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CN112166193A - 具有经修饰的接头结构域的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

具有经修饰的接头结构域的嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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CN112166193A
CN112166193A CN201980034413.2A CN201980034413A CN112166193A CN 112166193 A CN112166193 A CN 112166193A CN 201980034413 A CN201980034413 A CN 201980034413A CN 112166193 A CN112166193 A CN 112166193A
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CN
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leu
ser
cell
pro
gly
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Pending
Application number
CN201980034413.2A
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English (en)
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K.V.班达拉
J.T.库姆斯
T.J.萨德伦
S.C.巴里
J.H.Y.冯
S.R.麦科尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biosceptre Ausi Pty Ltd
Original Assignee
Biosceptre Uk Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及优化的嵌合抗原受体(CAR)以及表达该嵌合抗原受体的经遗传修饰的细胞，其可以靶向多种癌症类型。更具体地，CAR具有优化的接头长度，其有助于通过表达CAR的T细胞靶向和溶解多种癌细胞类型。

Description

具有经修饰的接头结构域的嵌合抗原受体及其用途
优先权
本申请要求于2018年5月21日提交的澳大利亚临时申请第2018901782号的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体，表达嵌合抗原受体的免疫细胞以及使用嵌合抗原受体来预防和/或治疗癌症的方法。
发明背景
免疫系统具有高度进化且特异性的机制，其保护生物体免受各种病理学影响。在这些机制中，检测和消除不需要的病原体，如细菌感染，病毒感染的细胞，并且重要地，可能导致恶性赘生物(癌症)的突变细胞。免疫系统预防癌症形成和生长的能力取决于免疫系统细胞区分“健康”细胞和“患病”(例如，赘生性或前赘生性)细胞的能力。这是通过识别指示细胞从健康状态向患病状态转变的细胞标志物(抗原)而实现的。
已经有通过操纵或指导免疫系统靶向表达癌细胞抗原的细胞来开发用于治疗癌症的免疫治疗方法的许多尝试。免疫治疗方法主要集中在开发体液免疫系统，其通过利用分离的或工程化的抗体，或者最近地免疫系统的细胞装备(cellular arm)。
实施细胞免疫疗法以治疗癌症的一种方法是利用从肿瘤中分离的T淋巴细胞，在重新施用于患者之前先进行离体扩增。尽管此方法提供了一些希望和功效，但有很多与此方法相关的技术挑战。分离的肿瘤来源的T细胞的异质性和离体扩增细胞的挑战，可能导致仅含有少量癌症抗原特异性T细胞的扩增群体。结果，该方法的功效是不可预测的且可变的。
为了解决与使用离体扩增的肿瘤分离的T细胞相关的一些缺陷，在1980年代后期开始开发嵌合抗原受体(CAR或人工T细胞受体)。嵌合抗原受体使对期望抗原特异的胞外区与胞内信号传导区组合，导致可以诱导T细胞功能的抗原特异性受体。
用CAR转化分离的T细胞导致对给定抗原特异的T细胞群。这些细胞使抗原结合分子的抗原特异性与内源性T细胞的溶解能力和自我更新相组合。结果，可以产生较大的抗原特异性T细胞群并施用于患者。
迄今为止，CAR T细胞疗法的开发和实施受到限制。最初，CAR T细胞已被用于治疗血液学癌症，如B细胞淋巴瘤。在IV期淋巴瘤患者中，使用针对B细胞标志物CD19的CAR T细胞治疗此类疾病引起高达80％的客观反应率以及大于50％的完全反应率。
然而，尽管CAR T细胞疗法在血液学癌症的治疗中取得了成功，但它们在其他癌症类型中的使用受到了限制。CAR T细胞无法成功治疗其他癌症类型，尤其是实体瘤的原因很多。这些原因包括T细胞接近实体瘤，实体肿瘤内的敌对和免疫抑制微环境，以及重要的是，难以开发靶向和攻击表达实体瘤特异性抗原的癌细胞的CAR-T细胞。
即使鉴定出肿瘤特异性抗原，产生有效靶向实体瘤细胞以及靶向各种癌症类型的CAR T细胞的能力也是很难的。
因此，显然需要开发靶向肿瘤相关抗原的CAR，该肿瘤相关抗原由癌性细胞选择性表达，并在由CAR转导的细胞中诱导应答。
包括在本说明书中的文件、行为、材料、设备、文章等的讨论仅仅是用于提供本发明的上下文的目的。没有提示或表示因为其在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在，所以这些事项中的任一种或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识。
发明概述
本发明部分地基于以下认识，即针对功能失调性P2X7受体的CAR识别其抗原的能力根据CAR的抗原识别结构域和跨膜结构域之间的接头结构域的长度而变化。因此，表达CAR的免疫细胞对表达功能失调性P2X7受体的靶细胞的功效受抗原识别结构域和跨膜结构域之间的接头结构域长度的影响。
因此，本发明提供了嵌合抗原受体，其包括识别功能失调性P2X7受体的抗原识别结构域、跨膜结构域和接头结构域，其中所述接头结构域由12至228个氨基酸组成。
在一些实施方案中，本发明提供嵌合抗原受体，其包括识别功能失调性P2X7受体的抗原识别结构域、跨膜结构域和接头结构域，其中所述接头结构域由30至228个氨基酸组成。
在一些实施方案中，接头结构域由50至200个氨基酸，或70至180个氨基酸，或90至160个氨基酸，或110至130个氨基酸，或115至125个氨基酸，或117至121个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由约119个氨基酸组成。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括接头结构域，该接头结构域包括与以下同源的氨基酸序列：IgG、IgD、IgA的免疫球蛋白铰链区，或IgM或IgE的重链恒定(CH)区2，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、96％或99％序列同一性的功能变体。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括与来自IgG同种型免疫球蛋白的铰链区同源的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、96％或98％序列同一性的功能变体。优选地，接头结构域包括与IgG1、IgG2或IgG4亚类抗体的铰链区同源的氨基酸序列，或其具有至少50％、66％、73％、75％、80％、83％、86％、91％或93％序列同一性的功能变体。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括与来自IgG同种型免疫球蛋白的铰链区同源的氨基酸序列，并且包括CXXC基序，其中“C”是半胱氨酸，且“X”是任何氨基酸。在一些实施方案中，CXXC基序选自由CPPC、CPRC或CPSC组成的组。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括与免疫球蛋白的CH区同源的一个或多个氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，与CH区同源的氨基酸序列与免疫球蛋白的CH1区、CH2区、CH3区或CH4区中的一个或多个同源，或与所述CH区具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括与IgG同种型免疫球蛋白的CH2区或CH3区中的一个或多个同源的一个或多个氨基酸序列，或与所述CH2或CH3区具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括一个或多个免疫球蛋白铰链区和/或免疫球蛋白的一个或多个CH区域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域由与免疫球蛋白铰链区和CH区，优选CH2区或CH3区同源的序列组成。在一些实施方案中，铰链区、CH2区或CH3区来自IgG同种型免疫球蛋白。在一些实施方案中，铰链区、CH2区或CH3区来自IgG4亚类。
在一些实施方案中，接头结构域由IgG铰链区和免疫球蛋白的一个或多个CH区组成。在一些实施方案中，接头结构域由IgG铰链区和免疫球蛋白的CH2或CH3区组成。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包括根据SEQ ID NO:9至17中任一项的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的的功能变体。优选地，嵌合抗原受体包根据SEQ ID NO:9至13的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域在接头结构域中不包含实质上与Fc受体结合的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在CD8+T细胞中表达时，根据本发明的嵌合抗原受体对表达功能失调性P2X7受体的靶细胞具有至少20％的体外细胞毒性，其中T细胞:靶细胞的比率为30:1或更大。在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的靶细胞是癌细胞。
在本发明的一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域识别与所述P2X7受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点相关的表位。在一些实施方案中，与完全功能性P2X7受体的ATP结合能力相比，功能失调性P2X7受体具有降低的结合ATP的能力。在一些实施方案中，功能失调性P2X7受体具有使受体功能失调的构象变化。在一些实施方案中，构象变化是氨基酸从反式构象变为顺式构象的氨基酸变化；优选地，构象变化是功能失调性P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域识别包括跨越所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置200处的甘氨酸至氨基酸位置216处的半胱氨酸的一个或多个氨基酸残基的表位。在一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域识别包括所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸的表位。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域包含与抗体的抗原结合区的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域包含与以下同源的氨基酸序列：包含结合功能失调性P2X7受体的抗体的可变重链或可变轻链的至少3个互补决定区(CDR)的结构域区的氨基酸序列，或与结合功能失调性P2X7受体的抗体的单链可变片段(scFv)同源的序列。
在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包括跨膜结构域，其包含以下的跨膜结构域的全部或部分：CD3、CD4、CD8或CD28，优选CD8或CD28，更优选CD28。
本发明进一步提供了如上所述的嵌合抗原受体在免疫细胞中表达时在治疗癌症中的用途。在一些实施方案中，免疫细胞是白细胞，在一些实施方案中，免疫细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是alpha beta(αβ)T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是gamma delta(γδ)T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，癌症是实体癌。
本发明进一步提供了核酸分子或核酸构建体，其包括编码如上所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明进一步提供了经遗传修饰的细胞，其包括如上所述的嵌合抗原受体、核酸分子或核酸构建体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是白细胞，在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是alpha beta(αβ)T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是gamma delta(γδ)T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是自然杀伤细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是自然杀伤T细胞。
本发明进一步提供了如上所述的经遗传修饰的细胞在治疗癌症中的用途。此外，本发明提供了杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，该方法包括将表达功能失调性P2X7受体的细胞暴露于包括如上所述的嵌合抗原受体、核酸分子或核酸构建体的细胞。在一些实施方案中，本发明提供了杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，该方法包括将表达功能失调性P2X7受体的细胞暴露于如上所述的经遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，癌细胞是实体癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞选自下组：脑癌细胞、食道癌细胞、口腔癌细胞、舌癌细胞、甲状腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、宫颈癌细胞、上皮细胞癌、皮肤癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞和睾丸癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞选自下组：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、卵巢癌细胞或黑素瘤癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞来自转移性癌症。在一些实施方案中，癌细胞来自患有III期癌症或IV期癌症的患者，或者在患有III期癌症或IV期癌症的患者体内。
在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞与表达功能失调性P2X7受体的细胞是自体的。在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的细胞在受试者体内。
本发明还提供了药物组合物，其包括经遗传修饰的细胞，该细胞包括如上所述的嵌合抗原受体、核酸分子或核酸构建体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在至少一些实施方案中，本发明提供了慢病毒载体，该载体包含编码本文所述的嵌合抗原受体的核酸。
此外，本发明提供了如本文所述的嵌合抗原受体、慢病毒载体、经遗传修饰的细胞或核酸在预防或治疗癌症中的用途。在至少一些实施方案中，提供了嵌合抗原受体、慢病毒载体、经遗传修饰的细胞或核酸在制造或制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在至少一些实施方案中，所述药物用于预防或治疗实体癌细胞。在一些实施方案中，所述药物用于预防或治疗选自下组的癌细胞：脑癌细胞、食道癌细胞、口腔癌细胞、舌癌细胞、甲状腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、宫颈癌细胞、上皮细胞癌、皮肤癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞和睾丸癌细胞。在一些实施方案中，所述药物用于预防或治疗选自下组的癌细胞：乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、卵巢癌细胞或黑素瘤癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞来自转移性癌症。在一些实施方案中，癌细胞来自患有III期癌症或IV期癌症的患者，或在患有III期癌症或IV期癌症的患者体内。
附图简要说明
图1：根据本发明实施方案的CAR构建体的示意图。
图2：IgG亚型抗体的铰链区和本发明示例性实施方案的突变的铰链区的比对。
图3：IgG1、IgG2、IgG4抗体和本发明示例性实施方案的突变的铰链区的比对。
图4：IgG亚型抗体的CH2区和本发明示例性实施方案的CH2区的比对。
图5：IgG亚型抗体的CH3区和本发明示例性实施方案的CH3区的比对。
图6：包括CNA1004 CAR的epHIV-7.2慢病毒载体。
图7：EGFRt和Fc在CAR转导的CD4+细胞上表达的散点图。
图8：EGFRt和Fc在CAR转导的CD8+细胞上表达的散点图。
图9：EGFRt和Fc在分离和扩增的CAR转导的CD4+细胞上表达的散点图。
图10：EGFRt和Fc在分离和扩增的CAR转导的CD8+细胞上表达的散点图。
图11：CAR转导的CD8+T细胞对各种靶细胞系的杀伤测定。
图12：CAR转导的CD8+T细胞对各种靶细胞系的杀伤测定。
图13：根据方案2用CNA1003 CAR转导的T细胞上CD4和CD8表达的散点图，以及EGFR表达的直方图。
图14：CD3+CNA1003 CAR T细胞对各种癌细胞系的杀伤测定。
图15：CD3+CNA1003 CAR T细胞对各种癌细胞系的杀伤测定。
图16：CD8+CNA1003 CAR T细胞对各种癌细胞系的杀伤测定。
图17：CD4+CNA1003 CAR T细胞对各种癌细胞系的杀伤测定。
图18：CAR转导的CD4+T细胞对各种靶细胞系的细胞因子分泌测定。
图19：CAR转导的CD4+T细胞对各种靶细胞系的细胞因子分泌测定。
图20：本发明另一实施方案中使用的BLIV载体。
图21：评估表达短铰链和长铰链BLIV-CAR的CD8+T细胞的效应子功能的杀伤测定。
图22：具有改变的抗原识别结构域的CAR构建体对不同癌细胞系的杀伤测定。
图23：前列腺癌的体内异种移植模型中的CD3+CNA1003 CAR T细胞功能。
图24：具有单剂量和双剂量的CD3+细胞的活CD4+和CD8+肿瘤浸润CNA1003 CAR T细胞的百分比。
图25：CD3+CD4+肿瘤浸润CNA1003 CAR T细胞的细胞因子分泌和激活概况。
图26：CD3+CD8+肿瘤浸润CNA1003 CAR T细胞的细胞因子分泌和激活概况。
图27：前列腺癌体内异种移植模型中的CD8+CNA1003 CAR T细胞功能。
图28：CD8+肿瘤浸润CNA1003 CAR T细胞的细胞因子概况和激活概况。
图29：施用不同剂量的CNA1003 CAR T细胞的小鼠异种移植前列腺癌模型中的肿瘤生长和尺寸。
图30：来自施用单剂量或双剂量的1x107个或2x107个CD3+CAR T细胞的小鼠的活CD3+肿瘤浸润CNA1003 CAR T细胞的总数和百分比，以及肿瘤浸润CAR T细胞的表型分析。
图31：CD4+和CD8+肿瘤浸润CAR T细胞对细胞毒性效应分子颗粒酶b和穿孔素的表达。
图32：乳腺癌体内异种移植模型中的CD8+CNA1003 CAR T细胞功能和肺转移性结节的定量。
发明详述
本文所指的核苷酸和多肽序列由序列标识号(SEQ ID NO:)表示。表1中提供了序列标识符的概述。还提供了序列表作为说明书的一部分。
表1
序列描述
Figure BDA0002791121080000091
Figure BDA0002791121080000101
Figure BDA0002791121080000111
本发明部分地基于发明人的认识，即CAR识别功能失调性P2X7受体的能力根据CAR的抗原识别结构域和跨膜结构域之间的接头结构域的长度而变化。因此，表达CAR的免疫细胞对表达功能失调性P2X7受体的靶细胞的功效受将抗原识别结构域连接至跨膜结构域的接头结构域的长度影响。具体而言，表达CAR的免疫细胞靶向并杀伤多种癌细胞类型的能力受到接头长度的影响。
如本领域已知，嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的蛋白质，其在细胞表面上表达时可以诱导抗原特异性细胞应答。CAR包括至少三个结构域：第一结构域是特异性识别抗原或者更具体地抗原的一个或多个表位部分的胞外抗原识别结构域；第二结构域是能够诱导或参与诱导细胞内信号传导途径的信号传导结构域；以及第三结构域是跨膜结构域，其跨越质膜并桥接细胞外抗原识别结构域和细胞内信号传导结构域。
前面的两个结构域的组合决定了CAR的抗原特异性和CAR诱导所期望的细胞应答的能力，其后者也取决于CAR的宿主细胞。例如，在T辅助细胞中表达并且具有包含CD3激活结构域的信号传导结构域的CAR的激活可以在一旦通过遇到其同源抗原而被激活就诱导CD4+T辅助细胞分泌一系列细胞因子。在进一步的实例中，同一CAR在CD8+细胞毒性T细胞中表达时，一旦由表达同源抗原的细胞激活就可以诱导细胞毒素的释放，其最终导致诱导抗原表达细胞的凋亡。
第三结构域(跨膜结构域)可以包含CAR信号传导结构域的一部分或可以与信号传导结构域缔合。跨膜结构域通常是一个或多个疏水性螺旋，其跨越细胞的脂质双层并将CAR嵌入细胞膜内。CAR的跨膜结构域可以是与细胞缔合时CAR的表达模式中的一个决定因素。例如，使用与CD3共受体缔合的跨膜结构域可以允许CAR尤其在幼稚T细胞中表达，而使用来自CD4共受体的跨膜结构域可以指导CAR在T辅助细胞中的表达。CD8共受体跨膜结构域的使用可以指导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中的表达，而CD28跨膜结构域可以允许在CTL和T辅助细胞两者中的表达，并且可以帮助稳定CAR。
嵌合抗原受体的另一组分或部分可以是接头结构域。接头结构域从跨膜结构域的细胞外侧跨越到抗原识别结构域，从而将抗原识别结构域连接到跨膜结构域。通常，在本领域中，接头结构域被视为任选的结构域，因为一些CAR在没有接头结构域的情况下起作用。
尽管不希望受到理论的束缚，据假设T细胞的效应子功能取决于T细胞与其靶细胞之间适当大小的突触的形成。通常，当T细胞经由其T细胞受体(TCR)识别抗原时，抗原的表位由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递(具体地，对于CD8+T细胞是MHC I类，且对于CD4+T细胞是MHC II类)。因此，T细胞与靶细胞之间的距离(突触距离)是恒定的(这是由TCR和MHC分子的长度决定的)。但是，CAR T细胞不是这种情况。
给定的CAR T细胞识别的表位将根据靶分子的大小和结构，表位在靶分子上的位置以及嵌合抗原受体(特别是抗原识别结构域)的性质而变化。此外，取决于表位在靶分子上的位置，嵌合抗原受体可能需要一定程度的柔性以允许抗原识别结构域的定向以与靶分子适当地相互作用并识别靶分子。
因此，在CAR中包括接头结构域可能是有益的，因为接头结构域可以为CAR的抗原识别结构域提供柔性，以允许抗原识别结构域的必要定向，并调节免疫突触距离。
本发明人已经认识到，当将抗原识别结构域连接至跨膜结构域的连接结构域在12至228个氨基酸之间，或优选在30至228个氨基酸之间时，嵌合抗原受体针对功能失调性P2X7受体的功能被优化。结果，优化的嵌合抗原受体能够靶向表达功能失调性P2X7受体的多种细胞类型。优选地，靶细胞是癌细胞，并且优化的嵌合抗原受体(在免疫细胞上表达时)可以靶向多种癌细胞类型。这是特别有利的，由于功能失调性P2X7被广泛的恶性肿瘤表达，因而表达本发明的优化的嵌合抗原受体的免疫细胞可以靶向各种癌症。
因此，本发明提供了嵌合抗原受体，其包括识别功能失调性P2X7受体的抗原识别结构域、跨膜结构域和接头结构域，其中所述接头结构域由12至228个之间的氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由30至228个之间的氨基酸组成。
抗原识别结构域
在国际公开WO2017/041143中，描述了靶向表达功能失调性P2X7受体的细胞的嵌合抗原受体，其全部公开内容通过引用的方式并入。
P2X7受体(嘌呤能受体P2X，配体门控离子通道，7)是在包括人类在内的多种物种中表达的ATP-门控离子通道。该受体由基因编码，所述基因的正式符号表示为P2RX7。该基因又被称为P2X嘌呤受体7、ATP受体、P2Z受体、P2X7受体和嘌呤能受体P2X7变体A。对于本公开的目的，该基因和编码的受体在本文中分别被称为P2X7和P2X7。
人P2X7基因的mRNA、编码(cDNA)和氨基酸序列分别以SEQ ID NO:1至3示出。人P2X7基因的mRNA和氨基酸序列也分别表示为GenBank登录号NM_002562.5和NP_002553.3。P2X7基因在黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、猪、鸡、斑马鱼和蛙中至少部分是保守的。人类和其他物种中的P2X7基因的更多详情可以从国家生物技术信息中心(National Centrefor Biotechnology Information)(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank数据库获得。例如，基因ID号对于人P2X7是5027，对于黑猩猩是452318，对于猴是699455，对于犬是448778，对于牛是286814，对于小鼠是18439，对于斑马鱼是387298，且对于蛙是398286。此外，至少73种生物体与人P2X7基因具有直向同源物。
关于人和其他物种中的P2X7基因的进一步详情也可以在NCBI的UniGene门户处找到(例如对于人P2X7参见UniGene Hs.729169-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi？UGID＝4540770&TAXID＝9606&SEARCH)。或者，可以从UniProt数据库(www.uniprot.org)获得P2X7基因的核苷酸和氨基酸序列的详情，其中人P2X7基因的UniProt ID是Q99572。将GenBank和UniProt记录的内容通过引用并入本文。
P2X7受体由三个蛋白质亚基(单体)形成，其中在人的天然受体中，至少一个单体具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。应当理解，如本文所提及的“P2X7受体”还包括受体的天然存在的变异，包括受体的剪接变体、天然存在的截短形式和等位变体。P2X7受体还可以包括具有经修饰的氨基酸序列的亚基，例如包括SEQ ID NO:3中所示的氨基酸的截短、氨基酸缺失或修饰的那些。
例如，P2X7基因或编码蛋白质的“变体”可以分别展示出与天然P2X7受体至少80％相同，至少90％相同，至少95％相同，至少98％相同，至少99％相同或至少99.9％相同的核酸或氨基酸序列。
P2X7受体通过ATP与该受体的ATP结合位点结合而被激活。这导致通道的快速打开(几毫秒内)，所述通道选择性允许小阳离子移动穿过膜。短时间段(几秒内)后，在细胞膜上形成了大孔，其允许高达900Da大小的分子渗透过细胞膜。这种孔形成最终导致细胞去极化，并且在许多情况下导致细胞毒性和细胞死亡。这种作用导致了相信P2X7受体参与多种细胞类型的凋亡。
P2X7受体功能的降低或丧失可以导致对诱导的凋亡有相当抗性的细胞。在许多情况下，这种对凋亡的抗性在正常“健康”细胞向突变的癌前或癌性细胞的转变中是至关重要的。因此，靶向具有P2X7受体的功能降低或功能丧失的细胞的能力为癌症疗法提供了可能的靶标。
因此，本发明的嵌合抗原受体识别功能失调性P2X7受体。如整个说明书中使用，关于P2X7受体的术语“功能失调性”包括相对于其在可比较细胞中相对正常的功能的受体的功能降低。在一些实施方案中，P2X7受体的功能可以降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于99％。在一些实施方案中，术语“功能失调性”可以包括非功能性P2X7受体。
本文涵盖了导致功能失调性受体的P2X7受体的野生型或天然形式中的任何改变。例如，功能失调性受体可以是受体的一个或多个氨基酸突变或改变的结果，所述氨基酸与结合受体的ATP相关。实际上，P2X7受体是功能失调性的，因为它具有在ATP结合位点处结合ATP的降低的能力，或不能在ATP结合位点处结合ATP。在这种情况下，嵌合抗原受体的抗原识别结构域将识别与ATP结合位点相关的功能失调性P2X7受体的表位。因此，在本发明的一些实施方案中，嵌合抗原受体的抗原识别结构域识别与P2X7受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点相关的表位。在一些实施方案中，与完整功能性P2X7受体的ATP结合能力相比，功能失调性P2X7受体具有降低的结合ATP的能力。在一些实施方案中，功能失调性P2X7受体不能结合ATP。
P2X7受体的一个或多个氨基酸的改变可以包括受体的一个或多个氨基酸的构象改变。因此，在本发明的一些实施方案中，抗原识别结构域识别功能失调性P2X7受体，其中所述功能失调性P2X7受体具有使受体功能失调的构象变化。具体而言，该构象变化可以是P2X7受体的一个或多个氨基酸从反式构象改变为顺式构象。在一些实施方案中，P2X7受体的位置210处的脯氨酸从反式构象变为顺式构象。在这种情况下，CAR的抗原识别结构域可以识别包括P2X7受体的氨基酸位置210处脯氨酸的表位。在本发明第一方面的一些实施方案中，抗原识别结构域识别包括跨越所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置200处的甘氨酸至氨基酸位置216处的半胱氨酸(包括端点)的一个或多个氨基酸的表位。在本发明第一方面的一些实施方案中，抗原识别结构域识别包括功能失调性P2X7受体的位置210处的脯氨酸的表位。在本发明第一方面的一些实施方案中，抗原识别结构域识别表位，所述表位包括功能失调性P2X7受体的位置210处的脯氨酸，和跨越所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置200处的甘氨酸至氨基酸位置216处的半胱氨酸(包括端点)的氨基酸残基中的一个或多个。
虽然不希望受理论束缚，但由于P2X7受体位置210处的脯氨酸构象改变，受体的三维结构可以得以改变。三维结构的这种改变可以允许CAR的抗原识别结构域结合先前在P2X7受体的天然三维结构中不可接近的氨基酸或表位。因此，在一些实施方案中，CAR识别由于SEQ ID NO:3的位置210处的脯氨酸的反式至顺式构象变化而暴露于抗原识别结构域的P2X7受体的一个或多个表位。这些表位可以包括P2X7受体的位置200至210或位置297至306(包括端点)处的一个或多个氨基酸。因此，在本发明第一方面的一些实施方案中，抗原识别结构域识别包括P2X7受体的位置200至210和/或297至306处的一个或多个氨基酸的表位。
如整个说明书中使用的，术语“识别”指抗原识别结构域与功能失调性P2X7受体，其部分或其表位缔合的能力。在一些实施方案中，抗原识别结构域可以直接结合功能失调性P2X7受体或其表位。在其他实施方案中，抗原识别结构域可以与功能失调性P2X7受体的加工形式结合。如本上下文中使用的，术语“加工形式”指通常由于细胞内加工而已经截短或消化的P2X7受体形式。因此，功能失调性P2X7受体的“加工形式”的识别可以是由于与主要组织相容性复合体(MHC)缔合而呈现的结果。
抗原识别结构域可以是可以识别功能失调性P2X7受体或其表位的任何合适的结构域。如整个说明书中使用，术语“抗原识别结构域”是指提供CAR对功能失调性P2X7受体的特异性的CAR部分。在本发明的背景下，抗原识别结构域仅包含CAR的细胞外区域(胞外域)的一部分。合适的抗原识别结构域包括但不限于与结合功能失调性P2X7受体的抗体的抗原结合位点具有序列同源性的多肽或其片段。因此，在本发明第一方面的一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能失调性P2X7受体的抗体具有同源性的氨基酸序列或其部分。在一些实施方案中，抗原识别结构域的部分包括与结合功能失调性P2X7受体的抗体具有同源性的氨基酸序列或其部分。与抗原结合结构域具有同源性的抗体序列可以是对P2X7受体具有亲和力的任何合适的抗体的序列。例如，该序列可以与源自以下物种中的一种或多种的抗体共享序列同源性；人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、雪貂、犬、鸡、猫、豚鼠、仓鼠、马、牛或猪。抗原识别结构域可以与从杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的序列共享序列同源性。当同源抗体序列的起源物种不是人类时，抗体优选是人源化抗体。同源抗体序列也可以来自非哺乳动物物种，如软骨鱼(例如鲨鱼IgNAR抗体-参见WO2012/073048)。或者，抗原结合结构域可以包括提供与鲨鱼抗体相似功能的经修饰的蛋白质支架，如具有基于鲨鱼IgNAR抗体的结合部分的i-体(i-body)(参见WO2005/118629)。另外，抗原识别结构域可以是任何其他合适的结合分子或肽，可以源自任何其他合适的结合分子或肽，或可以与任何其他合适的结合分子或肽共享序列同源性，所述结合分子或肽可以以足以激活CAR信号传导结构域的亲和力选择性与功能失调性P2X7受体相互作用。本领域已知用于鉴定抗原结合蛋白质的方法，如尤其是淘选噬菌体展示文库，蛋白质亲和层析，共免疫沉淀和酵母双杂交系统(参见Srinivasa Rao,V.et al.Int J Proteomics,2014；文章ID 147648)。
在以上上下文中(并在整个说明书中使用)，术语“同源性”和“同源”应根据美国国家生物技术信息中心医学主题词(NCBI MeSH)定义的“序列同源性，氨基酸”的定义来解释。这样，术语“同源性”和“同源”等应解释为“氨基酸的序列之间的相似度”。
在一些实施方案中，抗原识别结构域包含与结合功能失调性P2X7受体的单抗体结构域(sdAb)同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与来自抗体的可变重链(VH)或抗体的可变轻链(VL)的3个CDR同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能失调性P2X7受体的多价sdAb的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价sdAb是二价或三价sdAb。
在一些实施方案中，CAR的抗原识别结构域包括与结合功能失调性P2X7受体的抗体的片段-抗原结合(Fab)部分的氨基酸序列同源的氨基酸序列。如本领域中理解的，抗体的Fab部分由抗体的重链和轻链中每条的一个恒定区和一个可变区构成。
在本发明的一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能失调性P2X7受体的单链可变片段(scFv)的氨基酸序列同源的氨基酸序列。如本领域中理解的，scFv是包含用接头肽连接在一起的两部分的融合蛋白，所述两部分可以与抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)共享同源性或可以与抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)相同。例如，scFv可以包括源自识别功能失调性P2X7受体的抗体的VH和VL氨基酸序列。
在以上上下文中，将理解的是，术语“源自”不是指多肽本身的来源，而是指构成抗原结合区的部分的氨基酸序列信息的起源。因此，术语“源自”包括与结合功能失调性P2X7受体的抗体共享序列同一性的合成、人工或其他方式产生的多肽。
在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能失调性P2X7受体的多价scFv的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价scFv是二价或三价scFv。
在一些实施方案中，抗原识别结构域包括SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，抗原识别结构域包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体。
在一些实施方案中，抗原识别结构域包括结合肽，其包含与结合功能失调性P2X7受体的抗体的一个或多个CDR区具有同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合肽包括与结合功能失调性P2X7受体的抗体的VH和/或VL链的CDR1、2和3结构域具有序列同源性的一个或多个区域。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与跨越SEQ ID NO:4、6、7或8所示序列的位置30至35、50至67或98至108的CDR区中的任一个至少50％、60％、70％、80％、90％或94％相同的一个或多个序列。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括跨越SEQ IDNO:4、6、7或8所示序列的位置30至35、50至67或98至108处的一个或多个序列。间隔SEQ IDNO:4、6、7或8所示的抗原结合肽的CDR区的序列可以是允许CDR区的合适形成和构象的任何适合的序列。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与SEQ ID NO:4、6、7或8所示序列之一50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的序列。
已经在本领域中描述了针对功能失调性P2X7受体的抗体(可以从其衍生合适的氨基酸序列)以及用于生产此类抗体的方法(例如WO2001/020155，WO2003/020762，WO2008/043145，WO2008/043146，WO2009/033233，WO2011/020155和WO2011/075789)。用于产生针对特定表位的多克隆和单克隆抗体的方法(如之前给出的那些)将是本领域技术人员已知的。总之，在合适的免疫原性载体蛋白和任选地佐剂存在下将期望的表位(如包括位置210处的脯氨酸的功能失调性P2X7受体的区段)注射入合适的宿主动物中。然后从经免疫的动物中收集血清，并且可以基于抗体类别或其抗原特异性分离抗体。在评估纯化的抗体的适合性和特异性之后，可以进一步处理抗体以分离抗原结合片段，或测序以鉴定相关VH和VL结构域。用于产生针对功能失调性P2X7受体的抗体的合适表位是本领域已知的(参见WO2008/043146，WO2010/000041和WO2009/033233作为实例)。
接头结构域
接头结构域连接跨膜结构域和抗原识别结构域。已经形成了在不包括接头结构域的情况下起作用的CAR T细胞，因此，在这种情况下，接头结构域通常不被认为对所有CAR的功能都是必不可少的。然而，如上所述，并且不希望受到理论的束缚，接头结构域可以为CAR的胞外域(细胞外结构域)提供适当的分子长度，以允许抗原识别结构域识别表位，同时在表达CAR的效应细胞与靶细胞之间形成正确的免疫突触距离。此外，接头结构域可以为抗原识别结构域以正确的方式定向以识别其表位提供适当的柔性。
合适的接头结构域的选择可以基于(i)降低与Fc受体(如Fcγ和FcRn受体)的结合亲和力，从而使CAR表达细胞的“脱靶”激活最小化和(ii)通过增强抗原结合区的柔性优化CAR构建体的功效，减少形成免疫突触的空间限制(例如减少空间位阻和优化突触距离)。然而，选择铰链的方法在本领域中被认为是不可预测的，并且取决于表达CAR的效应细胞所靶向的特定抗原和表位的位置。
如实施例中所示，当接头结构域的长度为12个氨基酸时，表达针对功能失调性P2X7受体的CAR的细胞显示对大多数癌细胞系几乎没有反应性。此外，当接头结构域为228个氨基酸时，表达针对功能失调性P2X7受体的CAR的细胞显示对大多数癌细胞系几乎没有反应性。但是，转导入CD3+T细胞以及CD4+CD8+T细胞的纯化亚群时，仅119个氨基酸的接头针对大多数细胞系表现出广泛的功效。通常，CAR靶向对一种或选择的几种癌症类型特异的上调细胞标志物。这样，在设计CAR时通常不考虑与多种癌细胞类型的广泛反应性，通常也不认为其重要。但是，功能失调性P2X7受体由多种癌症类型表达。因此，与其他CAR不同，靶向功能失调性P2X7的CAR需要针对各种癌细胞类型进行优化。
此外，在一些实例中，与表达功能失调性P2X7受体的细胞系一起温育时，表达具有30个氨基酸的接头结构域的CAR并且针对功能失调性P2X7受体的细胞表现出与表达具有228个氨基酸的接头结构域的CAR的细胞相当的反应性。
因此，在一些实施方案中，接头结构域由12至228个氨基酸，或30至228个氨基酸，或50至200个氨基酸，或70至180个氨基酸，或90至160个氨基酸，或107至131个氨基酸组成氨基酸，或110至130个氨基酸，或115至125个氨基酸，或117至121个氨基酸组成。因此，在一些实施方案中，接头结构域由12至228个之间的氨基酸，或30至228个之间的氨基酸，或50至200个之间的氨基酸，或70至180个之间的氨基酸，或90至160个之间的氨基酸组成氨基酸，或107至131个之间的氨基酸，或110至130个之间的氨基酸，或115至125个之间的氨基酸，或117至121个之间的氨基酸组成。
如在整个说明书中参考数字范围所使用的，术语“在……之间”应理解为不包含边界数字。例如，在1至10之间是指2到9的范围(包括端点)。
在一些实施方案中，接头结构域由约119个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由119个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域的长度是119个氨基酸±50个氨基酸，或±40个氨基酸，或±30个氨基酸，或±20个氨基酸，或±10个氨基酸，或±5个氨基酸，或±2个氨基酸或±1个氨基酸。
在一些实施方案中，接头结构域由12至227个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由13至227个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由30至228个氨基酸组成。在一些实施方案中，接头结构域由31至227个氨基酸组成。
在一些实施方案中，接头结构域包括与来自免疫球蛋白的铰链区或来自参与细胞T细胞突触形成的膜结合分子的铰链区或胞外区同源的序列。例如，接头结构域可以包含具有与来自CD4、CD8、CD3、CD7或CD28区的铰链区同源的氨基酸序列的区域。
在一些实施方案中，接头结构域包含与免疫球蛋白的部分同源的序列。在一些实施方案中，该部分是CH1区、CH2区、CH3区、CH4区或铰链区的一个或多个。在一些实施方案中，该部分是免疫球蛋白的CH2区、CH3区或铰链区。在一些实施方案中，该部分是免疫球蛋白的CH2区或CH3区和铰链区。在一些实施方案中，免疫球蛋白选自IgG亚型。
在一些实施方案中，接头结构域与以下同源：IgG1的Fc区的部分，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域与以下同源：IgG2的Fc区，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域与以下同源：IgG3的Fc区，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域与以下同源：IgG4的Fc区，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域包括与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区中的超过一个的部分具有同源性的序列，例如，IgG1铰链区和IgG4的CH2或CH3区。
在一些实施方案中，接头结构域包括全部或部分免疫球蛋白铰链区。如本领域中将理解的，形成免疫球蛋白的铰链区的特定区因不同的同种型而变化。例如，IgA、IgD和IgG同种型免疫球蛋白在CH1和CH2区之间具有铰链区，而铰链区的功能由IgE和IgM同种型免疫球蛋白的CH2区提供。
以下表2中提供了可以并入接头结构域的序列的非穷举列表。在一些实施方案中，本发明的接头结构域可以包括表2中提供的任何一种或多种组分。在一些实施方案中，接头结构域可以包含表2中提供的一种或多种接头。此外，接头结构域可以是人工合成的序列，如聚甘氨酸序列或GGGGS(Gly4Ser)序列的重复序列(例如(Gly4Ser)3)。
表2可能的接头结构域组分
Figure BDA0002791121080000211
Figure BDA0002791121080000221
在一些实施方案中，接头结构域包括与选自SEQ ID NO:9至25和30至37的任何一个或多个序列同源的序列，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体或其部分。
在一些实施方案中，接头结构域包括与免疫球蛋白CH3结构域、免疫球蛋白CH2结构域或者CH2和CH3结构域两者同源的序列。在一些实施方案中，接头结构域包括与免疫球蛋白铰链区以及CH3结构域或CH2结构域的一个或多个同源的序列。免疫球蛋白序列可以包括一个或多个氨基酸修饰，例如1、2、3、4或5个取代、缺失、插入或添加，例如减少Fc受体(FcR)或新生儿Fc受体(FcRn)结合的取代。
术语“取代”是指亲本肽或蛋白质序列中特定位置的氨基酸被另一种氨基酸替代。可以以非保守的方式(例如，通过将属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一氨基酸分组的氨基酸；例如用疏水氨基酸取代亲水氨基酸)或以保守的方式(例如，通过将属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于同一分组的氨基酸；例如用亲水氨基酸取代亲水氨基酸)进行取代以改变所得蛋白质中的氨基酸。此类保守的改变通常导致经修饰的肽/蛋白质的构象和功能改变的减少。以下是各种氨基酸分组的实例：1)具有非极性R基团的氨基酸：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸；2)具有不带电荷的极性R基团的氨基酸：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；3)具有带电荷的极性R基团的氨基酸(在pH 6.0下带负电荷)：天冬氨酸，谷氨酸；4)碱性氨基酸(在pH 6.0下带正电荷)：赖氨酸，精氨酸，组氨酸(在pH 6.0下)。另一分组可以是具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。
本领域技术人员将认识到，任何氨基酸均可被化学上(功能上)相似的氨基酸取代并保留多肽的功能。此类保守氨基酸取代是本领域众所周知的。表3中的以下各组各自含有对于彼此是保守取代的氨基酸。
表3
示例性氨基酸保守取代
Figure BDA0002791121080000231
术语“插入”是指在序列内部添加氨基酸。“添加”是指氨基酸添加到序列的末端。“删除”是指从序列中去除氨基酸。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含接头结构域，该接头结构域包含与IgG，IgD，IgA的免疫球蛋白铰链区或IgM或IgE的重链恒定区2(CH2)同源的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、96％或99％序列同一性的功能变体。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包含与来自IgG同种型免疫球蛋白的铰链区同源的氨基酸序列，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、96％或98％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域包含与IgG1，IgG2，IgG3或IgG4铰链区同源的氨基酸序列，或其具有至少50％、66％、73％、75％、80％、83％、86％、91％、93％、96％或98％序列同一性的功能变体。在一些实施方案中，接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：包含一个或多个氨基酸残基被不同于未修饰的铰链结构域中存在的氨基酸残基取代的IgG1，IgG2，IgG3或IgG4铰链区。在一些实施方案中，接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：IgG1，IgG2或IgG4的铰链区，或其具有至少50％、66％、73％、75％、80％、83％，86％、91％或93％序列同一性的功能变体。
图2提供了IgG亚型铰链区和IgG4(突变的)铰链区(在本发明的实施方案中使用的“CAR-T-铰链”)的比对。另外，图3提供了IgG1，IgG2和IgG4铰链区和IgG4(突变的铰链区)的比对。可以看出，IgG1，IgG2和IgG4铰链区与IgG3的一部分之间具有高度的同源性。
在一些实施方案中，序列与来自IgG同种型免疫球蛋白的铰链区同源并包含CXXC基序，其中“C”是半胱氨酸且“X”是任何氨基酸。在一些实施方案中，CXXC基序选自CPPC，CPRC或CPSC。在优选实施方案中，CXXC基序是CPPC。在一些实施方案中，与铰链区同源的序列经修饰以包含CPPC基序。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包含与免疫球蛋白的CH区同源的一个或多个氨基酸序列。在一些实施方案中，与CH区同源的氨基酸序列与免疫球蛋白的CH1区、CH2区、CH3区或CH4区中的一个或多个同源，或与所述CH区域具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包含与IgG同种型免疫球蛋白的CH2区或CH3区中的一个或多个同源的一个或多个氨基酸序列，或与所述CH2或CH3区具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包含一个或多个免疫球蛋白铰链区和/或一个或多个免疫球蛋白的CH区。在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域由免疫球蛋白铰链区和CH区，优选CH2区或CH3区组成。在一些实施方案中，CH2和/或CH3区来自IgG同种型免疫球蛋白。在一些实施方案中，CH2和/或CH3区来自IgG抗体的IgG4亚类。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域包含根据SEQ ID No:9至17的氨基酸序列或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体或功能部分，优选嵌合抗原受体包含根据SEQ ID No:9至13的氨基酸序列或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体或功能部分。在一些实施方案中，接头结构域包含以下或由以下组成：根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或其具有至少50％、66％、73％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能变体。
免疫球蛋白(特别是IgG同种型抗体)的铰链区、CH2区和CH3区可以被Fc受体(如Fcgamma受体和Fc新生儿受体)结合。嵌合抗原受体的接头结构域的结合可以降低受体的功效，并可以导致脱靶杀伤。因此，在一些实施方案中，设计接头结构域以使其具有降低的或不具有与Fc受体结合的能力。在一些实施方案中，接头结构域与相比于其他免疫球蛋白同种型具有降低的Fc受体结合能力的免疫球蛋白同源。在一些实施方案中，嵌合抗原受体的接头结构域在接头结构域中不包含实质上与Fc受体结合的氨基酸序列。
Fc受体与不同IgG同种型结合的能力在以下表4中给出。
表4
与IgG亚型3结合的Fc受体
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
FcγRIa(CD64) +++ - ++++ ++
FcγRIIaa(CD32) +++ ++ ++++ ++
FcγRIIba(CD32) + - ++ +
FcγRIIIba(CD16a) +++ - ++++ -
FcRn +++ +++ +++ +++
在一些实施方案中，其中接头结构域包含与免疫球蛋白的Fc区同源的部分，该部分可以被修饰以减少与Fc受体的结合。本领域已知修饰Fc区以减少被Fc受体结合的方法。Fc gamma受体主要与免疫球蛋白区的较低铰链区和CH2区的n端结合，而新生儿Fc受体主要与CH2区的c端和CH3区的N端的氨基酸结合。Fc受体与IgG抗体结合的指南可在“AntibodyFc:Linking Adaptive and Innate Immunity”Ackerman and Nimmerjahn,ElsevierScience&Technology 2014的第7章中找到。因此，在这些区域进行修饰可以改变Fc受体与接头结构域的结合，该接头结构域与免疫球蛋白的Fc部分具有同源性。已显示可减少Fc-gamma受体和FcRn结合的人IgG1突变的非详尽示例列表包括：E116P，L117V，L118A，G119缺失，P121A，S122A，I136A，S137A，R138A，T139A，E141A，D148A，S150A，S150A，E152A，D153A，E155A，N159A，D163A，H168A，N169A，K171A，K173A，R175A，E176A，Q178A，Y179F，N180A，S181A，R184A，V188A，T190A，L192A，Q194A，N195A，D195A K200A，K205A，K209A，A210Q，A210S，A210G，P212A，P214A，E216A，K217A，S220A，K221A，A222T，K243A，Q245A，H251A，D259A，A261Q，E263A，E265A，V286A，S288A，K297A，S307A，E307A H316A，N317A，H318A，Y319A(编号对应于Uniprot参考编号P01857-1和SEQ ID NO:26中列出的序列)。图4和图5提供了四种IgG亚型的CH2和CH3区与本文提供的示例中使用的CH2和CH3区的比较。
跨膜和细胞内结构域
CAR的跨膜结构域将细胞外部分(胞外域)桥接至细胞内部分(胞内域)，其作用主要是结构性的。这样，跨膜结构域可以由可锚定并跨越细胞的脂质双层的任何序列组成。但是，跨膜结构域的性质可以影响其定位和表达。
在优选实施方案中，跨膜结构域与参与T细胞突触形成或T细胞信号诱导的分子的序列具有同源性。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含跨膜结构域，其包含与CD3，CD4，CD8或CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与CD8或CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列。
除了抗原识别结构域，接头结构域和跨膜结构域之外，本发明的嵌合抗原受体包含细胞内结构域(胞内域)，所述胞内域包含信号传导部分(信号传导结构域)。
嵌合抗原受体的细胞内信号传导结构域可以是由抗原识别结构域识别抗原导致的CAR活化后能够诱导细胞内信号传递级联或参与诱导细胞内信号传递级联的任何合适的结构域。CAR的信号传导结构域将根据CAR活化后期望的细胞结果而具体选择。尽管存在许多可能的信号传导结构域，当用于免疫治疗和癌症治疗时，信号传导结构域可以基于它们来源的受体，即活化受体和共刺激受体(参见下面的进一步详情)而分为两大类。因此，在一些实施方案中，信号传导结构域包括源自活化受体的部分。在一些实施方案中，信号传导结构域包括源自共刺激受体的部分。
如整个说明书中使用，针对活化受体或共刺激受体使用术语“部分”时，指受体中包括负责或参与受体与其关联抗原或配体相互作用后细胞内信号传导级联的起始/诱导的序列的任何区段。下文概述了通过CD3起始/诱导T细胞受体(TCR)的细胞内信号传递级联的实例。
不希望受理论束缚，TCR的细胞外部分主要包含克隆型TCRα和TCRβ链(TCRα/β受体)或TCRγ和TCRδ链(TCRγδ受体)的异二聚体。这些TCR异二聚体通常缺乏固有的信号传导能力，并且因此它们与CD3的多个信号传导亚基(主要是CD3-zeta，CD3-gamma，CD3-delta和CD3-epsilon)非共价缔合。CD3的gamma、delta、和epsilon链中的每个具有细胞内(细胞质)部分，其包括单个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(Immune-receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif，ITAM)，而CD3-zeta链包含三个串联ITAM。在MHC存在下，TCR由其关联抗原接合以及必需的共受体例如CD4或CD8结合后，起始信号传导，这导致酪氨酸激酶(即Lck)磷酸化CD3链的细胞内ITAM内的两个酪氨酸残基。随后，募集第二个酪氨酸激酶(ZAP-70-本身由Lck磷酸化激活)以使ITAM双磷酸化。结果，几个下游靶蛋白被活化，其最终导致细胞内构象改变，钙动员和肌动蛋白细胞骨架重排，当它们组合在一起时最终导致转录因子激活和T细胞免疫应答的诱导。
如整个说明书中使用的，术语“活化受体”涉及形成T细胞受体(TCR)复合物的组分或参与T细胞受体(TCR)复合物的形成的受体或共受体，或参与由识别抗原性或其他免疫原性刺激物导致的免疫细胞的特异性活化的受体。
此类活化受体的非限制性实例包括T细胞受体-CD3复合物的组分(CD3-zeta，CD3-gamma，CD3-delta和CD3-epsilon)，CD4共受体，CD8共受体，Fc受体或自然杀伤(NK)细胞相关活化受体诸如LY-49(KLRA1)，天然细胞毒性受体(NCR，优选NKp46，NKp44，NKp30或NKG2或CD94/NKG2异二聚体)。因此，在本发明第一方面的一些实施方案中，信号传导结构域包括源自以下成员中的任一种或多种的部分：CD3共受体复合物(优选CD3-Zeta(ζ)链)，CD4共受体，CD8共受体，Fc受体(FcR)(优选FcεRI或FcγRI)或NK相关受体如LY-49。
每个CD3链的特定细胞内信号传导部分是本领域已知的。举例来说，CD3ζ链的细胞内胞质区从SEQ ID NO:42所示序列的氨基酸52跨越至氨基酸164，其中三个ITAM区跨越SEQID NO:42的氨基酸61至89，100至128和131至159。此外，CD3ε链的细胞内部分跨越SEQ IDNO:43所示序列的氨基酸153至207，其中单个ITAM区跨越SEQ ID NO:43的氨基酸178至205。CD3γ链的细胞内部分跨越SEQ ID NO:44所示序列的氨基酸138至182，其中单个ITAM区跨越SEQ ID NO:44的氨基酸149至177。CD3δ的细胞内部分跨越氨基酸SEQ ID NO:45所示序列的氨基酸127至171，其中单个ITAM区跨越SEQ ID NO:45的氨基酸138至166。
在本发明的一些实施方案中，信号传导结构域包括源自CD3(优选CD3-ζ链或其部分)的部分或与CD3(优选CD3-ζ链或其部分)具有序列同源性的部分。在一些实施方案中，信号传导结构域包括与CD3 zeta(CD3-ζ)的细胞内结构域的全部或部分同源的信号。在一些实施方案中，CD3 zeta(CD3-ζ)共受体复合物的部分包括SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体。
可选择地，信号传导结构域包括Fc受体的细胞内部分，这是本领域已知的。例如，FcεR1的细胞内部分跨越SEQ ID NO:47所示序列的氨基酸1至59、118至130和201至244。此外，FcγRI的细胞内部分跨越SEQ ID NO:48所示序列的氨基酸314至374。
活化受体部分的各种组合可用于形成CAR的跨膜(TM)和细胞内(IC)部分，例如CD3ζTM和CD3ζIC(Landmeier S.et al.Cancer Res.2007；67:8335-43；Guest RD.et al.,JImmunother.2005,28:203-11；Hombach AA.et al.J Immunol.2007；178:4650-7)，CD4 TM和CD3ζIC(James SE.et al.J Immunol.2008；180:7028-38)，CD8 TM和CD3ζIC(PatelSD.et al.Gene Ther.1999；6:412-9)，以及FcεRIγTM和FcεRIγIC(Haynes NM.et al.JImmunol.2001；166:182-7；Annenkov AE.et al.J Immunol.1998；161:6604-13)。
如整个说明书中使用的，术语“共刺激受体”涉及在活化受体的抗原特异性诱导后辅助激活免疫细胞的受体或共受体。应当理解，共刺激受体不需要抗原的存在并且不是抗原特异性的，但通常是两种信号之一，另一种信号是诱导免疫细胞应答所需的激活信号。在免疫应答的情况下，共刺激受体通常通过在抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞或巨噬细胞表面上表达的其配体的存在而被激活。具体对于T细胞，共刺激对于导致细胞活化、增殖、分化和存活(所有这些通常是指在T细胞活化的保护下)是必需的，而在共刺激的缺乏下将抗原递呈给T细胞可导致无反应性，克隆删除和/或抗原特异性耐受的形成。重要的是，共刺激分子可告知T细胞对同时遇到的抗原的应答。一般而言，“阳性”共刺激分子背景下遇到的抗原将导致T细胞的活化和旨在消除表达该抗原的细胞的细胞免疫应答。然而，在“阴性”共受体背景下遇到的抗原将导致对共同遇到的抗原的耐受性的诱导状态。
T细胞共刺激受体的非限制性实例包括CD27，CD28，CD30，CD40，DAP10，OX40,4-1BB(CD137)，ICOS。具体而言，CD27，CD28，CD30，CD40，DAP10，OX40,4-1BB(CD137)和ICOS均代表增强T细胞应答活化的“阳性”共刺激分子。因此，在本发明第一方面的一些实施方案中，信号传导结构域包括源自CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)和ICOS中的任一种或多种的部分。
在本发明的一些实施方案中，信号传导结构域包括源自CD28、OX40或4-1BB共刺激受体的部分。在一些实施方案中，信号传导结构域包含4-1BB的部分。在一些实施方案中，4-1BB共刺激受体的部分包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％序列同一性的功能变体或部分。
可以利用共刺激受体部分的各种组合以形成CAR的跨膜(TM)和细胞内(IC)部分。例如CD8 TM和DAP10 IC或CD8 TM和4-1BB IC(Marin V.et al.Exp Hematol.2007；35:1388-97)，CD28 TM和CD28 IC(Wilkie S.et al.J Immunol.2008；180:4901-9；Maher J.etal.Nat Biotechnol.2002；20:70-5),以及CD8 TM和CD28 IC(Marin V.et al.ExpHematol.2007；35:1388-97)。
以上提到的活化和共刺激受体的序列信息在多种数据库中可以容易地获得。例如，表5中提供了这些受体的人氨基酸，基因和mRNA序列的实施方案。
表5活化和共刺激受体序列信息的概述
Figure BDA0002791121080000301
虽然参考人类活化和共刺激受体提供了表5，但本领域技术人员应当理解，每个受体的同源和直系同源形式存在于大多数哺乳动物和脊椎动物物种中。因此，以上提及的序列仅作为可包含在本发明第一方面的CAR中的受体序列的非限制性实例提供，并且可使用来自任何所需物种的同源和直系同源序列来产生适合于给定物种的CAR。
在本发明的一些实施方案中，跨膜结构域和信号传导结构域部分与同一分子共有同源性。例如，可以利用包含跨膜结构域和信号传导结构域的CD3部分。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列，或由与CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列组成；并且信号传导结构域包含CD28的细胞内结构域的全部或部分，或由CD28的细胞内结构域的全部或部分组成。
在本发明的一些实施方案中，信号传导结构域包括源自活化受体的部分和源自共刺激受体的部分。不希望受到理论的限制，在本上下文中，通过CAR的抗原识别结构域识别抗原将同时诱导细胞内活化信号和细胞内共刺激信号两者。因此，这将模拟表达共刺激配体的APC呈递抗原。可选择地，CAR可以具有信号传导结构域，其包含源自活化受体或共刺激受体的部分。在这种替代形式中，CAR将仅诱导活化细胞内信号传导级联或共刺激细胞内信号传导级联。
在本发明的一些实施方案中，信号传导结构域包含以下或由以下组成：4-1BB和CD3-ζ链的细胞内结构域的全部或部分。
在一些实施方案中，CAR将具有包含源自单个活化受体的部分和源自多个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自多个活化受体的部分和源自单个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自多个活化受体的部分和源自多个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自单个活化受体的部分和源自两个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自单个活化受体的部分和源自三个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自两个活化受体的部分和源自一个共刺激受体的部分的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR将具有包含源自两个活化受体的部分和源自两个共刺激受体的部分的信号传导结构域。应当理解的是，存在可以衍生信号传导结构域的活化受体和共刺激受体的数目的其他变化，并且认为上述示例不是对本文包括的可能组合的限制。
在本发明的一些实施方案中，跨膜结构域和信号传导结构域的部分与不同的分子共有同源性。在一些实施方案中，跨膜结构域包含以下或由以下组成：与CD28的跨膜结构域的全部或部分同源的序列；而信号传导结构域包含以下或由以下组成：4-1BB和CD3-ζ链的细胞内结构域的全部或部分。
嵌合抗原受体
在本发明的实施方案中，嵌合抗原受体包含：识别功能失调性P2X7受体的抗原识别结构域，包含与IgG4重链的铰链和CH3区同源的序列的接头结构域，包含与CD28的跨膜部分同源的序列的的跨膜结构域，以及包含CD3 zeta链的细胞内部分和4-1BB的胞质区的激活结构域，或者与同源部分的任一种具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的功能部分或等同物。
在本发明的一些实施方案中，嵌合抗原受体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51的功能变体。在一些实施方案中，功能变体包含与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51至少80％相同的氨基酸序列。在本发明的上下文中，“功能变体”可以包含任何氨基酸序列，只要它保持以上任一序列的功能。因此，相对于SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51之一，SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51之一的突变体形式或等位基因变体，直系同源物，同源物，类似物等等，功能变体可以具有例如一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，只要该功能变体保持SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51中的任一个的功能。
例如，对于SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51，嵌合抗原受体的优选功能是识别功能失调性P2X7受体，而不会显著识别功能性P2X7受体，并诱导细胞内信号传导，导致表达CAR的T细胞的活化。如本领域技术人员所理解的，可以对SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51所示的嵌合抗原受体的氨基酸序列的部分进行改变，而不会明显改变对功能失调性P2X7受体的识别和/或表达CAR的T细胞的活化。此类变化可以包括但不限于，嵌合抗原受体的铰链区的变化，跨膜结构域的变化，以及包含嵌合抗原受体的细胞内结构域的激活受体和/或共刺激受体部分的变化。
在一些实施方案中，功能变体可以包含与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51中的任一个至少85％的氨基酸序列同一性，至少90％的氨基酸序列同一性,至少91％的氨基酸序列同一性,至少92％的氨基酸序列同一性,至少93％的氨基酸序列同一性,至少94％的氨基酸序列同一性,至少95％的氨基酸序列同一性,至少96％的氨基酸序列同一性,至少97％的氨基酸序列同一性,至少98％的氨基酸序列同一性,至少99％的氨基酸序列同一性，或至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的氨基酸序列同一性。
当比较氨基酸序列时，应当在由多肽长度确定的比较窗口上比较序列。例如，设想表1中列出序列的任一种的至少20个氨基酸残基，至少50个氨基酸残基，至少75个氨基酸残基，至少100个氨基酸残基，至少200个氨基酸残基，至少300个氨基酸残基，至少400个氨基酸残基，至少500个氨基酸残基，至少600个氨基酸残基或全长内的比较窗口。比较窗口可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，约20％、约18％、约16％、约14％、约12％、约9％、约8％、约6％、约4％或约2％或更少的添加或缺失以用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施来进行，诸如BLAST家族的程序，如例如由Altschul等(1997,Nucl.Acids Res.25:3389-3402)公开的。全局比对程序也可用于比对大小大致相同的相似序列。全局比对程序的实例包括NEEDLE(可从www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得)，它是EMBOSS包的一部分(Rice P etal.,2000,Trends Genet.,16:276-277)，以及GGSEARCH程序(可从fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi？rm＝compare&pgm＝gnw获得)，它是FASTA包的一部分(Pearson W and Lipman D,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448)。这两个程序都是基于Needleman-Wunsch算法，该算法用于寻找两个序列沿着其整个长度的最佳比对(包括缺口)。序列分析的详细讨论也可以在Ausubel等(Unit 19.3("Current Protocols in Molecular Biology"John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章,1998)中找到。
核酸构建体与细胞的遗传修饰
本文所述的CAR可以通过本领域已知的任何方法来产生，尽管优选使用重组DNA技术来产生。可以通过本领域已知的分子克隆标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助的连接、定点诱变等)方便地制备编码嵌合受体几个区域的核酸，并将其组装成完整的编码序列。所得到的编码区优选插入到表达载体中，并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选T淋巴细胞细胞系，最优选自体T淋巴细胞细胞系。
因此，本发明还提供了核酸分子或核酸构建体，其包含编码以上所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子是非天然存在的核酸分子和/或合成的核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，核酸分子包括编码SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，功能变体包括与SEQ ID NO:50或SEQID NO:51至少80％相同的氨基酸序列。
核酸分子可以包含任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的或经修饰的RNA或DNA。例如，核酸分子可以包括单链和/或双链DNA，作为单链和双链区的混合物的DNA，单链和双链RNA，以及作为单链和双链区的混合物的RNA，包含可以是单链或更典型地是双链或单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，核酸分子可以包含三链区，其包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者。核酸分子还可以包含一个或多个经修饰的碱基或为了稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此术语“核酸分子”包含经化学，酶促或代谢修饰的形式。
在本发明的一些实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列。
本领域技术人员将理解，本发明考虑编码嵌合抗原受体的任何核苷酸序列，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的功能变体。例如，考虑SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的变体，所述变体包含与SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53不同的一个或多个核酸，但仍编码相同的氨基酸序列。由于遗传密码的简并性，大量的核酸可以编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53中由密码子指定丙氨酸的每个位置处，可以将密码子改变为描述的任何相应密码子而不改变所编码的多肽。因此，本文编码具有SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或者SEQ ID NO:52或SEQID NO:53的功能变体的嵌合抗原受体的每个核苷酸序列，同时描述了核苷酸序列的每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG，和通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核苷酸序列的每个沉默变异隐含在每个描述的序列中。
进一步地，在至少一些实施方案中，本发明提供了核酸在制备用于转化、转染或转导细胞的载体中的用途。优选地，该细胞是表达CD3、CD4或CD8中的一种或多种的T细胞。在一些实施方案中，该细胞用于制备预防或治疗癌症的药物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了载体在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
应当理解的是，根据本发明的核酸构建体可进一步包含以下一种或多种：一种或多种宿主的复制起点；在一种或多种宿主中有活性的可选择标志物基因；和/或一个或多个转录调控序列。
如本文所用，术语“可选择标志物基因”包括对有其表达的细胞赋予表型，以便于鉴定和/或选择用构建体转染或转导的细胞的任何基因。
“可选择标志物基因”包括以下的任何核苷酸序列，其当由用构建体转导的细胞表达时对细胞赋予便于这些经转导的细胞的鉴定和/或选择的表型。编码合适的可选择标志物的一系列核苷酸序列是本领域已知的(例如Mortesen,RM.and Kingston RE.CurrProtoc Mol Biol,2009；Unit 9.5)。编码可选择标志物的示例性核苷酸序列包括：腺苷脱氨酶(ADA)基因；胞嘧啶脱氨酶(CDA)基因；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；组氨醇脱氢酶(hisD)基因；嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(PAC)基因；胸苷激酶(TK)基因；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因，或抗生素抗性基因，诸如氨苄青霉素抗性基因，嘌呤霉素抗性基因，博来霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因；荧光报告基因，诸如绿色，红色，黄色或蓝色荧光蛋白编码基因；和基于发光的报告基因，诸如萤光素酶基因等等，它们允许使用诸如荧光激活细胞分选(FACS)的技术对细胞进行光学选择。
在本发明的一些实施方案中，可选择标志物包括修饰的表面表达的蛋白质或由修饰的表面表达的蛋白质组成。在一些实施方案中，表面表达的蛋白质是上皮生长因子受体(EGFR)。在一些实施方案中，上皮生长因子受体是截短的(EGFRt)。在一些实施方案中，可选择标志物与以下同源：SEQ ID NO:62所示的序列，或其具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.7％序列同一性的变体。
此外，应当注意的是，在构建体中可选择标志物基因可以是独立的读码框，或者可以与另一多肽(例如CAR)作为融合蛋白而表达。
如上所述，核酸构建体还可以包含一个或多个转录控制序列。术语“转录调控序列”应理解为包括实现可操作连接的核酸的转录的任何核酸序列。转录控制序列可以包括例如前导序列，聚腺苷酸化序列，启动子，增强子或上游激活序列和转录终止子。通常，转录控制序列至少包括启动子。如本文所用的，术语“启动子”描述赋予，激活或增强核酸在细胞中的表达的任何核酸。
在一些实施方案中，至少一个转录控制序列可操作地连接至根据本发明的核酸分子。出于本说明书的目的，当转录控制序列能够促进，抑制或以其他方式调节核酸分子的转录时，认为转录控制序列与给定核酸分子是“可操作地连接”。因此，在一些实施方案中，核酸分子处于转录控制序列如组成型启动子或诱导型启动子的控制下。
“核酸构建体”可以是任何合适的形式，诸如以质粒，噬菌体，转座子，粘粒，染色体，载体等的形式，其当与适当的控制元件结合时能够复制，并且可以使包含在所述构建体内的基因序列在细胞之间转移。因此，该术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。在一些实施方案中，核酸构建体是载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。
对于发生表达的细胞，组织或器官，启动子可组成性地或区别地调节可操作地连接的核酸分子的表达。因此，启动子可包括例如组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是在大多数环境和生理条件下有活性的启动子。“诱导型启动子”是在特定环境或生理条件下有活性的启动子。本发明考虑使用在感兴趣的细胞中有活性的任何启动子。如此，本领域普通技术人员将容易地确定各种各样的启动子。
哺乳动物组成型启动子可以包括但不限于猿病毒40(SV40)，巨细胞病毒(CMV)，P-肌动蛋白，泛素C(UBC)，延伸因子-1α(EF1A)，磷酸甘油酸激酶(PGK)和CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAGG)。
诱导型启动子可以包括但不限于化学诱导型启动子和物理诱导型启动子。化学诱导型启动子包括具有由化合物如醇，抗生素，类固醇，金属离子或其他化合物调节的活性的启动子。化学诱导型启动子的实例包括：四环素调控的启动子(例如参见美国专利第5,851,796号和美国专利第5,464,758号)；类固醇响应性启动子诸如糖皮质激素受体启动子(例如参见美国专利第5,512,483号)，蜕皮激素受体启动子(例如参见美国专利第6,379,945号)等；和金属响应性启动子，诸如金属硫蛋白启动子(例如参见美国专利第4,940,661号，美国专利第4,579,821号和美国专利第4,601,978号)等。
如上所提及，控制序列还可以包括终止子。术语“终止子”是指发出转录终止信号的转录单元末端的DNA序列。终止子是通常含有聚腺苷酸化信号的3’非翻译DNA序列，其有利于将聚腺苷酸序列添加到初级转录物的3’末端。如启动子序列一样，终止子可以是任何终止子序列，其在预期使用的细胞，组织或器官中是可操作的。合适的终止子对于本领域技术人员而言是已知的。
如将理解的，根据本发明的核酸构建体可以进一步包括其他序列，例如允许增强的表达，细胞质或膜运输和位置信号的序列。具体的非限制性实例包括内部核糖体进入位点(IRES)。
本发明适用范围延伸到基本上如本文所述的所有遗传构建体。这些构建体可以进一步包括用于在真核生物中维持和/或复制遗传构建体和/或将遗传构建体或其部分整合到真核细胞的基因组中的核苷酸序列。
本领域中已知用于将外源遗传物质，诸如本发明第三方面的核酸构建体有意引入(转染/转导)真核细胞的方法。如将理解的，最适于将核酸构建物引入到所期望的宿主细胞的方法取决于许多因素，诸如核酸构建体的大小，宿主细胞的类型，期望的转染/转导效率的比率和最终期望的或需要的转染/转导的细胞的存活力。此类方法的非限制性实例包括：用化学品如阳离子聚合物，磷酸钙或结构体如脂质体和树枝状聚合物进行的化学转染；非化学方法诸如电穿孔(参见Potter and Heller.“Transfection by Electroporation.”Curr.Prot.Mol.Bio.,ed.Frederick M.Ausubel et al.2003:Unit–9.3)，超声穿孔(Wang,M et al.Sci Reps,2018；8:3885)，热休克或光学转染；基于颗粒的方法，诸如“基因枪”递送，磁性转染，或穿刺转染或病毒转导。
用于哺乳动物细胞的多种病毒转导技术是本领域已知的。常见的病毒载体包括慢病毒和逆转录病毒。示例性方案见Wang L等(Proc.Natl.Acad.Sci,2011；108:E803-12)。备选的病毒载体包括HSV、腺病毒和AAV(Howarth J et al.Cell.Bio.&Toxic.,2010,vol.26,issue 1,pp 1–20)。
在一些实施方案中，本发明提供了慢病毒，其包含编码如本文所述的嵌合抗原受体的核酸。进一步地，本发明提供了慢病毒在制备用于预防或治疗癌症的细胞或药物中的用途。
核酸构建体将根据期望的转染/转导方法进行选择。在一些实施方案中，核酸构建体是病毒载体，并且用于将核酸构建体引入宿主细胞的方法是病毒转导。本领域中已知利用病毒转导来引发CAR在PBMC中表达的方法(Parker,LL.et al.Hum Gene Ther.2000；11:2377-87)，和更一般地利用逆转录病毒系统转导哺乳动物细胞的方法(Cepko,C.and Pear,W.Curr Protoc Mol Biol.2001,unit 9.9)。在一些实施方案中，核酸构建体是质粒，粘粒，人工染色体等，且可以通过本领域已知的任何合适的方法转染到细胞中。
根据本发明的核酸构建体可用于产生遗传修饰的细胞，该细胞可用于杀伤表达功能失调性P2X7受体的靶细胞。适用于遗传修饰的细胞可以是异源或自体的。
用于选择/分离细胞亚群的技术是本领域已知的。这些技术包括荧光激活细胞分选(Basu S.et al.J.Vis.Exp.2010；41:1546)，利用固定在基质上的抗体的技术，例如磁性细胞分离
Figure BDA0002791121080000381
设备以免疫磁性方式选择表达期望标志物的细胞(Zola H.etal.Blood,2005；106(9):3123-6)，或使用微流控芯片。一系列细胞标志物可用于分离免疫系统的细胞，包括(但不限于)：BCR、CCR10、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD16、CD19、CD21、CD23、CD25、CD27、CD31、CD32、CD33、CD34、CD38、CD39、CD40、CD43、CD45、CD45RA、CD45RO、CD48、CD49d、CD49f、CD51、CD56、CD57、CD62、CD62L、CD68、CD69、CD62、CD62L、CD66b、CD68、CD69、CD73、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD83、CD84、CD85g、CD86、CD94、CD103 CD106、CD115、CD117、CD122、CD123、CD126、CD127、CD130、CD138、CD140a、CD140b、CD141、CD152、CD159a、CD160、CD161、CD163、CD165、CD169、CD177、CD178、CD183、CD185、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD198、CD200、CD200R、CD203c、CD205、CD206、CD207、CD209、CD212、CD217、CD218 alpha、CD229、CD244、CD268、CD278、CD279、CD282、CD284、CD289、CD294、CD303、CD304、CD314、CD319、CD324、CD335、CD336、CXCR3、Dectin-1、Tc epsilor R1 alpha、Flt3、颗粒酶A、颗粒酶B、IL-9、IL-13apha1、IL-21R、iNOS、KLRG1、MARCO、MHC II类分子、RAG、ROR Gamma T、Singlec-8、ST2、TCR alpha/beta、TCR gamma/delta、TLR4、TLR7、VEGF、ZAP70。
特别注意的是T细胞标志物CCR10、CD1a、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD16、CD23、CD25、CD27、CD31、CD34、CD38、CD39、CD43、CD45、CD45RA、CD45RO、CD48、CD49d、CD56、CD62、CD62L、CD68、CD69、CD73、CD79a、CD80、CD81、CD83、CD84、CD86、CD94、CD103、CD122、CD126、CD127、CD130、CD140a、CD140b、CD152、CD159a、CD160、CD161、CD165、CD178、CD183、CD185、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD198、CD200、CD200R、CD212、CD217、CD218 alpha、CD229、CD244、CD278、CD279、CD294、CD304、CD314、CXCR3、Flt3、颗粒酶A、颗粒酶B、IL-9、IL-13alpha1、IL-21R、KLRG1、MHC II类分子、RAG、ROR gamma T、ST2、TCR alpha/beta、TCR gamma/delta、ZAP70。用于T细胞选择的特别优选的细胞标志物包括TCR gamma、TCR delta、CD3、CD4和CD8。
接着可以培养分离的细胞以改变细胞活性，扩增或激活。用于扩增和激活细胞的技术是本领域已知的(Wang X.and Rivière I.Mol.Thera.Oncolytics.2016；3:16015)。这些包括：使用抗CD3/CD28微珠或其他形式的固定化CD3/CD28激活抗体。然后可以在细胞因子(例如使用IL-2，IL-12，IL-15或IL-17)存在下在体外扩增活化的/经遗传修饰的细胞，再进行冷冻保存。Wang和Rivièra(同上)提供了扩增CAR T细胞的方法概述。
本发明进一步提供了经遗传修饰的细胞，其包括如上所述的嵌合抗原受体，核酸分子或核酸构建体。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是白细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是骨髓细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是单核细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是alpha beta(αβ)T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是gamma delta(γδ)T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是CD3+T细胞(例如幼稚CD3+T细胞或记忆CD3+T细胞亚群)。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞(例如幼稚CD4+T细胞或记忆CD4+T细胞亚群)。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞(例如幼稚CD8+T细胞或记忆CD8+T细胞亚群)。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是自然杀伤细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是自然杀伤T细胞。
表达嵌合抗原受体细胞的用途
经遗传修饰的细胞可用于靶向表达功能失调性P2X7受体的细胞，并且(取决于细胞类型)可帮助或导致对表达功能失调性受体的细胞的杀伤。在一些实施方案中，本发明提供了杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，该方法包括使表达功能失调性P2X7受体的细胞与如上所述的经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞接触。
表达功能失调性P2X7受体的细胞可以是癌细胞。因此，在一些实施方案中，本发明提供了如上所述的经遗传修饰的细胞在治疗癌症中的用途。此外，本发明提供了杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，该方法包括使表达功能失调性P2X7受体的细胞与包含如上所述的核酸分子或核酸构建体的细胞接触。在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，该方法包括使表达功能失调性P2X7受体的细胞与如上所述的经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞接触。
在一些实施方案中，癌细胞是实体癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞选自：脑癌细胞、食道癌细胞、口腔癌细胞、舌癌细胞、甲状腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、宫颈癌细胞、上皮细胞癌、皮肤癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞和睾丸细胞癌细胞。在一些实施方案中、癌细胞选自：乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、卵巢癌细胞或黑素瘤癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞来自转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是III期癌症或IV期癌症。
在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞与表达功能失调性P2X7受体的细胞是自体的。在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的细胞在受试者体内。
在一些实施方案中，当在CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中表达时，根据本发明的嵌合抗原受体对表达功能失调性P2X7受体的靶细胞具有至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的体外细胞毒性，其中导入CAR的CTL:靶细胞的比为30:1或更大，10:1或更大，3:1或更大或者1:1或更大。
在一些实施方案中，当在CD3+T细胞中表达时，本发明的嵌合抗原受体表现出针对至少2种不同的癌症类型，至少3种不同的癌症类型，至少4种不同的癌症类型，至少5种不同的癌症类型的活性，至少6种不同的癌症类型，至少7种不同的癌症类型，至少8种不同的癌症类型，至少9种不同的癌症类型，至少10种不同的癌症类型的活性。
在一些实施方案中，当在CD4+T辅助细胞中表达时，根据本发明的嵌合抗原受体与表达功能失调性P2X7受体的靶细胞共培养时增加IL-2、TNF alpha和/或IFN gamma的产生。在一些实施方案中，该增加是统计学上显著的增加。在一些实施方案中，统计学上显著的增加是达到0.05、0.01或0.001的P值。
在一些实施方案中，表达功能失调性P2X7受体的细胞是癌细胞。
本发明还提供了本文所述的嵌合抗原受体当在免疫细胞中表达时在治疗癌症中的用途。在一些实施方案中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，免疫细胞是骨髓细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是单核细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是gamma delta(γδ)T细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是CD3+T细胞(例如幼稚CD3+T细胞或记忆CD3+T细胞亚群)。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞(例如幼稚CD4+T细胞或记忆CD4+T细胞子集)。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞(例如幼稚CD8+T细胞或记忆CD8+T细胞亚群)。
本发明还提供了药物组合物，其包括经遗传修饰的细胞，该细胞包含如上所述的嵌合抗原受体，核酸分子或核酸构建体。
可以将经修饰以表达本文所述的嵌合抗原受体的T细胞或其他免疫细胞与“载体”或“赋形剂”一起配制成药物组合物，以递送至受试者。如本文所用，“载体”或“赋形剂”包括任何溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌和/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲剂、悬浮液、胶体等。这类介质和/或试剂在药物活性物质中的应用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与经遗传修饰的细胞不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可以将补充活性成分掺入组合物中。“药学上可接受的”是指不是生物学上不可取或不希望的反应性或毒性材料，并且该材料可以与经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞一起施用给个体，而不会引起任何不希望的生物学作用或者以有害方式与药物组合物中包含的任何其他成分(尤其是经遗传修饰的细胞)相互作用。
可以将药物组合物配制成适合于优选施用途径的多种形式。因此，组合物可以通过已知途径施用，包括例如肠胃外(例如皮内、经皮、皮下、肌内、静脉内、腹膜内等)。组合物也可以通过持续或延迟释放来施用。
制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域众所周知的方法制备。用药学上可接受的载体制备组合物的方法包括使经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。可以以任何合适的形式提供包括经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞的药物组合物，包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂、喷雾剂、气雾剂或任何形式的混合物。
该组合物可以与任何药学上可接受的赋形剂、载体、辅助剂或媒介物一起配制。在一些实施方案中，经遗传修饰的表达嵌合抗原受体的细胞的药物组合物可以例如每周一个剂量至多个剂量施用。在一些实施方案中，该方法可以通过以该范围之外的频率施用药物组合物来实施。
在一些实施方案中，药物组合物可以每周施用约一次至约五次。在一些实施方案中，药物组合物施用一次。在一些实施方案中，药物组合物施用两次。在一些实施方案中，药物组合物施用三次。在一些实施方案中，药物组合物施用四次。
在一些实施方案中，药物组合物包含至少5x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少3x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少2.5x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少1x108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少5x107个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少2.5x107个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少1x107个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少5x106个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少2.5x106个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含至少1x106个细胞。
在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少5x108个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少3x108个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少2.5x108个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少1x108个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少5x107个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少2.5x107个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少1x107个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少5x106个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少2.5x106个细胞。在一些实施方案中，施用药物组合物以提供至少1x106个细胞。
通常，将药物组合物以在一定程度上有效减轻、限制或改善病症例如癌症的症状或临床症状的量和给药方案施用给受试者。如本文所用，“改善”是指癌症的症状或临床体征特征的程度、严重性、频率和/或可能性的任何减轻。“症状”是指患者疾病或病况的任何主观证据。“体征”或“临床体征”是指与能够由患者以外的其他人发现的特定病症有关的客观物理发现。在癌症的情况下，将组合物以有效限制一种或多种肿瘤生长，减少一种或多种肿瘤的尺寸、体积或重量，降低癌症转移的速率，减少癌细胞的增殖或延长受试者预期寿命的量和给药方案施用于受试者。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”或变型将理解为暗示包含所陈述的要素或整数或者要素或整数的组，但不排除任何其他元素或整数或者元素或整数的组。
最后，参考分子生物学的标准教科书，其包含用于执行本发明所涵盖的基本技术的方法。参见例如Green MR and Sambrook J,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012。
对于本领域技术人员而言显而易见的是，尽管为了清楚和理解的目的已经对本发明进行了一些详细描述，但是可以对本文描述的实施方案和方法进行各种修改和改变而不脱离本说明书中公开的创造性构思的范围。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制上述的描述。
实施例1
抗功能失调性(非功能性)P2X7嵌合抗原受体的制备和表达
抗-功能失调性P2X7 CAR构建体
以下详述了示例性方案，其详述设计和表达根据本发明实施方案的抗功能失调性P2X7受体嵌合抗原受体的过程。
如图7所示，制备CAR构建体(统称为CNA CAR家族构建体)，其包含：(i)胞外域1，其包含CSF2RA(人集落刺激因子2受体alpha)前导序列2，针对具有氨基酸位置210处的脯氨酸反式构象变为顺式构象的功能失调性P2X7受体(与抗体的VH部分具有序列同源性)的抗原结合结构域3，(ii)CD28跨膜结构域4，以及(iii)胞内域5，其包含41BB的细胞内部分6，CD3-zeta链的细胞内部分7，T2A自切割位点8，和缺少细胞内信号传导结构域的EGFR受体的截短形式(EGFRt)9(EGFRt的表面表达可以代为度量转导效率)。
胞外域1和跨膜结构域4通过以下三个连接结构域中的一个连接：
a.12个氨基酸的接头区10，其包含IgG4铰链区的突变形式(参见图2以及SEQ IDNO:13和38)——生成被称为CNA1002的CAR。该嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列分别由SEQ ID NO:54和55提供；
b.119个氨基酸的接头区11，其包含IgG4铰链区和IgG4 CH2区的突变形式(参见SEQ ID NO:39)——生成被称为CNA1003的CAR。该嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列分别由SEQ ID NO:51和53提供；以及
c.228个氨基酸的接头区12，其包含IgG4铰链区，IgG4 CH2区和IgG4 CH3区的突变形式(参见SEQ ID NO:40)——生成被称为CNA1004的CAR。该嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列分别由SEQ ID NO:56和57提供。
然后将这些核酸分子克隆到慢病毒主链(epHIV-7.2-图6)中，形成核酸构建体。
制备了进一步的CAR家族(SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61)，其包含CD8a信号肽13，与上述CNA家族中使用的结合肽不同的抗功能失调性P2X7结合肽14(被称为PEP2-2-3)，包含CD28部分的跨膜区15(其也提供了胞内域5的一部分)，包含OX40的细胞内部分16和CD3zeta链的细胞内部分17的细胞内部分，以及T2A自切割位点9。结合肽和跨膜区通过30个氨基酸18(SEQ ID NO:41)或228个氨基酸19(SEQ ID NO 63)的连接结构域连接。30个氨基酸的接头结构域包含IgG4铰链区的突变形式(12aa)，接着是接头(G4S)3(15a.a.)，接着是氨基酸序列“DPK”(被称为BLIV CAR短铰链接头——参见SEQ ID NO:41)。
CAN家族病毒转染和慢病毒产生
根据以下方案，用含有CAR的CNA家族的载体瞬时转染239T细胞来产生慢病毒：
第1天—将293T细胞接种于10cm细胞培养板中补充有10％血清的10ml DMEM培养基。到24小时达到基本上汇合。准备四个平板用于包装每种病毒。将平板于37℃和5％CO2下温育过夜，以使细胞粘附到平板上。
第2天—下面列出了使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)瞬时转染四个平板所用的试剂和质粒DNA量(表6)。针对三种不同的CAN CAR构建体制备病毒：CNA1002，CNA1003和CNA1004。
每种病毒准备两个试管。在第一个试管中：使LV-CAR编码质粒与三个病毒包装质粒(pCMV-Rev2，pCHGP-2和pCMV-G)混合，在OptiMEM培养基中稀释。在第二管中：在OptiMEM中稀释适当体积的Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)。
将两个试管的内容物合并，轻轻搅拌，之后于室温下温育20分钟。然后将混合物(1ml/平板)加入到第一天制备的293T细胞中，并于37℃和5％CO2下温育过夜。
表6病毒包装转染
Figure BDA0002791121080000451
第3天—去除培养基，并更换为补充有10％血清和丁酸钠(最终浓度为6mM)的新鲜DMEM培养基，然后于37℃和5％CO2下再温育48小时。
第5天—收集来自四个平板的上清液并转移到锥形管中，接着在914RCF旋转10分钟去除细胞碎片。然后将上清液过滤(0.45μM)，并通过离心从过滤的上清液中浓缩病毒。
离心后，弃去上清液，并通过倒置试管使任何剩余的培养基排出。将残留的病毒沉淀物重悬于200μl无血清DMEM中，然后将浓缩的病毒悬浮液转移至新试管中。通过高速离心将病毒进一步浓缩，之后于-80℃保存。
病毒滴度测定
为了确定所制备病毒的转导能力，将已知体积的浓缩病毒(1:10000,1:5000,1:2000,1:1000,1:500.1:166和1:100)与H9细胞(500μl培养基中1x105)在硫酸鱼精蛋白(0.1mg/ml)存在下于37℃和5％CO2下温育48小时。通过用抗-EGFR(Erbitux-Biotin)染色经转导的H9细胞并利用流式细胞术计算表面表达来确定每种病毒的滴度。
经遗传修饰的CAR表达细胞的制备
通过以下方案之一制备转导的CD3+，CD4+和CD8+细胞：
方案1
自血小板单采血液成分术试剂盒(Bloodworks NW)从丢弃的减白(leukoreduction)室(LRS室)中分离出CD4+和CD8+T细胞。使用
Figure BDA0002791121080000461
分离器或LS柱分离T细胞。
用三种CNA CAR病毒(CNA1002，CNA1003和CNA1004)的每种分开转导CD4+和CD8+T细胞。每种细胞类型均包含未转导的模拟孔作为对照。
分离后，细胞用CD3/CD28
Figure BDA0002791121080000462
(1:1)刺激1-3天。计数经刺激的细胞，并将其分配在500ul培养基的24孔平板中(2x106个细胞/孔)。将硫酸鱼精蛋白以40ug/ml的终浓度添加到每个孔中。
基于从上述方法获得的病毒滴度结果计算转导所需的病毒量。将感染复数(MOI)3用于转导CD4+和CD8+细胞。加入解冻的病毒悬浮液后，使平板涡旋混合，并于32℃旋转接种(800RCF)30分钟。然后将平板在37℃和5％CO2下温育4小时。温育后，将温的针对CD4+细胞补充有5ng/ml rhIL-7和0.5ng/ml rhIL15，且针对CD8补充有50u/ml rhIL1-2和0.5ng/mlrhIL-15的完全培养基(1.5ml/孔)添加到每个孔中。
每2-3天通过补充一半含细胞因子的培养基来维持转导的细胞。在细胞在视觉上变得拥挤时扩增培养物体积。刺激第9天后去除Dynabeads。
方案2
使用Rosettesep人CD4、CD8或CD3 T细胞富集混合物(StemCell)，按照制造商的方案从全血中分离CD3+，CD4+和CD8+T细胞。
用三种CNA CAR病毒(CNA1002、CNA1003和CNA1004)的每种分开转导CD3+、CD4+和CD8+T细胞。另外，每种细胞类型包括未转导的模拟孔作为对照。
将CD4、CD8和CD3细胞在补充有以下细胞因子的完全离体培养基中培养(表7)
表7细胞因子补充物
细胞类型 IL-2 IL-7 IL-15
CD4 50U/ml 5ng/ml 0.5ng/ml
CD8 50U/ml 5ng/ml 5ng/ml
CD3 50U/ml 5ng/ml 0.5ng/ml
分离后，细胞用CD3/CD28 Dynabeads刺激1小时(3:1的细胞与珠比)。用终浓度8ug/ml的聚凝胺以感染复数(MOI)20转导经刺激的细胞。然后将平板于37℃和5％CO2下温育过夜。
第2天，去除并更换一半培养基以稀释聚凝胺的浓度。刺激24小时后，从CD8细胞中去除
Figure BDA0002791121080000471
在CD3+和CD4+T细胞中，将
Figure BDA0002791121080000472
放置10天。每2-3天通过去除一半培养基并添加补充有适当细胞因子的新鲜培养基对经转导的细胞进行饲养。在细胞在视觉上变得拥挤时扩增培养物体积。
确定转导效率
刺激10天后，按照以下方案通过对转导的CD3+、CD4+和CD8+细胞进行EGFR和/或Fc表达染色来确定转导效率：
—将转导的细胞样品转移到5ml聚苯乙烯试管中，并在室温下以1200rpm旋转3分钟来形成沉淀物。除去上清液，并用2ml FACS染色溶液洗涤细胞沉淀物；
—为每个转导的细胞系制备三个样品：(i)未染色的对照管，(ii)抗-EGFR染色的细胞，和(iii)抗-Fc染色的细胞；
—将细胞(不包括未染色的对照细胞)与生物素化的一抗(抗-EGFR或抗-Fc)的1:100稀释液于室温下黑暗中温育20分钟，然后通过如上述的离心洗涤细胞，并且用2ml FACS染色溶液(x2)洗涤所获得的沉淀物；
—将洗涤过的细胞与PE-偶联的链霉亲合素二抗于室温下于黑暗中温育20分钟，然后如上所述进行洗涤。
—接着将洗涤过的细胞离心，重悬于200ul FACS固定液中，并于4℃保存，直至通过流式细胞术进行分析。
CD4+细胞的结果提供在图7中。27.5％的用CNA1002 CAR转导的CD4+细胞呈截短的EGFR(EGFRt)表达阳性，表明用CNA1002 CAR的转导。16.09％的用CNA1003转导的CD4+细胞呈EGFRt表达阳性，并且11.65％的用CNA1004转导的CD4+细胞呈EGFRt阳性。
图8提供了CD8+细胞的结果。9.84％的用CNA1002 CAR转导的CD8+细胞呈截短的EGFR(EGFRt)表达阳性，表明用CNA1002 CAR的转导。12.30％的用CNA1003转导的CD8+细胞呈EGFRt表达阳性，并且9.2％的用CNA1004转导的CD8+细胞呈EGFRt阳性。
细胞分选和扩增
为了提高转导细胞的纯度，使用阳性选择和磁珠分离表达EGFRt的细胞。将转导的CD4+和CD8+细胞用生物素化的抗-EGFR抗体(1:100)于4℃染色20分钟，然后如上所述洗涤，并与抗生物素微珠
Figure BDA0002791121080000481
于4℃温育15分钟。使用MidiMACS磁体和LS柱，根据制造商的方案对细胞进行分选。
可选择地，使用本领域已知的方案，用标记的抗-EGFR抗体染色后，通过荧光激活细胞分选术(FACS)纯化转导的细胞。
随后，通过使用辐照的饲养细胞(PBMC和转导的B细胞)和可溶性OKT3抗体刺激细胞，使纯化的转导细胞扩增12天。在T25烧瓶中，将CD3+、CD4+和CD8+CAR-T细胞与冷冻PBMC以1:50或1:25(T细胞:PBMC)的比温育。将转导的B细胞系(1x106)和/或可溶性OKT3(抗-CD3抗体(30ng/ml))也添加到25ml完全RPMI中。此外，将rhIL-7和rhIL-15添加到CD4+细胞中，并且将rhIL-2和rhIl-15添加到CD8+中。每2至3天通过补充一半的培养基来维持转导的细胞。在细胞在视觉上变得拥挤时扩增培养物体积。
扩增12天后，如上所述，使用抗-EGFR和抗-人Fc抗体通过流式细胞术分析转导的CD4+和CD8+细胞的EGFRt和CART表面表达(图9和图10)。
图9中提供了CD4+细胞的结果。99.5％的用CNA1002 CAR转导的CD4+细胞呈截短的EGFR(EGFRt)表达阳性，表明用CNA1002 CAR的转导。99％的用CNA1003转导的CD4+细胞呈EGFRt表达阳性，并且82.9％的用CNA1004转导的CD4+细胞呈EGFRt表达阳性。21.2％的经CAN1002转导的CD4+细胞呈Fc阳性，83.6％的经CNA1003转导的CD4+细胞呈Fc阳性，并且82.6％的经CNA1004转导的CD4+细胞呈Fc阳性。
图10中提供了CD8+细胞的结果。94％的用CNA1002 CAR转导的CD8+细胞呈截短的EGFR(EGFRt)表达阳性，表明用CNA1002 CAR的转导。94.4％的用CNA1003转导的CD8+细胞呈EGFRt表达阳性，并且77％的用CNA1004转导的CD8+细胞呈EGFRt阳性。5.39％的经CNA1002转导的CD8+细胞呈Fc阳性，37.3％的经CNA1003转导的CD8+细胞呈Fc阳性，并且74.2％的经CNA1004转导的CD8+细胞呈Fc阳性。
实施例2
抗功能失调性-P2X7嵌合抗原受体效应子功能
为了评估CNA1002、CNA1003和CNA1004转导的T细胞的功能性，如下所述进行体外杀伤测定(CD8+细胞)和细胞因子释放测定(CD4+细胞)。CD8+CAR T效应子功能
使用铬释放测定评估了表达三个CNA家族CAR(CNA1002、CNA1003、CNA1004)的CD8+转导的T细胞的细胞毒活性。
针对一系列靶细胞(贴壁细胞和非贴壁细胞两者)，阳性对照细胞系(表达OKT3的K562细胞)和非癌性对照细胞系(K562细胞系)进行了第一项功能测定(图11)。三种癌细胞系用作靶细胞：MDA-MB-231(乳腺癌)，U87(神经胶质瘤)和SKNDZ(神经母细胞瘤)细胞系。
步骤1—第1天—早上将贴壁MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)靶细胞(5x106个)接种到T75烧瓶中的7ml完全培养基(含10％FBS的DMEM)中，并于37℃和5％CO2下温育6小时，以贴壁到烧瓶。贴壁后，向每个烧瓶中加入51Cr(75ul 5mCi/ml)，混合，并于37℃(5％CO2)温育过夜。
将非贴壁靶细胞系(K562，表达OKT3的K562，293T，U87和SKNDZ)接种到12孔板的4ml完全培养基中(5x106个/孔)。向每个孔中添加75ul 5mCi/ml 51Cr，混合，并于37℃(5％CO2)温育过夜。
步骤2—第2天—对表达CNA家族CAR的CD8+转导的细胞进行计数，并计算4种不同稀释度(30:1，10:1，3.3:1，1.1:1)所需的细胞体积。
步骤3—用PBS(10ml)溶液洗涤51Cr标记的靶细胞(通过胰蛋白酶消化收集贴壁细胞)两次，然后计数。将细胞浓度调整至5x104个/ml，并将完全RPMI(含10％FBS)中的5000个靶细胞添加到包含效应细胞的每个孔中，以提供所需的效应子与靶标(E:T)比。
针对每个靶细胞系分配额外的对照孔。对于最大的细胞溶解孔，将100ul 2％SDS溶液添加至单独的靶细胞，以引起完全细胞溶解。对于细胞溶解最小值或背景辐射，添加完全培养基。一旦将效应子和靶标组合，就将平板于37℃和5％CO2下温育4小时。
4小时温育结束时，于室温用制动器以104RCF旋转测定板。然后收获50ul的上清液并转移至白色LUMA板。使LUMA板在工作台干燥过夜。
步骤4—第3天—用TopCount闪烁计数器(Perkin Elmer)评估每个LUMA板的51Cr(计数/分钟-CPM)，指示细胞杀伤，并按以下阐述的方法计算细胞溶解百分比：
细胞溶解百分比＝(CPM样品-CPM最小)/(CPM最大-CPM最小)x100
如上所述进行第二项功能测定(图12)，包括上述靶细胞和M21-黑素瘤细胞以及OVCAR3-卵巢癌细胞。
如图11所示，第一项功能测定表明表达CNA1003的CD8+CAR-T细胞显示针对两种癌细胞系MDA-MB-231(46％E:T 30:1)和U87(14％E:T 30:1)的特异性细胞溶解。观察到细胞溶解的程度为滴度依赖性方式，其中细胞溶解值百分比随着E:T比的降低而降低。基于去污剂的最大溶解来计算细胞溶解值百分比。所有CD8细胞对K562细胞(阴性对照)没有细胞溶解，而针对K562-OKT3(阳性对照)看到高细胞溶解，这表明所有CD8群都能够引发有效的细胞溶解反应。
表达CNA1002和CNA1004的CD8+CAR-T细胞表现得类似于模拟转导的CD8+细胞，并且针对癌细胞系MDA-MB-231或U87未显示出明显的细胞溶解，这表明接头长度在抗功能失调性P2X7 CAR-T杀伤中起关键作用，并且在被优化时允许靶向一大批癌症类型。
如图12中可以看到，第二项功能测定证实了初步结果，并进一步证明了表达CNA1003的CD8+CAR T细胞对癌细胞系M21(约25％E:T 30:1)，OVACAR-3(约50％E:T 30:1)，MDA-MB-231(约40％E:T 30:1)和U87(约28％E:T 30:1)显示特异性溶解。此外，表达CNA1002的CD8+CAR T细胞显示使OVCAR-3(50％E:T 30:1)细胞系溶解的能力。
重要的是，这些结果表明，CNA1003 CAR对最大数目的癌细胞系表现出最广泛的活性。因此，可以得出结论：与具有12个氨基酸(CNA1002)或228个氨基酸(CNA1004)的接头结构域的CAR相比，30至228个氨基酸(具体包括119个氨基酸)的抗功能失调性P2X7 CAR接头提供了针对最大数目癌症类型的功效，其中CNA1002针对一种癌细胞系具有活性，而CNA1004针对任何癌细胞系都不具有活性。
CD3+CNA1003 CART效应子功能
BrightGlo荧光素酶细胞溶解测定
稳定表达萤光素酶的癌细胞系购自澳大利亚细胞库(CellBank Australia)。将靶细胞(1x104个)接种(50μl)到圆底96孔板中，每种测试条件一式三份。为每种靶细胞系分配额外的对照孔。计数CNA 1003CAR T细胞并进行系列稀释。将CAR T细胞按以下效应子:靶标(E:T)比(30:1，10:1，3.3:1，1.1:1)加入靶细胞。将96孔板于37℃和5％CO2温育16小时。随后，将等体积BrightGlo测定底物(Promega)添加到每个孔中，混合均匀，于室温下温育4分钟，然后将一部分混合物转移到不透明板。使用发光计(GloMax Promega)读取发光值。将从剩余靶细胞测量的发光值与来自单独的靶细胞的发光值进行比较，以计算CAR-T细胞和模拟转导的T细胞的细胞毒性百分比。
如上所述，产生并扩增了表达CNA1003 CAR的CD3+T细胞。CD3+T细胞群由约30％的CD8+T细胞和70％的CD4+T细胞组成(图13)。EGFRt的表面表达用作测量转导效率的代理者，并且成功地转导大约80％的CD3+T细胞。
使用上述BrightGlo萤光素酶测定系统评估了转导的CD3+细胞的细胞毒性功能。
将CAR T细胞与靶癌细胞系以0:1，10:1，3.3:1和1.1:1的E:T比与以下癌细胞系共培养16小时：PC3(前列腺癌)，C32(黑色素瘤)，SkMel5(黑色素瘤)，SkMel28(黑色素瘤)，MDA-MB-231(乳腺癌)，Be(2)M17(神经母细胞瘤)，Raji(淋巴瘤)和RD(横纹肌肉瘤)和ASPC-1(胰腺癌)。CD3+CAR T细胞用作效应细胞，并且未转导的CD3+T细胞用作阴性对照。
如图14和图15所示，针对所有测试的癌细胞系，观察到CD3+CNA1003CAR-T细胞的特异性细胞溶解：PC3(100％E:T 30:1)，C32(100％E:T 30:1)，SkMel5(82％E:T 30:1)，SkMel28(98％E:T 30:1)，MDA-MB-231(90％E:T30:1)，Be(2)M17(95％E:T 30:1)，Raji(48％E:T 30:1)，RD(99％E:T 30:1)和ASPc(59％E:T 30:1)。在某些癌症中观察到了滴度依赖性效应，其中细胞溶解值百分比随着E:T比的降低而降低。在每个指示的时间点对CD3+CNA1003 CAR T细胞与CD3+UT进行了比较，数据进行非配对学生t检验分析。数据代表两个独立的实验。
CD8+CNA1003 CART效应子功能
如上所述，产生并扩增了表达CNA1003 CAR的CD8+T细胞。使用上述BrightGlo萤光素酶测定系统评估了CD8+CNA1003 CAR T细胞对癌细胞系(靶细胞)MDA-MB-231(乳腺癌)，C32(黑色素瘤)，PC3(前列腺癌)和SKOV3(卵巢癌)的细胞毒性功能。将T细胞与靶癌细胞系以30:1、10:1、3.3:1和1.1:1的E:T比共培养16小时。CD8+CNA1003CAR细胞用作效应细胞。模拟CD8细胞(未转导的)用作非特异性杀伤的对照。
从图16中可以看到，观察到针对所有测试的四种癌细胞系MDA-MB-231(82％,E:T30:1)，C32(100％E:T 30:1)，PC3(98％E:T 30:1)和SKOV3(33％E:T 30:1)的特异性细胞溶解。在一些癌细胞系中观察到了滴度依赖性效应，其中细胞溶解百分比值随着E:T比的降低而降低。
CD4+CNA1003 CART效应子功能
CD8+T细胞是主要的细胞毒性T细胞群。然而，现在已知CD4+T细胞介导有效的抗肿瘤活性。
如上所述，产生并扩增了表达CNA1003 CAR的CD4+T细胞。使用上述BrightGlo萤光素酶测定系统评估了CD4+CNA1003 CAR细胞对癌细胞系(靶细胞)BT549(乳腺癌)，OVCAR3(卵巢癌)，C32(黑色素瘤)和PC3(前列腺癌)的细胞毒性功能。根据显示对表达CNA1003的T细胞杀伤的抗性的在先数据，SKNDZ(神经母细胞瘤)细胞用作阴性对照。
将CD4+CNA1003 CAR-T细胞与靶癌细胞系以30:1,10:1,3.3:1和1.1:1的E:T比共培养16小时。模拟转导的(未转导的-UT)CD4+细胞用作非特异性杀伤的对照。
观察到针对五种癌细胞系MDA-MB-231(67％E:T 30:1)，BT549(100％E:T 30:1)，OVCAR3(95％E:T 30:1)，C32(100％E:T 30:1)和PC3(77％E:T 30:1)的特异性细胞溶解(图17)。在所有实验中观察到滴度依赖性效应，其中细胞溶解百分比值随着E:T比的降低而降低。没有一种CAR T细胞显示针对神经母细胞瘤细胞系SKNDZ(阴性对照)的细胞溶解。在指定的时间点对CNA1003 CAR T细胞与CD4+UT进行了比较，数据进行非未配对学生t检验分析。数据代表两个独立的实验。
以上显示了识别功能失调性(特别是非功能性)P2X7的CD4+CAR T细胞对代表一大批癌症类型的多种癌细胞系具有明显的细胞毒性。
CD4+CART T-辅助功能
通过在根据步骤1和步骤2(上述)建立的细胞因子释放测定中测定细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α来测量表达CAR的CNA家族的CD4+细胞的活化。对于细胞因子释放测定，将靶细胞系与CD4+模拟物或表达CN1002、CNA1003或CNA1004 CAR的CD4+细胞于37℃下共培养24小时(5％CO2)。随后使用
Figure BDA0002791121080000531
验证试剂盒测定上清液中的细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α浓度。
使用K562和293T细胞系作为阴性对照和使用表达OKT3的K562作为阳性对照，进行第一项细胞因子释放测定(图18)。三种癌细胞系用作靶细胞：MDA-MB-231(乳腺癌)，U87(神经胶质瘤)和SKNDZ(神经母细胞瘤)细胞系。表达CNA1002、CNA1003或CNA1004 CAR的CD4+细胞用作效应细胞。模拟的CD4+细胞(未转导的)用作效应细胞的阴性对照。
如图18所示，当与MB-231(乳腺癌细胞)靶细胞和U87(神经胶质瘤)靶细胞温育时，含有表达CNA1003的效应细胞的细胞培养物显示出显著的IL-2、IFN-γ和TNF-α分泌。而表达CNA1002和CNA1004的CD4+细胞与任何靶细胞共同温育时表明很少的细胞因子分泌至无细胞因子分泌。
如上所述，进行第二项细胞因子释放测定(图19)，其包括上述靶细胞(U87细胞除外)，还包括OVCAR3-卵巢癌细胞。
如图19中可以看到，表达CNA1003的CD4+细胞与癌细胞系MDA-MB-231共培养的上清液中存在IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌增加，这证实了第一项细胞因子释放测定中的结果。
实施例3
其他嵌合抗原受体的方案
以下详述了示例的方案，其详述设计和表达根据本发明的一个实施方案的抗功能失调性(特别是非功能性[nf])P2X7受体CAR的过程。
PEP2-2-3(抗-nf-P2x7)嵌合抗原受体的设计
根据图1所示的示意图(如上所述)，设计抗-nf-P2X7嵌合抗原受体(CAR)，其具有30个氨基酸(BLIV CAR短铰链接头；SEQ ID NO:41)或228个氨基酸(BLIV CAR长铰链；SEQID NO:63)的铰链区。
慢病毒载体设计和组装
将设计的CAR并入图20所示的BLIV慢病毒质粒(System Biosciences，California，USA)中，该质粒包括荧光和生物发光报告蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫萤光素酶(FLuc)。BLIV质粒还包括GFP和FLuc报道蛋白编码序列之间的T2A编码序列，其允许FLuc和GFP蛋白的翻译后分离。
将与BLIV载体的NheI限制性位点的上游和下游序列具有同源性的序列添加到所设计的CAR的5’和3’末端，产生SEQ ID NO:58(CAR-短铰链)和SEQ ID NO:59(CAR-长铰链)所示的最终核苷酸序列。包含5’和3’序列允许使用Gibson克隆将抗nf P2X7 CAR并入BLIV载体中。
BLIV质粒在NheI克隆位点处进行限制性处理，并且使用Gibson组装并入抗-nfP2X7 CAR编码序列。
BLIV-CAR载体的克隆和评估
根据制造商的说明书，用生成的BLIV-CAR载体转导New England Biolabs 5-alpha感受态大肠杆菌细胞(Gibson组装克隆试剂盒中提供)。
在温育经转导的(大肠杆菌)细胞后，分离出用BLIV-CAR-短铰链质粒转导的10个细菌菌落和用BLIV-CAR-长铰链质粒转导的10个细菌菌落，纯化质粒DNA，并用BamHI限制性酶进行限制性处理。通过凝胶电泳对合适大小的限制性片段进行限制性DNA分析。
慢病毒载体的构建与验证
按照以下方法使用293T细胞从3质粒方案中包装慢病毒。
第1天：将293T细胞接种于T-225烧瓶中含10％血清的35ml DMEM培养基中，使得细胞在次日基本上汇合。
第2天：将30ug生成的BLIV-CAR质粒之一(或未修饰的BLIV质粒)，30ug gag-pol质粒delta 8.2和15ug VSV-G质粒(pMD2.G)加入到OptiMEM培养基中至最终体积为750ul，并且混合。加入300ul PEI溶液并于室温温育至少20分钟。接着将混合物加入到汇合的293T细胞中，之后于37℃温育。
第3天：加入质粒混合物后24小时，从293T细胞中倾析出上清液并于4℃保存。用35ml新鲜培养基更换倾析的混合物，然后于37℃进一步温育。
第4天：加入质粒混合物后48小时，去除培养基并与24小时收获的上清液合并。将合并的上清液以1500g旋转15分钟来除去任何残留的细胞碎片。上清液通过0.45um过滤器过滤，并且然后以17,000rpm旋转1小时。离心后，手动倾析出上清液，管中保留50至200ul。将离心管置于50ml有螺旋盖的管中以防止污染和蒸发，并使病毒于4℃重悬过夜。
第5天：将病毒重悬离开离心管底部并转移到新的1.5ml管中。将重悬的病毒在离心管中以5000rpm旋转5分钟来除去任何残留的碎片。
温育24小时后，通过GFP荧光的存在评估用BLIV-CAR-短铰链和BLIV-CAR-长铰链载体转染的293T细胞。将含有短铰链BLIV-CAR和长铰链BLIV-CAR病毒载体的第5天收集的上清液(如上所述)与新鲜的293T细胞一起温育，并显现GFP荧光以测试转导能力。
CAR T细胞效应子功能
使用RosetteSepTM人CD8+T细胞分离试剂盒(Stemcell technologies,Vancouver,Canada)根据制造商的说明书从50ml人血液中分离108个CD8+T细胞。纯度分析表明76.6％的经纯化的细胞是CD8+。
以105个细胞/孔将CD8+T细胞与1:1比率的dynal T细胞扩增(cell expander)磁珠(CD3/CD28)温育。然后将CD8细胞与慢病毒制备物以5或更高的感染复数(MOI)一起温育过夜，该慢病毒制备物含有未修饰的BLIV质粒，BLIV-CAR-短铰链质粒或BLIV-CAR-长铰链质粒。温育后，洗涤CD8+T细胞，之后与靶细胞共培养。
表达非功能性P2X7受体的靶细胞由乳腺癌细胞系BT549(ATCC HTB-122)提供。使用荧光膜计算间(intercalculating)染料eFluorTM 670(affymetrix eBioscience)按照制造商的说明书对这些细胞进行染料标记。
染料标记后，将靶细胞与制备的CD8+T细胞以10:1，5:1，1:1和0:1的(表达CAR的T细胞:靶标)比共培养。
共培养24小时后，收集细胞并使用荧光激活细胞分选术(FACS)分析。定量含有膜计算间染料的靶细胞的数量，以评估共培养的T细胞是否导致靶细胞死亡或细胞增殖的停滞。
图21说明与靶细胞和未转导的或对照转导的(未修饰的BLIV载体)CD8+T细胞的共培养物相比，表达30个氨基酸的BLIV CAR短铰链的CD8+T细胞在48小时后显示出靶细胞溶解的增加。30个氨基酸的BLIV CAR短铰链的功效略低于228个氨基酸的BLIV CAR长铰链(SEQ ID NO:63)的功效，所述BLIV CAR长铰链比BLIV-CAR短铰链显示略高的溶解。
实施例4
改变抗原识别结构域
比较了包含结合功能失调性(特别是非功能性(nf))P2X7受体的不同抗原识别结构域的六种不同CAR构建体的功效。三种CAR构建体包含由肽结合物组成的抗原识别结构域(单域抗体或sdAb)(CNA1003、CNA1103、CNA1203)，两种包含由识别nfP2X7的单克隆抗体的单链可变区(scfv)组成的抗原识别结构域(CNA1303和CNA1403)，以及一种是二肽(CNA1503)。
CNA1003、CNA1103和CNA1203由来自对nfP2X7特异的抗体可变重链的3个CDR形成。CNA1303和CNA1403由来自对nfP2X7特异的抗体可变重链通过具有SEQ ID NO:69所示序列的氨基酸连接到不同的抗-nfP2X7抗体的可变轻链形成。CNA1503由具有SEQ ID NO:69所示序列的氨基酸连接的两个dAb区形成。
这些嵌合抗原受体(CAR)构建体由以下组成：人集落刺激因子2受体α(CSF2RA)前导序列，以上所述的抗原识别结构域(SEQ ID NO:4–CNA1003；SEQ ID NO:64–CNA1103；SEQID NO:65–CNA1203；SEQ ID NO:66–CNA1303；SEQ ID NO:67–CNA1403；和SEQ ID NO:68–CNA1503)中的一种，接头结构域(IgG4铰链-CH3—长度为119个氨基酸)，CD28跨膜结构域，来自41BB和CD3 zeta结构域的细胞内信号传导结构域，以及末端自切割肽T2A。缺乏细胞内信号传导结构域的截短形式的EGFR受体(EGFRt)通过自切割肽T2A由同一转录本共表达。EGFRt的表面表达被用作度量转导效率和转导的T细胞的纯度的代理者(如上所述)。
将CAR构建体克隆到慢病毒骨架中，并转导CD8+T细胞以表达CNA1003、CNA1103、CNA1203、CNA1303、CNA1403和CNA1503，然后如上所述扩增。
按照上述方案，将表达CD8+CAR的T细胞用于BrightGlo细胞溶解测定。简而言之，将表达CAR的CD8+T细胞与靶癌细胞系以30:1，10:1，3.3:1和1.1:1的E:T比共培养16小时。基于BrightGlo萤光素酶的测定系统(Promega)用于测量六种CD8+CAR T细胞系针对四种不同癌细胞系的细胞溶解潜力：MDA-MB-231(乳腺癌)，C32(黑色素瘤)，PC3(前列腺癌)和SKOV3(卵巢癌)。模拟的CD8细胞(未转导的-UT)用作非特异性杀伤的对照。
如图22中可以看到，CNA1003 CAR-T细胞对所有四种癌细胞系MDA-MB-231，C32，PC3和OVCAR3都表现出特异性的细胞溶解。这符合我们之前的观察。CNA1203和CNA1503还显示了针对MDA-MB-231，C32，PC3和OVCAR3细胞系的特异性细胞溶解。但是，这与CNA1003CAR-T相同或略低。CNA1403对MDA-MB-231细胞系表现出特异性细胞溶解，但对其他三种测试细胞系表现出非常低的活性。CNA1103对C32和OVCAR3细胞系表现出特异性细胞溶解。在某些情况下观察到滴度依赖性效应，细胞溶解百分比值随E:T比的降低而降低。
这些结果表明，尽管抗原识别结构域可以影响CAR T细胞的功能性，但具有接头长度为119个氨基酸的抗nf-P2X7 CAR T细胞仍能维持针对特定细胞类型的抗癌功能。此外，本文提出的实验允许本领域技术人员筛选针对nf-P2X7的CAR对多种癌症类型的抗癌功能。
实施例5 CNA1003 CAR T细胞体内抑制前列腺癌细胞的肿瘤生长
为了测试CNA1003人CD3+T细胞(合并CD4+和CD8+)和单独CD8+T细胞在体内抑制肿瘤生长的能力，根据以下方案，使用植入了肿瘤细胞系和CAR T细胞的免疫受损的异种移植小鼠模型。
5至8周龄雄性免疫受损的NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠购自动物资源中心(Perth,WA)。将小鼠饲养在无病原体的条件下，12小时光照/黑暗周期。分析之前，通过CO2窒息对小鼠实施人道安乐死。
异种移植小鼠模型
将经过工程改造以表达萤光素酶的前列腺腺癌PC3细胞系维持在Ham's F-12营养混合物(Gibco)中，并于37℃，5％CO2下培养，该混合物补充有10％热灭活的胎牛血清(FCS；Corning)和100U/ml青霉素/链霉素(Life Technologies)。通过用无菌PBS冲洗烧瓶，并于37℃下用PBS(Gibco)中的胰蛋白酶/EDTA解离细胞4分钟，使细胞每2-3天传代一次。细胞定期进行支原体测试，并确认不含支原体。
用重悬于无菌PBS中的1x106个PC3人前列腺癌细胞皮下注射6至8周大的雄性NSG小鼠右侧。注射后第3天，施用1x107个人CAR T细胞。所施用的CAR T细胞选自以下组之一：(i)CD3+CNA1003 CAR T细胞(包括CD4+和CD8+T细胞两者)；(ii)纯化的CD8+CNA1003 CAR T细胞；(iii)通过流式细胞术针对EGFRt表达分选的CD3+CNA1003 CAR T细胞(“分选CAR”—针对CAR表达富集)；通过流式细胞术针对EGFRt分选的CD8+CNA1003 CAR T细胞(“分选CAR”)，或未转导的CD3+T细胞(图23A—CD3+和图27—CD8+)，或分为两次剂量，其中第二次剂量在第16天施用(图23B—CD3+)。
使用本领域已知且如上所述的方法，用荧光偶联物标记的抗-EGFR抗体(EGFR单克隆抗体(me1B3)，eFluor 660)染色后，通过基于荧光的细胞分选(FACS)富集细胞(称为“分选CAR”)。
从第5天开始，使用数字游标卡尺每2天测量一次肿瘤，通过测量最长距离作为长度，测量垂直距离作为宽度进行。肿瘤面积计算为长度×宽度。每天监测小鼠的健康状况，并且当肿瘤的长度等于或大于15mm时或者当小鼠表现出包括以下任意组合的疾病症状时，对小鼠实施安乐死：褶皱皮肤(ruffled coat)，驼背姿态，不愿移动，呼吸困难，初始体重的10％或更多的体重减轻，和/或行为或步态改变。
组织分析
为了分析肿瘤中CAR T细胞的浸润和细胞因子产生，从小鼠切下肿瘤，手动切成小块，并在温热的消化培养基中于37℃温育1.5小时，每15-20分钟混合。通过向DMEM(Gibco)补充5％热灭活的FCS(Corning)，2.5mM CaCl2，10mM HEPES(Gibco)，100U/ml青霉素/链霉素(Life Technologies)，30U/ml DNase I(Sigma-Aldrich)和1mg/ml胶原酶IA(Sigma-Aldrich)制备消化培养基。使肿瘤匀浆通过70um过滤器(BD Biosciences)，并在小鼠红细胞裂解缓冲液中于37℃温育5分钟。
通过流式细胞术分析肿瘤浸润细胞。为了细胞因子表达染色，将纯化的对照或CART细胞的单细胞悬液与温热的IMDM于37℃温育4小时，其中IMDM补充有10％FCS，200mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)，100U/ml青霉素/链霉素(Life Technologies)，54pM B-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，50ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA；Sigma-Aldrich)，1nM离子霉素(Life Technologies)和GolgiStop(以1:15稀释；BD Biosciences)。将单细胞悬液用近红外固定染料和10％人血清染色15分钟。然后用α-hu CD8 BUV395(RPA-T8)和CD4BUV496(SK3)抗体将细胞染色30分钟。为了细胞内染色，将细胞与Cytofix/Cytoperm一起温育20分钟，在Permwash缓冲液中洗涤，并用细胞内直接偶联的抗体染色20分钟，包括FNγPE(B27)、TNFα APC(MAb11)、CD107a PECy7(H4A3)以及颗粒酶B(Gzmb)BV421(GB11)和穿孔素(B-D48)T细胞(Prf+)。所有抗体和染色试剂均购自BD Biosciences。在1％多聚甲醛中固定后，用BD LSRFortessa X-20流式细胞仪捕获细胞。数据使用FlowJo Software V.10(TreeStar)进行分析。
结果
图23A和图27表明，在前列腺癌异种移植小鼠模型中，与用未转导的T细胞或PBS治疗的小鼠相比，单剂的未分选CD3+CNA1003 CAR T细胞(图23A)和CD8+CNA1003 CAR T细胞(图27)有效地减小肿瘤尺寸和重量。图23B表明双重剂量的分选CD3+T细胞比单剂的未分选CD3+T细胞更有效，而双重剂量的未分选CD3+T细胞(其中第一次后13天施用第二剂，图23B)与单剂(图23A)相当。
评估CD3+CNA1003 CAR T细胞对肿瘤中的浸润以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分比(图24)。此外，通过流式细胞术评估细胞因子IFNγ和TNFα的分泌；活化标志物，颗粒酶B(Gzmb+)和CD107a(LAMP-1)；以及中央记忆T细胞标志物，CD45RA和CCR7。
图24说明了分选的和未分选的CAR T细胞均浸润肿瘤，并且主要是CD4+T细胞，而CD8+细胞水平较低。
图25和图26显示CD3+CNA1003 CAR T细胞(同时表达CD4+和CD8+)浸润肿瘤并产生IFNγ和TNFα，并且对Gzmb+、Prf+和CD107a+呈阳性，表明浸润的CAR T细胞在肿瘤中被活化。正如所预期的，CD4+(T辅助细胞)产生更高水平的IFNγ和TNFα，而CD8+细胞显示更高水平的Gzmb+和Prf+。
图27显示，与用未转导的CD8+T细胞或PBS治疗的小鼠相比，纯化的CD8+CNA1003CAR T细胞的施用(不存在大量CD4+T细胞群的情况下)可有效治疗癌症并减少肿瘤的生长。另外，图28显示大量的CD8+T细胞浸润肿瘤，并且是活的且有活性的，如由IFNγ的分泌和Gzmb的表达证明。此外，大部分CD8+浸润物具有记忆表型(CD45RA-)，并表达淋巴结归巢趋化因子受体CCR7(约50％)。
鉴于以上情况，很明显，CD3+CNA1003 CAR T细胞和CD8+CNA1003CAR T细胞的递送能够治疗NSG小鼠中的癌症并抑制PC3人前列腺癌的肿瘤生长。当CD3+CAR T细胞以单剂的大量未分选群体，或以二剂的分选或未分选群体递送时，这是明显的。此外，已经表明，在接受单剂细胞的小鼠中的第25天和接受二剂的小鼠中的第27天两者时，肿瘤内都存在CNA1003+CAR T细胞。这与任何端点检测不到的未转导的CD3+和CD8+T细胞相反。此外，一定比例的CAR T CD4+表达细胞因子IFNγ和TNFα，并且较大比例的CD8+CAR T细胞表达颗粒酶B和CD107a，已知它们都是细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的重要介体。此外，在肿瘤中发现的大部分CD8+CNA1003CAR-T细胞具有中央记忆表型(CCR7+和CD45RA-)，并且大约45％具有效应T细胞表型(CCR7-和CD45RA-)，表明肿瘤中的CD8+CNA1003 CAR T细胞既能够作为效应细胞直接杀伤肿瘤细胞，又能够作为中央记忆细胞通过次级淋巴样器官进行再循环。这使它们能够充当自我更新池，在首次剂量后维持长期保护。
实施例6
CNA1003 CAR T细胞在体内的剂量响应
使用如上文实施例5所述的前列腺异种移植癌细胞模型，不同的是小鼠在肿瘤注射后第3天(d3)接受施用1x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞或2x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞。接受二剂的小鼠中，在肿瘤注射后第16天再次施用1x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞。未转导的(UT)CD3+T细胞以与上述相同的剂量和施用方案用作对照。
如上文实施例5中所述监测小鼠和肿瘤的发展。
组织分析和流式细胞术
如上文实施例5中所述，切除肿瘤并获得单细胞悬液。对于流式细胞术分析，接着将细胞用以下荧光标记的抗体染色30分钟：α-huCD8 BUV395(RPA-T8)，CD4 BUV496(SK3)，CD45RA APC(HI100)和CCR7 PE(150503)。对于细胞内染色，将细胞与Cytofix/Cytoperm一起温育20分钟，在Permwash缓冲液中洗涤，并用细胞内直接偶联的抗体染色20分钟，包括穿孔素(B-D48)和颗粒酶B BV421(GB11)。所有抗体和染色试剂均购自BD Biosciences。在1％多聚甲醛中固定后，细胞用BD LSRFortessa X-20流式细胞仪进行分析。数据分析使用FlowJo Software V.10(Tree Star)进行。
结果
图29A和图29B示出了在前列腺癌异种移植小鼠模型中，与用未转导(UT)的T细胞或PBS治疗的小鼠相比，1x107个CD3+CAR-T的单剂(图29A)或双重剂量(图29B)有效减小肿瘤尺寸。此外，图29C说明与1x107个细胞剂量相比，2x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞的单剂导致肿瘤尺寸进一步减小。与PBS治疗的小鼠或施用未转导的(UT)CD3+T细胞的小鼠相比，对单个小鼠的分析(图29C右图)显示，治疗的7只小鼠中，有6只的肿瘤生长显著降低。值得注意的是，7只小鼠中有4只显示几乎完全没有肿瘤。
图29D和图29E说明了施用1x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞(CAR-T CD3+(1))的单剂，1x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞(CAR-T CD3+(2))的二剂(相距13天)，或2x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞(CAR-T CD3+(2x107))的单剂的小鼠中肿瘤的生长情况。从图29D中可以看出，与接受CD3+CNA1003 CAR T细胞的所有其他组相比，第3天施用2x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞的单剂的小鼠的肿瘤尺寸更小。此外，与用PBS或未转导的CD3+T细胞治疗的小鼠相比，所有CAR治疗组的肿瘤尺寸均减小。分析肿瘤重量时这些结果也得到了反映，每个CAR治疗组(以字母“B”表示)的肿瘤重量均比未转导组(以字母“A”表示)或PBS治疗组的肿瘤重量更低(图29E)。
分析了肿瘤浸润T细胞的表型，结果显示在图30A和图30B中。图30A示出了活CD3+细胞/mg组织的百分比。可以看出，来自施用2x107个CD3+CNA1003 CAR T细胞(CAR T 2x)的单剂的小鼠的肿瘤具有最高百分比的活CD3+T细胞，并且所有治疗组(CAR-T(1)—1剂的1x107个CAR细胞；CART(2)—2剂的1x107个CAR细胞；和CAR-T(2x)—1剂的2x107个CAR细胞)都具有肿瘤浸润性CD3+T细胞，而未转导(UT)的对照具有的肿瘤浸润T细胞可忽略不计。
图30B中显示了肿瘤浸润细胞群的组成分析。可以看出，施用CD3+CNA1003 CAR T细胞的小鼠的肿瘤中存在的大多数CD4+和CD8+T细胞具有效应子表型(TEM–CDR7-CD45RA-)。中央记忆T细胞(TCM–CDR7+CD45RA-)和终末分化的效应记忆细胞(TEMRA–CDR7+CD45RA+)中也有相当大的比例，这两个细胞群都是可迁移到淋巴结的抗原刺激过的细胞。还存在少量的幼稚T细胞(TN–CDR7-CD45RA+)。
图31示出了CD4+和CD8+T细胞的颗粒酶b(Gzmb+)和穿孔素表达。颗粒酶b和穿孔素一起构成细胞毒性T淋巴细胞的主要杀伤机制，表明肿瘤浸润CAR T细胞是细胞毒性的。
实施例7
CNA1003 CAR T细胞在体内抑制乳腺癌细胞的肿瘤生长
6周龄雌性免疫受损的NSG小鼠购自动物资源中心(Perth,WA)。将小鼠饲养在无病原体的条件下，12小时光照/黑暗周期。通过CO2窒息对小鼠实施人道安乐死。
异种移植小鼠模型
对于原发性肿瘤模型，用重悬于无菌PBS:Matrigel中的2x106个MDA-MB-231人乳腺癌细胞(使其最终蛋白浓度为4至6mg/ml)皮下注射12至13周雌性NSG小鼠的第4个左侧乳腺脂肪垫(L4)。
注射后第3天，静脉内注射1x107个CD8+CNA1003 CAR-T细胞或对照CD8+T细胞(从人血中纯化并用慢病毒转导)。从第5天开始使用数字卡尺每2天测量一次肿瘤，测量最长距离为长度，垂直距离为宽度。肿瘤面积计算为长度×宽度。每天监测小鼠的健康状况，并在以下情况时对小鼠实施安乐死：肿瘤长度等于或大于15mm，或者当小鼠显示褶皱皮肤，驼背姿态，不愿移动或呼吸困难，体重减轻了初始体重的10％或更多，和/或行为或步态改变。
肺转移结节显现
通过CO2窒息对小鼠实施安乐死，切开胸腔并暴露气管。用26号针头经气管内注入重悬于水中的15％黑色墨水(Parker)，直至完全充满肺。取出肺，立即用重悬于水的55％EtOH，6％甲醛，8％冰醋酸(Fekete溶液)去染色。将肺分为5片，并计数白色结节。
结果
图32显示，在乳腺癌异种移植小鼠模型中，与用未转导的CD8+T细胞(“CD8+T”)或PBS治疗的小鼠相比，施用纯化的CD8+CNA1003 CAR T(“CAR-T”)细胞有效地(i)治疗癌症并减少肿瘤生长(尺寸和重量)，和(ii)减少在继发性部位例如肺中的转移形成。
鉴于以上，很明显，与给予对照CD8+人T细胞或PBS的小鼠相比，施用CD8+CNA1003CAR T细胞可以抑制NSG小鼠中人乳腺癌的肿瘤生长。这与接受CD8+CNA1003 CAR T细胞的小鼠中高度转移性MDA-MB-231肿瘤自发转移引起的肺结节较小有关。
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而且，要注意的是，除非上下文已另外指出，否则如本文所使用的，单数形式“一”，“一个”和“所述”包括复数形式。
序列表
<110> 生物权威（英国）有限公司
<120> 具有经修饰的接头结构域的嵌合抗原受体及其用途
<130> 1105707
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3680
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gtcattggag gagcttgaag ttaaagactc ctgctaaaaa ccagtacgtt tcattttgca 60
gttactggga gggggcttgc tgtggccctg tcaggaagag tagagctctg gtccagctcc 120
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atgagacgaa caaagtcact cggatccaga gcatgaatta tggcaccatt aagtggttct 240
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ggaaagagcc tgtcatcagt tctgtgcaca ccaaggtgaa ggggatagca gaggtgaaag 360
aggagatcgt ggagaatgga gtgaagaagt tggtgcacag tgtctttgac accgcagact 420
acaccttccc tttgcagggg aactctttct tcgtgatgac aaactttctc aaaacagaag 480
gccaagagca gcggttgtgt cccgagtatc ccacccgcag gacgctctgt tcctctgacc 540
gaggttgtaa aaagggatgg atggacccgc agagcaaagg aattcagacc ggaaggtgtg 600
tagtgtatga agggaaccag aagacctgtg aagtctctgc ctggtgcccc atcgaggcag 660
tggaagaggc cccccggcct gctctcttga acagtgccga aaacttcact gtgctcatca 720
agaacaatat cgacttcccc ggccacaact acaccacgag aaacatcctg ccaggtttaa 780
acatcacttg taccttccac aagactcaga atccacagtg tcccattttc cgactaggag 840
acatcttccg agaaacaggc gataattttt cagatgtggc aattcagggc ggaataatgg 900
gcattgagat ctactgggac tgcaacctag accgttggtt ccatcactgc cgtcccaaat 960
acagtttccg tcgccttgac gacaagacca ccaacgtgtc cttgtaccct ggctacaact 1020
tcagatacgc caagtactac aaggaaaaca atgttgagaa acggactctg ataaaagtct 1080
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tggttgtgta catcggctca accctctcct acttcggtct ggccgctgtg ttcatcgact 1200
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gctgtcagcc ctgtgtggtc aacgaatact actacaggaa gaagtgcgag tccattgtgg 1320
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accagcagct actagggaga agtctgcaag atgtcaaggg ccaagaagtc ccaagacctg 1440
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Lys Leu Tyr Gln Arg Lys Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Thr Lys
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Lys Lys Leu Val His Ser Val Phe Asp Thr Ala Asp Tyr Thr Phe Pro
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Lys Gly Ile Gln Thr Gly Arg Cys Val Val Tyr Glu Gly Asn Gln Lys
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Thr Cys Glu Val Ser Ala Trp Cys Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala
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Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Phe Thr Val Leu Ile
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Lys Asn Asn Ile Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile
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Asn Phe Ser Asp Val Ala Ile Gln Gly Gly Ile Met Gly Ile Glu Ile
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Tyr Trp Asp Cys Asn Leu Asp Arg Trp Phe His His Cys Arg Pro Lys
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Tyr Ser Phe Arg Arg Leu Asp Asp Lys Thr Thr Asn Val Ser Leu Tyr
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Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val Phe Gly Ile Arg Phe Asp Ile Leu
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Val Phe Gly Thr Gly Gly Lys Phe Asp Ile Ile Gln Leu Val Val Tyr
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Ile Gly Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Ala Ala Val Phe Ile Asp
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Phe Leu Ile Asp Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Cys Arg Ser His Ile Tyr
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Pro Trp Cys Lys Cys Cys Gln Pro Cys Val Val Asn Glu Tyr Tyr Tyr
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Arg Lys Lys Cys Glu Ser Ile Val Glu Pro Lys Pro Thr Leu Lys Tyr
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Val Ser Phe Val Asp Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gln Gln Leu
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Thr Pro Pro Ile Pro Gly Gln Pro Glu Glu Ile Gln Leu Leu Arg Lys
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Tyr Gln Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asp Val Asp Ser Thr Asn Ser Arg
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Leu Arg His Cys Ala Tyr Arg Cys Tyr Ala Thr Trp Arg Phe Gly Ser
545 550 555 560
Gln Asp Met Ala Asp Phe Ala Ile Leu Pro Ser Cys Cys Arg Trp Arg
565 570 575
Ile Arg Lys Glu Phe Pro Lys Ser Glu Gly Gln Tyr Ser Gly Phe Lys
580 585 590
Ser Pro Tyr
595
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn His
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Arg Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽的编码序列
<400> 5
gaggtccaac tgctggagag tggtgggggt ctcgtacaac cggggggatc tctcaggctc 60
tcatgtgccg cctcaggttt tacattccga aatcatgata tgggctgggt ccgccaagct 120
cctgggaagg ggttggagtg ggtttcagcc atctcaggaa gcggcggctc cacttactac 180
gctgattctg ttaaggggcg attcactata agccgagata atagcaagaa tactctctat 240
cttcagatga actcacttcg ggcggaagac actgcagtct attattgtgc cgaacccaaa 300
cccatggaca cggagttcga ctacagaagc cctgggacct tggttacagt gtctagt 357
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn His
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Met Lys
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Arg Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu
115
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合蛋白
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn His
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
1 5 10 15
Pro Pro Cys Pro
20
<210> 11
<211> 70
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp
1 5 10 15
Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr
20 25 30
Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
35 40 45
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
50 55 60
Pro Cys Pro Arg Cys Pro
65 70
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Cys
20
<210> 15
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro
50 55
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp
1 5 10 15
Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr
20 25 30
Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys
35 40 45
Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys
50 55 60
Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys
65 70 75 80
Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His
85 90 95
Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp
100 105 110
<210> 17
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe
1 5 10 15
Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly
20 25 30
Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp
35 40 45
Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln
50 55 60
Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr
65 70 75 80
Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys
85 90 95
Lys Cys Ala
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
1 5 10 15
<210> 19
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 20
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 21
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro Thr Lys Lys Ser
1 5 10 15
Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro Glu Thr Gln Lys
20 25 30
Gly Pro Leu Cys Ser Pro
35
<210> 22
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro Thr Lys Lys Ser Thr Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro Glu Thr Gln Lys Gly Pro
20 25 30
Leu Cys Ser Pro
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala
20 25 30
Ser Ala Leu Pro
35
<210> 24
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr
1 5 10 15
Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro
20
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PolyG/S铰链
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 28
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 29
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 32
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 34
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
100 105
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头结构域
<400> 38
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 39
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 40
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 40
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Glu Phe Asp
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR序列
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys
20 25 30
<210> 42
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 43
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 44
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg
180
<210> 45
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 46
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 zeta的细胞内CAR结构域
<400> 46
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 47
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu
1 5 10 15
Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu
20 25 30
Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His
35 40 45
Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr
50 55 60
Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys
65 70 75 80
Ser Val Leu Asp Ile Ser His Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe
85 90 95
Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly
100 105 110
Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg
115 120 125
Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly
130 135 140
Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His
145 150 155 160
Ile His Ser Cys Gln Lys Phe Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser
165 170 175
Phe Ser Thr Glu Ile Val Val Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly
180 185 190
Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu
195 200 205
Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu Asp Arg Val Tyr Glu Glu Leu Asn Ile
210 215 220
Tyr Ser Ala Thr Tyr Ser Glu Leu Glu Asp Pro Gly Glu Met Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ile Asp Leu
<210> 48
<211> 374
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290 295 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325 330 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355 360 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210> 49
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞内结构域的CAR 41BB部分
<400> 49
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
1 5 10 15
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
20 25 30
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 50
<211> 823
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR氨基酸序列
<400> 50
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe
115 120 125
Asp Tyr Arg Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
130 135 140
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
145 150 155 160
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
165 170 175
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
180 185 190
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
195 200 205
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
210 215 220
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
245 250 255
Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
260 265 270
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
275 280 285
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
290 295 300
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
305 310 315 320
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
325 330 335
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
370 375 380
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
385 390 395 400
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
405 410 415
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
420 425 430
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu
435 440 445
Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
450 455 460
Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro
465 470 475 480
His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly
485 490 495
Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys
500 505 510
His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro
515 520 525
Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro
530 535 540
Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu
545 550 555 560
Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu
565 570 575
Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser
580 585 590
Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu
595 600 605
Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu
610 615 620
Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly
625 630 635 640
Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala
645 650 655
Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly
660 665 670
Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg
675 680 685
Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe
690 695 700
Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln
705 710 715 720
Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln
725 730 735
Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala
740 745 750
Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala
755 760 765
Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr
770 775 780
Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser
785 790 795 800
Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala
805 810 815
Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
820
<210> 51
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR氨基酸序列
<400> 51
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe
115 120 125
Asp Tyr Arg Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
130 135 140
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
145 150 155 160
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
165 170 175
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
180 185 190
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
195 200 205
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
210 215 220
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
245 250 255
Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
260 265 270
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
275 280 285
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
290 295 300
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
305 310 315 320
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
325 330 335
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
340 345 350
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
370 375 380
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
385 390 395 400
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
405 410 415
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
420 425 430
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 52
<211> 2478
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO 50的编码序列
<400> 52
gccaccatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc cagaggtcca actgctggag agtggtgggg gtctcgtaca accgggggga 120
tctctcaggc tctcatgtgc cgcctcaggt tttacattcc gaaatcatga tatgggctgg 180
gtccgccaag ctcctgggaa ggggttggag tgggtttcag ccatctcagg aagcggcggc 240
tccacttact acgctgattc tgttaagggg cgattcacta taagccgaga taatagcaag 300
aatactctct atcttcagat gaactcactt cgggcggaag acactgcagt ctattattgt 360
gccgaaccca aacccatgga cacggagttc gactacagaa gccctgggac cttggttaca 420
gtgtctagtg aatctaagta cggaccgccc tgcccccctt gccctggcca gcctagagaa 480
ccccaggtgt acaccctgcc tcccagccag gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 540
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gatatcgccg tggaatggga gagcaacggc 600
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc 660
ctgtactccc ggctgaccgt ggacaagagc cggtggcagg aaggcaacgt cttcagctgc 720
agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgag cctgagcctg 780
ggcaagatgt tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg 840
gtcaccgtgg ccttcatcat cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 900
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 960
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc 1020
gacgcccctg cctaccagca gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1080
agggaagagt acgacgtcct ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag 1140
cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1200
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc 1260
ctgtatcagg gcctgtccac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc 1320
ctgcccccaa ggctcgaggg cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac 1380
gtggaggaga atcccggccc taggatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag 1440
ttaccacacc cagcattcct cctgatccca cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt 1500
gaatttaaag actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc 1560
tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat 1620
actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg 1680
tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta 1740
gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg 1800
aacataacat ccttgggatt acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt 1860
tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc 1920
tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc 1980
caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc 2040
gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag 2100
ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg 2160
cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc 2220
cactacattg acggccccca ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac 2280
aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac 2340
tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc 2400
ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg 2460
atcggcctct tcatgtga 2478
<210> 53
<211> 1333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 51的编码序列
<400> 53
cgccaccatg cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt 60
cctcctgatc ccagaggtcc aactgctgga gagtggtggg ggtctcgtac aaccgggggg 120
atctctcagg ctctcatgtg ccgcctcagg ttttacattc cgaaatcatg atatgggctg 180
ggtccgccaa gctcctggga aggggttgga gtgggtttca gccatctcag gaagcggcgg 240
ctccacttac tacgctgatt ctgttaaggg gcgattcact ataagccgag ataatagcaa 300
gaatactctc tatcttcaga tgaactcact tcgggcggaa gacactgcag tctattattg 360
tgccgaaccc aaacccatgg acacggagtt cgactacaga agccctggga ccttggttac 420
agtgtctagt gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctggcc agcctagaga 480
accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct 540
gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgatatcgcc gtggaatggg agagcaacgg 600
ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg gacagcgacg gcagcttctt 660
cctgtactcc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag gaaggcaacg tcttcagctg 720
cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagtccctga gcctgagcct 780
gggcaagatg ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct 840
ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat 900
attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg 960
ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc 1020
cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag 1080
aagggaagag tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 1140
gcctcggcgg aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 1200
cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg 1260
cctgtatcag ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 1320
cctgccccca agg 1333
<210> 54
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CNA1002 CAR氨基酸序列
<400> 54
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe
115 120 125
Asp Tyr Arg Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
130 135 140
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val
145 150 155 160
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
165 170 175
Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
180 185 190
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
195 200 205
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
210 215 220
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
225 230 235 240
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
245 250 255
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
260 265 270
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
275 280 285
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
290 295 300
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
305 310 315 320
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu
325 330 335
Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
340 345 350
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu
355 360 365
Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val
370 375 380
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
385 390 395 400
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
405 410 415
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
420 425 430
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
435 440 445
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
450 455 460
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
465 470 475 480
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
485 490 495
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
500 505 510
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
515 520 525
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
530 535 540
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
545 550 555 560
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
565 570 575
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
580 585 590
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
595 600 605
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
610 615 620
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
625 630 635 640
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
645 650 655
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
660 665 670
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
675 680 685
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
690 695 700
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
705 710 715
<210> 55
<211> 2158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:54的编码DNA
<400> 55
cgccaccatg cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt 60
cctcctgatc ccagaggtcc aactgctgga gagtggtggg ggtctcgtac aaccgggggg 120
atctctcagg ctctcatgtg ccgcctcagg ttttacattc cgaaatcatg atatgggctg 180
ggtccgccaa gctcctggga aggggttgga gtgggtttca gccatctcag gaagcggcgg 240
ctccacttac tacgctgatt ctgttaaggg gcgattcact ataagccgag ataatagcaa 300
gaatactctc tatcttcaga tgaactcact tcgggcggaa gacactgcag tctattattg 360
tgccgaaccc aaacccatgg acacggagtt cgactacaga agccctggga ccttggttac 420
agtgtctagt gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctatgt tctgggtgct 480
ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg ccttcatcat 540
cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag 600
accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga 660
aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctaccagca 720
gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agggaagagt acgacgtcct 780
ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca 840
ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg 900
catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac 960
cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa ggctcgaggg 1020
cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga atcccggccc 1080
taggatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag ttaccacacc cagcattcct 1140
cctgatccca cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc 1200
cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca 1260
catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca 1320
ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg 1380
gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac 1440
caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt 1500
acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg 1560
ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat 1620
tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg 1680
ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag 1740
ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt 1800
ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac 1860
ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca 1920
ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta 1980
cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg 2040
gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat 2100
ggtgggggcc ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatgtga 2158
<210> 56
<211> 932
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CNA1004 CAR氨基酸序列
<400> 56
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe
115 120 125
Asp Tyr Arg Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
130 135 140
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
355 360 365
Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
370 375 380
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly
385 390 395 400
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
405 410 415
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
420 425 430
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
435 440 445
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
450 455 460
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
465 470 475 480
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
485 490 495
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
500 505 510
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
515 520 525
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
530 535 540
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly
545 550 555 560
Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met
565 570 575
Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala
580 585 590
Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu
595 600 605
Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys
610 615 620
Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe
625 630 635 640
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
645 650 655
Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln
660 665 670
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu
675 680 685
Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val
690 695 700
Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile
705 710 715 720
Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
725 730 735
Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr
740 745 750
Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
755 760 765
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
770 775 780
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
785 790 795 800
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
805 810 815
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
820 825 830
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
835 840 845
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
850 855 860
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
865 870 875 880
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
885 890 895
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
900 905 910
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile
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Gly Leu Phe Met
930
<210> 57
<211> 2809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:56的编码DNA
<400> 57
cgccaccatg cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt 60
cctcctgatc ccagaggtcc aactgctgga gagtggtggg ggtctcgtac aaccgggggg 120
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caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca 660
gttccagagc acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa 720
cggcaaagaa tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgaaaagac 780
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cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc 960
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ccggtggcag gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca 1080
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tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa 1380
tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag tacgacgtcc tggataagcg 1440
gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg aagaaccccc aggaaggcct 1500
gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg 1560
cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag ggcctgtcca ccgccaccaa 1620
ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca aggctcgagg gcggcggaga 1680
gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc ctaggatgct 1740
tctcctggtg acaagccttc tgctctgtga gttaccacac ccagcattcc tcctgatccc 1800
acgcaaagtg tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc 1860
tacgaatatt aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc 1920
ggtggcattt aggggtgact ccttcacaca tactcctcct ctggatccac aggaactgga 1980
tattctgaaa accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa 2040
caggacggac ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca 2100
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caaggagata agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa 2220
tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa 2280
cagaggtgaa aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga 2340
gggctgctgg ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag 2400
ggaatgcgtg gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc 2460
tgagtgcata cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg 2520
acggggacca gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa 2580
gacctgcccg gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc 2640
cggccatgtg tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct 2700
tgaaggctgt ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc 2760
cctcctcttg ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatgtga 2809
<210> 58
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码序列 BLIV-CAR短铰链CAR
<400> 58
gaccggcgcc tactctagag gagcgcgtca tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc 60
cactcgctct tctccttcac gccgcaagac ccgaagtgca gcttctggag tctggaggtg 120
gtttggtgca gcctggcggg tctctcagat tgtcatgcgc cgcatccggt ttcacctttc 180
ggaaccatga tatgggttgg gtccgccagg ccccaggcaa gggtcttgag tgggtctccg 240
ccatcagcgg cagtggcggg tccacatact acgcagactc cgtcaaaggc agatttacaa 300
tttcacggga taatagtaag aacactctgt acctccagat gaatagtctc cgggcggagg 360
acacagctgt gtactattgc gcggagccaa agccaatgga tactgagttt gattattgga 420
gcccgggaac cctggtgaca gtatccagcg gcggcggcgg ctctggcggt gggggtagcg 480
gaggcggcgg aagcgaatcc aaatatggcc ctccttgtcc accgtgcccc gatccaaagt 540
tctgggtgct ggtggtagtg ggtggcgtcc tggcctgtta ttctctgctt gtgacagtcg 600
cgtttatcat cttttgggtc cggtctaaac gctctaggtt gttgcactcc gattacatga 660
acatgacccc acgccggcct ggccctacgc ggaagcacta ccaaccttac gctcctccca 720
gggatttcgc cgcttacagg agccgagatc agagactgcc acccgatgca cacaaaccac 780
ccggtggtgg gtctttcagg accccaatcc aggaggagca agctgacgcg cattccaccc 840
ttgccaagat aagggtcaaa tttagtaggt cagctgacgc gccggcctat caacagggac 900
agaaccagtt gtataatgaa ctcaatctcg gacgacgcga ggagtacgac gtactggata 960
agaggcgcgg cagggatcct gaaatgggcg gcaagccccg gcgaaaaaac ccccaggagg 1020
gactctacaa tgagctgcag aaggacaaaa tggcagaagc ttactccgaa attggaatga 1080
agggcgaaag aaggagaggg aaagggcacg atggcctgta tcagggcctg agtaccgcca 1140
ccaaggacac gtatgatgcc ctgcatatgc aggcactgcc ccctagagga agcggggcta 1200
cgaatttcag cctcctgaaa caggctggcg acgtggagga aaatccgggg ccaggcgaat 1260
<210> 59
<211> 1875
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码序列 BLIV-CAR长铰链CAR
<400> 59
gaccggcgcc tactctagag gagcgcgtca tggctcttcc tgtgaccgca ttgctgctgc 60
cgctggcctt gctgctgcat gcagctcggc cagaagttca actgctggag agtggagggg 120
gcctcgtgca gccgggcggc agcttgcgcc tgtcatgtgc agcaagcggg ttcaccttta 180
ggaaccacga tatggggtgg gtgaggcagg ctccgggaaa gggtctggaa tgggtgagtg 240
ccatatcagg gagcggaggc tccacctact acgcagactc cgtgaagggt cggtttacga 300
tttccagaga caattccaag aataccctgt acctgcagat gaactccctc cgcgccgaag 360
atacagcagt ctactactgt gcagaaccaa aaccaatgga tacagaattc gactattgga 420
gtcctggaac tcttgtcact gtatccagtg gaggaggcga gagtaaatat ggacctccgt 480
gtccgagttg tcccgcgcct cctgtggccg gcccctctgt atttctgttt ccacctaagc 540
cgaaagatac attgatgatt agccgaacac cagaggttac ttgtgtggtt gttgacgtga 600
gtcaagagga ccctgaggtg cagtttaatt ggtatgtcga cggagttgag gtgcataacg 660
ccaagacgaa gccgcgagag gagcagttta attccaccta cagggtcgta tccgttctca 720
ctgtccttca ccaggactgg ctgaatggga aggagtacaa atgcaaagtg agcaataaag 780
gcctgccgag ctccatcgaa aaaaccattt ccaaggcaaa aggccaaccc cgagagccac 840
aggtctatac cctgccacca agccaggagg aaatgaccaa gaatcaggtg agcctcacct 900
gtctggtcaa gggcttctac ccgtccgaca tcgcggtgga gtgggagagt aacggacagc 960
ctgaaaacaa ttacaagaca accccgcctg ttttggactc tgacggctcc ttttttctgt 1020
actctcggct taccgtggat aagagtagat ggcaagaagg caacgtcttc agctgttccg 1080
tgatgcatga ggcgctgcat aaccattata cacaaaaaag tctgtccttg agcctgggca 1140
aattttgggt gctggtggtg gtggggggtg tcctcgcttg ctacagtttg ttggtgacag 1200
ttgcctttat tattttttgg gtgcgcagta agcggagtcg cctccttcat tccgactata 1260
tgaacatgac acctcgccgc ccaggcccaa cgaggaaaca ttatcagcca tatgcaccac 1320
ctagagactt tgccgcttac cggtcccgag atcaaaggct tccccccgat gcacacaaac 1380
cacccggcgg tggctcattt cgaacaccaa ttcaggaaga gcaggcagac gcccacagca 1440
ccctggccaa gatccgggta aagttcagcc gaagtgcaga tgcgccggca taccagcagg 1500
gccagaatca attgtacaat gagcttaacc tcggccgcag agaggagtat gatgtactgg 1560
ataagcggcg cggacgggat cctgagatgg gaggaaagcc tcggagaaaa aatccccagg 1620
aaggacttta caatgagttg cagaaggata agatggccga agcatattct gaaatcggga 1680
tgaaaggtga gcggcggaga ggaaaaggcc acgacgggct ctaccagggg ctgagcacag 1740
ctactaaaga tacatacgac gcacttcata tgcaagccct gcctccccgc ggaagcggtg 1800
ccacgaactt ttctctcctc aaacaggctg gggacgtcga ggaaaatcca ggtcccggcg 1860
aattcgccac catgc 1875
<210> 60
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BLIV-CAR短氨基酸序列
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp
115 120 125
Tyr Trp Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
145 150 155 160
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val
165 170 175
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
180 185 190
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
195 200 205
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
210 215 220
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp
225 230 235 240
Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe
245 250 255
Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala
260 265 270
Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
275 280 285
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
290 295 300
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
305 310 315 320
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
325 330 335
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
340 345 350
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
355 360 365
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
370 375 380
Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly
385 390 395 400
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
405
<210> 61
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BLIV-CAR长铰链CAR氨基酸序列
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp
115 120 125
Tyr Trp Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Glu
130 135 140
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
165 170 175
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
195 200 205
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
245 250 255
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
290 295 300
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
325 330 335
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
340 345 350
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
355 360 365
Leu Gly Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
370 375 380
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
385 390 395 400
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
405 410 415
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
420 425 430
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala
435 440 445
His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu
450 455 460
Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser
465 470 475 480
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
485 490 495
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
500 505 510
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
515 520 525
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
530 535 540
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
545 550 555 560
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
565 570 575
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr
580 585 590
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
595 600 605
Pro Gly Glu
610
<210> 62
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFRt氨基酸序列
<400> 62
Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His
1 5 10 15
Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile
20 25 30
Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His
35 40 45
Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val
50 55 60
Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln
65 70 75 80
Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu
85 90 95
Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn
100 105 110
Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu
115 120 125
Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys
130 135 140
Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys
145 150 155 160
Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln
165 170 175
Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr
180 185 190
Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro
195 200 205
Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu
210 215 220
Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val
225 230 235 240
Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala
245 250 255
Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys
260 265 270
Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly
275 280 285
Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly
290 295 300
His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
325 330 335
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu
340 345 350
Gly Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 63
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BLIV-CAR长接头结构域
<400> 63
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Met Lys
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Arg Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu
115
<210> 65
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 65
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn His
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 66
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Ser Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Thr Ser Leu Val Glu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Ala
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val
145 150 155 160
Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln
165 170 175
Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly
180 185 190
Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg
225 230 235 240
Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Leu
245 250 255
Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln Arg Ala
260 265 270
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
275
<210> 67
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn His
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile
115 120 125
Phe Pro Pro Ser Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
145 150 155 160
Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
165 170 175
Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Gln Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
260 265 270
<210> 68
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合肽
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Met Lys
20 25 30
Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe Asp Tyr Arg Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
165 170 175
Phe Thr Phe Arg Asn His Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
195 200 205
Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
210 215 220
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Pro Lys Pro Met Asp Thr Glu Phe
245 250 255
Asp Tyr Pro Ser Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265
<210> 69
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多价CAR的偶联区
<400> 69
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30

Claims (64)

1.嵌合抗原受体，其包括识别功能失调性P2X7受体的抗原识别结构域、跨膜结构域和接头结构域，其中所述接头结构域由12至228个氨基酸组成。
2.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由30至228个氨基酸组成。
3.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由50至200个氨基酸组成。
4.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由70至180个氨基酸组成。
5.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由90至160个氨基酸组成。
6.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由110至130个氨基酸组成。
7.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由115至125个氨基酸组成。
8.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由117至121个氨基酸组成。
9.根据权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由约119个氨基酸组成。
10.根据权利要求1至9中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与免疫球蛋白铰链区同源的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至9中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：IgG、IgD、IgA的免疫球蛋白铰链区，或者IgM或IgE的重链恒定(CH)2区，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％、96％或99％序列同一性的功能变体。
12.根据权利要求1至11中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：来自IgG同种型免疫球蛋白的铰链区，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
13.根据权利要求1至11中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：免疫球蛋白的IgG1、IgG2或IgG4亚类的铰链区，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％或93％序列同一性的功能变体。
14.根据权利要求1至13中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与来自包括CXXC基序的IgG同种型免疫球蛋白的铰链区同源的氨基酸序列。
15.根据权利要求14的嵌合抗原受体，其中所述CXXC基序选自CPPC、CPRC或CPSC的组。
16.根据权利要求1至15中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的一个或多个氨基酸序列：免疫球蛋白的重链恒定(CH)区，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
17.根据权利要求1至16中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：免疫球蛋白的CH1区、CH2区、CH3区和/或CH4区中的一个或多个，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
18.根据权利要求1至16中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含与以下同源的氨基酸序列：IgG同种型免疫球蛋白的CH2区和/或CH3区中的一个或多个，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的功能变体。
19.根据权利要求1至18中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由一个或多个免疫球蛋白铰链区和/或免疫球蛋白的一个或多个CH区组成。
20.根据权利要求1至19中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由IgG铰链区和免疫球蛋白的一个或多个CH区组成。
21.根据权利要求1至20中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域由IgG铰链区和/或免疫球蛋白的CH2或CH3区组成。
22.根据权利要求1至21中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含根据SEQID NO:9至17的氨基酸序列，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
23.根据权利要求1至21中任一项的嵌合抗原受体，其中所述接头结构域包含根据SEQID NO:9至13的氨基酸序列，或者其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、93％或96％序列同一性的功能变体。
24.根据权利要求1至23中任一项的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体在所述接头结构域中不包含实质上与Fc受体结合的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至24中任一项的嵌合抗原受体，其中在CD8+T细胞中表达时，所述嵌合抗原受体对表达功能失调性P2X7受体的靶细胞具有至少20％的体外细胞毒性，其中表达CAR的CD8+T细胞:靶细胞的比率为30:1或更大。
26.根据权利要求1至25中任一项的嵌合抗原受体，其中在CD3+T细胞中表达时，所述T细胞表现出针对至少2种不同癌症类型，至少3种不同癌症类型，至少4种不同癌症类型，至少5种不同癌症类型，至少6种不同癌症类型，至少7种不同癌症类型，至少8种不同癌症类型，至少9种不同癌症类型，至少10种不同癌症类型的活性。
27.根据权利要求1至26中任一项的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域识别与所述P2X7受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点相关的表位。
28.根据权利要求1至27中任一项的嵌合抗原受体，其中与全功能性P2X7受体的ATP结合能力相比，所述功能失调性P2X7受体具有降低的结合ATP的能力。
29.根据权利要求1至28中任一项的嵌合抗原受体，其中所述功能失调性P2X7受体具有使所述受体功能失调的构象变化。
30.根据权利要求29的嵌合抗原受体，其中所述构象变化是氨基酸从反式构象变为顺式构象的变化。
31.根据权利要求30的嵌合抗原受体，其中从反式构象变为顺式构象的氨基酸是所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸。
32.根据权利要求1至31中任一项的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域识别包括跨越所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置200处的甘氨酸至氨基酸位置216处的半胱氨酸的一个或多个氨基酸残基的表位。
33.根据权利要求1至32中任一项的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域识别包括所述功能失调性P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸的表位。
34.根据权利要求1至33中任一项的嵌合抗原受体，其中所述抗原识别结构域包含与结合功能失调性P2X7受体的抗体的抗原结合结构域的氨基酸序列同源的氨基酸序列，或者其中所述抗原识别结构域包含与功能失调性P2X7受体结合的抗体的重链和/或轻链的互补决定区。
35.根据权利要求1至34中任一项的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含CD8或CD28的全部或部分跨膜结构域。
36.核酸分子，其包含编码根据权利要求1至35中任一项的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
37.核酸构建体，其包含根据权利要求36的核酸分子。
38.经遗传修饰的细胞，所述细胞包含根据权利要求1至35中任一项的嵌合抗原受体。
39.经遗传修饰的细胞，所述细胞包括根据权利要求36的核酸分子或根据权利要求37的核酸构建体。
40.根据权利要求38或39的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是白细胞。
41.根据权利要求38至40中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。
42.根据权利要求38至41中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。
43.根据权利要求38至42中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞。
44.根据权利要求43的经遗传修饰的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
45.根据权利要求43的经遗传修饰的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
46.根据权利要求43的经遗传修饰的细胞，其中所述T细胞是gamma delta T细胞。
47.根据权利要求38至42中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是自然杀伤细胞。
48.根据权利要求38至42中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是自然杀伤T细胞。
49.根据权利要求38至42中任一项的经遗传修饰的细胞，其中所述细胞是巨噬细胞。
50.根据权利要求38至49中任一项的经遗传修饰的细胞或表达根据权利要求1至35中任一项的嵌合抗原受体的细胞在治疗癌症中的用途。
51.根据权利要求50的用途，其中所述癌症是实体癌。
52.杀伤表达功能失调性P2X7受体的细胞的方法，所述方法包括将表达功能失调性P2X7受体的细胞暴露于表达根据权利要求1至35中任一项的嵌合抗原受体的细胞，或者所述方法包括将表达功能失调性P2X7受体的细胞暴露于根据权利要求38至49中任一项的经遗传修饰的细胞。
53.根据权利要求52的方法，其中表达功能失调性P2X7受体的细胞是癌细胞。
54.根据权利要求53的方法，其中所述癌细胞是来自实体癌的细胞。
55.根据权利要求53或54的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、胶质母细胞瘤癌细胞、卵巢癌细胞或黑素瘤癌细胞。
56.根据权利要求52至55中任一项的方法，其中所述表达嵌合抗原受体的细胞或所述经遗传修饰的细胞是与表达功能失调性P2X7受体的细胞自体的细胞。
57.根据权利要求52至56中任一项的方法，其中所述表达功能失调性P2X7受体的细胞在受试者体内。
58.根据权利要求57的方法，其中所述受试者体内的细胞是来自转移性癌症的细胞。
59.药物组合物，其包含根据权利要求38至49中任一项的经遗传修饰的细胞，根据权利要求36的核酸分子，或根据权利要求37的核酸构建体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
60.根据权利要求1至35中任一项的嵌合抗原受体在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
61.病毒载体，其包含根据权利要求36的核酸分子或根据权利要求37的核酸构建体。
62.根据权利要求61的病毒载体在转导用于预防或治疗癌症的细胞中的用途。
63.根据权利要求36的核酸分子或根据权利要求37的核酸构建体在细胞的转导、转化或转染中的用途。
64.根据权利要求63的用途，其中所述细胞用于制备预防或治疗癌症的药物。
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