CN112156227A

CN112156227A - 骨充填材料的组合物、预备品以及它们的制备方法和应用

Info

Publication number: CN112156227A
Application number: CN202010646853.8A
Authority: CN
Inventors: 李倩; 杨春; 赵继志; 祖岩; 穆月
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2021-01-01
Also published as: CN106729972A

Abstract

本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及骨充填材料的组合物、预备品以及它们的制备方法和应用。该骨充填材料组合物，包括骨粉、明胶和交联剂，兼有诱导作用、弹性、塑形性好的优点。骨充填材料预备品为骨充填材料组合物制备的溶液经冷冻干燥后的产品。制备骨充填材料的方法，包括将所述骨充填材料组合物或预备品与医学上可接受的溶剂混合。本发明原材料来源广泛，制备简易，在临床应用时，能及时提供可填充的骨充填材料。本发明的骨充填材料可广泛用于科研领域或作为医用材料使用。

Description

骨充填材料的组合物、预备品以及它们的制备方法和应用

本申请是申请日为2016年12月05日，申请号为201611102957.2，发明名称为“骨充填材料的组合物、预备品以及它们的制备方法和应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及骨充填材料的组合物、预备品以及它们的制备方法和应用。

背景技术

人体骨修复技术经过了漫长的发展时期，主要是在材料的生物相容性方面做出了极大的改进，从原始的柳条到金属，再到医用高分子，如今骨修复材料已经进入了仿生材料的阶段。但是无论是何种材料，在临床的使用手段上都没有多大的改善，基本上仍沿用着颗粒型或条形这些不易塑形的材料，在临床使用中对医生技术要求很高，尤其是对于骨裂或不愈合的骨缝，操作起来十分不便。由于外伤、肿瘤、病理性疾病或其他形式造成的骨创伤及在口腔科骨植入术中，骨缺损处的形状常常很不规则，或创口部位较深。而植骨术中常用的填充物形状固定规整(或散成颗粒状不成形)，不易随意塑形，导致在填充过程中在缺损处残留死腔，影响成骨效果，延长愈合时间。为改善植骨效果，若能采用涂膜、手指塑形、注射器注入等方式对骨充填材料进行塑形，必然能获得更好的修复效果，但这就对骨填充材料的塑形性提出了更高要求。

中国专利文献CN102755668公开了一种可塑型医用骨泥，其为主要由多糖或蛋白胶液或有机粘合剂和骨粉组成的泥状复合材料。这种骨泥形态的骨填充物，由于其柔软易塑的特性，除了在细小骨缝隙的填充中仍然存有一定欠缺外，能满足大多植骨术的塑形要求，但是在骨填充材料的应用中，仍然存在以下问题。

就骨粉而言，以Bio-Oss骨粉为例，Bio-Oss骨粉一般自牛骨中提取，经过工艺加工，将所有的有机成分从牛的松质骨中彻底去除，而精细的骨小梁结构和内部空隙被保存下来，从而为成骨细胞的长入提供了支架，并保证了血凝块的稳定和血管的再生，是一种天然的、无抗原性、具有骨传导作用的移植材料，目前在临床上得到了广泛的应用。Bio-Oss骨粉化学成分接近人体骨无机结构(低晶体天然磷灰石)，宏观及微观物理结构与人体松质骨也极为相似。但在临床使用及成骨诱导能力方面却存在以下不足：(1)骨粉颗粒的弹性模量约1GPa，远远高于公认的能够诱导干细胞骨向分化的弹性基底硬度(约0.1MPa)；(2)单纯无机骨材料不能在化学或生物因子诱导条件下促进成骨作用；(3)在那些作为颗粒状骨粉使用的情形中，颗粒状骨粉还存在移位、游走、难以成形、不易放置的缺点，导致临床操作不便，植骨效果难以保证。

目前，临床上常用的骨充填材料除Bio-Oss骨粉外，还有Bio-Oss骨胶原，是指由90％的Bio-Oss和10％的胶原组成，为疏松多孔结构，呈立体矩形块状(3mm*5mm*7mm)。该材料的弹性模量较Bio-Oss骨粉有所降低(约1MPa)，但仍然高于诱导干细胞骨向分化的理想范围，且价格昂贵，给病人带来经济负担。

综上，目前已有的骨充填材料难以同时解决以下问题：

(1)临床上常用的骨充填材料(异种骨或人工合成骨材料)硬度过大，不适宜间充质干细胞的骨向分化及骨细胞功能的维持；

(2)材料只为缺损部位提供物理支持，缺少生长因子的诱导作用；

(3)材料塑形性较差，不能满足大面积或特殊形态要求的缺损移植手术，不适宜临床上骨缺损治疗的个性化需求。

此外，部分骨充填材料的商业成品，还存在价格昂贵，难以广泛应用的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种骨充填材料组合物，包括骨粉、明胶和交联剂。

本发明还提供一种骨充填材料预备品，其为所述骨充填材料组合物制备的溶液经冷冻干燥处理后获得的冻干产品。

本发明还提供一种制备骨充填材料预备品的方法，包括对所述骨充填材料组合物制备的溶液实施冷冻干燥处理。

本发明进一步还提供一种制备骨充填材料的方法，包括将所述骨充填材料组合物或骨充填材料预备品与医学上可接受的溶剂混合。

此外，本发明还提供本发明方法制备的骨充填材料在科研领域中的应用和作为医用材料的应用。

本发明骨充填材料组合物能够制得适宜弹性模量的骨填充材料，又由于骨填充材料硬度适宜，可进一步促进骨髓间充质干细胞骨向分化及成骨细胞功能。经冷冻干燥处理的骨充填材料组合物，形成了具有大量空隙的骨粉支架结构，更有弹性和韧性，易于塑形，且更具诱导作用。其可以粉末、流体、半固体的形式使用，因而塑形性好。因此，本发明的骨充填材料兼有弹性、诱导作用、塑形性好的特点。所述方法原材料来源广泛，制备简易，在临床应用时，能及时提供可填充的骨充填材料，可适应多种骨修复情形的塑形。

附图说明

图1为实施例1的实验组4制备的骨粉-明胶膜的外观图；

图2为实施例2制备明胶/京尼平-骨粉支架过程中，第一次预冻后产品的外观图；

图3为实施例2制备明胶/京尼平-骨粉支架过程中，第一次冻干后产品在京尼平水溶液中浸泡的外观图；

图4为实施例2制备明胶/京尼平-骨粉支架过程中，第二次冻干后产品在京尼平水溶液中浸泡后的外观图；

图5为实施例2制备的明胶/京尼平-骨粉支架的环境扫描电镜图；

图6为倒置显微镜下BMSCs的形态X100；

图7为免疫印迹检测成骨标记物蛋白水平表达图；

图8为Real-time荧光定量PCR检测成骨标记物mRNA水平表达图；

图9为免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态——激光共聚焦显微镜下Col-I成骨分化标志蛋白标记的细胞染色结果；

图10为免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态——激光共聚焦显微镜下OCN成骨分化标志蛋白标记的细胞染色结果；

图11为免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态——激光共聚焦显微镜下OPN成骨分化标志蛋白标记的细胞染色结果；

图12为免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态的统计结果图；

图13为碱性磷酸酶活性测定培养皿中细胞染色的肉眼观察情况(上)和倒置显微镜下观察的情况(下)；

图14为碱性磷酸酶(ALP)活性测定的统计结果图。

具体实施方式

在本发明中，如无特别说明，所有操作均在室温、常压条件实施，所有“％”为质量百分比。

本发明的骨充填材料组合物，包括骨粉、明胶和交联剂。

本发明使用的明胶，作为可降解的生物大分子，是成骨诱导因子之一，可有效促进植骨区周围骨质的新生；明胶与胶原相比，还降低了生产成本。以成品骨粉为原材料，保留了材料本身的化学特性，经过与明胶凝胶的混合，重建了材料的多孔支架结构。明胶和骨粉的比例能够调节材料的弹性模量，能够制备不同弹性模量的骨充填材料，利用物理环境的诱导作用促进了骨移植后的成骨效果，适宜间充质干细胞的骨向分化及骨细胞功能的维持。明胶具有粘结固体的效果，经交联后形成半固体，加入骨粉颗粒后，材料变得易于塑形，不受骨缺损形态和大小的限制，可根据需要进行个性化的材料制备。

我们已知，间充质干细胞来源的成骨细胞的数量和功能对促进新骨形成至关重要。近年来，研究发现细胞外基质(extracellular matrix,ECM)弹性即细胞所感知的材料的弹性，可以影响诱导干细胞向成骨细胞分化的过程。我们经过探索，发现干细胞成骨分化在弹性大约为10⁵Pa的基质上明显占优势，过软或者过硬的胞外基质都对体外培养的干细胞成骨分化、成骨细胞功能维持不利。临床上常用的骨粉颗粒的弹性模量约1GPa，临床上单纯使用这类材料，在物理环境角度可能不能达到最理想的促成骨作用。即，传统的骨充填材料(包括大多数骨泥)硬度非常高，而经研究显示，过硬基底(即骨充填材料形成的基底)不利干细胞骨向分化，而适宜硬度材料可以促进骨细胞活力和成骨。本发明骨充填材料组合物可通过调整其成分比例使材料硬度可控，为干细胞向成骨细胞分化提供了良好的物理环境。

所述本发明骨充填材料组合物，还可包括医学上可接受的溶剂。具体在作为产品包装时，所述组分可分开包装，或部分或全部组分混合后包装。

胶原是细胞外基质的主要成分，是人体中含量最丰富的一种结构蛋白，占人体蛋白总量的30％以上。胶原具有来源广泛、容易获得、生物安全性好、免疫原性低等特点，在体内可被生物体降解，降解产物可被机体吸收且降解速率可控，利于干细胞的黏附、增殖、分化，且有利于表型的保持。但是，胶原由于降解速率过快、制备的支架机械强度小，以及高纯度胶原获得成本高等不足，使其应用受到限制。明胶是胶原的降解产物，为一种天然多肽聚合物。使用上，明胶具有可改性、便于加工塑型等优点。明胶与胶原相似，具有生物活性强，可促进细胞的生长增殖等优点。明胶水溶液在温度低于35℃可形成热可逆性的凝胶，在温度低于35℃时为凝胶状态，高于35℃时为溶液。明胶水凝胶的热稳定性和力学稳定性不高，一般通过化学交联的方法改善。

本发明使用的明胶具有生物因子诱导的作用，同时与Ⅰ型胶原相比还降低了成本。更出乎意料的是，明胶与骨粉的配合使用，还可以调整骨充填材料的弹性模量，促进骨移植后的成骨效果，同时还易于塑形。

在一个优选的实施方案中，所述骨粉为羟基磷灰石为主要成分的骨替代材料；优选Bio-Oss骨粉。Bio-oss骨粉主要成分是羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)，HA是人体及动物骨的主要无机成分，生物相容性好、硬度大，具有良好的承重性，还具有骨诱导性，可与骨组织牢固结合。但HA抗疲劳强度不佳、脆性大、强度低，限制了其在生物材料中的直接应用。本发明骨粉与明胶的协同使用，避免了该问题。

所述骨粉以微观颗粒大小及所需骨充填材料形状为标准，可将成品骨粉进行不同程度的研磨。在一个优选的实施方案中，所述骨粉的颗粒大小为10um-200um。

在一个优选的实施方案中，所述交联剂为京尼平、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)等中的一种或多种；优选京尼平。

京尼平(genipin)是从栀子中提取京尼平苷，再由β－葡萄糖苷酶水解后得到的环烯醚萜类化合物，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，是一种优良的天然生物交联剂，其毒性远低于甲醛、戊二醛等传统化学交联剂。研究表明，genipin的细胞毒性低于戊二醛的1/10⁴，而其促细胞增值的能力则是戊二醛的5×10³倍。

所述骨粉与明胶的用量关系为：相同交联剂浓度下，骨粉比例越大，明胶浓度越大，材料越硬。在一个优选的实施方案中，所述明胶与骨粉的质量比为0.05-0.4:1，更优选0.15-0.4:1。

所述交联剂的用量，以本领域技术人员理解的能够达到交联目的的用量范围为限。在一个优选的实施方案中，所述交联剂的用量为骨充填材料总重量的0.05-0.5％，优选0.2％。

本发明还提供一种骨充填材料预备品，为所述骨充填材料组合物制备的溶液经冷冻干燥处理后获得的冻干产品。该预备品由冷冻干燥工艺制备，形成了具有大量空隙的骨粉支架结构，更有弹性和韧性，易于塑形。

本发明另外还提供一种制备骨充填材料预备品的方法，包括对所述骨充填材料组合物制备的溶液实施冷冻干燥处理。

在一个优选的实施方案中，所述冷冻干燥处理分两步进行：

第一步，制备明胶溶液，并与骨粉混合成明胶溶液和骨粉的混合物，冷冻干燥明胶溶液和骨粉的混合物，得明胶-骨粉支架；

第二步，制备交联剂溶液，并与明胶-骨粉支架混合成交联剂溶液和明胶-骨粉支架的混合物，冷冻干燥交联剂溶液和明胶-骨粉支架的混合物，得明胶/交联剂-骨粉支架，得所述骨充填材料预备品。

上述步骤中，制备溶液的常用溶剂为适应冷冻干燥工艺常规使用的溶剂，典型地为生理盐水。

冷冻干燥法制备的明胶/交联剂-骨粉支架，除利用了材料的化学性质和生物特性外，所形成的三维支架结构可模拟体内松质骨骨小梁的结构，为移植后骨缺损区血管化和间充质干细胞的附着提供良好的空间结构。而且，可通过与Bio-oss骨粉混合的方法，对材料的力学性质进行改进和调控。此处采用的冷冻干燥法，利用深度冷冻的溶剂在真空下升华的原理制备了多孔支架。采用二次冻干操作，可得到更为均匀和大量空隙的骨粉支架，以利于成骨；而且，这样获得的交联结构更有弹性和韧性，易于塑形。

此外，冻干法制备三维支架时，还可通过改变混合物的浓度来改变孔的尺寸。在更优选的实施方案中，第一步冷冻干燥时，所述明胶溶液的质量分数为5-10％。在另一更优选的实施方案中，第二步冷冻干燥时，所述交联剂溶液的质量分数为0.3％-1％，优选0.3％。

本发明另外还提供一种制备骨充填材料的方法，包括：将所述骨充填材料组合物或所述骨充填材料预备品与医学上可接受的溶剂混合。

所述医学上可接受的溶剂，例如为血液、生理盐水等。溶剂的用量，以形成便于临床植骨术操作的半固态骨填充材料为限。半固态的骨填充材料即可用于各种骨充填情形的塑形。具体在临床应用中，还可将所述骨粉、明胶和交联剂混合后，直接施入患者的骨移植区，患者的体液、血液等与所述混合物作用而实现骨的填充。

在一个优选的实施方案中，获得的骨充填材料的弹性模量为0.05-0.8MPa，更优选0.05-0.3MPa，最优选0.1-0.2MPa。

本发明还包括所述骨充填材料组合物和骨充填材料预备品以及它们的制备方法之间任意组合后形成的实施方案。

上述方法制备的骨充填材料作为实验材料，可广泛用于科研领域中，例如建立动物模型、实验分析等。

上述方法制备的骨充填材料作为医用材料，可广泛用于医药领域中，例如作为骨骼或牙齿的修复材料等。

以下参照实施例和附图，对本发明作进一步说明，其中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行。

实施例1

(1)在无菌条件下将成品Bio-Oss骨粉(购自GeistlichPharmaAG)研磨成粉末状，研磨后的粉末颗粒在环境扫描电子显微镜下观察，颗粒大小约10um-200um。此颗粒大小正适宜混匀制作弹性硬度均匀的支架材料，并形成大小适宜的空隙，以利于细胞长入，成骨。

(2)配置5％和10％浓度的明胶水溶液，50℃水浴搅拌促溶解，恢复至室温待用；配置5％的戊二醛水溶液。

(3)根据表1的用量，按照下述步骤，分别制备不同配比的骨粉-明胶膜。

操作步骤：

a.在玻璃片上将研磨后的骨粉粉末与明胶溶液、戊二醛溶液迅速混匀，用另一玻璃片盖在混合后的胶体表面，并适当加压，使混合后的胶体形成完整均匀的膜状，厚度约1mm。

b.室温静置10分钟后，将盖有玻璃片的骨粉-明胶膜放入纯水中，小心揭去玻璃片，保证膜的完整，注意避免长时间暴露在空气中，防止明胶水分流失导致膜变形。

c.用抽滤后的1％甘氨酸溶液浸泡并反复洗脱数次，至少24小时，以中和游离的戊二醛。

d.以PBS溶液清洗膜3次，并用紫外线照射30-40min，材料制备完毕。

制得的骨粉-明胶膜的弹性模量如表1所示，实验组4制备的骨粉-明胶膜的外观如图1所示。

表1骨粉-明胶膜的制备及弹性模量结果

备注：上述弹性模量通过原子力显微镜对基底材料进行测量测得(测试方法具体见实验例部分)，该测量方法在生物力学弹性测量实验中得到了广泛认可和应用。

由表1可知，当明胶溶液的浓度为5％时，我们逐渐增加组合物中明胶的质量比来调节组合物的弹性模量，在相同明胶溶液浓度时，增加明胶质量比同时伴随着溶剂(水)的增加，可使组合物的弹性模量随着明胶的质量比增加而下降，此时调节组合物弹性模量的关键物质是溶剂——水；但具有生物活性的物质的添加是本发明的初衷和优势，于是我们尝试增加了明胶溶液的浓度，发现在10％明胶溶液浓度下，得到了相较于5％明胶溶液浓度时更小范围的弹性变化，并且在溶液-骨粉质量比为4：1时，所得到的弹性模量值符合目前已知的干细胞成骨分化的理想硬度范围。另外，在对该材料进行制备时，我们发现10％明胶溶液因具有良好的半固体性质，在骨粉-明胶膜的制备中表现出了良好的塑形性，所得到的骨粉-明胶膜具有很好的韧性，易于保存，如图1示。

实施例2

(1)在无菌条件下将成品Bio-Oss骨粉(购自GeistlichPharmaAG)研磨成粉末状，研磨后的粉末颗粒环境扫描电子显微镜下观察颗粒大小约10um-200um。此颗粒大小正适宜混匀制作弹性硬度均匀的支架材料，以利于细胞长入，成骨。

(2)配置10％浓度的明胶水溶液，50℃水浴搅拌促溶解，恢复至室温待用；配置1％京尼平水溶液储液(京尼平购自上海士锋生物科技有限公司)。

(3)根据表2的用量，按照下述步骤，制备明胶/京尼平-骨粉支架。制备获得的明胶/京尼平-骨粉支架的弹性模量见表2。

操作步骤：

a.在冰上操作，明胶水溶液在低温下缓慢凝固，凝固过程中不断搅拌，使骨粉均匀分布于凝胶中，约5min稳定后，立即放入-20℃，预冻过夜。得明胶-骨粉如图2所示。

b.样品从-20℃冰箱中取出后，放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥24h。

c.冻干后的样品呈海绵状，在配置好质量分数为0.3％的京尼平水溶液中浸泡，37℃恒温，24h，此时因交联反应，凝胶呈深蓝色，如图3所示。

d.再一次进行预冻及冻干过程，得到明胶/京尼平-骨粉支架，呈深蓝色多孔结构，如图4所示。

表2明胶/京尼平-骨粉支架的制备及弹性模量结果

(4)电镜观察

获得的明胶/京尼平-骨粉支架孔隙分布均匀，孔隙大小在20-100微米之间，如图5所示。图中a和b所示为材料的表面形貌，放大倍数分别是500X和2000X，箭头所指为骨粉颗粒，*号所指为明胶支架的孔隙结构。可见材料表面呈均匀的多孔结构，骨粉颗粒均匀相间于明胶多孔结构中。

由以上实验及结果可知，利用冷冻干燥的方法，可以得到孔隙均匀分布、大小适宜的支架结构，孔隙大小在20-100微米之间，为干细胞在材料支架中的附着和铺展提供了良好的空间结构；研磨后的骨粉在支架结构中均匀镶嵌，使该支架中发挥作用的生物活性物质良好暴露，从而发挥其诱导干细胞骨向分化的作用；通过明胶与Bio-oss骨粉的混合，使所得组合物的弹性模量可控，达到了适宜干细胞骨向分化的理想硬度范围；所得组合物的形态、大小在上述各步骤中都可进行调节，可满足不同缺损的空间需求。所以，本发明的方法巧妙地将空间结构、支架弹性、生物诱导等对干细胞成骨有影响的因素综合在一起，最大程度的保证了植骨后的成骨效果。

实验例成骨分化诱导实验

(1)大鼠骨髓间充质干细胞的培养

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)能够稳定传代，在倒置相差显微镜下见铺展的细胞呈梭形(如图6)，三天左右达到90％密度，进行1:2传代，本实验取3-6代细胞进行成骨分化诱导实验观察。

(2)基底材料的制备

采用表3的交联剂配比，按照下述方法制备实验用基底：

a.取弹性模板材料聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)前驱物A剂(基本组分)至离心管内，称量其质量。

b.按质量比10:1、20:1、35:1、60:1、80:1比例分别加入B剂(交联剂)，充分混合均匀，配平后5000rpm离心5分钟，去除胶体内因搅拌产生的气泡。

c.将混合好的PDMS混合液倾倒于培养皿内，水平静置1h，待胶体完全铺展于皿底后，保持水平置入鼓风干燥箱中70℃烘烤24h。

d.置于超净台内，紫外光照射下2h后，再在凝胶表面覆盖一层0.2mg/mL的I型胶原蛋白溶液(I型胶原蛋白购自：Sigma Ltd)，孵育过夜。

e.在接种细胞前，用PBS清洗凝胶3遍，并用紫外线照射30～40min，待细胞接种。

(3)基底材料硬度测量

采用原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)对基底材料进行弹性测量，本实验所用仪器为AFM(NT-MDT,NTEGRA)。实验中采用四棱锥针尖，将AFM探针定位在基底表面，在AFM力曲线模式下进行测量，采用赫兹-斯内登模型对所得曲线进行拟合，得到杨氏模量值。该力学测定方法用于研究材料的机械性能，利用AFM力-距离曲线测量系统在相同的负载速率下测量得到材料表面力的曲线，每个硬度的材料分别测量至少10个点，获得至少10条力曲线。测量值如表3，可知，基底弹性硬度随交联剂的减少而下降，呈现数量级的差异。

表3基底材料配比及硬度测量结果

(4)免疫印迹检测(Western blot)成骨标记物蛋白水平表达

将大鼠骨髓间充质干细胞分别培养于上述5个不同硬度的胞外基质和一个空白培养皿上，提取接种7天后细胞的总蛋白，用Col-I、OPN、BMP2的特异性抗体进行免疫印记实验，GAPDH作为内参。

结果如图7，图中，A是免疫印记的条带结果，B、C、D是对A结果的数据统计。该实验结果来自8次独立实验，其统计结果的数值是在各组取平均值和标准差后归一的结果，各组值与1:10组进行比较，“*”表示P<0.05。

(5)Real-time荧光定量PCR检测成骨标记物mRNA水平表达

将大鼠骨髓间充质干细胞分别培养于上述5个不同硬度的胞外基质和一个空白培养皿上，提取收集接种7天后细胞的总RNA，逆转录为cDNA，用Col-I、OPN、BMP2的启动子区的引物进行实时荧光定量PCR去检测富集到的DNA片段的量，GAPDH作为内参。

结果如图8，图中A、B、C、D是实时定量PCR的结果对实验所得CT值的数据统计。该实验结果来自4次独立实验，其统计结果的数值是在各组取平均值和标准差后归一的结果，各组值与1:10组进行比较，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

(6)免疫荧光染色检测成骨标记物的分布状态

6组细胞在上述不同基底上培养7天后，收集细胞，应用抗Col-I、OCN、OPN抗体，FITC、罗丹明和DAPI染色，激光共聚焦显微镜观测(20×油镜)。

结果见图9-12。图9-11是激光共聚焦显微镜下的细胞染色结果；随机挑选5个视野，计算细胞荧光强度，总计细胞量大于50个，统计结果如D图。该实验结果来自3次独立实验，其统计结果的数值是在各组取平均值和标准差后归一的结果，各组值与1:10组进行比较，结果如图12，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。绿色：示Col-I和OPN，红色：示OCN，蓝色：示细胞核。

(7)碱性磷酸酶(ALP)活性测定

6组细胞在不同基底上培养7天后，用染色的方法进行碱性磷酸酶活性检测，染色后分别进行肉眼观察和镜下观察。

结果见图13-14。图13示培养皿中细胞染色的肉眼观察情况(上)和倒置显微镜下观察的情况(下)；随机选取镜下5个视野，进行染色密度的统计，各组值与1:10组(高弹性模量)进行比较，所得统计结果如图14，“*”表示P<0.05。

结论：由以上实验说明，利用不同检测方法、在不同检测水平上，大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性基底诱导下表现出了大致相同的骨向分化差异，与较硬基底诱导条件相比，其分化高峰出现在基底弹性模量0.354±0.04MPa的范围内，这一结果说明，如Bio-oss骨粉(弹性模量约1GPa)这样高弹性模量的骨充填材料可能不能为干细胞向成骨分化提供最理想的物理环境，而本发明利用高弹性模量的骨粉和低弹性模量的明胶进行混合，降低了材料的弹性模量，并且通过尝试，实现了具体的材料制备过程、模拟了适宜干细胞生长分化的结构。最重要的是，在本实验的理论指导下，得到了接近于实验结论的优选的明胶-骨粉比例和弹性模量数值。在该数值的指导下，可通过本发明的骨填充材料组合物制备出适宜硬度/弹性，兼具骨引导和骨诱导作用、塑形性好的骨填充材料。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的情况下，对本发明的技术方案进行的修改或者等同替换，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种骨充填材料组合物，其特征在于，包括骨粉、明胶和交联剂。

2.根据权利要求1所述的骨充填材料组合物，其特征在于，所述骨粉为羟基磷灰石为主要成分的骨替代材料；优选Bio-Oss骨粉。

3.根据权利要求1或2所述的骨充填材料组合物，其特征在于，所述交联剂为京尼平、戊二醛和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCl)中的一种或多种；优选京尼平。

4.根据权利要求1-3任一项所述的骨充填材料组合物，其特征在于，

所述明胶与骨粉的质量比为0.05-0.4:1，优选0.15-0.4:1；和/或

所述交联剂的用量为能达到交联目的的量，优选为骨充填材料总重量的0.05-0.5％，优选0.2％。

5.一种骨充填材料预备品，其特征在于，为权利要求1-4任一项所述骨充填材料组合物制备的溶液经冷冻干燥处理后获得的冻干产品。

6.一种制备骨充填材料预备品的方法，其特征在于，包括对权利要求1-4任一项所述骨充填材料组合物制备的溶液实施冷冻干燥处理。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥处理分两步进行：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

第一步冷冻干燥时，所述明胶溶液的质量分数为5-10％；和/或

第二步冷冻干燥时，所述交联剂溶液的质量分数为0.3％-1％，优选0.3％。

9.一种制备骨充填材料的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1-4任一项所述骨充填材料组合物与医学上可接受的溶剂混合；或

将权利要求6-8任一项所制备的骨充填材料预备品与医学上可接受的溶剂混合。

10.权利要求9所述方法制备的骨充填材料在科研领域和作为医用材料的应用。