CN1122368A - 造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外扩增造血干细胞和祖细胞，特别是巨核细胞及其祖细胞的方法，可以单独使用人血小板第四因子(简称PF4)或藻类多糖(简称ZD)和一些造血细胞生长因子相继或同时联合使用，扩增的造血干细胞和祖细胞制剂，可冻存建立造血干细胞和祖细胞库，用于治疗细胞供者本人或其他人在患血细胞特别是血小板减少症，各种骨髓移植适应症时输注或移植，采用本发明方法涉及的人PF4和ZD制作成药物，可用于体内扩增血细胞达到治疗目的。
Description
本发明涉及一种新的扩增造血干、祖细胞，主要是巨核细胞及其祖细胞的方法，联合相继应用血小板第四因子(Plateletfactor4，简称PF4)、造血细胞生长因子以及能调节血细胞生长因子活性的藻类多糖物质。
已知造血多能干细胞在一定的条件下，如在不同的造血细胞生长因子的刺激下能向粒单细胞、红细胞或巨核细胞祖细胞分化，进一步增殖产生成熟的白细胞、红细胞或巨核细胞。每个巨核细胞又能产生数千个有功能的血小板。
造血干细胞分化增殖产生成熟的血细胞这一复杂的细胞和生物学过程称造血发生(Hematopoiesis)。而造血干细胞分化成为巨核细胞祖细胞，再增殖产生巨核细胞，后者进一步成熟产生血小板，这一细胞和生物学过程称巨核细胞生成(Megakaryocytopoiesis)(韩忠朝等，中华血液学杂志，14：159-161，1993)。
已知不少因子如白介素(Interleukin或IL)3，6，11，粒单细胞集落形成刺激因子(GM-CSF)，干细胞因子(SCF)和红细胞生成素(EPO)能对巨核细胞生成这一过程起调节作用，但一些在体外有一定刺激作用的因子在体内却没有作用或作用甚微(Han等，Int J Hemnatol，54：3-14，1991)。已知再生障碍性贫血(再障)病人或动物血清中含有多种造血细胞生长因子如SCF、EPO、GM—CSF、IL6、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)和成纤维细胞生长因子(FGF)，对造血干细胞和祖细胞有明显的刺激作用。此外还含有对巨核细胞和血小板的生长有特异性刺激作用的因子。目前已经纯化分离和分子克隆出二种因子，一种是c-Mpl ligandthrombopoietin/MK-CSF(血小板生成素/巨核细胞集落形成刺激因子)，对巨核细胞和血小板生成有明显刺激作用(Sauvage etal，Nature369：533-538，1994；Kaushansky et al，Nature369：568-571，1994)，另一种是发明者从再障病人的尿中纯化分离出一种新的造血细胞生长因子——巨核细胞生成素(MPO)，它对巨核细胞的生长和血小板生成也有明显刺激作用。
在正常情况下，造血干细胞和祖细胞主要存在于骨髓中，新生儿脐带血中含量也很丰富，成人末梢血则含量甚微。骨髓和脐带血都可用作造血干祖细胞的来源。但是每个脐带所含的血中和每次可采集的骨髓中含有的造血干祖细胞的绝对数较低，不能满足移植的需要。根据一些资料统计，每个脐带所含的血量平均为100ml，可分离40×107单个核细胞，约2-5×104粒单细胞集落形成单位(CFU-GM)。如模拟体内条件(EX VIV0)进行体外扩增可以使造血干祖细胞的数量增加几倍到几十倍。这些细胞可以供移植需要，也可长期冻存，建立造血干细胞库。这些细胞输入体内，可很快分化增殖形成成熟血细胞，因此可以治疗各种血细胞减少症，也可移植给骨髓衰竭病人，重建其造血功能。
目前进行造血干祖细胞EX VIVO扩增的方法主要为分离采集脐带血或骨髓单个核细胞或CD34+细胞，然后体外培养，加入一种或多种血细胞生长因子去刺激干细胞向祖细胞分化，使祖细胞的数量在一定时间内明显增多。最常用的因子有IL1、IL3、IL6、SCF、GM-CSF、G-CSF和EPO。这些方法能扩增CFU-GM和暴式红细胞集落形成单位(BFU-E)，对于细胞也有作用，但对巨核细胞祖细胞的作用有限。最近的资料进一步表明脐带血单个核细胞移植后的血小板恢复较慢。因此新的祖细胞扩增和采集方法为脐带血或骨髓的移植所必需。
为此，本发明目的是提供一种体外扩增和大量制备人和动物造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的方法，是在培养条件中加入人血小板第四因子和(或)藻类多糖，或与造血细胞生长因子联合相继或同时使用。
本发明涉及的方法明显优于已知的方法，其主要特征之一是PF4的应用。PF4是造血细胞特别是巨核细胞祖细胞的生长抑制因子。将PF4加到人骨髓细胞培养中能显著抑制巨核细胞祖细胞(CFU-MK)，粒单细胞祖细胞(CFU-GM)以及混合集落形成细胞(mCFU-MK)的生长(HAN等，Blood，76：1234-1239，1990；Br JHaematol，81：1-5，1992)，但对高增殖多能造血干细胞(HPP-CFS)的生长没有抑制作用(Har，J Lab&Clin Med，123：610-6，1994)。本发明用人血小板中纯化的或基因重组的PF4，并采用FACS(流式细胞分析仪)分析PF4对细胞生长周期的作用，观察到PF4能阻止细胞进入G2/M期，并使增殖细胞寿命延长。经PF4孵育的巨核细胞株细胞洗涤后重新种植到富含造血生长因子的培养基中，能很快增殖使细胞数显著增多。同样，经PF4孵育3-6天的骨髓细胞洗涤后重新种植到富含造血生长因子的培养基中，能使集落形成显著增多。这些结果证实PF4对造血细胞生长的抑制是可逆非细胞毒的，其作用主要是延缓细胞增殖。
本发明的另一特征是藻类多糖的使用。藻类多糖是从海洋藻类中分离出来的粘多糖样物质。实验证明，低浓度的海洋藻类在有血清，特别是再障血清时，对巨核细胞生长有明显的刺激作用。海洋藻类还能中和PF4和转移生长因子β1(TGFβ1)对巨核细胞生长的抑制作用。此外，藻类多糖并能增强MPO，IL6和FGF刺激巨核细胞生长的活性，与GM-CSF和EPO分别合用能协同刺激CFU-GM和BFU-E的生长。用藻类多糖作原料生产的药物藻酸双脂钠也具有类似作用。
将藻酸双脂钠注射入小鼠体内，每天一次共注射5天，便能使小鼠骨髓中巨核细胞和末梢血中血小板数量增加。如与IL6合用，这一促巨核细胞-血小板生长的作用更为明显。综上所述，藻类多糖实为一种新的促巨核细胞-血小板生长的物质。以藻类多糖单独或复合一些生长因子而制备的药品可用于治疗血小板减少症和其它血细胞减少症。
本发明的另一特征是使用脐带血清或再障血清替代造血细胞生长因子去扩增造血干、祖细胞。由于造血细胞生长因子价格高昂且来源有限，因此价格低廉的造血细胞生长因子替代物的使用更为实用。脐带血通常为遗弃物。需接受干细胞移植的病人如再障或白血病化疗后移植前均有血细胞减少，故其血清含较高的造血细胞生长刺激活性，特别是受体血清的使用还可减少免疫反应和移植排斥现象。本发明的实验证实脐带血清和再障病人血清具有造血细胞生长因子同样甚至更明显的扩增作用。藻类多糖与再障血清，或与MPO、IL6、IL3、GM-CSF、FGF、EPO和SCF一起加到骨髓细胞培养中，能使这些因子刺激细胞集落形成的活性进一步增高。这些可通过流式细胞仪分析发现人CD34阳性细胞数目、骨髓和脐带血造血细胞集落形成分析来证实。
本发明的又一特征是PF4、造血细胞生长因子(或脐带血清和再障血清)以及藻类多糖的先后有机结合使用。其原理是将骨髓或脐带血细胞与含有PF4和脐带血清或再障血清的培养液孵育3-6天，促使早期干细胞向祖细胞分化增殖，阻止祖细胞进入G2/M期进行分裂增殖，并加速原已丧失增殖能力的细胞成熟死亡，从而使造血干细胞和祖细胞的比例和绝对数值大大增高。细胞然后经含藻类多糖的培养液洗涤，去除PF4，再种植到富含造血细胞生长因子(或脐带血清和再障血清)以及藻类多糖的培养液中培养扩增，从而获得大量的造血干细胞和祖细胞。根据所给造血细胞生长因子的不同，可定向扩增不同的造血干细胞和祖细胞，还可以从中扩增和分离浓缩巨核细胞-血小板。
本发明用下列实施例进一步说明，但并不限制本发明范围：
例1，人红白细胞白血病(HEL)是一种具有巨核细胞特征白血病，PF4能抑制HEL的生长(Han et al，J Lab&Clin Med，120：1992)。将纯化的人PF4(5μg)加到HEL培养体系中培养3天，然后用FACS观察PF4对细胞周期的作用。结果显示PF4延长细胞S期时间，使进入G2/M期的细胞明显减少，说明PF4的作用是阻止细胞进入分裂(表1)。采用基因重组的人PF4作上述试验，得出的结果相似(结果未列入)。
表1，人血小板因子4(PF4)对细胞周期的作用
| 细胞经48小时液体培养 | 加PF4(5μg/毫升)孵育 | 不加PF4孵育 |
| 细胞数量增加 | 1.98倍 | 3.24倍 |
| 细胞倍增时间(小时) | 35 | 26 |
| 细胞各时期百分数G1：S：G2/M： | 48.845.55.7 | 59.429.111.5 |
| 细胞各时期所需时间(小时)G1：S：G2/M： | 16.915.82 | 15.57.63 |
例2，将人PF4、TGFβ1和藻类多糖(ZD)分别与Balb/c小鼠的骨髓细胞(2×105/ml)一起加到含10％人再障血清的血浆凝块培养体系中培养10天，然后按Han et al的方法(Br J Haematol，81：1-5，1992)，鉴别各类祖细胞数量。表2显示PF4和TGFβ1对CFU-GM、CFU-MK和BFU-E有抑制作用，对HPP-CFC没作用。它们的抑制作用能被从海带中分离的藻类多糖物质(ZD)的同时加入所中和。ZD本身对CFU-MK的生长也有刺激作用。
表2，人PF4和TGFβ1对造血祖细胞生长的作用
结果以均数＋标准差表示。符号*和#分别表示P＜0.01和P＜0.05。统计分析采用Student′st检验。
| 因子 浓度(/ml) | HPP-CFC | CFU-MK | CFU-GM | BFU-E |
| 无 | 6±1/105细胞 | 52±8/105细胞 | 49±6/105细胞 | 16±2/105细胞 |
| PF4 5μg | 7±1/105细胞 | 14±3/105细胞* | 28±4/105细胞# | 9±1/105细胞# |
| TGF－β1 1μg | 7±0.8/105细胞 | 12±2/105细胞* | 11±2/105细胞# | 4±1/105细胞* |
| ZD 5μg | 6±0.5/105细胞 | 78±9/105细胞* | 56±5/105细胞 | 18±2/105细胞 |
| PF4＋ZD | 7±1/105细胞 | 54±11/105细胞 | 53±5/105细胞 | 14±1/105细胞 |
| TGF－β1＋ZD | 5±1/105细胞 | 52±8/105细胞 | 46±3/105细胞 | 13±2/105细胞 |
例3，藻类多糖(ZD)除单独能刺激CFU-MK生长外，还能在体外与MPO、IL6和bFGF起协同刺激作用，促进巨核细胞集落的形成，还与GM-CSF或EPO协同刺激CFU-GM或BFU-E的生长。表3显示ZD单独或与生长因子联合对造血干细胞和祖细胞生长的作用。
表3，藻类多糖(ZD)单独或与生长因子联合对造血干细胞和祖细胞生长的作用
| 浓度(/ml) | CFU-MK | CFU-GM | BFU-E |
| ZD 00.1μg1μg#10μg100μg | 7±121±3#29±3*27±2*25±3* | 15±217±313±218±315±2 | 00000 |
| MPO 1μg | 35±4 | 18±2 | 1±0.7 |
| ZD＋MPO | 72±4# | 21±3 | 2±1 |
| IL6 20ng | 18±2 | 20±2 | 0 |
| ZD＋IL6 | 38±3# | 24±3 | 2±1 |
| GM－CSF 10ng | 22±4 | 45±3 | 0 |
| ZD＋GM－CSF | 23±3 | 78±3# | 0 |
| EPO 1U | 19±3 | 17±3 | 37±3 |
| ZD＋EPO | 25±3 | 19±3 | 68±4# |
例4，将藻酸双脂钠注射到不同组的Balb/c小鼠(250g/只)体内，每组至少5只小鼠。剂量为1-50μg/次，每天两次，连续注射6天，然后检测其骨髓造血干细胞和血液中血小板的数量。其结果见下表4：
*该符号表示与剂量0组比较，P＜0.05。
| 藻酸双脂钠剂量(μg/次) | 巨核细胞数±103/股骨 | 巨核细胞祖细胞数×103/股骨 | 粒细胞祖细胞数×103/股骨 | 白细胞数×109/升 | 血红蛋白克/100毫升 | 血小板数×109/升 |
| 0 | 5.3±0.3 | 1.5±0.1 | 2.5±0.2 | 3.2±0.3 | 14.0±0.5 | 890±58 |
| 1 | 6.2±0.5* | 2.5±0.2 | 2.6±0.3 | 2.9±0.4 | 14.2±0.4 | 966±78 |
| 10 | 6.9±0.7* | 3.1±0.5* | 2.7±0.2 | 3.2±0.6 | 14.1±0.5 | 1120±82* |
| 50 | 6.8±0.5* | 2.9±0.4* | 2.6±0.3 | 3.3±0.5 | 14.5±0.7 | 1050±76* |
本实验用的藻酸双脂钠系青岛第三制药厂生产的藻酸双脂钠注射液。此药主要用于抗凝、隆血脂、改善微循环，剂量1-3mg/kg体重量/日。本实验证明低剂量藻酸双脂钠可升高巨核细胞和血小板的数量。
例5，经人PF4孵育24小时的骨髓细胞经含藻类多糖物质的培养液二次洗涤后，骨髓细胞再种植到血浆凝块培养体系中。结果发现其干、祖细胞的生长不再明显受到抑制(表5)，说明藻类多糖有能中和PF4的作用。
例6，将每公斤150毫克的5-fluorouracil注入Balb/c小鼠，注射后第六天，小鼠出现骨髓衰竭，此时将采集的骨髓细胞，与PF4孵育48小时，然后将孵育后的细胞重新种植到含干细胞因子或IL3加IL6的血浆凝块培养体系中培养12天，然后检测各类造血细胞集落数量，发现PF4孵育后被干细胞因子或IL3加IL6刺激生长的造血细胞集落数量明显增高。这些结果表明PF4的孵育能增高干细胞的数量(表6)。
例7，将脐带血单个核细胞(2×105细胞/毫升)加到含10-4M的2-巯基乙醇和1％牛血清白蛋白的α-培养液中，再加10％体积的再障血清、脐带血清以及藻类多糖和细胞生长因子培养6天，然后用FACS检测CD34+细胞的百分率。另一实验是将脐带血单个核细胞加到含不同因子来源的血浆凝块中培养12天，然后检测CFU-州、CFU-MK和BFU-E的数量。结果见表7，发现脐带血清具有再障血清以及五种因子组合的类似活性。藻类多糖的添加使它们的活性进一步增高。
表5，藻类多糖物质(ZD)对PF4的作用
| HPP-CFC | CFU-MK | CFU-GK | BFU-E | |
| 未与因子孵育的骨髓细胞 | 4±1/105细胞 | 25±4/105细胞 | 32±6/105细胞 | 24±3/105细胞 |
| 未与因子孵育的骨髓细胞＋ZD洗涤 | 5±1/105细胞 | 32±3/105细胞 | 34±4/105细胞 | 28±3/105细胞 |
| PF4孵育的骨髓细胞 | 6±2/105细胞 | 13±2/105细胞# | 19±3/105细胞# | 14±2/105细胞# |
| PF4孵育的骨髓细胞＋ZD洗涤 | 5±2/105细胞 | 2.7±2/105细胞 | 33±4/105细胞 | 23±3/105细胞 |
表6，PF4孵育对造血细胞集落生长的作用
| 骨髓细胞 生长因子 | HPP-CFC | CFU-MK | CFU-GK |
| 未与因子孵育的骨髓细胞 IL3＋IL6 | 7±2/105细胞 | 34±3/105细胞 | 44±7/105细胞 |
| 未与因子孵育的骨髓细胞 SCF | 14±3/105细胞 | 14±2/105细胞 | 18±3/105细胞 |
| PF4孵育的骨髓细胞# IL3＋IL6 | 38±2/105细胞* | 56±2/105细胞* | 54±4/105细胞# |
| PF4孵育的骨髓细胞# SCF | 46±3/105细胞* | 49±4/105细胞* | 35±1/105细胞 |
表7，再障血清、脐带血清以及各种因子组合对造血干祖细胞数量的作用比较
| CD34+细胞 | CFU-GM | CFU-MK | BFU-E | |
| 再障血清 | 1.8％ | 26/2×105细胞 | 45/2×105细胞 | 28/2×105细胞 |
| 再障血清＋ZD | 25％ | 32/2×105细胞 | 91/2×105细胞 | 35/2×105细胞 |
| 脐带血清 | 17％ | 22/2×105细胞 | 41/2×105细胞 | 19/2×105细胞 |
| 脐带血清＋ZD | 23％ | 29/2×105细胞 | 78/2×105细胞 | 41/2×105细胞 |
| SCF＋IL3＋IL6＋GM－CSF＋EPO | 19％ | 29/2×105细胞 | 40/2×105细胞 | 36/2×105细胞 |
| SCF＋IL3＋IL6＋GM－CSF＋EPO＋ZD | 26％ | 41/2×105细胞 | 76/2×105细胞 | 56/2×105细胞 |
例8，基于这些发现，本发明先将PF4与脐带血单个核细胞在含5％脐带血清的培养液中孵育48小时，细胞然后经含藻类多糖脂物质的培养液洗涤后，再加入到含再障血清或脐带血清或生长因子和藻类多糖组份的血浆凝块培养液中培养12天去检测各种造血祖细胞的数量，结果显示HPP-CFC、CFU-MK和CFU-GM的数量明显增高，其中以PF4加再障血清加藻类多糖或PF4加IL6加IL3加藻类多糖的配方对提高CFU-MK的数量最佳，而PF4加GM-CSF加SCF加藻类多糖的配方对提高CFU-GM的数量作用最佳，PF4加SCF加EPO加藻类多糖的配方对提高BFU-E的数量作用最佳，PF4加SCF加bFGF加藻类多糖对干细胞的作用最佳。
表8，PF4孵育对造血干、祖细胞生长的影响
结果以与未加PF4但加5％脐带血清孵育48小时后的脐带血单个核细胞再经血浆凝块培养所得的结果比较得出的倍数来表达。
| HPP-CFC | CFU-GM | CFU-MK | BFU-E | |
| PF4＋再障血清 | 2.50 | 1.52 | 2.72 | 1.34 |
| PF4＋再障血清＋ZD | 3.61 | 1.72 | 3.80 | 1.63 |
| PF4＋脐带血清 | 2.43 | 1.43 | 2.62 | 1.36 |
| PF4＋脐带血清＋ZD | 3.62 | 1.62 | 3.45 | 1.72 |
| PF4＋IL3＋IL6 | 1.70 | 1.72 | 2.15 | 1.32 |
| PF4＋IL3＋IL6＋ZD | 3.10 | 1.93 | 3.23 | 1.56 |
| PF4＋SCF＋GM－CSF | 2.12 | 3.12 | 1.17 | 1.22 |
| PF4＋SCF＋GM－CSF＋ZD | 3.12 | 3.52 | 1.64 | 1.42 |
| PF4＋SCF＋EPO | 1.68 | 1.43 | 1.21 | 3.12 |
| PF4＋SCF＋EPO＋ZD | 2.72 | 1.62 | 1.72 | 3.74 |
| PF4＋SCF＋bFGF | 2.37 | 1.72 | 1.67 | 2.10 |
| PF4＋SCF＋bFGF＋ZD | 3.64 | 2.10 | 2.24 | 2.42 |
Claims (6)
1.一种体外扩增和大量制备人造血干细胞、祖细胞以及巨核细胞的方法，其特征是在培养条件中加入人血小板第四因子和(或)藻类多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所应用的人血小板第四因子可以是从人血小板中纯化的天然蛋白，也可以是基因重组或化学合成的蛋白肽或其活性片断。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所应用的藻类多糖是从海藻中分离的粘多糖样物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是人血小板第四因子和藻类多糖可以与造血细胞生长因子或脐带血清和再生障碍性贫血病人血清相继或同时联合使用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是扩增制备的造血干细胞和祖细胞以及巨核细胞悬液可冻存建立干细胞库。
6.根据权利要求1、2、3、4所述的方法，其特征是用人血小板第四因子或藻类多糖以单一成份或复合成份或与治疗有效量的造血细胞因子和白细胞介素配制成可在体内扩增血细胞的药物。
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