CN112176035A - 一种新型crispr核酸检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型CRISPR核酸检测方法及应用，检测方法，包括如下步骤：步骤一，样本处理；步骤二，制备反应体系；反应体系包括：与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，酶缓冲液；步骤三，将待检测核酸和探针加入核糖蛋白复合体溶液中；步骤四，酶切反应，信号的检测和结果的判读；本发明可以应用于检测单链DNA、RNA、双链DNA、单位点突变的CRISPR核酸等多种核酸和多个位点，设计灵活性高，特异性好，方便快捷，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是一种新型CRISPR核酸检测方法及应用。
背景技术
近年来，CRISPR核酸检测技术日新月异，在病原体检测，遗传病检测，癌症检测，微生物耐药性检测，环境微生物检测等领域的应用增长迅速。
最早的CRISPR核酸检测技术是利用氨基酸修饰的dCas9蛋白与EGFP荧光蛋白融合，在特定的向导RNA引导下，特异性与靶标序列结合。该方法耗时长，成本高，操作复杂，实际应用比较困难。
CRISPR核酸检测技术的转折点在2016年，张峰团队发现Cas13a具有旁路切割活性。当Cas13a与带有靶标识别区域的crRNA结合后，能够特异性识别靶标单链RNA，并对靶标RNA进行切割。于此同时，该酶的旁路切割活性被激活，非特异性地剪切附近的单链RNA。利用这一技术，2017年，第一种较为简单且实用的CRISPR核酸检测技术SHERLOCK诞生。同一时期，Cas12a的旁路切割活性亦被发现。不同于Cas13a，Cas12a在向导RNA的引导下，能够特异性识别和结合双链DNA，并获得对单链DNA的旁路切割活性。在此技术的基础上，DETECTR和HOLMES检测法相继发表。
这些方法目前已被应用于病原体检测，单位点多态性检测等多个领域，相比于传统的Realtime-PCR或FISH杂交技术，具有速度快，特异性高，操作简单等特点。
目前应用于CRISPR核酸检测的Cas酶主要有Type II型的dCas9,type V型的Cas12a、Cas12b，Cas12c和type VI型的Cas13a，Cas13b等。dCas9因为不具有旁路切割活性因而无法起到信号放大的作用，其检测的灵敏度不高，且操作复杂。基于Cas13的SHERLOCK核酸检测方法，特异性的识别RNA片段，与常用的片段扩增技术的兼容性差，需要在反应中引入T7反转录步骤，使其难度和可操作性都较高。基于Cas12的DETECTR和HOLMES,其检测的底物可以是双链DNA也可以是单链DNA，但是在已单链DNA为检测物的时候，其特异性存在一定的下降，对位点突变等不敏感。
此外现有的CRISPR检测方法，在设计靶标序列的时候，都需要考虑PAM(protospacer adjacent motif)位点这一前提。比如Cas12的靶标序列必须设计在一段TTTN或TTN的PAM位点下游附近，否则该方法无法有效识别靶标序列。特定的PAM位点序列在某些生物中出现的概率并不高，这给整个检测的设计带来了困难。
与此同时，Cas9，Cas12和Cas13的分子量都较大，且存在较长的疏水区域，在表达上存在一定的难度，提高了物料成本。
根据市场上产品的这些缺陷，开发一种在靶标设计上不受PAM位点限制，且能够检测包括单链DNA,双链DNA，RNA在内的核酸，成本低廉，操作简便，特异性好的CRISPR方法，在科学研究和产业应用上都具有重大的意义；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型CRISPR核酸检测方法及应用，本发明将与待检测靶标序列互补的crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合得到核糖核蛋白复合体，直接检测单链DNA、RNA、双链DNA等多种核酸和多个位点，设计灵活性高，特异性好，方便快捷，成本低廉。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种新型CRISPR核酸检测方法，包括：
与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，酶缓冲液；或与待检测靶标序列互补的crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA，Cas14酶，酶缓冲液组成的反应体系，在加入待检测核酸后，通过酶切反应，产生可检测的信号变化。
一种新型CRISPR核酸检测方法，包括如下步骤：
步骤一，制备反应体系；
反应体系包括：与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；或反应体系包括：由crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；
步骤二，将待检测核酸加入核糖蛋白复合体溶液中；
步骤三，酶切反应，信号的检测和结果的判读。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法，Cas14酶包括：Cas14a，Cas14b，Cas14c，或者于Cas14旁路切割活性类似的Cas蛋白。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法，待检测核酸为直接检测样本中的核酸或者检测经扩增后的核酸。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法，待检测核酸包括：RNA、单链DNA或者双链DNA。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于直接检测核酸的步骤包括：
配制反应体系，所述反应体系包括：tracrRNA，crRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将待测核酸加入反应体系，
将反应体系置于25-95℃，5-200min。
读取信号。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于与恒温扩增结合的一步法核酸检测的步骤包括：
配制反应体系，该体系包括恒温扩增反应体系、Cas14酶、探针、tracrRNA和crRNA；将待测核酸加入反应体系中，并于25-95℃进行扩增及酶切5-200min；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
读取信号。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于与扩增技术结合的两步法核酸检测的步骤包括：
配制恒温扩增反应体系或者PCR反应体系；将待测核酸加入扩增反应体系中，并于25-99℃进行扩增5-240min；
配置Cas14a酶切反应体系，将配制的酶切反应体系至于25-95℃温浴1-60min；所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶、探针、tracrRNA和crRNA，酶缓冲液；
将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
读取信号。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于检测单链DNA的步骤包括：
配制反应体系，所述反应体系包括：tracrRNA，crRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将待测核酸加入反应体系，
将反应体系置于25-95℃，5-200min；
读取信号。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，
ssDNA靶标为：
5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTCATTTCATGGACCAGAACAACCCGCTATTTCGTCATCTGGACTGCTATTGGAGTCTGTCACGTGAGCGTGCCG-3’；
tracrRNA为：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
crRNA为：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGUCAUCUGGACUGCUAUUGG-3；
单链DNA探针为：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于检测双链DNA的步骤包括：
配制恒温扩增反应体系或者PCR反应体系；将待测核酸加入扩增反应体系中，并于25-99℃进行扩增5-240min；
配置Cas14a酶切反应体系，将配制的酶切反应体系至于25-95℃温浴1-60min；所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶，探针，tracrRNA，crRNA，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
读取信号。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，
交叉引物包括：
正向交叉引物CPF：
TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA；
逆向交叉引物CPR：
TGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTAATGGACACACATAATAGCTTTA；
正向外围引物FB：
AGCGTTAGGTATATCGGAAG；
内部增强引物1IP1：
CTGACATATATAGCATCAGTTA；
内部增强引物2IP2：
GTTTTATTAGTGATTTTTTGTT；
反向外围引物RB：
GTTCCATATCACATGGATGTC；
TracrRNA为：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
crRNA为：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAAC-3’；
单链DNA探针为：5’-Hex-TTTTTTTT-BHQ-3’。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于检测单位点突变的步骤包括：
非对称PCR扩增：
配制扩增体系，扩增体系的反向引物的浓度为正向引物的1.5-50倍，或者正向引物的浓度为反向引物的1.5-50倍；
PCR扩增；
配制Cas14a酶切反应体系配制，所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶、探针、sgRNA，酶切缓冲液混合；
将配制的酶切反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
酶切反应：将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-99℃，1-60min；读取信号。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，
突变型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGGAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
野生型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
正向引物：5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTC-3’；
反向引物：5’-CGGCACGCTCACGTGACTGAC-3’；
sgRNA为:
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUAAAGACGAAUGAAGGAAUGCAACCGGCUAGACGGGAAGACCCC-3；
单链DNA探针为：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，应用于检测RNA的步骤包括：
配制逆转录扩增体系，所述逆转录扩增体系包括：RT-PCR、RT-LAMP、RT-CPA等类型的逆转录扩增反应体系；
加入待检测的RNA进行逆转录扩增；
配制Cas14a酶切反应体系，包括：Cas14酶、探针、tracrRNA、crRNA，酶切缓冲液；
将配制的酶切反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
酶切反应：将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃，1-60min；读取信号。
前述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，
检测新冠病毒的引物包括：
正向外围引物BF:AACACAAGCTTTCGGCAG，
逆向外围引物BR:GAAATTTGGATCTTTGTCATCC，
正向环引物CPF:TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGCCAAGGAAATTTTGGGGAC，
逆向环引物CPR：CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG，
内部增强引物1AF：TTCCTTGTCTGATTAGTTC，
内部增强引物2AR：ACCTTCGGGAACGTGGTT；
tracrRNA：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
crRNA：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGAAGAACGCUGAAGCGCUG-3’；
单链DNA探针：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
本发明的有益之处在于：
本发明的方法在检测靶标的设计上不受PAM位点的限制，设计灵活性高，而其他利用Cas12或者Cas13酶的CRISPR核酸检测方法在均要求在检测靶标的附近有PAM位点；
本发明利用Cas14的活性，将与待检测靶标序列互补的crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合得到核糖核蛋白复合体，得到特异性结合、非特异性旁路切割活性的特点，应用该方法可以直接检测单链DNA、RNA、双链DNA等在内的多种核酸和多个位点；
该检测技术的特异性好，方便快捷，成本低。
附图说明
图1是本发明的crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合得到核糖核蛋白复合体的原理图；
图2是本发明的实施例1的实验结果图(纵坐标为：减去基准值之后的最终信号强度，横坐标为：不同检测物浓度)；
图3是本发明的实施例2的灵敏度实验结果图；
图4是本发明的实施例3检测突变型序列的实验结果图；
图5是本发明的实施例4的实验结果的酶切信号曲线与荧光通道FAM之间的关系图；
图6是本发明的实施例4的实验结果的阳性样本和阴性样本减去基准后的最终荧光强度对比图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种新型CRISPR核酸检测方法，
步骤一，样本处理；
在进行CRISPR检测之前，根据不同样本的特性选择适当的样本处理方法。
步骤二，样本扩增；(可选步骤)
对待检测核酸进行扩增可以提高检测靶标的浓度，使用不同的扩增技术亦可拓展该方法检测核酸的种类；
作为一种实施例，当待检测核酸为双链DNA时，可以采用非对称PCR或者CPA等扩增方法得到大量的待检靶标的单链DNA片段。作为另一种实施例，当待检测核酸为RNA时，可以在扩增方法的基础上加入反转录步骤或者反转录酶，从而通过扩增得到待检测的单链DNA片段。
步骤三，制备反应体系；
反应体系包括：与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，酶缓冲液；或反应体系包括：由crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA，Cas14酶，酶缓冲液；作为一种实施例，Cas14酶包括：Cas14a，Cas14b，Cas14c。
步骤四，将待检测核酸和探针加入核糖蛋白复合体溶液中；探针为单链DNA探针，可以使荧光基团标记或抗体标记。
步骤五，信号的检测和结果的判读。
信号的检测和结果的判读包括：荧光信号的检测和结果的判读，免疫层析试纸的检测和结果的判读。当加入的探针为代有荧光基团和淬灭基团的单链DNA时，探针在被Cas酶剪切之后释放出荧光信号，该荧光信号可以采用PCR仪，酶标仪，或者其他荧光信号检测设备进行采集。信号的采集时间可以时在检测反应结束后，可以于检测反应同时进行。通过荧光信号的强度，可以判定结果是否为检出或未检出。当加入的探针为抗体标记时，则可以在检测反应结束后，通过免疫层析试纸来显示结果。
以上步骤并非绝对，也可结合简化为一步法或者两步法进行，在此不一一举例，只要是利用Cas14的活性，将与待检测靶标序列互补的crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合得到核糖核蛋白复合体，得到特异性结合、非特异性旁路切割活性的特点的方法都在本发明的保护范围内。该检测方法可以直接用于检测单链DNA样本。亦可与多种扩增技术结合使用，提高灵敏度，扩展检测样本的范围。该技术可与包括PCR；交叉引物恒温扩增技术；LAMP；RPA在内的多种扩增技术结合实现对单链和双链DNA的检测。如在扩增体系中加入反转录酶，则可实现对RNA的检测。利用该方法的原理，亦可与数字PCR，芯片技术等结合开发出灵敏度更高的核酸检测方法。
本发明的原理解析：
Cas14是一类新型的Cas酶，包括Cas14a、Cas14b、Cas14c等。它具有较短的氨基酸序列，仅为Cas12何Cas13的一半至三分之二，为400-700个氨基酸。Cas14需要和向导RNA结合，从而获得特异性结合并剪切单链DNA的能力。向导RNA可以有两种形式：1.一种是以较短的CRISPR RNA(crRNA)的形式，crRNA与Cas14的结合需要在具有特定二级结构的transactivating CRISPR RNA(tracrRNA)的帮助下才能实现。crRNA的5’端与tracrRNA的3’端具有互补区域，两者通过互补区域结合形成能够与Cas14结合的二级结构。2.另一种形式即将crRNA与tracrRNA结合成为一条整体的sgRNA,该RNA折叠之后形成的二级结构具有和Cas14结合的能力。
如图1所示：tracrRNA的3’和crRNA的5’序列通过互补结合，且tracrRNA能够折叠形成具有多个发卡结构的复杂二级结构。这一结构使得tracrRNA和crRNA能够与Cas14酶结合，被Cas14酶包裹，形成核糖核蛋白复合体。Cas14与向导RNA结合以后，便能够特异性识别与crRNA识别区域序列互补的单链靶标DNA序列。当Cas14-向导RNA复合体找到靶标序列后，便可以与靶标序列结合，并在识别区域3’端的下游对靶标序列进行剪切。于此同时，Cas14-向导RNA复合体获得非特异性的旁路切割活性，即快速无差别的剪切一切附近的单链DNA(如单链DNA探针)。
本发明利用Cas14这一活性，设计与待检测靶标序列互补的crRNA。将crRNA、tracrRNA和Cas14酶混合，在酶缓冲液中进行温浴后得到核糖核蛋白复合体。将待检测核酸和单链报告探针加入核糖蛋白复合体溶液中，在适当温度下进行酶切反应，再通过读取信号，得到检测结果。
以下通过四个应用实施例验证本检测方法具有灵敏度高的有益效果；
实施例1：
Cas14a检测单链DNA的方法
本实施例，阐述了一种利用Cas14a酶检测单链DNA的CRISPR核酸检测方法。
1.材料与方法：
1.1 ssDNA靶标：
5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTCATTTCATGGACCAGAACAACCCGCTATTTCGTCATCTGGACTGCTATTGGAGTCTGTCACGTGAGCGTGCCG-3’；
1.2 tracrRNA：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
1.3 crRNA：
5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGUCAUCUGGACUGCUAUUGG-3；
1.4单链DNA探针：
5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’；
1.4 Cas14酶
该Cas14酶可为Cas14a，Cas14b，Cas14c或者其他Cas14酶；
1.5 1X酶反应溶液：
10-200mM NaCl，
5-100mM Tris-HCl，
2-50mM MgCl2，
10-500μg/ml BSA，
pH 7-9@25℃。
检测过程包括：
步骤1：配制反应体系。反应体系为：10-500nM的tracrRNA、10-500nM的crRNA、10-500nM的Cas14酶、1nM-2000mM单链DNA探针、10-200mM NaCl，5-100mM Tris-HCl，2-50mMMgCl2，10-500μg/ml BSA，pH 7-9@25℃；
步骤2：(可选步骤)：将反应体系至于30-60℃，5-60min；
步骤3：将待测单链DNA加入反应体系，单链DNA探针的浓度为5-2000nM；
步骤4：将反应体系至于25-65℃5-60min。
步骤5：读取荧光信号。
结果：如图2所示。
结果分析：该方法用于直接检测单链DNA，灵敏度可以达到：0.1nM.纵坐标为减去基准值之后的最终荧光信号强度。横坐标为不同检测物浓度。
结论：采用本发明所述的检测方法，可以对单链DNA样本进行检测，其检测灵敏度达到0.1nM.
实施例2：
双交叉引物恒温扩增结合Cas14a检测大肠杆菌
本实施例描述了一种利用双交叉引物恒温扩增技术对待检测双链DNA进行扩增后利用Cas14a酶进行CRISPR核酸检测的方法。
材料与方法
引物：
CPF：TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA；
CPR：TGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTAATGGACACACATAATAGCTTTA；
FB AGCGTTAGGTATATCGGAAG；
IP1 CTGACATATATAGCATCAGTTA；
IP2 GTTTTATTAGTGATTTTTTGTT；
RB GTTCCATATCACATGGATGTC；
TracrRNA：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
CrRNA：
5’--3’；
单链DNA探针：
5’-Hex-TTTTTTTT-BHQ-3’；
Cas14酶：
该Cas14酶可为Cas14a，Cas14b，Cas14c或者其他Cas14酶。
Bst DNA聚合酶Neb。
检测过程为：
步骤1：样本处理
将含有大肠杆菌的培养液经水稀释后，100℃煮沸5-30min；
步骤2：配置恒温扩增反应体系：
0.1-2μM CPF正向交叉引物
0.1-2μM CPR逆向交叉引物
0.1-1μM FB正向外围引物
0.1-1μM RB反向外围引物
0.1-2μM IP1内部增强引物1
0.1-2μM IP2内部增强引物2
0.1-1M Betaine
2-15mM MgSO4
0.4-1.2mM dNTPs
1-20U Bst DNA聚合酶。
步骤3：核酸扩增
将处理后的大肠杆菌样本加入交叉引物恒温扩增反应体系中，并于55-65℃进行扩增10-60min。
步骤4：Cas14a酶切反应体系配制。
将等摩尔数的Cas14酶，tracrRNA和crRNA(终浓度(0.02-2μM))，1nM-2000mM探针与酶切缓冲液混合。酶切缓冲液的成分为：
10-200mM NaCl
5-100mM Tris-HCl
2-50mM MgCl2
10-500μg/ml BSA
pH 7-9@25℃
将配制的酶切反应体系至于30-55℃温浴5-30min。
步骤5：酶切反应
将适当体积的扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.001/1-5/1。在酶标仪或者PCR仪中25-55℃酶切5-60min并读取荧光信号。
结果：如图3所示：改用该方法检测大肠杆菌的灵敏度可以达到100CFU/ml，阴性样本没有酶切信号。
结论：此方法可以有效检测大肠杆菌。交叉引物恒温扩增技术能对双链模板进行恒温扩增，其产物中含有大量目的序列的单链，非常适合与Cas14a酶联合使用。
实施例3：
本实施例阐述了一种利用利用非对称PCR结合Cas14a酶检测单位点突变的CRISPR核酸检测方法。
待检测序列：
材料：
突变型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGGAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
野生型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
正向扩增引物：5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTC-3’；
反向扩增引物：5’-CGGCACGCTCACGTGACTGAC-3’；
SgRNA:
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUAAAGACGAAUGAAGGAAUGCAACCGGCUAGACGGGAAGACCCC-3’；
PCR试剂盒：TaKaRa Ex
Cas14酶：该Cas14酶可为Cas14a，Cas14b，Cas14c或者其他Cas14酶；
单链DNA探针：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’；
检测过程为：
步骤1：非对称PCR扩增
扩增体系的配制：扩增体系的配液如下:需要注意的是反向引物的浓度为正向引物的10-50倍；
扩增程序：
程序1：98℃10sec，55℃30sec，72℃45sec循环数：20-40；
或者程序2：98℃10sec，60℃1min循环数20-40。
步骤2：Cas14a酶切反应体系配制。
将等摩尔数的Cas14酶，sgRNA(终浓度(0.02-2μM))，1nM-2000mM探针，与酶切缓冲液混合。酶切缓冲液的成分为：
pH 7-9@25℃
将配制的酶切反应体系至于30-55℃温浴5-30min。
步骤3：酶切反应
将适当体积的扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.001/1-5/1。在酶标仪或者PCR仪中25-55℃酶切5-60min并读取荧光信号。
结果：
如图4所示：采用非对称PCR扩增结合Cas14a的CRISPR核酸检测法可以有效检出突变型序列。
结论：该方法通过非对称PCR将双链待检测DNA，扩增为单链DNA为主的产物。并利用Cas14a CRISPR核酸检测法对产物进行酶切检测。通过酶切信号的强度判定待检测DNA为野生型或者突变型。该方法特异性好，灵敏度高，可重复性强。具有操作简便，结果解读清晰等特点。
实施例4：一种使用Cas14a1检测新冠病毒的方法
本实施例阐述了一种利用RT-LAMP和CRISPR结合使用的一步法新冠病毒RNA检测方法
材料：
1.1靶标：
新冠病毒N基因靶核酸；
1.2引物：
正向外围引物BF:AACACAAGCTTTCGGCAG；
逆向外围引物BR:GAAATTTGGATCTTTGTCATCC；
正向环引物CPF:TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGCCAAGGAAATTTTGGGGAC；
逆向环引物CPR：CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG；
内部增强引物1AF：TTCCTTGTCTGATTAGTTC；
内部增强引物2AR：ACCTTCGGGAACGTGGTT；
1.3tracrRNA：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
1.4crRNA：
5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGAAGAACGCUGAAGCGCUG-3’；
1.5Cas14酶：
该Cas14酶可为Cas14a，Cas14b，Cas14c或者其他Cas14酶；
1.6逆转录酶：
AMV-RT；
1.7单链DNA探针：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’；
检测具体步骤：
步骤一：RT-LAMP扩增体系的配制：
0.1-2μM CPF
0.1-2μM CPR
0.1-1μM BF
0.1-1μM BR
0.1-2μM AF
0.1-2μM AR
0.1-1M Betaine
2-15mM MgSO4
0.4-1.2mM dNTPs
1-20U Bst DNA聚合酶
1-20U AMV-RT
步骤2：加样
加入待检测的新冠病毒N基因靶核酸，加样的浓度未100拷贝每反应，阴性对照加入等体积的超纯水或无新冠病毒的咽拭子提取液。阴性和阳性各4个重复。
步骤3：RT-LAMP扩增
将加样完毕的反应管至于金属浴，PCR仪，或者水浴等可以恒温加热的设备中，进行扩增，扩增温度为50-70℃。
步骤4：Cas14a酶切反应体系配制。
将等摩尔数的Cas14酶，crRNA,tracrRNA(终浓度(0.02-2μM))，1nM-2000mM探针与酶切缓冲液混合。酶切缓冲液的成分为：
pH 7-9@25℃；
将配制的酶切反应体系至于30-55℃温浴5-30min。
步骤5：酶切反应
将适当体积的扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.01/1-1/1。在酶标仪或者PCR仪中25-55℃酶切5-60min并读取荧光信号。
结果如图5、6所示：
图5：为酶切信号曲线，荧光通道为FAM。图6:为阳性样本和阴性样本减去基准后的最终荧光强度对比。
4个阳性样本全部检出，阴性样本全部未检出。
结论：通过于RT-LAMP整合，该CRISPR检测方法可以检测病毒RNA样本，其灵敏度高于100拷贝每反应。
由以上实验可知，本发明的检测方法与目前的CRISPR核酸检测相比，具有不受PAM位点限制的特点，可以灵活设计检测的片段和crRNA/sgRNA及扩增引物的优点；且检测灵敏度高，操作简便，成本可控；可检测单链DNA，双链DNA，RNA等多种核酸，特别是检测单链DNA或者单链DNA扩增产物时具有优异的特异性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州优思达生物技术有限公司
<120> 一种新型CRISPR核酸检测方法及应用
<141> 2020-10-14
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gccgcgatca aggagttctt catttcatgg accagaacaa cccgctattt cgtcatctgg 60
actgctattg gagtctgtca cgtgagcgtg ccg 93
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cuucacugau aaaguggaga accgcuucac caaaagcugu cccuuagggg auuagaacuu 60
gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120
cccucgaaac aaauucauuu 140
<210> 3
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gacgaaugaa ggaaugcaac gucaucugga cugcuauugg 40
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tttttttttt 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tggctcctgt gtattttata gcattgagat gaagttattg ttccaaca 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agcgttaggt atatcggaag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ctgacatata tagcatcagt ta 22
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<213> Artificial Sequence
<400> 8
gttttattag tgattttttg tt 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gttccatatc acatggatgt c 21
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gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gacgaaugaa ggaaugcaac 20
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<213> Artificial Sequence
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tttttttt 8
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ctttactgag tctgtcacgt gagcgtgccg a 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agccgcgatc aaggagttct tcacaatcta cccgcggcta gacggaaaga ccccatgaac 60
ctttactgag tctgtcacgt gagcgtgccg a 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120
cccucgaaac aaauucauuu aaagacgaau gaaggaaugc aaccggcuag acgggaagac 180
ccc 183
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<213> Artificial Sequence
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tttttttttt 10
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cgcattggca tggaagtcac tttgatggca cctgtgtag 39
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
cuucacugau aaaguggaga accgcuucac caaaagcugu cccuuagggg auuagaacuu 60
gagugaaggu gggcugcuug caucagccua augucgagaa gugcuuucuu cggaaaguaa 120
cccucgaaac aaauucauuu 140
<210> 26
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gacgaaugaa ggaaugcaac gaagaacgcu gaagcgcug 39
<210> 27
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tttttttttt 10
Claims (16)
1.一种新型CRISPR核酸检测方法，其特征在于，包括：
与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，酶缓冲液；或与待检测靶标序列互补的crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA，Cas14酶，酶缓冲液组成的反应体系，在加入待检测核酸后，通过酶切反应，产生可检测的信号变化。
2.一种新型CRISPR核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，制备反应体系；
反应体系包括：与待检测靶标序列互补的crRNA，tracrRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；或反应体系包括：由crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；
步骤二，将待检测核酸加入核糖蛋白复合体溶液中；
步骤三，酶切反应，信号的检测和结果的判读。
3.根据权利要求1或2所述的一种新型CRISPR核酸检测方法，其特征在于，所述Cas14酶包括：Cas14a，Cas14b，Cas14c，或者于Cas14旁路切割活性类似的Cas蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的一种新型CRISPR核酸检测方法，其特征在于，所述待检测核酸为直接检测样本中的核酸或者检测经扩增后的核酸。
5.根据权利要求1或2所述的一种新型CRISPR核酸检测方法，其特征在于，所述待检测核酸包括：RNA、单链DNA或者双链DNA。
6.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于直接检测核酸的步骤包括：
配制反应体系，所述反应体系包括：tracrRNA，crRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将待测核酸加入反应体系，
将反应体系置于25-95℃，5-200min。
读取信号。
7.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于与恒温扩增结合的一步法核酸检测的步骤包括：
配制反应体系，该体系包括恒温扩增反应体系、Cas14酶、探针、tracrRNA和crRNA；将待测核酸加入反应体系中，并于25-95℃进行扩增及酶切5-200min；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
读取信号。
8.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于与扩增技术结合的两步法核酸检测的步骤包括：
配制恒温扩增反应体系或者PCR反应体系；将待测核酸加入扩增反应体系中，并于25-99℃进行扩增5-240min；
配置Cas14a酶切反应体系，将配制的酶切反应体系至于25-95℃温浴1-60min；所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶、探针、tracrRNA和crRNA，酶缓冲液；
将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
读取信号。
9.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于检测单链DNA的步骤包括：
配制反应体系，所述反应体系包括：tracrRNA，crRNA，Cas14酶，探针，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将待测核酸加入反应体系；
将反应体系置于25-95℃，5-200min；
读取信号。
10.根据权利要求9所述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，
ssDNA靶标为：
5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTCATTTCATGGACCAGAACAACCCGCTATTTCGTCATCTGGACTGCTATTGGAGTCTGTCACGTGAGCGTGCCG-3’；
tracrRNA为：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
所述crRNA为：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGUCAUCUGGACUGCUAUUGG-3；
单链DNA探针为：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
11.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于检测双链DNA的步骤包括：
配制恒温扩增反应体系或者PCR反应体系；将待测核酸加入扩增反应体系中，并于25-99℃进行扩增5-240min；
配置Cas14a酶切反应体系，将配制的酶切反应体系至于25-95℃温浴1-60min；所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶，探针，tracrRNA，crRNA，酶缓冲液；所述crRNA与待检测靶标序列互补；
将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
读取信号。
12.根据权利要求11所述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，交叉引物包括：
正向交叉引物CPF：
TGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTGAGATGAAGTTATTGTTCCAACA；
逆向交叉引物CPR：
TGAAACTTGGCAAATGTCTGTTAGTAATGGACACACATAATAGCTTTA；
正向外围引物FB：
AGCGTTAGGTATATCGGAAG；
内部增强引物1IP1：
CTGACATATATAGCATCAGTTA；
内部增强引物2IP2：
GTTTTATTAGTGATTTTTTGTT；
反向外围引物RB：
GTTCCATATCACATGGATGTC；
所述TracrRNA为：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
所述crRNA为：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAAC-3’；
单链DNA探针为：5’-Hex-TTTTTTTT-BHQ-3’。
13.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于检测单位点突变的步骤包括：
非对称PCR扩增：
配制扩增体系，扩增体系的反向引物的浓度为正向引物的1.5-50倍，或者正向引物的浓度为反向引物的1.5-50倍；
PCR扩增；
配制Cas14a酶切反应体系配制，所述Cas14a酶切反应体系包括：Cas14酶、探针、sgRNA，酶切缓冲液混合；
将配制的酶切反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
酶切反应：将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-99℃，1-60min；读取信号。
14.根据权利要求13所述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，
突变型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGGAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
野生型序列：
5’-aGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCaCAATCTACCCGCGGCTAGACGGAAAGACCCCATGAACCTTTACTGaGTCTGTCACGTGAGCGTGCCGa-3’；
正向引物：5’-GCCGCGATCAAGGAGTTCTTC-3’；
反向引物：5’-CGGCACGCTCACGTGACTGAC-3’；
所述sgRNA为:
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUAAAGACGAAUGAAGGAAUGCAACCGGCUAGACGGGAAGACCCC-3；
单链DNA探针为：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
15.一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，应用于检测RNA的步骤包括：
配制逆转录扩增体系，所述逆转录扩增体系包括：RT-PCR、RT-LAMP、RT-CPA等类型的逆转录扩增反应体系；
加入待检测的RNA进行逆转录扩增；
配制Cas14a酶切反应体系，包括：Cas14酶、探针、tracrRNA、crRNA，酶切缓冲液；
将配制的酶切反应体系置于25-95℃温浴1-60min；
酶切反应：将扩增产物加入酶切反应体系中，扩增产物和酶切反应体系的体积比为0.0001/1-5/1；
将反应体系置于25-95℃，1-60min；读取信号。
16.根据权利要求15所述的一种新型CRISPR核酸检测方法的应用，其特征在于，
检测新冠病毒的引物包括：
正向外围引物BF:AACACAAGCTTTCGGCAG，
逆向外围引物BR:GAAATTTGGATCTTTGTCATCC，
正向环引物CPF:TGCGGCCAATGTTTGTAATCAGCCAAGGAAATTTTGGGGAC，
逆向环引物CPR：CGCATTGGCATGGAAGTCACTTTGATGGCACCTGTGTAG，
内部增强引物1AF：TTCCTTGTCTGATTAGTTC，
内部增强引物2AR：ACCTTCGGGAACGTGGTT；
tracrRNA：
5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3’；
crRNA：5’-GACGAAUGAAGGAAUGCAACGAAGAACGCUGAAGCGCUG-3’；
单链DNA探针：5’-FAM-TTTTTTTTTT-BHQ-3’。
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