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CN112143815B - 一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN112143815B CN202011332715.9A CN202011332715A CN112143815B CN 112143815 B CN112143815 B CN 112143815B CN 202011332715 A CN202011332715 A CN 202011332715A CN 112143815 B CN112143815 B CN 112143815B
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Jiangsu Shenji Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请公开了一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法。所述核酸组合物包括针对FGFR2基因18种融合突变类型设计的引物和探针。所述试剂盒除包括上述核酸组合物外，还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。本申请还提供一种检测FGFR2基因融合突变的方法，首先提取检测样本的RNA并逆转录成cDNA，然后再以cDNA为模板采用上述试剂盒进行实时荧光PCR反应，最后根据Ct值判定检测样本的阴阳性。本申请可同时特异性检测FGFR2基因的18种融合突变，突变位点覆盖范围广，减少了检测次数，且具有灵敏度高，重复性好，操作简便，检测速度快，结果容易判读等优点。

Description

一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及 检测方法
技术领域
本申请涉及体外分子诊断技术领域，特别涉及一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）是起源于胆管上皮细胞的一种高度异质性恶性肿瘤，约占全部胃肠道恶性肿瘤的3%，是继肝癌之后第二大常见的肝胆系恶性肿瘤。在我国，胆管癌的发病率和死亡率逐年上升。胆管癌恶性程度很高，进展很快，根治性手术是目前唯一有效的治愈办法，但大多数患者（65%）诊断时即为晚期失去手术切除的机会，且术后易复发，预后极差。对于不可手术切除或转移性CCA患者，吉西他滨联合顺铂或其他化疗药物是一线系统治疗的标准方案。然而，多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果也会有较大差异，胆管癌总体5年生存率仍很低（约10%）。随着肿瘤分子生物学的发展，靶向治疗备受关注，成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）基因是胆管癌患者治疗的重要靶点。
FGFR2基因定位于人染色体10q26.13，由18个外显子（ENST00000358487.10）组成，长度约为120 kb，编码含821个氨基酸的单链跨膜糖蛋白。FGFR2蛋白存在主要表达于上皮细胞的FGFR2-Ⅲb和主要表达于间质细胞的FGFR2-Ⅲc两种亚型。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）与FGFR2受体结合后，诱导FGFR2发生二聚体化，胞内区酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TK）自身磷酸化和受体构象的改变，引起包括RAS-RAF-MAPK通路，PI3K-AKT通路，JAK-STAT通路以及PLCγ-PKC通路在内的一系列下游级联信号通路的活化，从而调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移等。FGFR2异常活化会促进肿瘤细胞过度增值、分化，促进肿瘤新生血管生成，并抑制肿瘤细胞凋亡。因此，FGFR2信号通路异常在多种恶性肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用。
FGFR2基因与BICC1、AHCYL1、KIAA1598和TACC3等基因发生融合后，会持续激活FGFR2酪氨酸激酶区及下游信号通路，进而引起肿瘤发生。临床研究显示，小分子靶向药物（如：Pemigatinib/培米加替尼，Erdafitinib /厄达替尼，Infigratinib/英菲格拉替尼，Derazantinib/德拉替尼，Futibatinib/TAS-120等）可以特异作用于FGFR2基因融合突变，通过抑制FGFR2酪氨酸激酶区域活性，阻断其下游信号转导通路，抑制肿瘤细胞增值，从而达到治疗效果。因此，检测FGFR2融合突变状态是指导靶向药物用药的前提，对于提高胆管癌患者的生存率，延长生存期、提高生存质量有着重要意义。
目前用于检测融合基因的方法主要包括：染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）、实时荧光PCR（RT-PCR）以及二代测序（NGS）。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比较，实时荧光定量PCR检测的灵敏度达到1%，可以进行更快速、更精准的检测融合基因，这也是美国国立综合癌症网络（NCCN）指南以及专家共识中所推荐的检测融合基因行之有效的方法。二代测序技术虽然灵敏度也可以达到1%，但是由于高昂的成本及较长的检测周期限制了其在融合基因检测中的应用。多重荧光PCR可以同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，尤其是适用于样本量比较少且检测靶标比较多的项目。因此多重荧光PCR方法在胆管癌融合基因筛查方面有更大的应用价值。但是，目前还没有检测FGFR2融合基因突变的试剂盒和方法，尤其是不能同时检测FGFR2基因的多种融合突变，不能满足临床快速检测的实际需求。
发明内容
针对现有技术无法采用实时荧光定量PCR法快速检测FGFR2基因融合突变的问题，本申请提供一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法。
第一方面，本申请提出一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物，采用以下技术方案实现：
一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物，包括以下引物和探针序列：
FB-M1正向引物序列SEQ ID NO.1；
FB-M1反向引物序列SEQ ID NO.2；
FB-M2反向引物序列SEQ ID NO.3；
FB-M3反向引物序列SEQ ID NO.4；
FB-M4反向引物序列SEQ ID NO.5；
FB-M5反向引物序列SEQ ID NO.6；
FB-M6反向引物序列SEQ ID NO.7；
FB-M7反向引物序列SEQ ID NO.8；
FB-M8反向引物序列SEQ ID NO.9；
FB-M9反向引物序列SEQ ID NO.10；
FB-M10反向引物序列SEQ ID NO.11；
FB-M11反向引物序列SEQ ID NO.12；
FB-M12反向引物序列SEQ ID NO.13；
FB-M13反向引物序列SEQ ID NO.14；
FB-M14反向引物序列SEQ ID NO.15；
FB-M15反向引物序列SEQ ID NO.16；
FB-M16反向引物序列SEQ ID NO.17；
FB-M17反向引物序列SEQ ID NO.18；
FB-M18反向引物序列SEQ ID NO.19；
探针序列SEQ ID NO.20，所述探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
通过采用上述技术方案，本申请根据NCBI公布的人野生型FGFR2基因序列以及融合伴侣基因序列，将FGFR2基因和融合伴侣基因进行拼接得到融合序列，应用Oligo 7.0引物设计软件跨融合位点设计了多对特异性引物和探针，能够特异性的扩增融合突变基因，从而特异性的指示被测样本中FGFR2基因融合突变的存在。更重要的是，本申请针对FGFR2基因的18种融合突变类型进行了引物和探针的设计，融合突变类型的覆盖范围非常广，几乎覆盖了大部分融合突变类型，从而达到进行一次PCR反应便可同时检测多个融合突变的目的，减少了FGFR2基因融合突变的检测次数。另外，本申请在探针序列上引入荧光报告基团和荧光淬灭基团，在不进行PCR反应时，荧光淬灭基团能够淬灭荧光报告基团，无荧光信号产生；当进行PCR反应后，DNA聚合酶的5’外切酶活性能够对探针进行酶切，使荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光报告基团得以报告荧光信号并被监测系统监测收集，并且随着PCR 反应的进行，荧光信号也等比例增加，从而可以通过荧光信号的出现与否判读样本中是否存在目标基因的扩增，进而快速检测样本中是否存在FGFR2基因融合突变。
因此，采用本申请引物探针组合可以一次同时检测FGFR2基因产生的18种融合突变，特异性好，减少了基因突变融合的检测次数，降低了检测成本，缩短了获得检测结果的时间。
可选的，所述核酸组合物中还包括内参基因的引物和探针序列：
GAPDH正向引物序列SEQ ID NO.21；
GAPDH反向引物序列SEQ ID NO.22；
GAPDH探针序列SEQ ID NO.23，所述探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
通过采用上述技术方案，本申请在针对FGFR2基因18个融合突变位点设计引物和探针的同时，还设计了一组内参引物和内参探针，内参引物和内参探针的设计可以有效矫正实验过程中存在的误差，从而保证实验结果的准确性，以获得真是可靠的实验结果。
可选的，所述探针序列的5’端选用FAM荧光基团标记，探针序列的3’端选用BHQ1荧光基团标记。
通过采用上述技术方案，本申请的荧光报告基团选用FAM荧光基团，荧光淬灭基团选用BHQ1荧光基团，在PCR反应进行后，FAM荧光基团发出的荧光可以监测到，从而快速判读样本中是否存在目标基因。
第二方面，本申请提供一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，采用以下技术方案：
一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，包括上述核酸组合物。
可选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。
可选的，所述DNA聚合酶为Taq 酶，所述阳离子为Mg2+。
通过采用上述技术方案，本申请试剂盒包括上述核酸组合物，以及实时荧光定量PCR反应所必需的Taq 酶、PCR缓冲液、dNTPs和Mg2+。其中，核酸组合物中引物用于引发PCR反应，探针用于实现PCR反应的定量分析。本申请选用的热启动Taq酶可以抑制或将 PCR 反应中的非特异性 DNA 扩增最小化，而且其激活时间较短，活性时间较长，短时间内就可以恢复5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。本申请的PCR缓冲液可以调节反应过程中体系的酸碱度，维持酸碱稳定，为Taq 酶进行催化反应提供了良好的环境，保证了PCR扩增反应的顺利进行。dNTPs为PCR反应的原料，在Taq酶以及引物的作用下，可以实现基因的扩增。Mg2+不仅是Taq酶β亚基的激活剂，可与Taq酶螯合，使Taq酶发挥活性，Mg2+还是dNTPs的激活剂，用于吸引dNTPs γ磷酸基团上的氧的电子，使得聚合反应更容易发生。
本申请试剂盒通过引物的设计与优化以及反应体系的不断优化，实现了高灵敏特异检测，待测样本检测灵敏度可达到10拷贝/μL，同时还具有很好的重复性，每个拷贝进行多次重复实验，Ct值相差不到0.5个循环，实验结果稳定可靠。另外，试剂盒所用试剂价格便宜，易于购买，生产成本较低。
可选的，所述试剂盒还包括PCR增强剂。优选的，所述PCR增强剂选用5%二甲基亚砜。
通过采用上述技术方案，本申请在实时荧光定量PCR体系中还加入PCR增强剂，PCR增强剂优化了荧光PCR反应体系，提高了DNA聚合酶活性，而且还增加了PCR反应的灵敏度和特异性，从而提高PCR扩增产物含量，极大的提高了对低拷贝核酸的检出，降低了反应的错误率。
第三方面，本申请提供了一种用于检测人FGFR2基因融合突变的方法，采用以下技术方案：
一种用于检测人FGFR2基因融合突变的方法，包括以下步骤：
S1.提取检测样本的RNA，将RNA逆转录为cDNA；
S2.以步骤S1获得的cDNA为模板，采用上述试剂盒进行实时荧光PCR扩增反应；
S3. 根据荧光信号达到设定阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准。
通过采用上述技术方案，本申请首先提取检测样本的RNA并逆转录成cDNA，然后再以cDNA为模板进行实时荧光PCR反应，最后根据Ct值判定检测样本的阴阳性。整个检测方法的操作步骤简便，只需90分钟便可完成检测，检测时间大为缩短，结果容易判读，充分满足了临床快速检测的实际需求。
可选的，步骤S1中，检测样本包括检测样本包括新鲜病理组织、冰冻病理切片、石蜡包埋组织或切片。
通过采用上述技术方案，本申请既可以检测新鲜病理组织中FGFR2基因融合突变情况，又可以检测石蜡包埋组织中检测样本FGFR2基因融合突变情况，应用范围广。
可选的，步骤S3中，Ct值大于等于30，检测样本为阴性；Ct值小于30，检测样本为阳性。
通过采用上述技术方案，本申请在基底反应过后，检测反应体系中的荧光强度，从而判读检测样本中FGFR2基因融合突变的阴阳性，Ct值大于等于30，表明检测样本中不存在FGFR2基因融合突变；Ct值小于30，表明检测样本中存在FGFR2基因融合突变。其中，将30设为临界点是经过无数次样本检测所得到的，若判断阴阳性的临界点小于30，可能会出现过多的假阴性，尤其是在样本中拷贝数比较小的情况下，造成实验结果不准确；若判断阴阳性的临界点大于30，可能会出现过多的假阳性，同样会造成实验结果的偏差。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请构建了多重荧光PCR反应体系，可同时特异性检测FGFR2基因的18种融合突变，突变位点覆盖范围广，一次反应便可对检测样本的多个位点同时进行检测，减少了检测次数，满足了临床快速检测的要求；
2.本申请的实时荧光定量PCR体系灵敏度高，待测样本检测灵敏度可达到10拷贝/μL；
3.本申请的实时荧光定量PCR体系重复性好，检测结果稳定可靠，为临床用药提供了可靠的参考价值；
4.本申请的FGFR2基因融合突变的检测方法检测速度快，检测过程只需要90分钟，从而提高了一段时间内样本的检测量；
5.本申请的FGFR2基因融合突变的检测方法检测样本范围广，新鲜病理组织、冰冻病理切片、石蜡包埋组织或切片均能够获得准确可靠的实验结果；
6.本申请的FGFR2基因融合突变的检测方法操作简便，结果容易判读，临床应用范围广。
附图说明
图1是本申请试剂盒有效性检测结果图；
图2是本申请试剂盒灵敏度检测结果图；
图3是本申请试剂盒重复性检测结果图；
图4是本申请试剂盒临床阳性样本检测结果图；
图5是本申请试剂盒临床阴性样本检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的PCR增强剂购自sigma公司。
制备例
含有FGFR2基因融合突变的阳性对照质粒的制备
（1）分别将18个含有FGFR2基因融合突变位点的基因与pcDNA3.1（+）质粒连接，构建18个含有FGFR2基因融合突变的质粒。所述18个含有FGFR2基因融合突变位点的基因序列如下（下述序列中，未划线部分表示一个基因，划线部分表示另一个基因）：
FGFR2(17)_BICC1(3) SEQ ID NO.24
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGATCATGGAGGAAACAA ATACGCAGATTGCTTGGCCATCAAAACTGAAGATCGGAGCCAAATCCAAGAAAGATCCCCATATTAAGGTTTCTGGA AAGAAAGAAGATGTTAAAGAAGCCAAGGAAATGATCATGTCTGTCTTAGACACAAAAAGCAATCGAGTCACACTGAA GATGGATGTTTCACATACAGAACATTCACATGTAATCGGCAAAGGTGGCAACAATATTAAAAAAGTGATGGAAGAAA CCGGATGCCATATCCACTTTCCAGATTCCAACAGGAATAACCAAGCAGAAAAAAGCAACCAGGTATCTATAGCGGGA CAACCAGCAGGAGTAGAATCTGCCCGAGTTAGAATTCGG
FGFR2(17)_BICC1(18) SEQ ID NO.25
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGGCTCATCCATGTCCC TTTCACGGTCCAACAGTCGTGAGCACTTGGGAGGTGGAAGCGAATCTGATAACTGGAGAGACCGAAATGGAATTGGA CCTGGAAGTCATAGTGAATTTGCAGCTTCTATTGGCAGCCCTAAGCGTAAACAAAACAAATCAACGGAACACTATCT CAGCAGTAGCAATTACATGGACTGCATTTCCTCGCTGACAGGAAGCAATGGCTGTAACTTAAATAGCTCTTTCAAAG GTTCTGACCTCCCTGAGCTCTTCAGCAAACTGGGCCTGGGCAAATACACAGATGTTTTCCAGCAACAAGAGATCGAT CTTCAGACATTCCTCACTCTCACAGATCAGGATCTGAAGGAGCTGGGAATAACTACTTTTGGTGCCAGGAGGAAAAT GCTGCTTGCAATTTCAG
FGFR2(17)_AFF3(7) SEQ ID NO.26
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGAGATGACCTGGCTTC CACCACTTTCTGCTATTCAAGCACCTGGCAAAGTGGAACCAACCAAATTTCCATTTCCAAATAAGGACTCTCAGCTT GTATCCTCTGGACACAATAATCCAAAGAAAGGTGATGCAGAGCCAGAGAGTCCAGACAGTGGCACATCGAATACATC AATGCTGGAAGATGACCTTAAGCTAAGCAGTGATGAAGAGGAGAATGAACAGCAGGCAGCTCAGAGAACGGCTCTCC GCGCTCTCTCTGACAG
FGFR2(17)_ARHGAP24(3) SEQ ID NO.27
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGGTACTATTTTTCTGC CTGGAAATAAAGTTTCTGAGCATCCCTGCAATGAAGAGAACCCAGGGAAGTTCCTTTTTGAAGTAGTTCCAGGAGGC GATCGAGATCGGATGACAGCAAATCATGAAAGCTACCTCCTCATGGCAAGCACCCAGAATGATATGGAAGACTGGGT GAAGTCAATCCGCCGAGTCATATGGGGACCTTTCGGAGGAGGCATTTTTGGACAGAAACTGGAGGATACTGTTCGTT ATGAGAAGAGATATGGGAACCGTCTGGCTCCGATGTTGGTGGAGCAGTGCGTGGACTTTATCCGACAAAGGGGGCTG AAAGAAGAGGGTCTCTTTCGACTGCCAGGCCAGGCTAATCTTGTTAAGGAGCTCCAAGATGCCTTTGACTGTGGGGA GAAGCCATCATTTGACAGCAACACAGATGTACACACGGTGGCATCACTTCTTAAGCTGTACCTCCGAGAACTTCCAG AACCAGTTATTCCTTATGCGAAGTATGAAGATTTTTTGTCATGTGCCAAACTGCTCAGCAAGGAAGAGGAAGCA
FGFR2(17)_CASP7(3) SEQ ID NO.28
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGATGGCAGATGATCAGG GCTGTATTGAAGAGCAGGGGGTTGAGGATTCAGCAAATGAAGATTCAGTGGATGCTAAGCCAGACCGGTCCTCGTTT GTACCGTCCCTCTTCAGTAAGAAGAAGAAAAATGTCACCATGCGATCCATCAAGACCACCCGGGACCGAGTGCCTAC ATATCAGTACAACATGAATTTTGAAAAGCTGGGCAAATGCATCATAATAAACAACAAGAACTTTGATAAAGTGACAG GTATGGGCGTTCGAAACGGAACAGACAAAGATGCCGAGGCGCTCTTCAAGTGCTTCCGAAGCCTGGGTTTTGACGTG ATTGTCTATAATGACTGCTCTTGTGCCAAGATGCAAGATCTGCTTAAAAAAG
FGFR2(17)_CCAR2(4) SEQ ID NO.29
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGGTGGGGAGAAACAGC GGGTCTTCACTGGTATTGTTACCAGCTTGCATGACTACTTTGGGGTTGTGGATGAAGAGGTCTTTTTTCAGCTAAGT GTGGTGAAGGGCCGTCTGCCCCAGCTGGGTGAGAAGGTGCTGGTGAAGGCTGCATACAACCCAGGCCAGGCAGTGCC CTGGAATGCTGTCAAGGTGCAAACGCTCTCCAACCAGCCCCTACTGAAGTCCCCAGCACCTCCTCTTCTGCATGTAG CAGCCCTGGGCCAGAAGCAAGGGATCCTGGGAGCTCAGCCTCAGTTGATCTTCCAGCCTCACCGGATTCCCCCACTC TTTCCTCAGAAGCCTCTGAGTCTCTTCCAAACATCCCACACACTTCACCTGAGCCACCTGAACAGATTTCCTGCCCG GGGCCCTCATGGACGGTTGGATCAGGGCCGAAG
FGFR2(17)_CCDC6(2) SEQ ID NO.30
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGCAAGCCAGGGCTGAGC AGGAAGAAGAATTCATTAGTAACACTTTATTCAAGAAAATTCAGGCTTTGCAGAAGGAGAAAGAAACCCTTGCTGTA AATTATGAGAAAGAAGAAGAATTCCTCACTAATGAGCTCTCCAGAAAATTGATGCAGTTGCAGCATGAGAAAGCCGA ACTAGAACAGCATCTTGAACAAGAGCAGGAATTTCAGGTCAACAAACTGATGAAGAAAATTAAAAAACTGGAGAATG ACACCATTTCTAAGCAACTTACATTAGAACAGTTGAGACGGGAGAAGATTGACCTTGAAAATACATTGGAACAAGAA CAAGAAGCACTAGTTAATCGCCTCTGGAAAAGGATGGATAAGCTTGAAGCTGAAAAGCGAATCCTGCAGGAAAAATT AGACCAGCCCGTCTCTGCTCCACCATCGCCTAGAGATATCTCCATGGAGATTGATTCTCCAGAAAATATGATGCGTC ACATCAGGTTTTTAAAGAATGAAGTGGAACGGCTGAAGAAGCAACTGAGAGCTGCTCAGTTACAGC
FGFR2(17)_CGNL1(9) SEQ ID NO.31
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGAATGTCGAGGTCTTGG CGAGCAGGAGCAACACTTCAGAGCAAGACCAGGCGGGGACTGAAATGCGCGTGAAGCTTCTGCAGGAGGAGAATGAG AAGCTGCAGGGAAGAAGCGAAGAGCTGGAGCGGAGAGTTGCTCAGCTTCAAAGGCAGATCGAGGACCTGAAAGGCGA TGAAGCCAAGGCGAAGGAAACGCTGAAGAAGTACGAGGGAGAAATACGACAGTTAGAGGAGGCCCTTGTGCACGCCA GAAAGGAAGAAAAAGAAGCTGTGTCAGCCAGAAGGGCCCTGGAGAATGAACTGGAGGCTGCTCAGGGAAATCTGAGT CAGACTACCCAGGAGCAGAAGCAGTTGTCTGAGAAGCTCAAAGAGGAGAGTGAGCAGAAGGAGCAGCTAAGAAGGTT GAAGAACGAGATGGAGAATGAGCGGTGGCACCTGGGCAAAACCATTGAGAAACTGCAGAAGGAGATGGCAGACATTG TTGAGGCCTCCCGTACCTCAACCCTGGAGCTCCAGAACCAGCTGGATGAGTATAAGGAGAAAAACCGCAGGGAGCTC GCAGAAATGCAAAGACAGTTGAAGGAGAAAACGCTGGAGGCAGAAAAGTCCCGACTGACAGCCATGAAAATGCAGGA TGAG
FGFR2(17)_CTNNA3(14) SEQ ID NO.32
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGACCCCAGAGGAACTGG AGGATGTTTCTGACCTTGAAGAGGAACACGAGGTCCGCAGTCACACCAGCATTCAGACCGAAGGGAAAACTGATAGG GCTAAGATGACTCAACTGCCTGAGGCAGAAAAAGAAAAGATTGCTGAGCAAGTTGCTGATTTCAAGAAAGTAAAGAG TAAGCTGGATGCTGAGATTGAGATATGGGATGATACAAGCAACGACATCATTGTTCTGGCCAAGAACATGTGTATGA TCATGATGGAGATGACAGACTTCACTAGGGGCAAAGGACCACTAAAGCATACAACTGATGTGATCTATGCAGCGAAA ATGATATCAGAATCAGGATCAAGGATGGATGTCCTTGCTCGGCAGATTGCTAATCAGTGCCCAGATCCATCTTGTAA ACAGGACTTGTTGGCCTACCTGGAACAGATTAAGTTCTACTCCCACCAACTGAAAATCTGCAGTCAAGTTAAAGCTG AGATCCAGAACCTGGGAGGAGAGCTCATCATGTCAGCT
FGFR2(17)_DZANK1(9) SEQ ID NO.33
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGATGGGCTTGTGTGCAG AATGCAGAAGCTTGGTACCCATGAACACTCCCATCTGTGTGGTGTGTGAGGCCCCTCTTGCTCTACAGCTGCAGCCA CAGGCAAGCCTCCACTTGAAGGAGAAGGTAATTTGCCGGGCCTGTGGTACAGGAAATCCTGCTCACCTGAGATACTG TGTCACCTGTGAGGGGGCCCTGCCTTCATCACAAGAGTCGATGTGCAGTGGGGATAAAGCCCCTCCTCCGCCCACTC AGAAAGGGGGGACCATTTCCTGCTACAGATGTGGTCGCTGGAATCTCTGGGAGGCGTCCTTCTGCGGCTGGTGTGGA GCCATGCTCGGCATTCCTGCTGGCTGTTCTGTTTGCCCTAAATGTGGGGCCAGCAATCACCTGTCTGCCCGATTCTG TGGCTCCTGTGGTATTTGTGTGAAGTCCCTAGTGAAACTTAGCTTGGACAGAAGCCTGGCTCTAGCTGCTGAGGAAC CTCGCCCTTTTTCTGAG
FGFR2(17)_INA(2) SEQ ID NO.34
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGATAGCATTGGGCAGC TGGAGAATGATCTGAGGAACACCAAGAGTGAGATGGCACGCCACCTTCGGGAATACCAGGACTTGCTCAATGTCAAA ATGGCTCTTGACATTGAGATAGCAGCTTACAGGAAACTGCTGGAAGGCGAGGAGACACGTTTTAGCACCAGTGGGTT AAGCATTTCGGGGCTGAATCCACTTCCCAATCCAAGTTACCTGCTCCCACCTAGAATCCTCAGTGCTACAACCTCCA AAGTCTCATCCACTGGGCTATCACTTAAGAAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCATCTAAGGTAGCCTCTAAGAAAACC TCCCAGATAGGGGAAAGTTTTGAAGAAATATTAGAGGAGACAGTAATATCTACTAAGAAAACCGAGAAATCAAATAT AGAAGAAACCACCATTTCAAGCCAAAAAATATAATTCCATTGCTTTGAAAAAGTTAATGCTTAAGAGGGAATGATAT GCATTTG
FGFR2(17)_KIAA1598(8) SEQ ID NO.35
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGTAAATAAAGTTAAAC AAGAAAAGACTGTTTTAAATTCAGAAGTTCTTGAACAGAGAAAAGTCTTAGAAAAATGCAATAGAGTGTCCATGTTA GCTGTAGAAGAGTATGAGGAGATGCAAGTAAACCTGGAGCTGGAGAAGGACCTTCGAAAGAAAGCAGAGTCATTTGC ACAAGAGATGTTCATTGAGCAAAACAAGCTAAAGAGACAAAGCCACCTTCTGCTGCAGAGCTCCATCCCTGATCAGC AGCTTTTGAAAGCTTTAGACGAAAATGCAAAACTCACCCAGCAACTTGAAGAAGAGAGAATTCAGCATCAACAAAAG GTCAAAGAATTAGAAGAGCAACTAGAAAATGAAACACTCCACAAAGAAATACACAACCTCAAACAGCAACTGGAGCT TCTAGAGGAAGATAAAAAGGAATTGGAATTGAAATATCAGAATTCTGAAGAGAAAGCCAGAAATTTAAAGCACTCTG
FGFR2(17)_OFD1(3) SEQ ID NO.36
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGACACAACTTCGAAACC AGCTAATTCATGAGTTGATGCACCCTGTATTGAGTGGAGAACTGCAGCCTCGGTCCATTTCAGTAGAAGGGAGCTCC CTCTTAATAGGCGCCTCTAACTCTTTAGTGGCAGATCACTTACAAAGATGTGGCTATGAATATTCACTTTCTGTTTT CTTTCCAGAAAGTGGTTTGGCAAAAGAAAAGGTATTTACTATGCAGGATCTATTACAACTCATTAAAATCAACCCTA CTTCCAGTCTCTACAAATCACTGGTTTCAGGATCTGATAAAGAAAATCAAAAAGGTTTTCTTATGCATTTTTTAAAA GAATTGGCAGAATATCATCAAGCTAAAGAGAGTTGTAATATGGAAACTCAGACAAGTTCGACATTTAACAGAGATTC TCTGG
FGFR2(17)_PPHLN1(4) SEQ ID NO.37
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGATGGCTACAATAGAC TAGTTAATATTGTGCCAAAGAAACCACCACTGCTAGACAGACCTGGTGAAGGAAGCTACAATAGATATTACAGTCAT GTTGATTACCGAGACTATGACGAGGGCCGCAGTTTTTCTCATGATCGAAGAAGTGGTCCACCTCACAGAGGAGATGA ATCTGGTTATAGATGGACAAGAGACGATCATTCTGCAAGCAGGCAACCTGAATACAGGGACATGAGAGATGGCTTTA GAAGAAAAAGTTTCTACTCTTCCCATTATGCGAGAGAGCGGTCTCCTTATAAAAGGGACAATACTTTTTTCAGAGAA TCACCTGTTGGCCGAAAGGATTCTCCACACAGCAGATCTGGTTCCAGTGTCAGTAGCAGAAGCTACTCTCCAGAAAG GAGCAAATCATACTCTTTCCATCAGTCTCAACATAGAAAGTCCGTGCGTCCTGGTGCCTCCTACAAACGGCAGAATG AAGGAAATCCTGAAAGAG
FGFR2(17)_SLMAP(3) SEQ ID NO.38
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGTTTTATCTTCAAGACA CTAAAAGTAGTAATGGTACTTTTATAAATAGCCAGAGATTGAGTCGAGGCTCTGAAGAAAGTCCACCATGTGAAATT CTTTCCGGTGACATTATCCAGTTTGGAGTAGACGTGACAGAGAATACACGGAAAGTTACCCATGGGTGTATTGTTTC CACAATAAAACTTTTTCTACCAGATGGTATGGAAGCCCGGCTCCGCTCAGATGTCATCCATGCACCATTACCAAGTC CTGTTGACAAAGTTGCTGCTAACACTCCAAGTATGTACTCTCAGGAACTATTCCAGCTTTCTCAGTATCTACAG
FGFR2(17)_UBP1(6) SEQ ID NO.39
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGGTACACTGCATCAGCA CAGAATTTACTCCACGGAAGCACGGAGGTGAAAAGGGAGTGCCCTTTAGGATCCAGGTTGACACCTTTAAGCAGAAT GAAAATGGAGAATACACAGATCATCTACACTCAGCTAGCTGCCAAATCAAAGTTTTTAAGCCTAAAGGTGCAGACAG GAAACAAAAAACTGACCGAGAGAAGATGGAGAAGAGAACAGCTCATGAAAAAGAAAAGTATCAGCCGTCCTATGATA CCACAATCCTCACAGAGATGAGGCTTGAGCCTATAATTGAAGATGCAGTTGAACATGAGCAGAAAAAGTCCAGCAAG CGGACTTTGCCAGCAGACTACGGTGATTCTCTGGCAAAGCGAGGCAGTTGTTCTCCGTGGCCCGATGCCCCCACAGC CTATGTGAATAACAGCCCTTCCCCAGCGCCCACTTTCACCTCCCCACAGCAGAGCACTTGCAGTGTCCCAGACAG
FGFR2(17)_MYPN(6) SEQ ID NO.40
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGTGTCAGAGCCCCACCA ATTACTTGCAGGGATTGGATGGAAAACCTATCATTGCAGCTCCTGTGTTTACAAAGATGCTACAAAATTTGTCAGCT TCTGAGGGTCAGCTGGTTGTCTTTGAATGCAGAGTAAAAGGAGCTCCATCTCCTAAGGTTGAGTGGTATAGAGAAGG GACTTTAATAGAAGATTCTCCAGATTTTAGGATTTTACAGAAAAAACCTCGATCCATGGCAGAGCCAGAGGAGATTT GCACCTTGGTCATTGCTGAGGTGTTTGCAGAAGATTCTGGGTGCTTCACATGTACTGCAAGCAACAAATACGGCACA GTGTCAAGCATTGCACAGCTGCACGTGAGAG
FGFR2(17)_AHCYL1(2) SEQ ID NO.41
TGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTCTCACAACCAATGAGCAAATCCAGTTTGCTG ATGACATGCAGGAGTTCACCAAATTCCCCACCAAAACTGGCCGAAGATCTTTGTCTCGCTCGATCTCACAGTCCTCC ACTGACAGCTACAGTTCAGCTGCATCCTACACAGATAGCTCTGATGATGAGGTTTCTCCCCGAGAGAAGCAGCAAAC CAACTCCAAGGGCAGCAGCAATTTCTGTGTGAAGAACATCAAGCAGGCAGAATTTGGACGCCGGGAGATTGAGATTG CAGAGCAAGACATGTCTGCTCTGATTTCACTCAGGAAACGTGCTCAGGGGGAGAAGCCCTTGGCTGGTGCTAAAATA GTGGGCTGTACACACATCACAGCCCAGACAGCGGTGTTGATTGAGACACTCTGTGCCCTGGGGGCTCAGTGCCGCTG GTCTGCTTGTAACATCTACTCAACTCAGAATGAAGTAGCTGCAGCACTGGCTGAGGCTG
（2）将构建好的质粒采用TIANGEN（HighPure Plasmid Kit, DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。
（3）所提质粒DNA溶于Tris-HCl 中（10mmol/L, PH8.0），经紫外分光光度计检测提取质量并确定浓度，然后将18个质粒溶液等浓度进行混合，用Tris-HCl（10mmol/L，PH8.0）溶液调整质粒DNA浓度到2ng/μL。
实施例1
针对突变位点设计合成引物和探针
根据NCBI公布的人FGFR2基因序列以及融合伴侣基因序列（野生型序列），针对FGFR2基因18种融合突变来设计特异性引物和探针。并通过特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测，FGFR2基因18个融合突变位点见表1。
表1 FGFR2基因融合检测位点
Figure 134258DEST_PATH_IMAGE001
针对选定的18个融合突变位点，应用Oligo 7.0引物设计软件设计多对特异引物和探针，引物和探针序列如表2所示。
本申请设计的探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。优选的，目的基因探针的荧光报告基团选用FAM荧光基团，荧光淬灭基团选用BHQ1荧光基团；内参基因探针的荧光报告基团选用HEX荧光基团，荧光淬灭基团选用BHQ1荧光基团。
表2 FGFR2基因融合突变引物和探针核苷酸序列
Figure 644874DEST_PATH_IMAGE002
本申请的引物和探针均由通用生物系统（安徽）有限公司合成。
另外，本申请还提供了与表2引物探针序列具有同一性的核苷酸序列，此处所述的“同一性核苷酸序列”表示在严格条件下（最大严紧性条件下）与靶杂交的寡核苷酸，以及在具有适当的核苷酸插入或缺失情况下进行对比时，与表中核苷酸片段至少有约60%同一性的核苷酸序列。更佳地，具有80%同一性的核苷酸序列，最佳地，具有90%同一性的核苷酸序列。
杂交条件根据杂交时所用条件的严紧性程度来分，严紧性程度以核酸结合复合物或探针的解链温度（Tm）为依据。例如，“最大严紧性”为Tm-5℃（低于探针Tm 5℃）；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在 Tm以下约10-20℃；低严紧性发生在Tm以下约20-25℃。
在本申请中，“同一性”指，两种或以上的序列或亚序列进行比较时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是根据BLAST或BLAST2.0算法，它们分别在以下文献中公开：Altschul 等（1977）Nucl.Acid.res.25:3389-3402 和 Altschul 等（1990） J.Mol.Biol.215:403-410。
实施例2
一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，包括实施例1中的引物探针、Taq酶、10×PCR Buffer、dNTPs、MgCl2和PCR增强剂。
上述试剂盒中各试剂在最终的反应扩增体系中的终浓度参见表3：
表3 反应扩增体系中各组分的终浓度
Figure 893453DEST_PATH_IMAGE003
具体的，以25μL反应体系为例，上述试剂盒中各组分的具体加入量参见表4：
表4 实时荧光定量PCR反应体系各组分加入量
Figure 895519DEST_PATH_IMAGE004
采用上述反应体系的PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒，64℃退火 20秒，72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒，60℃退火35秒，72℃延伸 20秒，30个循环。最后30个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
检测标准：
检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准：Ct值大于或等于30，检测样本为阴性，说明检测样本未发生FGFR2基因融合突变；Ct值小于30，检测样本为阳性，说明检测样本中发生FGFR2基因融合突变。
性能检测实验
1.实施例2试剂盒的有效性检测
本申请以制备例制备的含有18个FGFR2基因融合突变质粒的混合液作为阳性对照，将其加入到本申请实施例2的扩增体系中作为模板，进行实时荧光定量PCR反应，具体方法如下：
（1）向PCR反应体系中加入5 μL制备例获得的含有18个质粒DNA的混合液作为反应模板，阴性对照组以5 μL水样作为反应模板，采用实施例2的扩增体系和扩增条件进行实时荧光定量PCR；
（2）检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准：
采用ABI7500实时荧光PCR仪进行扩增，在后30个循环退火阶段检测 FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准：Ct值大于等于30，检测样本为阴性；Ct值小于30，检测样本为阳性。
实验结果参见图1，从图1中可以看出，采用本申请实施例2的扩增体系和反应条件扩增阳性对照，在FAM通道可以检测出荧光信号，而且扩增曲线呈现标准的S型，Ct值小于30，同时阴性对照组Ct值大于等于30。实验结果表明，本申请试剂盒能够用于检测FGFR2基因融合突变，结果符合预期且有效。
2. 实施例2试剂盒的灵敏度检测
取经定量后浓度为1000个拷贝/μL的质粒DNA，进行稀释，得到100个拷贝/μL、10个拷贝/μL和5个拷贝/μL三个浓度，将上述四个浓度的质粒DNA作为PCR模板，每次反应加入5μL，阴性对照组以5 μL水样作为反应模板，采用实施例2的扩增体系和扩增条件进行实时荧光定量PCR。
实验结果参见图2，从图2中可以看出，上述4个浓度在FAM通道均可检测出荧光信号，而且扩增曲线呈现标准的S型，Ct值均小于30，同时阴性对照组Ct值均大于等于30。实验结果表明，本申请试剂盒灵敏度可稳定的维持在10个拷贝/μL，灵敏度高，有效降低了假阴性的发生率，为后期临床用药提供了很高的参考价值。本申请以5个拷贝/μL阳性对照品作为扩增模板，也可以获得扩增曲线且Ct值小于30，检测结果比较稳定，但采用5个拷贝/μL待测样本作为扩增模板，检测结果会发生轻微浮动，所以采用本申请实施例2的扩增体系进行待测样本检测，待测样本浓度低至10个拷贝/μL，可以确保获得准确的检测结果。
3. 实施例2试剂盒的重复性检测
以1000个拷贝/μL、100个拷贝/μL和10个拷贝/μL的质粒DNA为模板，采用实施例2的扩增体系和扩增条件进行实时荧光定量PCR，每个拷贝重复十次，检测实施例2试剂盒的重复性。
实验结果参见图3，从图3中可以看出，无论是DNA模板的浓度是1000个拷贝/μL、100个拷贝/μL还是10个拷贝/μL，每个拷贝的10次重复实验中，Ct值均相差不到0.5个循环，实验结果表明，本申请试剂盒重复性好，实验结果稳定可靠。
4. 实施例2试剂盒的临床检测
利用本申请实施例2试剂盒的特异性引物和探针以及荧光PCR反应体系检测30例临床胆管癌石蜡包埋组织样本，其中包括经直接测序法检测确定的FGFR2融合阳性7例和FGFR2野生型样本23例，具体的检测步骤如下：
（1）样本处理
上述各胆管癌样本各取1g，分别加入1mL二甲苯，涡旋震荡10s，16000g室温离心2min，弃上清液，加入300μL无水乙醇后离心，易于组织沉降。吸弃上清，加入1ml无水乙醇，涡旋振荡10s，16000g室温离心 2min。吸弃上清，打开样本盖子并放入真空离心浓缩仪中，30℃，AQ模式干燥样本 10min。干燥结束后，小心取出样本，并盖上管盖。
（2）RNA提取
将处理后的样本采用RNA提取试剂盒提取RNA（QIAGEN RNeasy FFPE Kit（Cat No.73504）），具体步骤如下：
在离心管中加150 μL PKD缓冲液及 10 μL蛋白酶K，震荡混匀，56℃孵育15min，80℃孵育15min，用掌上离心机短暂离心后，观察样本消化情况。冰上孵育3min，室温20000g离心15min。待降到室温后，加入16ul DNase Booster缓冲液和10 μL DNaseI原液，室温孵育15min，后加入320 μL Buffer RBC，混匀；
转移全部上清至新的2ml 离心管中，加入样本总体积10%的DNase BoosterBuffer。再加入10µl DNase I 储备液，上下颠倒混匀，短暂离心，室温孵育 15min。加入320µl RBC缓冲液，充分混匀，加入1mL无水乙醇吸打混匀后迅速进入下一步。转移650µl样本，包括沉淀物至吸附柱中，8000g室温离心30s，弃滤液。加入500µl RPE缓冲液，8000g室温离心30s，弃滤液。将吸附柱转移至新的2mL收集管中，开盖，16000g离心5min。将吸附柱转移至新的已标记的1.5ml 离心管中。加入20µl 无核酸酶水，静置5min，16000g离心1min，收集RNA。
若检测样本为新鲜病理组织，取1克左右样本使用QIAGEN的RNA提取试剂盒提取RNA。
（3）RNA反转录为cDNA
将提取获得的RNA溶于0.1% DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1，并确定其含量。取0.1～5μg的RNA作为cDNA合成的模板，采用江苏申基生物科技有限公司的试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系参见表5：
表5 cDNA合成体系
Figure 178733DEST_PATH_IMAGE005
上述cDNA合成体系按如下步骤进行逆转录：
a）按照表5各组分的加入量配置反应体系，充分混匀；
b）42℃保温1个小时；
c）95℃保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板。
（4）以制备得到的cDNA为模板，采用实施例2的扩增体系和反应条件进行实时荧光PCR反应，在检测FGFR2野生型样本时，采用含有FGFR2基因融合突变的质粒作为阳性对照；
（5）检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准：
采用ABI7500实时荧光PCR仪进行扩增，在后30个循环退火阶段检测 FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准：Ct值大于等于30，检测样本为阴性；Ct值小于30，检测样本为阳性。
实验结果如图4、图5和表6所示，从图4、5中可以看出，7例FGFR2融合阳性样本在FAM通道均可以检测出荧光信号，并且Ct值均小于30；23例FGFR2野生型样本的Ct值均大于等于30，并且阳性对照组能够扩增出Ct值小于30的曲线，说明以上实验结果有效。以上检测结果表明，在所检测的30例胆管癌样本中，有7例发生有FGFR2基因融合突变，本申请实时荧光PCR方法与直接测序法的一致率为100%，进一步证明了本申请体系检测FGFR2基因融合突变的有效性、准确性和可靠性。另外，从表6还可以看出，本申请实施例2试剂盒的检测时间是90min，而传统的测序方法检测时间是2-3天，这表明本申请的荧光定量PCR方法可以极大的缩短检测时间，更加符合临床快速检测的标准。
表6 本申请检测结果与直接测序法比较
Figure 594671DEST_PATH_IMAGE006
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏申基生物科技有限公司
<120> 一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tgatgaggga ctgttggcat g 21
<210> 2
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<212> DNA
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atggccaagc aatctgcgta t 21
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<212> DNA
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cccaagtgct cacgactgtt 20
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<212> DNA
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tgccaggtgc ttgaatagca g 21
<210> 5
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<212> DNA
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<400> 5
gttctcttca ttgcagggat gc 22
<210> 6
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ctcaaccccc tgctcttcaa t 21
<210> 7
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<212> DNA
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ataccagtga agacccgctg 20
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ctccttctgc aaagcctgaa tt 22
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ctgaagtgtt gctcctgctc 20
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ggtctgaatg ctggtgtgac t 21
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agcttctgca ttctgcacac 20
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gtgccatctc actcttggtg t 21
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gctccaggtt tacttgcatc t 21
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ctccactcaa tacagggtgc at 22
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cagtggtggt ttctttggca c 21
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tcagagcctc gactcaatct c 21
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ccgtgcttcc gtggagtaaa 20
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tccatccaat ccctgcaagt 20
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tggtggggaa tttggtgaac t 21
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agttggtaga agacttggat c 21
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atgggtgtga accatgagaa 20
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<212> DNA
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agtgatggca tggactgtgg 20
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cctcaagatc atcagcaatg cctcc 25
<210> 24
<211> 801
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagat catggaggaa acaaatacgc agattgcttg gccatcaaaa 480
ctgaagatcg gagccaaatc caagaaagat ccccatatta aggtttctgg aaagaaagaa 540
gatgttaaag aagccaagga aatgatcatg tctgtcttag acacaaaaag caatcgagtc 600
acactgaaga tggatgtttc acatacagaa cattcacatg taatcggcaa aggtggcaac 660
aatattaaaa aagtgatgga agaaaccgga tgccatatcc actttccaga ttccaacagg 720
aataaccaag cagaaaaaag caaccaggta tctatagcgg gacaaccagc aggagtagaa 780
tctgcccgag ttagaattcg g 801
<210> 25
<211> 856
<212> DNA
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tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgaggg ctcatccatg tccctttcac ggtccaacag tcgtgagcac 480
ttgggaggtg gaagcgaatc tgataactgg agagaccgaa atggaattgg acctggaagt 540
catagtgaat ttgcagcttc tattggcagc cctaagcgta aacaaaacaa atcaacggaa 600
cactatctca gcagtagcaa ttacatggac tgcatttcct cgctgacagg aagcaatggc 660
tgtaacttaa atagctcttt caaaggttct gacctccctg agctcttcag caaactgggc 720
ctgggcaaat acacagatgt tttccagcaa caagagatcg atcttcagac attcctcact 780
ctcacagatc aggatctgaa ggagctggga ataactactt ttggtgccag gaggaaaatg 840
ctgcttgcaa tttcag 856
<210> 26
<211> 701
<212> DNA
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tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagga gatgacctgg cttccaccac tttctgctat tcaagcacct 480
ggcaaagtgg aaccaaccaa atttccattt ccaaataagg actctcagct tgtatcctct 540
ggacacaata atccaaagaa aggtgatgca gagccagaga gtccagacag tggcacatcg 600
aatacatcaa tgctggaaga tgaccttaag ctaagcagtg atgaagagga gaatgaacag 660
caggcagctc agagaacggc tctccgcgct ctctctgaca g 701
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tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgaggg tactattttt ctgcctggaa ataaagtttc tgagcatccc 480
tgcaatgaag agaacccagg gaagttcctt tttgaagtag ttccaggagg cgatcgagat 540
cggatgacag caaatcatga aagctacctc ctcatggcaa gcacccagaa tgatatggaa 600
gactgggtga agtcaatccg ccgagtcata tggggacctt tcggaggagg catttttgga 660
cagaaactgg aggatactgt tcgttatgag aagagatatg ggaaccgtct ggctccgatg 720
ttggtggagc agtgcgtgga ctttatccga caaagggggc tgaaagaaga gggtctcttt 780
cgactgccag gccaggctaa tcttgttaag gagctccaag atgcctttga ctgtggggag 840
aagccatcat ttgacagcaa cacagatgta cacacggtgg catcacttct taagctgtac 900
ctccgagaac ttccagaacc agttattcct tatgcgaagt atgaagattt tttgtcatgt 960
gccaaactgc tcagcaagga agaggaagca 990
<210> 28
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<400> 28
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagat ggcagatgat cagggctgta ttgaagagca gggggttgag 480
gattcagcaa atgaagattc agtggatgct aagccagacc ggtcctcgtt tgtaccgtcc 540
ctcttcagta agaagaagaa aaatgtcacc atgcgatcca tcaagaccac ccgggaccga 600
gtgcctacat atcagtacaa catgaatttt gaaaagctgg gcaaatgcat cataataaac 660
aacaagaact ttgataaagt gacaggtatg ggcgttcgaa acggaacaga caaagatgcc 720
gaggcgctct tcaagtgctt ccgaagcctg ggttttgacg tgattgtcta taatgactgc 780
tcttgtgcca agatgcaaga tctgcttaaa aaag 814
<210> 29
<211> 872
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tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgaggg tggggagaaa cagcgggtct tcactggtat tgttaccagc 480
ttgcatgact actttggggt tgtggatgaa gaggtctttt ttcagctaag tgtggtgaag 540
ggccgtctgc cccagctggg tgagaaggtg ctggtgaagg ctgcatacaa cccaggccag 600
gcagtgccct ggaatgctgt caaggtgcaa acgctctcca accagcccct actgaagtcc 660
ccagcacctc ctcttctgca tgtagcagcc ctgggccaga agcaagggat cctgggagct 720
cagcctcagt tgatcttcca gcctcaccgg attcccccac tctttcctca gaagcctctg 780
agtctcttcc aaacatccca cacacttcac ctgagccacc tgaacagatt tcctgcccgg 840
ggccctcatg gacggttgga tcagggccga ag 872
<210> 30
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<212> DNA
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<400> 30
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
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catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagca agccagggct gagcaggaag aagaattcat tagtaacact 480
ttattcaaga aaattcaggc tttgcagaag gagaaagaaa cccttgctgt aaattatgag 540
aaagaagaag aattcctcac taatgagctc tccagaaaat tgatgcagtt gcagcatgag 600
aaagccgaac tagaacagca tcttgaacaa gagcaggaat ttcaggtcaa caaactgatg 660
aagaaaatta aaaaactgga gaatgacacc atttctaagc aacttacatt agaacagttg 720
agacgggaga agattgacct tgaaaataca ttggaacaag aacaagaagc actagttaat 780
cgcctctgga aaaggatgga taagcttgaa gctgaaaagc gaatcctgca ggaaaaatta 840
gaccagcccg tctctgctcc accatcgcct agagatatct ccatggagat tgattctcca 900
gaaaatatga tgcgtcacat caggttttta aagaatgaag tggaacggct gaagaagcaa 960
ctgagagctg ctcagttaca gc 982
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<400> 31
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
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gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
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<400> 32
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
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actcaactgc ctgaggcaga aaaagaaaag attgctgagc aagttgctga tttcaagaaa 600
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ggaccactaa agcatacaac tgatgtgatc tatgcagcga aaatgatatc agaatcagga 780
tcaaggatgg atgtccttgc tcggcagatt gctaatcagt gcccagatcc atcttgtaaa 840
caggacttgt tggcctacct ggaacagatt aagttctact cccaccaact gaaaatctgc 900
agtcaagtta aagctgagat ccagaacctg ggaggagagc tcatcatgtc agct 954
<210> 33
<211> 933
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagat gggcttgtgt gcagaatgca gaagcttggt acccatgaac 480
actcccatct gtgtggtgtg tgaggcccct cttgctctac agctgcagcc acaggcaagc 540
ctccacttga aggagaaggt aatttgccgg gcctgtggta caggaaatcc tgctcacctg 600
agatactgtg tcacctgtga gggggccctg ccttcatcac aagagtcgat gtgcagtggg 660
gataaagccc ctcctccgcc cactcagaaa ggggggacca tttcctgcta cagatgtggt 720
cgctggaatc tctgggaggc gtccttctgc ggctggtgtg gagccatgct cggcattcct 780
gctggctgtt ctgtttgccc taaatgtggg gccagcaatc acctgtctgc ccgattctgt 840
ggctcctgtg gtatttgtgt gaagtcccta gtgaaactta gcttggacag aagcctggct 900
ctagctgctg aggaacctcg ccctttttct gag 933
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
aatgggcggc ttccagtcaa gtggatggct ccagaagccc tgtttgatag agtatacact 180
catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
tcgccctacc cagggattcc cgtggaggaa ctttttaagc tgctgaagga aggacacaga 300
atggataagc cagccaactg caccaacgaa ctgtacatga tgatgaggga ctgttggcat 360
gcagtgccct cccagagacc aacgttcaag cagttggtag aagacttgga tcgaattctc 420
actctcacaa ccaatgagga tagcattggg cagctggaga atgatctgag gaacaccaag 480
agtgagatgg cacgccacct tcgggaatac caggacttgc tcaatgtcaa aatggctctt 540
gacattgaga tagcagctta caggaaactg ctggaaggcg aggagacacg ttttagcacc 600
agtgggttaa gcatttcggg gctgaatcca cttcccaatc caagttacct gctcccacct 660
agaatcctca gtgctacaac ctccaaagtc tcatccactg ggctatcact taagaaagag 720
gaggaggagg aggaggcatc taaggtagcc tctaagaaaa cctcccagat aggggaaagt 780
tttgaagaaa tattagagga gacagtaata tctactaaga aaaccgagaa atcaaatata 840
gaagaaacca ccatttcaag ccaaaaaata taattccatt gctttgaaaa agttaatgct 900
taagagggaa tgatatgcat ttg 923
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tgtattcatc gagatttagc agccagaaat gttttggtaa cagaaaacaa tgtgatgaaa 60
atagcagact ttggactcgc cagagatatc aacaatatag actattacaa aaagaccacc 120
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catcagagtg atgtctggtc cttcggggtg ttaatgtggg agatcttcac tttagggggc 240
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ctgcagagct ccatccctga tcagcagctt ttgaaagctt tagacgaaaa tgcaaaactc 720
acccagcaac ttgaagaaga gagaattcag catcaacaaa aggtcaaaga attagaagag 780
caactagaaa atgaaacact ccacaaagaa atacacaacc tcaaacagca actggagctt 840
ctagaggaag ataaaaagga attggaattg aaatatcaga attctgaaga gaaagccaga 900
aatttaaagc actctg 916
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gtattgagtg gagaactgca gcctcggtcc atttcagtag aagggagctc cctcttaata 540
ggcgcctcta actctttagt ggcagatcac ttacaaagat gtggctatga atattcactt 600
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gataaagaaa atcaaaaagg ttttcttatg cattttttaa aagaattggc agaatatcat 780
caagctaaag agagttgtaa tatggaaact cagacaagtt cgacatttaa cagagattct 840
ctgg 844
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acagcccaga cagcggtgtt gattgagaca ctctgtgccc tgggggctca gtgccgctgg 840
tctgcttgta acatctactc aactcagaat gaagtagctg cagcactggc tgaggctg 898

Claims (7)

1.一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物和探针序列：
FB-M1正向引物序列SEQ ID NO.1；
FB-M1反向引物序列SEQ ID NO.2；
FB-M2反向引物序列SEQ ID NO.3；
FB-M3反向引物序列SEQ ID NO.4；
FB-M4反向引物序列SEQ ID NO.5；
FB-M5反向引物序列SEQ ID NO.6；
FB-M6反向引物序列SEQ ID NO.7；
FB-M7反向引物序列SEQ ID NO.8；
FB-M8反向引物序列SEQ ID NO.9；
FB-M9反向引物序列SEQ ID NO.10；
FB-M10反向引物序列SEQ ID NO.11；
FB-M11反向引物序列SEQ ID NO.12；
FB-M12反向引物序列SEQ ID NO.13；
FB-M13反向引物序列SEQ ID NO.14；
FB-M14反向引物序列SEQ ID NO.15；
FB-M15反向引物序列SEQ ID NO.16；
FB-M16反向引物序列SEQ ID NO.17；
FB-M17反向引物序列SEQ ID NO.18；
FB-M18反向引物序列SEQ ID NO.19；
探针序列SEQ ID NO.20，所述探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物，其特征在于：所述核酸组合物中还包括内参基因的引物和探针序列：
GAPDH正向引物序列SEQ ID NO.21；
GAPDH反向引物序列SEQ ID NO.22；
GAPDH探针序列SEQ ID NO.23，所述探针序列的5’端采用荧光报告基团修饰，探针序列的3’端采用荧光淬灭基团修饰。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测人FGFR2基因融合突变的核酸组合物，其特征在于：所述探针序列的5’端选用FAM荧光基团标记，探针序列的3’端选用BHQ1荧光基团标记。
4.一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-3任一所述的核酸组合物。
5.根据权利要求4所述的一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和阳离子。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Taq 酶，所述阳离子为Mg2+。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测人FGFR2基因融合突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR增强剂。
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