CN112368006A

CN112368006A - 直接饲喂微生物在预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的用途

Info

Publication number: CN112368006A
Application number: CN201980030497.2A
Authority: CN
Inventors: T·帕罗特; L·帕林
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: International N&H Denmark ApS
Priority date: 2018-03-06
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2021-02-12
Also published as: RU2020132317A; EP3762000B1; BR112020018019A2; MX2020009181A; PH12020551413A1; US20210000892A1; JP2021516258A; UA129447C2; EP3762000A1; DK3762000T3; TWI790356B; WO2019173174A1; ES2996916T3; KR20210006883A; TW201938036A; US11351207B2; CA3093251A1; JP7522046B2; KR102889175B1

Abstract

描述了用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的组合物和方法。

Description

直接饲喂微生物在预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月6日提交的美国临时专利申请号62/639,158的优先权，所述申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本领域涉及直接饲喂微生物在预防和/或治疗患有基于大肠杆菌的感染的动物中的用途。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli/E.Coli)是革兰氏阴性的杆状细菌，通常栖居于大多数哺乳动物和鸟类物种的肠道微生物群落或生态系统中。根据菌体(O)、荚膜(K)、菌毛(F)和鞭毛(H)抗原，大肠杆菌可分为150至200种血清型或血清组。大多数大肠杆菌是共生的，也就是说，它们驻留在肠中，但对宿主动物无害。只有一小部分菌株具有致病性，会产生毒力因子，使它们致病。一些大肠杆菌具有未知与疾病相关的组合毒力基因，并可能被认为具有潜在的致病性。所有大肠杆菌都可能携带对抗微生物剂具有抗性的基因。

在动物中，大肠杆菌的有毒菌株引起多种疾病，其中包括新生小牛的败血病和腹泻、奶牛的急性乳腺炎、与支原体引起的慢性呼吸道疾病有关的大肠杆菌病，其中支原体引起家禽的肝周炎、心包炎、败血性肺、腹膜炎等，以及阿拉巴马州腐烂(Alabama rot)犬病。

大肠杆菌细菌不断地通过粪便脱落到动物的直接环境中，并污染室内饲养的动物的围栏、垫料和地板以及室外动物的土壤。它们可以持续很长时间，可能超过10周，并且可以通过泥浆和粪肥撒布到施肥的田间和农作物以及地面和地表水。

大肠杆菌通过受污染的饲料、处理人员和饮用水传播给其他动物，并可能通过运输卡车等车辆在不同农场之间传播。对于鸟类，感染是通过口腔途径或通过吸入污染的粉尘而发生的。来自动物的大肠杆菌也可能通过直接接触、或摄入随粪肥散布而被污染的食物或水、或摄入被屠宰场的动物尸体污染的肉类而传播给人类。产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)引起的肠感染是年幼动物(如猪和小牛)最常见的大肠杆菌病类型，通常表现为严重的水性腹泻。它也是发展中国家的旅行者(“旅行者腹泻”)和儿童腹泻的重要原因。

猪中的ETEC通常具有传染性，在大量病猪中和几头病猪中并且一批接一批地都发现了相同的菌株。这些菌株通常在感染后仅脱落几天，这可能是由于免疫力的发展所致。

抗生素在治疗人类和动物方面的使用导致了抗微生物抗性，现在已成为全球主要的健康威胁。正在寻求开发抗生素替代品以解决该全球健康问题。因此，需要寻找新的和替代的方法来预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染。

发明内容

在一个实施例中，公开了一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的组合物，其中所述组合物包含基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)918(NRRL B-50508)、和15AP4(PTA-6507)。

在第二个实施例中，本文公开的组合物可以在动物中产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率(feed ratio)、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

在第三个实施例中，所述直接饲喂微生物呈内生孢子的形式。

在第四个实施例中，本文所述组合物中的任一种进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

在第五个实施例中，所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

在第六个实施例中，本文描述组合物中的任一种可以为饲料添加剂组合物或预混物。

在第七个实施例中，公开了包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种的饲料。

在第八个实施例中，公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种以及施用说明书。

在第九个实施例中，公开了一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的方法，所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包含直接饲喂微生物，所述直接饲喂微生物包含枯草芽孢杆菌菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。如此施用的组合物可以在动物中产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。该组合物可以包含以上或本公开中其他地方描述的任何特征。

附图说明

图1示出了膳食处理对作为肠道健康指标的紧密连接蛋白表达的影响。

具体实施方式

引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。

在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，否则适用以下定义。

在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。

术语“包括”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包括”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。

在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。

如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物可以是多胃的，例如反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

如本文所用的，术语“反刍动物”是指能够通过在消化之前在专门的胃中发酵(主要通过微生物作用)从基于植物的食物中获取营养素的哺乳动物。所述过程通常需要将发酵的摄取物(称为反刍食物)再次反刍和咀嚼。再次咀嚼反刍食物以进一步分解植物物质和刺激消化的过程叫做反刍。大约150种反刍动物物种包括家养物种和野生物种两者。反刍动物包括但不限于牛、奶牛、山羊、绵羊、长颈鹿、牦牛、鹿、麋鹿、羚羊、水牛等。

如本文所用的，术语“CFU”意指“集落形成单位”并且是代表衍生自单个祖细胞的细胞聚集的集落中的活细胞的测量。

如本文所用的，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然存在的微生物的来源。DFM可以包含一个或多个这样的天然存在的微生物，例如细菌菌株。DFM的类别包括孢子形成菌，例如芽孢杆菌属和梭菌属(Clostridium)，以及非孢子形成菌例如乳酸菌、酵母和真菌。因此，术语DFM涵盖以下中的一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母或真菌及其组合。

芽孢杆菌属是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，如热、水分和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粉和压成丸粒的饮食中。

如本文所用的术语“基于芽孢杆菌的组分”是指(i)基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物，其包含本文所述的芽孢杆菌属细菌菌株，(ii)从这些菌株制得的芽孢杆菌培养物获得的上清液，或(iii)(i)和(ii)的组合。

“饲料”和“食品”分别意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。

如本文所用的，术语“食品”以广义使用-并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。

关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。在一个优选的实施例中，所述食物或饲料供单胃动物和多胃动物食用。

如本文所用的，术语“益生菌”定义了当例如以足够数量摄取或局部施用时，有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一个或多个可证明的健康益处)的活的微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少10⁶-10¹²，优选至少10⁶-10¹⁰，优选10⁸-10⁹cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。

术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主的不可消化食物成分。

如本文所用的术语“病原体”意指任何疾病的致病物。这样的致病物可以包括但不限于细菌、病毒、真菌致病物等。

术语“基于大肠杆菌的感染”意指由大肠杆菌细菌引起的疾病或感染，例如腹泻。

术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。

术语“有效量”意指向动物施用足够量的指定组分以达到所期望的效果。

在一个实施例中，公开了一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的组合物，其中所述组合物包含基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含枯草芽孢杆菌菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。

在第二个实施例中，本文公开的组合物可以在动物中产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

本文描述的基于芽孢杆菌的DFM组分可以包含活的细菌或可以包含上清液、或是活的细菌与培养上清液的组合。优选的基于芽孢杆菌的DFM组分是活的细菌。

在一个实施例中，DFM可能是一种形成孢子的细菌菌株并且因此术语DFM可能由孢子组成或包含孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用的术语“活的细菌”可能包括细菌孢子，如内生孢子或分生孢子。可替代地，本文所述的饲料添加剂组合物中的DFM可能不由细菌孢子组成或不包含细菌孢子，例如内生孢子或分生孢子。

本文所述的基于芽孢杆菌的DFM为以下菌株的组合：

枯草芽孢杆菌菌株3BP5(登录号NRRL B-50510)、

解淀粉芽孢杆菌菌株918(ATCC登录号NRRL B-50508)、以及

解淀粉芽孢杆菌菌株1013(ATCC登录号NRRL B-50509)。

公开于2013年2月28日的WO 2013-329013中描述了菌株3BP5和1013。

公开于2005年11月17日的US 2005-0255092中描述了菌株15AP4。

在一些实施例中，重要的是基于芽孢杆菌的DFM组分具有对热的耐受性，即耐热性，例如形成孢子。当饲料被压成丸粒时尤其如此。芽孢杆菌纲能在生长不利的条件下形成稳定的内生孢子，对热、pH、水分和消毒剂有很强的抵抗力。如果细菌/DFM不是孢子形成物，那么应该保护所述细菌/DFM以使其在饲料加工中存活，如下文所述。

如本文所述的基于芽孢杆菌的组分可以作为一种或多种培养物和一种或多种载体制备(如果使用的话)，并可以将它们添加到条带或桨式混合器中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将组分混合，这样使得导致培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选地为干燥的可流动粉末。因此，基于芽孢杆菌的组分可包含：基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物，其包含本文描述的三种芽孢杆菌属细菌菌株、或获得自芽孢杆菌培养物的上清液、或一种或多种芽孢杆菌属细菌菌株和上清液这二者的组合。然后可以将此类的基于芽孢杆菌的组分添加到动物饲料或饲料预混物中。它可以添加到动物饲料的上部(“上部饲喂”)，或者可以添加到液体，例如动物的饮用水中。

在本文所述的基于芽孢杆菌的DFM中包含单个菌株的比例可以从1％到99％不等，并且优选地从25％到75％不等。

在动物饲料中如本文所述的基于芽孢杆菌的组分的适合剂量范围为约1x10³CFU/g饲料至约1x 10¹⁰CFU/g饲料，适当地在约1x 10⁴CFU/g饲料至约1x 10⁸CFU/g饲料之间，适当地在约7.5x 10⁴CFU/g饲料至约1x 10⁷CFU/g饲料之间。

本领域普通技术人员将容易地知道来自本文所述属中的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。动物饲料可以包括植物材料，如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。

术语“动物饲料”、“饲料”、和“喂养料”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料，该组包含：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。

当用作饲料(例如功能性饲料)或用于制备饲料(例如功能性饲料)时，如本文所述的基于芽孢杆菌的组分可以与以下一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，可以提及选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、偏亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在一个优选的实施例中，如本文所述的基于芽孢杆菌的组分可与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。包含如本文所述的基于芽孢杆菌的组分的饲料添加剂组合物可以与复合饲料混合，或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

如本文所用的，术语秣料(fodder)是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。

术语秣料包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩饲料和颗粒饲料、油和混合给养，并且也包括发芽谷物和豆类。

秣料可获自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、Chau moellier羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，它们包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。

合适地，如本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers DriedGrain Soluble)(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

此外，此类喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

另外或可替代地，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦，大麦，黑麦，燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获得自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。

如本文所述，饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲用植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所用的，术语饲料在一些实施例中还涵盖宠物食品。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。

在一些实施例中术语饲料还可以涵盖鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。

还涵盖在术语“饲料”中的是鸟食，其包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。

如本文所用，术语“接触”是指将饲料添加剂组合物间接或直接施用于产品(例如饲料)。可以使用的施用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。

基于芽孢杆菌的组分可以优选地与产品(例如喂养料)混合。可替代地，它可包括在喂养料的乳液或原始成分中。

对于一些应用而言，重要的是，使它在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。

可将基于芽孢杆菌的组分和受控量的基于芽孢杆菌的组分应用于散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。

本文所述的DFM可以以合适的浓度添加，例如，以提供约2x 10³CFU/g饲料至约2x10¹¹CFU/g饲料，合适地在约2x 10⁶至约1x 10¹⁰，合适地在约3.75x 10⁷CFU/g饲料至约1x10¹⁰CFU/g饲料的日剂量的最终饲料产品中的浓度添加。

优选地，基于芽孢杆菌的组分将是热稳定的以便进行高至约70℃、高至约85℃、或高至约95℃的热处理。热处理可以从约30秒高至几分钟进行。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前存在/有活性的基于芽孢杆菌的组分的至少约50％在冷却至室温之后仍存在/有活性。在一个特别优选的实施例中，将基于芽孢杆菌的组分均化，以制成粉末。

替代性地，将基于芽孢杆菌的组分配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，该文献通过引用并入本文。

在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。此类的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使储存稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响所述至少一种蛋白酶和/或包含一种或多种细菌菌株的DFM的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na₂SO₄。

含有基于芽孢杆菌的组分的饲料可以使用饲料制粒工艺生产。任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将该混合物在达到指定温度(例如从60℃-100℃)的调节器中加热，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。

关于颗粒，至少一个包衣可包含占所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个包衣可包含两个包衣。所述两个包衣可为水分水合包衣和防潮包衣。在一些实施例中，所述水分水合包衣可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮包衣可为所述颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合包衣可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮包衣可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

所述颗粒可使用饲料制粒方法制备并且所述饲料预处理方法可在70℃与95℃之间(如在85℃与95℃之前)进行长达若干分钟。

可将基于芽孢杆菌的组分配制成用于动物饲料的颗粒，其包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒过程之后，所述颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮包衣；和水分水合包衣，其为所述颗粒的至少25％w/w，所述颗粒在蒸汽加热制粒过程之前具有小于0.5的水活度。

所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮包衣并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合包衣可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述防潮包衣可为所述颗粒的2％w/w至10％w/w。

颗粒可使用蒸汽加热制粒方法制备，所述方法可在85℃至95℃进行高至若干分钟。

可替代地，所述组合物处于适合于消耗的液体制剂中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。

此外，可通过将基于芽孢杆菌的组分施用(例如喷涂)于载体底物(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，包含如本文所述的基于芽孢杆菌的组分的此类饲料添加剂组合物可以配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施例中，如本文所述的此类基于芽孢杆菌的组分可以配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

应当理解，如本文所公开的基于芽孢杆菌的组分适合用于添加至任何适当的饲料材料中。

如本文所用的，术语饲料材料是指由动物消费的基础饲料材料。进一步应当理解，饲料材料可以包括例如至少一种或多种未加工的谷物和/或加工过的植物和/或动物材料，如大豆粉或骨粉。

技术人员应当理解，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养所述动物的目的。

优选地，喂养料可包含如下饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、水稻、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的组分，如大豆粉、油菜籽粉、低芥酸菜籽粉、棉籽粉、向日葵籽粉、动物副产物粉及其混合物。更优选地，喂养料可包括动物脂肪和/或植物油。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。优选地，喂养料为玉米大豆粉混合物。

在另一个方面，提供了用于生产喂养料的方法。喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

喂养料可为单胃动物的喂养料，诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭子、鹅、水禽)、生猪(所有年龄段)、宠物(例如狗、猫)或鱼，优选地，喂养料为家禽的喂养料。

本文所述的基于芽孢杆菌的组分可置于动物饲料的上部，即上部饲喂。可替代地，可以将本文所述的基于芽孢杆菌的组分添加到液体中，例如动物的饮用水中。

如本文所用的，术语“接触”是指间接或直接将如本文所述的基于芽孢杆菌的组分施用到产品(例如饲料)中。

可以使用的施用方法的实例包括但不限于：在包含基于芽孢杆菌的组分的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物-如本文所述的基于芽孢杆菌的组分与产品混合而直接施用、将此类的饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。在一个实施例中，优选地将如本文所述的饲料添加剂组合物-基于芽孢杆菌的组分与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。这允许所述组合物赋予性能益处。

制备如本文所述的基于芽孢杆菌的组分的方法还可包括使粉末制粒的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸粒。

任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。

喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

如上所述，基于芽孢杆菌的组分和/或包含其的喂养料可以以任何合适的形式使用。它能以固体或液体制剂或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。

一种基于芽孢杆菌的组分，包括将如本文所述的基于芽孢杆菌的组分与饲料可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合，和(任选地)包装。

可使喂养料和/或基于芽孢杆菌的组分与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。由此衍生的组合物可在本文中称为预混物。该喂养料可包含按重量计至少0.0001％的基于芽孢杆菌的组分。合适地，喂养料可以包含按重量计至少0.0005％、至少0.0010％、至少0.0020％、至少0.0025％、至少0.0050％、至少0.0100％、至少0.020％、至少0.100％、至少0.200％、至少0.250％、至少0.500％的基于芽孢杆菌的组分。

优选地，食物或基于芽孢杆菌的组分可以进一步包含至少一种生理学上可接受的载体。所述生理学上可接受的载体优选地选自以下中的至少一者：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石、PVA、及其混合物。在一个另外的实施例中，所述食物或饲料可还包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂可选自EDTA或柠檬酸。

在一个实施例中，可以将如本文所述的基于芽孢杆菌的组分(无论是否包入胶囊内)与至少一种生理学上可接受的载体一起配制，该载体选自以下各项中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

在一些实施例中，如本文所述的基于芽孢杆菌的组分将处于生理学上可接受的载体中。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。治疗性组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质)可以存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制成用于被患者摄取的片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和混悬剂。一旦配制，可以直接向受试者施用。待治疗的受试者可以是动物。

据信，本文公开的组合物可以在动物中产生一种或多种性能益处(即，动物性能)，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。

“改善的动物性能”是指与不包含本文公开的组合物的饲料或饲料添加剂组合物相比，存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率、和/或改善的肠屏障完整性、和/或降低的死亡率、和/或减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率。如本文所用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。

“增加的饲料效率”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量中增重增加。

如本文所用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于当所述饲料不包含本文公开的饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。

肠道完整性和微生物群似乎有助于维持肠道健康。支持肠屏障有助于降低感染和炎症的风险。例如，紧密连接是两个细胞紧密结合的区域，它们的膜结合在一起，形成了实际上不能渗透流体的屏障。保护紧密连接完整性的能力可以改善动物的健康。还需要维持紧密连接，以避免“肠渗漏”，肠渗漏可能导致进一步的细胞损伤。因此，期望通过帮助或提高动物维持良好调节的屏障功能的能力来改善肠道完整性，所述屏障功能阻止细菌无意地进入动物体内)。

紧密连接，也称为闭锁连接，是两个细胞的紧密结合区域，它们的膜结合在一起，形成了实际上不能渗透流体的屏障。在肠道健康的背景下，紧密连接是可导致肠道完整性好坏的、肠道上皮细胞之间的通道。当存在良好的肠道完整性时，紧密连接蛋白(例如密封蛋白(Claudin)3和闭锁蛋白(Occludin))会在两个上皮细胞之间以较高的水平表达，有助于提供一个屏障，所述屏障阻止病原体从肠腔向体循环中转移(降低渗透性)。密封蛋白是紧密连接蛋白最重要的家族，claudin 3是编码这些紧密连接蛋白的基因之一。闭锁蛋白是另一种重要的紧密连接蛋白。密封蛋白和闭锁蛋白是最早鉴定出的紧密连接整合膜蛋白。紧密连接蛋白RNA的测量可以作为屏障完整性和肠道健康的指标，因为如果在动物的胃肠道中不维持紧密连接，则可能导致渗透性，这可能允许病原体和毒素从肠腔中转移进入体循环，并因此损害动物健康，或甚至导致动物死亡(例如败血症)。

通过使用本文教导的组合物而减少的大肠杆菌在粪便中的脱落可以减少基于大肠杆菌的感染的进一步扩散，并且还改善动物性能。

如本文所用的营养素消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养素的比率。营养素消化率可测量为所施用至受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或施用至受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。

如本文所用的，营养素消化率可以测量为通过一段时间内营养素摄入量与通过排泄物完全收集而得出的营养素的排出量之间的差异；或通过使用惰性标记来测量，其中所述惰性标记不被动物吸收并允许研究者可计算在整个胃肠道或胃肠道的一部分消失的营养素的量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。

如本文所用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如本文所用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。

在一些实施例中，本文所述的组合物可提高受试者对膳食半纤维素或纤维的消化率或利用率。

如本文所用的术语存活率意指存活的受试者人数。术语“改善的生存率”是“降低的死亡率”的另一种说法。

“增加的增重”是指与饲喂不含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含饲料添加剂组合物的饲料时动物体重增加。

本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：

1.一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的组合物，其中所述组合物基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含芽孢杆菌属菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌菌株918(NRRL B-50508)、和15AP4(PTA-6507)，单独或与衍生自这些菌株的培养上清液组合使用。

2.如实施例1所述的组合物，其中所述组合物产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

3.如实施例1或2所述的组合物，其中所述直接饲喂微生物呈内生孢子的形式。

4.如实施例1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

5.如实施例3所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

6.如实施例4所述的组合物，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

7.如实施例1、2、5或6所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

8.如实施例3所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

9.如实施例4所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

10.一种饲料，所述饲料包含如实施例7所述的饲料添加剂组合物。

11.一种饲料，所述饲料包含如实施例8或9所述的饲料添加剂组合物。

12.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施例7所述的饲料添加剂组合物以及施用说明书。

13.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施例8或9所述的饲料添加剂组合物以及施用说明书。

14.一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的方法，所述方法包括施用有效量的组合物，所述组合物包含基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含枯草芽孢杆菌菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌菌株918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。

15.如实施例14所述的方法，其中所述组合物产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

16.如实施例14或15所述的方法，其中所述直接饲喂微生物呈内生孢子的形式。

17.如实施例14或15所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

18.如实施例16所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

19.如实施例17所述的方法，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

20.如实施例18所述的方法，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

21.如实施例14、15、19和20所述的方法，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

22.如实施例16所述的方法，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

实例

除非在本文中另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wileyand Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，所述实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

实例1

三株基于芽孢杆菌属的直接饲喂微生物(芽孢杆菌属菌株3BP5、918、15AP4)对用F18产肠毒素大肠杆菌激发的断奶仔猪的生长性能、粪便大肠杆菌脱落评分和肠屏障功能的影响材料与方法

居住和环境

动物和实验方案的使用已获得动物实验委员会的批准。根据NRC(2012)的建议，饲喂的基础饮食应配制为平衡能量和蛋白质，并满足或超过该年龄段猪生长的营养需求(表1)。

基础饮食分为几部分，然后用表1鉴定的直接饲喂微生物(DFM)处理。在饲料混合过程中，冲洗混合器以防止饮食的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每种处理饮食中收集样品，并且一起混合用于饲料中DFM计数。混合期间收集每种处理饮食的样品，并保存在-20℃下直至需要。

表1：醪液形式的猪的基础饮食组合物实例(按饲喂百分比)

¹在一个阶段以醪液形式提供的膳食处理

²FTU-植酸酶单位

³SID-标准化回肠消化率

⁴STTD-标准化总消化道消化率

表2：实验饮食鉴定

¹2种芽孢杆菌属菌株：芽孢杆菌属菌株B22和15AP4

²3种芽孢杆菌属菌株：芽孢杆菌属菌株3BP5、918和15AP4

实验设计

在为期17天的实验中，总共使用了72头刚断奶的混合性别(阉公猪和母猪各50％)的仔猪，体重6.44±0.64kg。每头仔猪都经过基因测试，以确保对F18大肠杆菌的敏感性。将猪分别称重，按体重分区，并将区内的猪随机分配给4种膳食处理之一。每个围栏养两只猪，并且根据它们的激发状况，将其关在2个单独房间中的1个中；1个较小的房间，用于18头未激发的对照猪(9个围栏；PC处理)，另一个较大的房间，用于54头激发的猪(27个围栏；9个围栏/对于NC、NC+DFM1和NC+DFM2的处理)。所有的猪都饲养在一个环境受控的房间里。每个围栏都配备有一个单侧不锈钢自动喂食器和一个乳头式饮水器，允许猪任意取食和饮水。

实验进行了17天。它包括7天的饮食适应期，然后是10天的激发期。在断奶后第7天(研究的第7天)，使NC、NC+DFM1和NC+DFM2处理组中的猪口服地感染有F18产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。PC处理组未被大肠杆菌激发。

生长性能以及粪便样本收集与分析

在第0、7和17天(试验结束)测量体重和饲料消耗，以监测平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、以及增重与饲料收益率(G:)。在第7天(即将激发前)和感染后天数(dpi)1、2、3、4、5、6 7和10时收集粪便拭子，以评估大肠杆菌的脱落。粪便评分是在每天的基础上，以盲评的方式，使用以下等级进行目测排名：1＝固体；2＝半固体；3＝半液体；4＝液体。

在dpi 10(研究的最后一天)时，每个围栏的一头猪通过电击晕而处死，然后放血以收集以下组织：新鲜且固定的回肠和结肠段、以及回肠和结肠消化液。通过PCR分析回肠组织段，以确定影响紧密连接(肠道)完整性的紧密连接蛋白的RNA表达。

将初始体重作为协变量，使用PROC MIXED(SAS 9.4)分析生长性能数据。在PROCGLIMMIX中，将时程数据作为重复测量进行分析。

结果

生长性能：在7天的适应期内，四种处理中的ADG、ADFI或G:F没有显著差异(P>0.10)。但是，用NC+DFM2处理的体重增重在数值上大于所有其他处理。在研究的前7天中，采用NC+DFM2饮食的猪增重0.781kg(最终重量-初始重量)，而采用PC、NC和NC+DFM1饮食的猪分别增重0.239、0.188和0.365kg(表3)。

这意味着在膳食适应的前7天中，饲喂NC+DFM2饮食的猪的ADG和G:F也比所有其他处理要高(表3)。

表3.膳食处理对1周适应期间(研究的第0-7天)猪生长性能的影响的最小二乘方平均值

在10天的激发期后(研究的第8-17天)，与PC相比，采用NC、NC+DFM1和NC+DFM2处理的猪具有较低的最终BW(P＝0.002)、较低的ADG(P<.0001)和较低的ADFI(P＝0.002)(表4)。这是成功的大肠杆菌激发的预期结果。但是，与对照相比，只有NC和NC+DFM1处理组具有较低的G:F。

NC+DFM2猪具有中等G:F，其比NC高19％(0.647相对于0.542)，并且在统计学上与PC相似(表4)。

饲喂DFM2的猪在10天激发期内增重2.477kg，而饲喂NC或NC+DFM1的猪分别仅增重2.312和1.881kg(表4)。

表4.膳食处理对10天激发期内(研究的第8-17天)猪生长性能的影响的最小二乘方平均值

大肠杆菌脱落评分：总体而言，如预期的那样，PC处理的大肠杆菌脱落评分(SS)低于激发处理(P<.0.01，表6)。与NC相比，NC+DFM2处理在2dpi时使SS增加(P＝0.04)，但在7dpi时使SS降低(P＝0.003)(表5)。在dpi 5和10时，相对于NC，NC+DFM2在数值上降低了SS(表5)。

总体而言，与NC相比，NC+DFM1和NC+DFM2在数值上减少了大肠杆菌粪便脱落(分别为1.96和2.03，相对于2.12；表6)。

表5.感染后每天膳食处理对ETEC脱落¹的影响

¹ETEC脱落评分系统：0＝负数，1＝第1部分的增长，2＝第2部分的增长，3＝第3部分的增长，4＝第4部分的增长

²对比：1)PC相对于NC，2)NC相对于NC+DFM1，3)NC相对于NC+DFM2

表6.在整个10天激发期膳食处理对ETEC脱落的影响

粪便评分：如预期的那样，从感染后第3天到8dpi，PC的粪便评分(FS)比NC低(P<.0001，表7)。饲喂NC+DFM2的猪在2dpi时的FS比NC猪高；但是，在dpi 7时，DFM 2猪的FS低于NC猪(P<0.10；表7)。

而且，在dpi 4-10时，饲喂DFM2的猪的FS在数值上低于饲喂NC的猪。在任何dpi时，DFM1与NC相比均未显著降低FS(表7)。

表7.感染后每天膳食处理对粪便评分¹的影响

¹粪便评分系统：0＝正常，1＝半固体，2＝轻度腹泻3＝严重腹泻

²对比：1)PC相对于NC，2)NC相对于DFM1，3)NC相对于DFM2

紧密连接蛋白RNA表达(肠道完整性)：

紧密连接，也称为闭锁连接，是两个细胞的紧密结合区域，它们的膜结合在一起，形成了实际上不能渗透流体的屏障。在肠道健康的背景下，紧密连接是可导致肠道完整性好坏的、肠道上皮细胞之间的通道。当存在良好的肠道完整性时，紧密连接蛋白(例如密封蛋白3和闭锁蛋白)会在两个上皮细胞之间表达，有助于提供一个屏障，所述屏障阻止病原体从肠腔向体循环中转移。密封蛋白是紧密连接蛋白最重要的家族，claudin 3是编码这些紧密连接蛋白的基因之一。闭锁蛋白是另一种重要的紧密连接蛋白。密封蛋白和闭锁蛋白是最早鉴定出的紧密连接整合膜蛋白。紧密连接蛋白RNA的测量可以作为屏障完整性和肠道健康的指标，因为如果在动物的胃肠道中不维持紧密连接，则可能导致渗透性，这可能允许病原体和毒素从肠腔中转移进入体循环，并因此包含动物健康，或甚至导致动物死亡。

在实验中发现，膳食处理对紧密连接蛋白密封蛋白3的RNA表达没有显著影响；但是，PC在数值上高于NC和NC+DFM1(0.982，分别相对于0.638和0.648；图1)。但是，NC+DFM2显示密封蛋白3的RNA表达在数值上与PC相似(0.945相对于0.982；图1)。

处理(即DFM1或DFM2)对紧密连接蛋白闭锁蛋白的RNA表达有显著影响，因此NC和NC+DFM1的闭锁蛋白表达低于PC，但NC+DFM2的闭锁蛋白表达处于PC和NC中间(P＝0.045)。P值显示了各处理之间的总体差异，如图1所示。

Claims

1.一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的组合物，其中所述组合物基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株918(NRRLB-50508)和15AP4(PTA-6507)，单独或与衍生自这些菌株的培养上清液组合使用。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述直接饲喂微生物呈内生孢子的形式。

4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

5.如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

7.如权利要求1、2、5或6所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

8.如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

9.如权利要求4所述的组合物，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

10.一种饲料，所述饲料包含如权利要求7所述的饲料添加剂组合物。

11.一种饲料，所述饲料包含如权利要求8或9所述的饲料添加剂组合物。

12.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求7所述的饲料添加剂组合物以及施用说明书。

13.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求8或9所述的饲料添加剂组合物以及施用说明书。

14.一种用于预防和/或治疗动物中基于大肠杆菌的感染的方法，所述方法包含施用有效量的组合物，所述组合物包含基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物组分，所述组分包含枯草芽孢杆菌菌株3BP5(NRRL B-50510)；解淀粉芽孢杆菌918(NRRL B-50508)和15AP4(PTA-6507)。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述组合物产生一种或多种性能益处，所述性能益处选自由以下组成的组：增加的体重增重、增加的饲养收益率、改善的肠屏障完整性、降低的死亡率和减少的大肠杆菌在粪便中的脱落。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述直接饲喂微生物呈内生孢子的形式。

17.如权利要求14或15所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种酶，所述酶任选地可以被包入胶囊内。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述至少一种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。

21.如权利要求14、15、19和20所述的方法，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

22.如权利要求16所述的方法，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。

23.如权利要求17所述的方法，其中所述组合物为饲料添加剂组合物或预混物。