf10、FcRγ、CD3ζ的或Dectin-1的细胞内结构域。

11.包括根据权利要求8至10中任一项所述的巨噬细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。

12.根据权利要求11所述的药物组合物在生产用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是原发性或转移性实体瘤。

13.根据权利要求6-7和12中任一项所述的用途，其中所述原发性或转移性实体瘤是膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。