CN112034177A - Npy作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了NPY作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途，属于分子诊断技术领域。本发明确定了人体血清中NPY蛋白表达水平与长期低剂量电离辐射暴露紧密相关，血清中NPY蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此血清中NPY蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测NPY蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露检测。检测NPY蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及NPY作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
背景技术
电离辐射可对机体在分子、细胞、组织和器官等不同水平上发生影响，使机体产生不同程度的生物效应。高、低剂量(<100mGy)的辐射生物效应不尽相同。低剂量电离辐射对放射职业人群和公众的影响更为普遍，其生物效应更加复杂。电离辐射引发的细胞突变、染色体畸变和基因表达等等不同水平的规律性变化，可以作为辐射生物标志物，应用于受照剂量评估、辐射分子流行病学调查等等。
辐射分子流行病学将传统流行病学研究和分子生物学技术相结合，从分子水平探讨电离辐射对机体的影响。辐射分子流行病学调查对于评估辐射易感性、维护人群健康、建立合理而有效的辐射防护策略等有着重要的应用价值。辐射分子流行病学研究中最重要的内容是辐射生物标志物，可以包括DNA、RNA、蛋白质、酶、代谢产物、其他生化分子，等等。目前常用的微核分析、染色体畸变等检测方法只能够反映细胞水平的生物效应，并且在低剂量条件下响应不足。免疫组化、原位杂交、实时荧光定量PCR、生物芯片、代谢组学等技术的发展为研究辐射标志物提供了更多可能。酶联免疫吸附(ELISA)技术利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，捕获目标蛋白并对其定性或定量分析。抗体芯片将ELISA高度集成，形成一种微型、高通量化的蛋白质分析技术，用于检测相关蛋白的表达丰度。
辐射分子流行病学研究的关键是适合的辐射生物标志物，目前有研究趋势利用组学技术(基因组学、蛋白组学、代谢组学)寻找一系列分子标识形成辐射生物效应的“指纹图谱”。但开发长期低剂量辐射生物标志物依然是一项挑战，其主要原因包括：低剂量辐射引发的生物效应不够明显，分子变化敏感性较低；许多辐射效应受到半衰期和接触时间的限制，随时间恢复或消失，分子变化具有时效性。
神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)普遍存在于哺乳动物，是生物体内重要的神经递质。其生理功能主要包括：促进摄食行为、调控机体能量平衡；直接对下丘脑活动产生作用，影响许多因子与激素的合成和分泌；调节血管的收缩，增强血管紧张、收缩血并抑制舒血管物质的作用；与免疫功能有密切关系，调控炎性因子、趋化因子等诸多细胞因子。神经肽Y蛋白的UniProtKB编号为P01303。尚未见到NPY与低剂量辐射生物效应的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供NPY作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
本发明提供了NPY作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
进一步地，所述NPY为人血清中的NPY蛋白。
本发明还提供了检测NPY蛋白的试剂在制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒中的用途。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为检测人血清中NPY蛋白的试剂。
本发明还提供了一种诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒，它包括用于检测NPY蛋白的试剂。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
进一步地，所述检测NPY蛋白的试剂为检测人血清中NPY蛋白的试剂。
本发明中NPY是指人血清中的NPY蛋白；血清NPY水平是指人血清中NPY蛋白的表达水平。NPY蛋白的UniProtKB编号为P01303。
本发明的目的在于针对电离辐射分子流行病学调查的需求，提供一种新型电离辐射生物标志物，用于长期低剂量电离辐射暴露诊断。本发明的关键在于，确定了人体血清中NPY蛋白表达水平与长期低剂量电离辐射受照人群显著相关，血清中NPY蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此可以通过检测人体血清中NPY作为辐射分子流行病调查的生物标志物，即血清中NPY蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物。本发明实施例具体采用抗体芯片和酶联免疫分析(ELISA)方法进行检测人体血清中NPY，但不仅仅限于该手段，可以采用现有蛋白分析技术公开的各种手段，即任何能够检测NPY的方法均可用。
NPY可作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测NPY蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露检测。检测NPY蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为抗体芯片一次性筛查16个样本中的蛋白因子示意图。
图2为抗体芯片检测放射组(R，×)与对照组(C，●)的NPY水平差异(n＝8；**p<0.01)，纵坐标为芯片信号值，芯片信号值越大说明NPY水平越高。
图3为放射组(R，×)与对照组(C，●)人血清NPY水平差异(n＝20；**p<0.01)。
图4为放射组(R，空心点)与对照组(C，实心点)的血液细胞检验差异：■□，白细胞；●○，红细胞；▲△，血红蛋白；▼▽，血小板(n＝20；*p>0.05)。
图5为放射组(R，空心点)与对照组(C，实心点)的生化免疫检验差异：◆◇肌酐；▼▽，尿酸；■□，葡萄糖；●○，总胆固醇；▲△，甘油三脂(n＝20；*p>0.05)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、抗体芯片初筛血清NPY水平与长期低剂量电离辐射暴露的关系
选取放射职业人员(工作年限为10～30年，即长期低剂量电离辐射暴露)和非放射职业人员(非长期低剂量电离辐射暴露)各8名男性，分别作为放射组和对照组。采集空腹晨间静脉血，置于高速冷冻离心机(贝克曼，JXN-30)迅速离心(3000rpm，15min)分离获得血清1mL，保存于-80℃冰箱(赛默飞，TSE240V-ULTS)。
采用广州瑞博奥(RayBiotech)公司的高密度抗体筛选芯片Human Array L-1000(试剂盒)，对每个血清样品可检测包括NPY在内的1000个细胞因子。
1、试剂盒内容包括：
玻璃芯片——
Biotin label-based human antibody array 1and 2，Item E；
标记试剂——Labeling Reagent，Item B，1张玻片配1管；
终止液——Stop Solution，Item D，50μL；
封闭缓冲液——Blocking Buffer，Item F，每瓶8mL，2张玻片配2瓶；
标记缓冲液——Serum Buffer，Item K，每瓶8mL，2张玻片配1瓶；
1500×荧光标记链霉亲和素——Cy3 equivalent，1张玻片配1管；
透析管和浮漂——Dialysis tube and Floating Rack，Item A；
20×的洗液I——20X Wash Buffer I，Item G，30mL；
20×的洗液II——20X Wash Buffer II，Item H，30mL。
2、主要实验步骤
主要实验步骤如图1所示。
2.1样品透析：取200μL血清样品置于透析管在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析，间隔3h更换透析液，透析三次以后收集样品，测定总蛋白浓度。(1×PBS的配制：1.0g KCl、40g NaCl、1.0g KH2PO4、5.75g Na2HPO4用4500ml去离子水溶解，用1M NaOH调节pH＝8.0，最后用去离子水定容至5000ml。)
2.2生物素标记样品：将适量(40～50μL，根据透析后总蛋白浓度确定)血清样品与140～150μL标记缓冲液混合(二者总体积190μL)，并加入22μL标记试剂，快速混匀，摇床上室温孵育30min，每5min轻弹离心管，混合反应试剂。加入3μL终止液，在4000mL的1×PBS(pH＝8)中4℃边搅拌边透析，间隔3h更换透析液，透析三次以后收集样品。
2.3芯片干燥：将玻片芯片在室温平衡1h后，打开包装袋，揭开密封条，放在真空干燥器干燥1h。
2.4封闭和孵育：
1)每个芯片孔中加入400μL的封闭缓冲液，室温摇床上孵育1h；
2)抽去封闭缓冲液，标记后的血清样品用封闭缓冲液稀释80倍后，每孔中添加400μL，4℃振荡过夜孵育；
3)抽去样品，每个孔中加入1mL的1×洗液I(20×洗液I用去离子水稀释)室温振荡，洗玻片4次，每次5min；
4)抽去1×洗液I，每个孔中加入1mL1×洗液II(20×洗液II用去离子水稀释)室温振荡，洗玻片4次，每次5min；
5)抽去1×洗液II，Cy3-链霉亲和素管中加入1ml的封闭缓冲液，再用封闭缓冲液稀释5倍。每孔加入400μL上述稀释液室温避光振荡孵育2h；
6)按照步骤3)和4)洗玻片，待检测。
2.5荧光检测：采用激光扫描仪例如InnoScan 300扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)检测。
3、数据分析
采用微阵列显著性分析方法(SAM)对抗体芯片表达谱进行统计学分析处理。差异表达倍数在1.5倍以上，即≥1.5或≤0.67，确定为差异表达的蛋白因子。
4、结果
结果如图2所示：放射组人员(R-NPY)人血清中NPY蛋白的平均表达水平显著高于对照组(C-NPY)平均表达水平，其差异表达倍数为1.8倍，且具有统计学意义(p<0.01)，表明人血清中NPY蛋白的表达水平可以区分放射职业人群和普通对照人群。
实施例2、酶联免疫吸附测定(ELISA)血清NPY水平与长期低剂量电离辐射暴露的关系
选取放射职业人员(工作年限为10～30年，即长期低剂量电离辐射暴露)和非放射职业人员(非长期低剂量电离辐射暴露)各20名男性，分别作为放射组和对照组。采集空腹晨间静脉血，置于高速冷冻离心机(贝克曼，JXN-30)迅速离心(3000rpm，15min)分离获得血清1mL，保存于-80℃冰箱(赛默飞，TSE240V-ULTS)。
NPY酶联免疫试剂盒购自美国瑞博奥(EIA-NPY)，检测方法按照说明书的实验步骤进行，具体步骤如下：按照说明书的方法稀释血清样品、制备标准液及其它试剂；在96孔板(康宁，353072)每孔中加入100μl的NPY抗体，置于4℃LED圆周数显摇床(大龙，SK-O180-S)轻微振荡孵育过夜；将96孔板置于自动微孔洗板机(美谷分子，MultiWash+)洗板4次，每孔中加入100μl的血清样品或者标准品，于25℃轻微振荡孵育2.5h；洗板4次，每孔中加入100μl的链霉亲和素溶液，于25℃轻微振荡孵育45min；洗板4次，每孔中加入100μl的反应物溶液，于25℃轻微振荡避光孵育30min；每孔中加入50μl的反应终止液，立即使用多功能读板机(美谷分子，I3X)在450nm处读取光信号；根据标准曲线计算获得样品NPY浓度，结果如表1和图3所示。
表1.放射组和对照组血清NPY水平对比
放射组人员的平均血清NPY水平为1.39±0.67ng/ml，显著高于对照组平均水平(0.56±0.42ng/ml)，其差异具有统计学意义(p<0.01)，表明NPY水平可以区分放射职业人群和普通对照人群(图3和表1)。NPY生理功能众多，并且与心血管、脑血管、消化、内分泌等各系统的发病机制、疾病发展及预后有关。有研究发现，长期高血压患者的血浆NPY水平显著高于对照组，脑梗塞患者、脑出血患者、慢性肾功能衰竭患者，NPY水平也相应有所提高。分析放射组与对照组的血液细胞(图4)和生化免疫指标(图5)，并未发现这些指标具有统计学意义的差异(p>0.05)。两组人员在BMI、高血压、血脂异常、甲状腺功能和肝功能等方面也不存在统计学差异(p>0.05)，但放射组人员的血清NPY水平显著高于对照组(表1)。结果表明NPY水平可以区分放射职业人群和普通对照人群，长期低剂量电离辐射暴露人群血清NPY水平高于非长期低剂量电离辐射暴露的普通人群。
实施例3、长期低剂量电离辐射暴露诊断的试剂盒
任何检测NPY蛋白的试剂都可以用于制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒。
如实施例2所述试剂盒：
(1)试剂盒组成：同实施例2，主要有NPY抗体、标准品、链霉亲和素溶液、反应物溶液、反应终止液。
(2)试剂盒的使用方法：同实施例2。
综上，本发明确定了人体血清中NPY蛋白表达水平与长期低剂量电离辐射暴露紧密相关，血清中NPY蛋白表达水平高低可以区分长期低剂量电离辐射暴露人群，因此血清中NPY蛋白可以作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物，检测NPY蛋白的试剂及试剂盒，可应用于长期低剂量电离辐射暴露检测。检测NPY蛋白的方式简便，可以采用芯片或其他蛋白分析技术开展大规模、高通量的人群筛查，具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.NPY作为长期低剂量电离辐射暴露诊断的分子标记物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述NPY为人血清中的NPY蛋白。
3.检测NPY蛋白的试剂在制备诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
6.根据权利要求3～5任一项所述的用途，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为检测人血清中NPY蛋白的试剂。
7.一种诊断长期低剂量电离辐射暴露的试剂盒，其特征在于：它包括用于检测NPY蛋白的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为酶联免疫吸附试验用试剂或酶联免疫分析试剂。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为westernblot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
10.根据权利要求7～9所述的试剂盒，其特征在于：所述检测NPY蛋白的试剂为检测人血清中NPY蛋白的试剂。
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