CN112034163A - 生物小分子的检测方法和设备和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用超高频谐振器产生体声波的系统对溶液中的生物小分子直接进行检测的方法。本发明还提供了基于所述方法用于对生物小分子进行检测的设备或装置。本发明提供的方法与设备适合用于临床检测，特别是小型化的即时检测。

Description

生物小分子的检测方法和设备和试剂盒

本申请要求以下中国专利申请的优先权：2019年6月3日提交的、申请号为201910476691.5、发明名称为“生物小分子的检测方法和设备和试剂盒”，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及细胞研究方法学与医疗器械领域。具体的，本发明涉及一种对生物分子进行分离和检测的设备和使用所述设备来分离和检测生物学物质的方法。

背景技术

生物分子，例如代谢物等小分子，还有蛋白和核酸的提纯与检测是许多基础的生物机理研究、医学和疾病诊断以及医疗仪器开发等领域广泛关注的核心问题。

现有技术中利用各种物理场将目标生物分子聚集在一个特定局部区域。例如使用纳米尺寸的颗粒材料作为载体，对复杂生物样品中的生物目标分子(血液、唾液、尿液等)进行特异性的提纯，然后对纳米尺寸的颗粒载体进行操作，从而实现了对目标生物分子的操作。例如，捕捉和限制纳米粒子以及分子，进而实现局部区域内的聚集，是超高灵敏度生物传感器、新型药物传输方法等领域长期追求的目标。高速离心被用来分离不同尺度的纳米粒子；介电泳技术也被也用来捕捉积累和组装纳米粒子；磁镊和光镊技术都被用来操纵纳米粒子和生物分子。目前已有的分子富集技术包括施加高电压的电泳技术、纳米流道辅助的分子富集和纳米过滤膜实现分子筛选等。

然而这些技术受限于高能量、低通量和易阻塞等缺点，需要在局部产生非常大的场强分布，对分子操作存在较大的局限性。与此同时，直接使用物理场操作分子的特异性较差。

检测设备的便携化是现代科学仪器发展的一大趋势。便携式的生物传感装置具有更为广泛的应用，例如家庭健康检测、人体健康指标实时检测、以及医疗资源匮乏的偏远地区的诊断等。一般而言，便携式传感器具有体积小、操作简单、快捷可靠、价格相对较低等特点。相应地，只有符合上述特点的生物传感技术或者方式才有望率先被研发成为便携式生物传感器。

因此，目前亟需一种更有效、更方便的对生物分子的富集、分离和检测的方法和系统。

发明内容

本发明提供了新的利用超高频谐振器产生体声波的系统对生物物质进行分离、富集和检测的方法。本发明还提供了通过所述方法用于对生物物质进行分离、富集和检测的分离和检测设备。本发明提供的分离和检测方法具有对材料要求低、操作简单，检测时间段、需要样品少、灵敏度高的特点。

本发明提供的方法与设备为生物分子的检测，特别是小型化的即时检测提供了一个有力的工具。

具体的，本发明提供了一种检测样品中的靶物质的方法，所述方法包括：

在设备中处理含有靶物质的样品，所述设备包括；容纳溶液的容器；一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述容器的壁(例如容器底部)上，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，即被旋流收集，并在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

在本发明的其中一个方面，所述方法的靶物质为生物小分子物质，例如为肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核酸(DNA、RNA、PNA、适体(aptomer))以及核酸前体(核苷和核苷酸)、多糖、脂质等。其中，蛋白质可包括细胞因子、激素、维生素、表面受体、半抗原、抗原、抗体、酶、生长因子、重组蛋白质、毒素、以及其片段和组合。所述生物小分子物质通常具有纳米数量级或更小的尺寸，例如小于100nm。

在靶物质在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合后，可通过检测靶物质携带的可检测的标记来检测所述靶物质。这些标记包括而不限于荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。

本发明的方法可用于检测样品中的生物物质。所述样品可以是含有靶物质的培养液或其悬浮液或其上清、缓冲液，例如为各种病毒、细菌或细胞的培养液或其悬浮液或其上清。有例如为各种动物如人的各种体液，包括血液、组织液、细胞外液、淋巴液、脑脊液、房水、尿液、汗液等。

在本发明的其中一个方面，通过所述超高频体声波谐振器的顶部表面作为固体载体，其上具有靶生物物质的对应的结合配体(binding ligand)，然后，通过所述结合配偶体与靶生物物质的特异性结合，可以选择性地将靶生物物质结合到器件表面上。所述超高频体声波谐振器设置在本发明的设备的容器的底部，因此超高频体声波谐振器的顶部通常也是容器的底部表面的一部分。

“结合配体”是指能够与另一生物分子进行结合或相互作用(特别是特异性结合或相互作用)的任何生物分子或其它有机分子。这种结合或相互作用可称为“配体”结合或相互作用。例如，但不限于，抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物结合或相互作用。

因此，本发明的超高频体声波谐振器的顶部表面上具有与靶物质(特异性)结合的配体，所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物。可根据本发明的载体的所需用途选择适合的配体。

可通过本领域已知的方法将所述配体结合到器件表面上。例如，通过还原性胺化或通过使结合配体上的亲核基团与器件表面的聚合物上的活化酯侧链例如N-羟基琥珀酰亚胺活化酯反应，可以实现直接结合。又例如，配体和聚合物上的胺基团和羧酸基团可以通过常规的肽形成化学方法，例如使用碳二亚胺连接。

本发明提供的方法的靶物质为生物物质，一般为具有特定结构的分子，例如为肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、核酸(DNA、RNA、PNA、适体(aptomer)等)以及核酸前体(核苷和核苷酸)、多糖、脂质例如脂囊泡等。其中，蛋白质可包括细胞因子、激素、维生素、表面受体、半抗原、抗原、抗体、酶、生长因子、重组蛋白质、毒素、以及其片段和组合。所述生物物质通常具有纳米数量级或更小的尺寸，例如小于100nm。

本发明的方法还包括检测分离的靶物质，例如通过检测在超高频体声波谐振器的顶部结合的靶物质本身的特征信号或标记信号。可以通过各种已知的方法对生物物质进行检测，特别是可视性检测。可以采用具有荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等标记的特异配体去识别靶物质。例如，当靶物质是蛋白或酶时，可以采用具有荧光或放射性同位素标记的抗体特异性识别所述蛋白或酶，通过检测所述荧光或放射性同位素来检测靶物质。优选的，本发明通过荧光性进行检测。所述靶物质可标记可检测的荧光基团，通过光学检测部件对发出的荧光信号进行检测。

本发明的方法利用超高频体声波谐振器在溶液中产生超高频体声波，在溶液中基本上不产生驻波，声波衰减到流体中产生的体积力使得流经的溶液中出现声射流，并引起有同样通量的流体往回流，产生涡旋。超高频谐振器产生的多个连续涡旋形成声流体涡旋通道。本发明的方法在溶液中产生的涡旋中存在各种液流和其中的粒子的相互作用。通过体声波区域的涡旋的粒子受到流体拖拽力(Stokes drag force)和声波衰减引起的声辐射力(acoustic radiation force)的共同作用。由于本发明中的粒子的尺寸为纳米级别，因此受的力主要为旋流中的流体拖拽力，并在涡旋中围绕旋流中心运动，其运动轨迹一端接近和接触超高频谐振器的顶部。由此，在存在超高频体声波谐振器在溶液中产生超高频体声波引起的涡旋时，溶液中的粒子会不断进入涡旋，并且不断接近和接触超高频谐振器的顶部。申请人出乎意料地发现，在所述旋流中运动的粒子，在接近静止的对应配体时，仍然能发生有效的结合。

在本发明的方法中，所述超高频体声波谐振器可产生高频(约0.5-50GHz)的振动，在溶液中引发相应频率的体声波。在本发明的其中一个方面，所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器(FBAR)或固态装配型谐振器(SMR)，优选为固态装配型谐振器。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器为厚度伸缩振动模式的声波谐振器，压电材料薄膜层在垂直方向上生长而制成，通过d33压电系数耦合垂直电场激发振动。本发明采用的超高频体声波谐振器可以在装置和液体的界面产生局部化的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。本发明的声波谐振器包括由下往上依次设置的声波反射层、底电极层、压电层及顶电极层。所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射层相重叠区域构成体声波产生区域。所述超高频体声波谐振器的顶部表面配置在流体通道的壁上，向对侧的壁产生传播方向与所述壁垂直的体声波；由所述顶部表面构成的区域可称为体声波作用区域。本发明的超高频体声波谐振器的压电层的厚度范围为约1nm～2um。本发明的超高频体声波谐振器的频率在约0.5-50GHz，优选为约1-10GHz。

在本发明中，所述声波作用区域的形状可以为任意形状。在本发明的其中一个方面，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域宽度为约50-300μm，例如为约70-150μm。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm²，优选为约5000-20000μm²。

所述超高频体声波谐振器产生的体声波由高频信号发生器的信号驱动。驱动谐振器的脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制驱动，脉冲宽度调制可以产生任何期望的波形，例如正弦波、方波、锯齿波或三角波。脉冲电压信号也可以具有调幅或调频开始/停止能力，以开始或消除体声波。

在本发明的其中一个方面，本发明的方法用于分离和/或检测样品中的多种靶物质。例如，在本发明的方法中，在同一个容纳样品的容器中可以按需要设置多个超高频体声波谐振器，在不同超高频体声波谐振器的顶部分别结合对应于多个靶物质的配体，由此可以对同一个样品同时做多个靶物质的检测。

本发明还提供了用于上述检测样品中的靶物质的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

一个或多个超高频体声波谐振器，其用于设置于一个流体通道的一个壁上，在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波，所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述配体是肽、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、PNA、核苷酸或多糖。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述配体为生物素或链霉亲和素，或为抗原或抗体。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm²，优选为约5000-20000μm²。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述超高频体声波谐振器产生的体声波的功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。

在其中一个方面，所述本发明的试剂盒中所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。

本发明还提供了用于上述检测样品中的靶物质的方法的设备。在本发明的其中一个方面，所述设备用于实现前述本发明的用于从样品纯化靶物质的方法。

在本发明的其中一个方面，所述设备包括：

容纳溶液的容器；一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述容器的壁上，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

在本发明的其中一个方面，所述设备还具有功率调节装置，其输出功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。

在本发明的其中一个方面，所述设备的超高频体声波谐振器的体声波产生区域的宽度为约50-300μm，例如为约70-150μm。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm²，优选为约5000-20000μm²。

在本发明的其中一个方面，所述设备的流体通道的宽度为约200-2000μm，优选为约500-1500μm。

在其中一个方面，所述本发明的设备中所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物。

在其中一个方面，所述本发明的设备中所述配体是肽、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、PNA、核苷酸或多糖。

在其中一个方面，所述本发明的设备中所述配体为生物素或链霉亲和素。

在其中一个方面，所述本发明的设备中所述配体为抗原或抗体。

在其中一个方面，所述本发明的设备中所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。

本发明还提供了用于从样品纯化靶物质的方法的装置。所述装置是一种小型的便携装置。在本发明的其中一个方面，所述装置用于实现前述本发明的用于从样品纯化靶物质的方法。

在本发明的其中一个方面，所述装置包括：

外壳；

流体通道，其具有入口和出口；

一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的底部，所述超高频体声波谐振器可产生传向所述流体通道顶部的频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

在本发明的其中一个方面，所述流体通道的出口具有封闭机构。在本发明的其中又一个方面，所述封闭机构是可装卸的。本发明的装置可用于在样品进入流道后，封闭出口，使得流体通道内的液体静止，然后开启超高频体声波谐振器产生涡旋。在本发明的其中又一个方面，所述封闭机构是与出口联通，但与外界隔绝的腔体。所述腔体具有可变形材料制成的按压部，所述按压部在受到压力和压力取消时，所述腔体发生形变。

在本发明的其中又一个方面，所述流体通道的入口也可通过例如盖子等可拆卸结构进行封闭。

在本发明的其中一个方面，所述超高频谐振器具有接收脉冲电压信号的电路。在本发明的其中又一个方面，所述超高频谐振器具有接受与外部高频信号发生器连接的电路和接口，所述接口设置在装置外壳上。在本发明的其中另一个方面，所述超高频谐振器具有接受射频信号的电路。

在本发明的其中一个方面，所述超高频谐振器产生的体声波功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。

在本发明的其中一个方面，所述装置的超高频体声波谐振器的体声波产生区域的宽度为约50-300μm，例如为约70-150μm。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm²，优选为约5000-20000μm²。

在本发明的其中一个方面，所述装置还设置有观察窗。所述观察窗可供人眼观察，或可用于与外部检测仪器连接，用于观察超高频谐振器表面富集和结合的靶物质释放的信号，例如荧光等发光信号。

在其中一个方面，所述本发明的装置中所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物。

在其中一个方面，所述本发明的装置中所述配体是肽、糖蛋白、脂蛋白、DNA、RNA、PNA、核苷酸或多糖。

在其中一个方面，所述本发明的装置中所述配体为生物素或链霉亲和素。

在其中一个方面，所述本发明的装置中所述配体为抗原或抗体。

在其中一个方面，所述本发明的装置中所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器或固态装配型谐振器，例如为厚度伸缩振动模式的声波谐振器。

本发明还提供了上述试剂盒、设备或装置用于检测样品中的靶物质的方法。本发明提供的方法、试剂盒、设备或装置可以用来体内或离体检测几乎任何分析物。尽管在一个优选的实施方案中分析物可能是一种生物分子，但是不必须受此限制，只要特异性结合配偶体是可获得的或者在这里所描述的本发明的一些实施方案中可以测定分析物的一些其它性质。合适的分析物实际上包括生物材料或者从其中处理出的材料中发现的任何分析物。实际上使用本发明方法可以检测优选可以悬浮于或溶解于水溶液中的任何分析物。所感兴趣的分析物的实施例包括1)抗体，例如抗肝炎(例如甲肝，乙肝和丙肝)，麻疹，流行性腮腺炎和风疹的抗体；2)滥用药物和它们的代谢副产物，例如可替宁，可卡因，苯甲酰芽子碱，benzoizazpine，四氢大麻酚，烟碱，乙醇；3)治疗药物，包括茶碱，苯妥英，对乙酰氨基酚，锂，地西泮，去甲替林，司可巴比妥，苯巴比妥等等；4)激素和生长因子，例如睾酮，雌二醇，17-羟基孕甾酮，孕甾酮，甲状腺素，促甲状腺激素，促卵泡激素，促黄体素，α转化生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子I和II，生长激素释放抑制因子，和性激素结合球蛋白；和5)其它分析物，包括葡萄糖，胆甾醇，咖啡因，皮质类固醇结合球蛋白，DHEA结合糖蛋白等等。

在本公开中使用的，术语“配体”或“分析物”或“标记物”指测定的任何分子。通过其与抗配体的相互作用来测定，其特异性地或非特异性地结合配体，或者通过配体的特征性电介质性质来测定。配体一般定义为对其存在由于对所述配体的某些部分的识别而特异性地或非特异性地结合所述配体的另一个分子(即抗配体)的任何分子。抗配体，例如可以是一种抗体和配体分子，例如特异性结合抗体的抗原。在抗原与表面结合并且抗体是要检测的分子的情况下，为了本发明的目的，抗体成为配体并且抗原是抗配体。配体还可以包括细胞，细胞膜，细胞器及其合成类似物。

用于实施本发明的合适的配体包括但不限于抗体(形成抗体/表位复合体)，抗原，核酸(例如天然的或合成的DNA，RNA，gDNA，cDNA，mRNA，tRNA，等等)，凝集素，糖(例如形成凝集素/糖复合体)，糖蛋白，受体和它们的相关配体(例如生长因子和它们的相关的受体，细胞因子和它们相关的受体，信号受体等等)，小分子，例如候选药物(或者来自天然产物或者在组合实验室开发和贮存的合成类似物)，代谢产物，滥用药物和它们的代谢副产物；辅助因子，例如维生素和其它天然存在的和合成的化合物，生理体液中发现的氧和其它气体，细胞成分，细胞膜和相关的结构，植物和动物源中发现的其它天然产物，其它部分或完全合成的产物等等。

如这里所使用的，术语“抗配体”指特异性或非特异性结合其它分子(即配体)的分子。通过其与其特异性结合的配体的相互作用或者通过其自身特征性电介质性质来测定抗配体。如这里所使用的，抗配体通常固定在表面上，或者单独地或者作为固定在表面上的结合配偶体的成员。在一些实施方案中，抗配体可以由信号电路或导体表面上的分子组成。或者，一旦抗配体与配体结合，得到的抗配体/配体复合体可以被认为是用于下面的结合目的的抗配体。

如这里所使用的，术语“特异性结合”当指蛋白质或多肽，核酸，或者受体或者这里所描述的其它结合配偶体时，指是蛋白质和/或其它生物物质异源种群中所感兴趣的相关配体的决定因素的结合反应。因此，在指定条件下(例如抗体情况下的免疫测试条件)，具体的配体或抗体结合其特定的“靶物”(例如激素特异性结合其受体)，并且不以明显量结合样品中存在的其它蛋白质或者结合配体或抗体可以在来自生物体的器官或样品中接触的其它蛋白。类似地，核酸可以在预先选择的条件下相互杂交。

如这里所使用的，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异性结合的抗原之间存在的非共价相互作用类型。如这里所使用的，生物样品是用于所感兴趣的分析物测试的健康和/或病理状态的生物组织或液体的样品。这样的样品包括但不限于痰，羊水，血液，血细胞(例如白细胞)，组织或细针活组织检查样品，尿，腹膜液，和胸膜液，或其中的细胞。生物样品还可以包括组织切片，例如为了组织学目的的冷冻切片。尽管样品一般取自人患者，但是测试可以用来测定来自任何哺乳动物例如狗，猫，绵羊，牛和猪的样品中所感兴趣的分析物。可以根据需要，通过在合适的缓冲溶液中稀释或如果需要浓缩来预处理样品。可以使用多种标准缓冲水溶液，使用多种缓冲液中的一种，例如磷酸盐，Tr i s，或者类似物，优选在生理pH下使用。

如这里所使用的，术语“结合作用”指最小的两个分子结构例如配体和抗配体之间的相互作用或相关性。当两种分子结构直接或非直接物理接触时或者当两种结构物理分离但是之间电磁耦合时可以发生这种相互作用。药学概念上所感兴趣的结合作用的实施例包括但不限于配体/受体，抗原/抗体，酶/底物，DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA，核酸错配，互补核酸和核酸/蛋白质。或者，术语“结合作用”可以指这里所描述的与信号电路结合的单分子或分子结构，例如配体或抗配体/配体复合体。在这种情况下，信号电路是第二分子结构。

如这里所使用的，术语“配体/抗配体复合体”指与抗配体结合的配体。结合可以是特异性的或非特异性的，键一般是共价键，氢键，免疫结合，范德瓦耳力或者其它类型的结合。

如这里所使用的，术语“偶联”指或者通过直接或非直接物理连接或者通过信号连接的任何形式，例如静电或电磁偶联，两种结构之间的能量的转移。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出本发明的方法的示例性实施方式的示意图。其显示在超高频体声波谐振器的顶部特异结合的靶物质(链霉亲和素)-配体(生物素)的示意图。

图2示出本发明的方法和设备可以通过体声波引起的涡旋聚集微米级的聚苯乙烯微粒和纳米级的分子。

图3显示本发明的方法和设备可以将溶液中的生物小分子(链霉亲和素)通过体声波引起的涡旋递送到超高频体声波谐振器的顶部与配体(生物素)结合和被检测。

图4示出本发明的检测样品中的靶物质的便携装置的示例性实施方式的示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。

实施例1

流体通道和超高频体声波谐振器制备：

通过软光刻制备由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的流体通道。

通过在硅基的晶圆上进行化学气相沉积、金属溅射、光刻，完成超高频体声波谐振器芯片的制作。具体的方法如下：

1.使用浓硫酸与双氧水体积比为3:1的食人鱼溶液对硅片的表面进行彻底的清洗，该方法可以有效地去除硅片上的有机物和无机物。

2.在清洗过的硅片上，通过表面溅射的方法形成一层氮化铝薄膜，再使用离子增强型化学气相沉积的方法，沉积一层二氧化硅薄膜。接着使用同样的方法，交替沉积氮化铝薄膜和二氧化硅薄膜，形成氮化铝和二氧化硅交替重叠的布拉格声反射结构。

3.在布拉格反射层结构上，溅射出一层600nm的钼薄膜作为底电极。接着采用标准光刻技术，包括涂胶、曝光、显影等，对钼电极薄膜进行光刻，之后进行刻蚀，形成有目标图案的底电极。

4.在钼电极上再溅射一层氮化铝薄膜作为压电层。使用干法刻蚀对氮化铝薄膜定义图案。在本示例性的实施方式中，采用五角形。

5.使用负光刻胶对掩模版上的图案进行转移，再溅射出一层50nm厚的钛钨合金，它作为粘附层可以增加金电极的粘附性。之后使用蒸镀的方法长出一层300nm厚的金薄膜的上电极。最后使用丙酮去除掉目标图案周围的金薄膜，形成有目标图案的金电极。

最后，将超高频体声波谐振器装置与PDMS微通道芯片粘合集成。超高频体声波谐振器装置设置在通道的中间位置。

将谐振器装置用标准SMA接口与网络分析仪连接，通过测试频谱找到谐振峰，可测得在本示例性的实施方式中，超高频谐振器装置在微流道中发出的体声波的频率为2.5GHz。

实施例2

本发明的方法和设备采用的超高频谐振器能够在溶液内通过发射体声波引起涡流。溶液中的粒子同时受到声辐射力和拖拽力的作用。由于微米级的粒子粒径较大，主要受到声辐射力的影响，会沿着涡旋从外向内运动，当其运动到谐振器边缘时，此时中心液体正自下向上继续运动，而大粒径的粒子会因为受到了较大的声辐射力的水平分量，而被推向偏离涡旋轨迹的内侧的区域，当粒子远离器件边缘一定距离后，此时声辐射力因为距离变远而减小，粒子又会受到由上而下的微涡旋的流体拖拽力而再次移动至器件边缘，如此往复。当粒子粒径较小，受拖拽力的影响较小，难于聚集，聚集所需要的时间更长。

本实验测试了两种粒子：一类是微米级的聚苯乙烯微球，尺寸分别是5um，9um，通过观测不同粒径粒子聚集在谐振器边缘需要的时间来研究该尺度粒子的聚集效果。微米尺度的粒子粒径较大，可以在常光下观测到粒子的运动。另一类是纳米尺度的粒子，由于纳米粒子的粒径较小，在常光下难以观测，实验使用的是具有荧光标记的多聚赖氨酸(PLL)：PLL-FITC，分子量约250000，通过观测荧光强度在谐振器边缘的增强和时间来研究纳米粒子的聚集效果。

结果如图2所示，图2(a－d)是9um的聚苯乙烯粒子随时间的聚集效果。从图中可以看出，5分钟后，谐振器边缘已经聚集了大量的微球。图2(e－h)是5um的聚苯乙烯微球的聚集结果，5分钟时，可以看到器件边缘有一定的聚集，对比d图可以明显看出，9um粒子的聚集更快也更多。图2(i-l)是PLL-FITC的聚集结果。可以看出，5分钟后，器件边缘的荧光强度只有微小变化，随着时间的增强，荧光强度略有增强，直到1小时后，可以看到较明显的荧光增强效果。

结果证明，尺寸小于100纳米，甚至更小的分子也可进入特超声体声波在溶液中产生的涡流。

实施例3

在超高频声波谐振器表面用PLL-生物素进行修饰以产生带有生物素分子的在超高频声波谐振器表面，在溶液中加入有荧光(FITC)标记的链霉亲和素。对于对照组不施加功率，靶物质(链霉亲和素)-配体(生物素)通过自由扩散进行结合和反应。对于实验组施加1mW功率，观察在超高频声波谐振器表面产生涡旋后靶物质(链霉亲和素)-配体(生物素)的反应。

具体的实验流程如下：

(1)配置1mg/ml的PLL-PEG-生物素溶液和200nM异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素(FITC-SAv)。

(2)将超高频声波谐振器至于食人鱼洗液(浓硫酸与过氧化氢体积比为三比一的溶液)中清洗15s。

(3)将清洗过的芯片置于PLL-PEG-生物素溶液中室温下孵育30分钟。

(4)加入50ml的FITC-SAv溶液，施加1mW功率(实验组)或不施加功率(对照组)后，用荧光显微镜(Olympus BX53，Japan)通过摄像机(Olympus DP73，Japan)记录荧光强度。

在实验的过程中，分别在25分钟，30分钟，40分钟后对其检测结果进行拍照。图3(a－d)显示没有谐振器发出体声波和在溶液中产生涡流的谐振器的表面的信号。可以看出，40分钟后，谐振器上的荧光没有丝毫增强，即生物素与链霉亲和素的反应较少，没有达到检测的最低阈值。图3(e－h)是谐振器发出体声波和在溶液中产生涡流下的观察结果。可以明显看出，随着时间的增强，荧光强度越来越强，在谐振器边缘形成了一个五边形光圈。

经过实验验证，在本发明的方法和装置中，能够将溶液中的小分子通过声致涡旋递送到超高频谐振器表面，与涂覆在该表面的目标分子的配体结合，达到捕捉和检测溶液中的小分子的目的。

发明人认为，这个意外发现的其中一个原理在于，溶液中可以与配体特异性结合的靶物质小分子要在具有配体的界面表面上与配体结合，如果仅靠靶物质小分子在液体中的自由扩散，与配体接触和结合，需要等待很长的时间；而通过本发明的方法和装置，利用特超声体声波在溶液中形成的涡流(涡流的轨迹的一端与特超声谐振器表面接近或接触)，能够将溶液中的生物小分子迅速递送到特超声谐振器表面，因此大大增强了分子之间的接触机会，极大的加快了结合和被检测的过程。而且，由于不断地将溶液中的待测靶物质小分子持续地输送到涡流范围，进入到涡流范围的小分子被结合到配体上后，其它小分子继续进入；在整个容器中的待测靶物质小分子都有机会进入到涡流中并与配体结合，相当于富集和补充了溶液中的所有待测靶物质小分子。

可见，本发明的方法和装置不但加快生物小分子的检测时间，还可以大大提高检测灵敏度。

实施例4

本发明的方法基于具有超高频谐振器的设备。超高频谐振器的加工采用与半导体工艺兼容的MEMS加工，便于小型化和集成化。本方面提供的设备体积小，操作简化。

本发明提供了一种检测样品中的靶物质的小型便携装置，其结构示意图如图4。所述装置具有外壳101和外壳内的流体腔体102，其具有入口108和出口103。出口103之上放置一个与出口103联通，但与外界隔绝的腔体104。液体样品107可以直接覆盖在入口109之上，例如通过滴管或加样器。用手指施加一定的压力在腔体104之上，使得腔体发生了体积缩小变形；然后将样品107放置在入口108之上，然后轻轻地放开手指，则腔体的体积会恢复原来的大小，在外界大气压的作用下，样品107会被吸入微流道腔体102，然后启动设置在腔体底部的超高频体声波谐振器105，产生涡流106，将样品中的靶物质递送到超高频体声波谐振器的表面，该表面具有可与靶物质特异性结合的配体。可以通过观察窗(图中未示出)来用人眼直接观察被配体捕获的靶物质释放的信号，例如荧光等发光信号，也可用于与外部检测仪器连接。

上述装置中的超高频谐振器具有接收脉冲电压信号的电路。例如，所述超高频谐振器具有接受与外部高频信号发生器连接的电路和接口，所述接口设置在装置外壳上。

又例如，所述超高频谐振器具有接受射频信号的电路。通过无线信号来激发或停止体声波的发射。

所述超高频体声波谐振器可产生高频(约0.5-50GHz)的振动，在溶液中引发相应频率的体声波。在本发明的其中一个方面，所述超高频体声波谐振器为薄膜体声波谐振器(FBAR)或固态装配型谐振器(SMR)，优选为固态装配型谐振器。在本发明的其中又一个方面，所述超高频体声波谐振器为厚度伸缩振动模式的声波谐振器，压电材料薄膜层在垂直方向上生长而制成，通过d33压电系数耦合垂直电场激发振动。本发明采用的超高频体声波谐振器可以在装置和液体的界面产生局部化的声流，不需要耦合介质或结构的帮助。本发明的声波谐振器包括由下往上依次设置的声波反射层、底电极层、压电层及顶电极层。所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射层相重叠区域构成体声波产生区域。所述超高频体声波谐振器的顶部表面配置在流体通道的壁上，向对侧的壁产生传播方向与所述壁垂直的体声波；由所述顶部表面构成的区域可称为体声波作用区域。本发明的超高频体声波谐振器的压电层的厚度范围为约1nm～2um。本发明的超高频体声波谐振器的频率在约0.5-50GHz，优选为约1-10GHz。

所述超高频谐振器产生的体声波功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域的宽度为约50-300μm，例如为约70-150μm。

虽然关于本发明的示例实施例及其优点已经详细说明，应当理解在不脱离本发明的精神和所附权利要求限定的保护范围的情况下，可以对这些实施例进行各种变化、替换和修改。对于其他例子，本领域的普通技术人员应当容易理解在保持本发明保护范围内的同时，工艺步骤的次序可以变化。

此外，本发明的应用范围不局限于说明书中描述的特定实施例的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法及步骤。从本发明的公开内容，作为本领域的普通技术人员将容易地理解，对于目前已存在或者以后即将开发出的工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤，其中它们执行与本发明描述的对应实施例大体相同的功能或者获得大体相同的结果，依照本发明可以对它们进行应用。因此，本发明所附权利要求旨在将这些工艺、机构、制造、物质组成、手段、方法或步骤包含在其保护范围内。

以下论文的全文通过引用在本申请公开。

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Claims (10)

1.一种检测样品中的靶物质的方法，所述方法包括：

在设备中处理待测样品，所述设备包括；容纳溶液的容器；一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述容器的一个壁上，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

2.如权利要求1所述的方法，其中包括检测靶物质携带的可识别的标记的步骤，所述标记例如为荧光或其它形式的(例如化学发光，生物发光，辐射发光，电发光，电化学发光，机械发光，结晶发光，热致发光，声致发光，磷光和光致发光等)发光，酶促反应，放射性等。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物，

例如，其中所述靶物质为生物素或链霉亲和素，或为抗体或抗原。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述超高频体声波谐振器的体声波产生区域面积为约1000-50000μm²，优选为约5000-20000μm²。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述超高频体声波谐振器产生的体声波的功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。

6.用于权利要求1-5中任一项所述的检测样品中的靶物质的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

一个或多个超高频体声波谐振器，其用于设置于流体通道的一个壁上，在所述流体通道产生传向所述流体通道的对侧的壁的频率为约0.5-50GHz的体声波，所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述靶物质和所述配体互为抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化合物、受体/激素、受体/效应物、或阻抑物/诱导物，

例如，其中所述配体为生物素或链霉亲和素，或为抗原或抗体。

8.用于权利要求1-5中任一项所述的检测样品中的靶物质的方法的设备，包括：

容纳溶液的容器；一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述容器的壁上，所述超高频体声波谐振器可产生频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

9.权利要求8所述的设备，其具有功率调节装置，用于调节所述超高频谐振器产生的体声波的功率，优选的，其中所述功率调节装置的输出功率为约0.01-20mW，优选为0.1-10mW，更优选为0.5-5mW。

10.检测样品中的靶物质的装置，所述装置包括：

外壳；

流体通道，其具有入口和出口；

一个或多个超高频体声波谐振器，其设置于所述流体通道的底部，所述超高频体声波谐振器可产生传向所述流体通道顶部的频率为约0.5-50GHz的体声波；所述超高频体声波谐振器的顶部具有与靶物质结合的配体；

所述超高频谐振器发射体声波，使得体声波区域的溶液产生旋流，当溶液中存在所述靶物质时，所述靶物质进入所述旋流，在所述超高频体声波谐振器的顶部与所述配体接触和结合。

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