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CN112029001B - 靶向nk激活性受体的嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向NK激活性受体的新型嵌合抗原受体，其可以治疗由NK细胞病变引起的恶性肿瘤，同时也可以在通用型CAR细胞的背景下避免患者体内NK细胞对引入的治疗性CAR细胞的杀伤。本发明还涉及表达这种新型嵌合抗原受体的工程化免疫细胞、包含其的组合物及其在治疗疾病中的用途。

Description

靶向NK激活性受体的嵌合抗原受体
技术领域
本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及靶向NK激活性受体的嵌合抗原受体、表达此类嵌合抗原受体的工程化免疫细胞及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)细胞疗法作为一种靶向肿瘤的新型精准靶向疗法，近年来已经证明了其在肿瘤治疗，尤其是血液肿瘤治疗方面的良好效果。它的基本原理是在免疫细胞(例如常用的T细胞、NK细胞等)中通过基因工程装载外源性的嵌合抗原受体，经过体外扩增后，再将经修饰的免疫细胞回输至人体，从而对靶向肿瘤细胞进行杀伤。嵌合抗原受体一般由抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区组成，通过抗原结合区与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的结合，将信号经由胞内信号转导区传递至免疫细胞内部，进而激活免疫细胞发挥其效应功能。
NK细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，能够通过多种机制杀伤靶细胞，例如释放穿孔素和颗粒酶引起细胞溶解、通过激活凋亡途径引起细胞凋亡、释放细胞因子直接作用于靶细胞、细胞介导的细胞毒性作用等，在肿瘤免疫、抗病毒感染中均起到重要的作用。NK细胞的活化状态由激活性受体和抑制性受体之间的平衡所决定。正常情况下，识别MHC-I类分子的抑制性受体在平衡中占主导地位，以阻止NK细胞对自身健康细胞的杀伤。但是，当细胞表面MHC-I类分子的表达降低或缺失，或者肿瘤细胞、病毒感染细胞等通过表面抗原与激活性受体结合，都会使活化信号超过抑制信号，进而激活NK细胞杀伤靶细胞。
在通用型CAR-T细胞中，通常需要抑制或敲除MHC-I类分子，例如HLA和B2M以降低宿主对外源引入的CAR-T细胞的免疫排斥。但这种抑制或敲除会使宿主体内的NK细胞活化，导致宿主NK细胞对CAR-T细胞的杀伤，严重影响CAR-T细胞在体内的增殖和存活，进而影响CAR-T细胞的疗效。
因此，需要开发一种新型的嵌合抗原受体，以解决NK细胞对治疗性CAR细胞的杀伤问题。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了一种新型嵌合抗原受体，其包含抗原结合区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合区靶向NK激活性受体。
在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自NKG2家族，优选选自NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H，更优选是NKG2D。在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自天然细胞毒性受体(Natural cytotoxicity receptors,NCR)家族，优选选自NKp30、NKp44、NKp46和NKp80，更优选选自NKp30和NKp46。在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自KIR-S家族，优选选自KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1，更优选KIR2DS4。在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自协同受体，优选选自2B4、DNAM-1、CD2和LFA-1。
在一个实施方案中，所述新型嵌合抗原受体包含第二抗原结合区，其与选自以下的肿瘤抗原结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述靶标选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。
在一个实施方案中，所述抗原结合区是抗体或其功能性片段，包括但不限于免疫球蛋白分子、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fv(sdFv)、抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、所述抗原的天然配体或其功能性片段。
在一个实施方案中，所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。优选地，跨膜结构域选自CD8α、CD4、CD28和CD278的跨膜结构域。
在一个实施方案中，所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。优选地，所述胞内信号传导结构域是包含CD3ζ的信号传导结构域。
在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18(LFA-1)、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、NKG2D、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、CD94、LTB、ZAP70以及它们的组合。在一个优选的实施方案中，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。例如，在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含DAP12的胞内区。更优选地，所述共刺激结构域包含两个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和CD28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB胞内区和DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和DAP12的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区和DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区和DAP12的胞内区。
本发明还提供编码如上所述的新型嵌合抗原受体的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。
在第二个方面，本发明还提供表达如上所述的新型嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。
在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞表达两个嵌合抗原受体，其中第一嵌合抗原受体包含靶向NK激活性受体的第一抗原结合区，第二嵌合抗原受体包含靶向肿瘤抗原的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、dCK、TCR/CD3基因(例如TRAC、TRBC、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ)、MHC相关基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、HLA-DPA、HLA-DQ、HLA-DRA、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA)和免疫检查点基因，如PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。优选地，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA、PD1、LAG3、TIM3、CTLA4。
在一个实施方案中，为减少工程化免疫细胞之间的互相杀伤，所述工程化免疫细胞中被嵌合抗原受体靶向的相应内源性NK激活性受体的表达被抑制或沉默。在一个优选的实施方案中，所述NK激活性受体是NKG2D或NKp46。
在一个实施方案中，所述工程化免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。优选地，所述T细胞是CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞或αβ-T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等。
在一个实施方案中，本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化免疫细胞、核酸分子或载体，和一种多种药学上可接受的赋型剂。
在第三个方面，本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明还提供根据本发明的新型钱和抗原受体、核酸分子、载体、工程化免疫细胞或药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
本发明的新型嵌合抗原受体的优势之处在于通过特异性靶向NK细激活性受体启动对NK细胞的杀伤，一方面可以治疗由NK细胞病变引起的恶性肿瘤，另一方面也可以在通用型CAR细胞的背景下(尤其是在抑制或敲除MHC相关基因的情况下)避免患者体内NK细胞对引入的治疗性CAR细胞的杀伤，从而增强CAR细胞的存活，提高治疗效果。
发明详述
除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
嵌合抗原受体
本发明提供一种新型嵌合抗原受体，其包含抗原结合区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合区靶向NK激活性受体。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原结合区(例如抗体或其抗原结合部分)、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。非MHC限制性的抗原识别给予表达CAR的T细胞与抗原处理无关的识别抗原的能力，因此绕过了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞内表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)的α链和β链二聚化。
如本文所用，“抗原结合区”是指可以与抗原结合的任何结构或其功能性变体。抗原结合区可以是抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体及其功能性片段，或所述抗原的天然配体或其功能性片段。例如，抗原结合区包括但不限于免疫球蛋白分子、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fv(sdFv)、抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体、纳米抗体、所述抗原的天然配体或其功能性片段等，优选选自Fab、scFv、sdAb和纳米抗体。在本发明中，抗原结合区可以是单价或二价，且可以是单特异性、双特异性或多特异性的抗体。
“Fab”是指免疫球蛋白分子被木瓜蛋白酶裂解后产生的两个相同片段中的任一个，由通过二硫键连接的完整轻链和重链N端部分组成，其中重链N端部分包括重链可变区和CH1。与完整的IgG相比，Fab没有Fc片段，流动性和组织穿透能力较高，并且无需介导抗体效应即可单价结合抗原。
“单链抗体”或“scFv”是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过接头连接而成的抗体。可以选择接头的最佳长度和/或氨基酸组成。接头的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的接头(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于接头的大小和组成的选择，参见例如，Hollinger等人,1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，其全文通过引用并入本文。scFv可以包含以任何顺序连接的VH和VL，例如VH-接头-VL或VL-接头-VH。
“单结构域抗体”或“sdAb”是指一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，也称为“重链抗体”。
“纳米抗体”或“Nb”是指单独克隆并表达出来的VHH结构，其具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文所用，术语“NK激活性受体”是指具有基于免疫受体酪氨酸的激活性基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)或与之结合的NK细胞表面受体。大多数NK激活性受体通过其跨膜区的精氨酸或赖氨酸残基与对应的衔接蛋白(例如DAP12、FcεRIγ、CD3ζ等)相结合，从而启动胞内信号转导。NK激活性受体与配体的结合使衔接蛋白包含的ITAM发生酪氨酸磷酸化，进而募集酪氨酸激酶如Syk、Zap70等，传递下游信号，诱导NK细胞活化。
在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自NKG2家族，优选选自NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H，更优选是NKG2D。这些NKG2家族活性受体的胞外段具有高度同源性，大多含有一个C型凝集素样结构域。其中，NKG2E和NKG2H由同一个基因编码，后者是前者的截短序列。NKG2C和NKG2E/H的表达需要与CD94形成异源二聚体，通过结合包含ITAM的DAP12分子，使得ITAM中的两个酪氨酸残基迅速发生磷酸化，进而募集ZAP-70和Syk，导致NK细胞激活。NKG2F的氨基酸序列与NKG2C类似，在跨膜区具有赖氨酸残基，并且也是通过与DAP12结合来传递活化信号。NKG2D的表达非常广泛，在人中不仅表达于所有NK细胞，而且表达于绝大多数γδT细胞和活化的CD8+αβT细胞，在鼠中则表达于所有NK细胞、部分γδT细胞和部分巨噬细胞。NKG2D以同源二聚体的形式表达，其可与两种不同的衔接蛋白DAP10和DAP12结合，经由两种信号途径分别介导不同的功能。一方面，NKG2D可以通过跨膜区的带正电的精氨酸残基与DAP10结合，使DAP10磷酸化，进而通过依赖PI3K的Ras非依赖性的信号传导途径激活NK细胞发挥细胞毒性作用。另一方面，NKG2D也可以结合包含ITAM的DAP12，通过酪氨酸残基的磷酸化募集酪氨酸激酶如Syk和ZAP-70，导致下游信号的传导，诱导细胞因子和趋化因子的释放。
在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的抗原结合区是靶向NKG2D的抗体或其功能性片段，优选靶向NKG2D的Fab、scFv、sdAb和纳米抗体，更优选是靶向NKG2D的scFv。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKG2D抗体，其包含：
(i)分别如SEQ ID NO：61、62和63所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：64、65和66所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)分别如SEQ ID NO：67、68和69所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：70、71和72所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iii)分别如SEQ ID NO：67、68和73所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：74、75和76所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或
(iv)分别如SEQ ID NO：77、78和79所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：80、81和82所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
优选地，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKG2D抗体，其包含与SEQ ID NO：27第1-121位、SEQ ID NO：29第1-109位、SEQ ID NO：31第1-109位或SEQ ID NO：33第1-108所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：27第137-246位、SEQ ID NO：29第122-243位、SEQID NO：31第122-236位或SEQ ID NO：33第121-243位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。更优选地，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKG2D抗体，其包含如SEQ ID NO：27、29、31或33所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，作为NKG2D抗体的替代，本发明的嵌合抗原受体还可以包含NKG2D的天然配体。NKG2D在人中的配体是MIC基因(包括MICA和MICB)和ULBP基因(包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6)，在鼠中的配体是Rae-1、H60和MULT1。MICA和MICB位于MHC基因复合体中HLA-B基因座一侧，其同源性高达91％。ULBP基因在结构上与MHC-I类分子相似，都含有α1和α2结构域，但不含α3功能域和β2微球蛋白。因此，在该实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含以下蛋白或其功能性片段：MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、Rae-1、H60和MULT1。
在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自天然细胞毒性受体(Naturalcytotoxicity receptors,NCR)家族，优选选自NKp30、NKp44、NKp46和NKp80，更优选选自NKp30和NKp46。NKp30是NK细胞发挥杀伤活性的关键因子之一，并且在多种肿瘤及病毒感染时表达水平失调，可能参与了肿瘤及病毒的免疫逃逸。NKp30的胞外段是一个V型免疫球蛋白样结构域，通过一段疏水氨基酸序列与富含精氨酸的跨膜区相连。NKp30与CD3ζ结合，并通过后者的ITAM向胞内传递活化信号。NKp44的胞外区含有一个V型结构域，跨膜区具有与KAPAP/DAP12相结合的带电赖氨酸。虽然NKp44的胞内区含有ITIM，但其缺少抑制功能，并不能减弱DAP12传递的活化信号。研究表明NKp44可与病毒的血凝素结合，发挥NK细胞的抗病毒效应。NKp46的胞外区有两个C2型Ig样结构域，跨膜区含有一个带正电的精氨酸残基，胞内区不含ITAM基序，因此与NKp30类似，其也需要通过与胞内段含有ITAM的CD3ζ和/或FcεRIγ等分子形成复合体，共同向胞内传递活化信号。NKp46表达于所有成熟NK细胞表面，是启动NK细胞杀伤功能的关键性受体。NKp46也能与病毒的血凝素结合，发挥NK细胞的抗病毒效应。NKp80以同源二聚体的形式几乎表达于所有NK细胞表面，与其配体活化诱导的C型凝集素(activation-induced C-type lectin，AICL)结合后能迅速活化NK细胞，提高NK细胞的细胞毒性和分泌炎性细胞因子的能力。
在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的抗原结合区是靶向NKp46的抗体或其功能性片段，优选靶向NKp46的Fab、scFv、sdAb和纳米抗体，更优选是靶向NKp46的scFv。在一个优选的实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKp46抗体，其包含
(i)分别如SEQ ID NO：83、84和85所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：86、87和88所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)分别如SEQ ID NO：89、90和91所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：92、93和94所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iii)分别如SEQ ID NO：95、96和97所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：98、99和100所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iv)分别如SEQ ID NO：101、84和102所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：103、87和104所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或
(v)分别如SEQ ID NO：105、106和107所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：108、109和110所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
优选地，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKp46抗体，其包含与SEQ ID NO：35第1-107位、SEQ ID NO：37第1-107位、SEQ ID NO：39第1-107位、SEQ ID NO：41第1-107位或SEQID NO：43第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：35第123-244位、SEQ ID NO：37第123-238位、SEQ ID NO：39第123-238位、SEQ ID NO：41第123-242位或SEQID NO：43第123-237位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。更优选地，本发明的嵌合抗原受体包含抗NKp46抗体，其包含如SEQ ID NO：35、37、39、41或43所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，作为NKp46抗体的替代，本发明的嵌合抗原受体可以包含NKp46的天然配体。研究发现，NK细胞通过NKp46识别病毒血凝素(hemagglutinin,HA)，并与其发生凝集，进而杀伤流感病毒感染的细胞。此外，NKp46还结合一种可溶性糖蛋白，补体因子P(CFP)。据报道，缺失CFP的患者更容易受到脑膜炎奈瑟球菌的感染，而用CFP治疗这种感染则有赖于NKp46的作用。因此，在该实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含HA或CFP或其功能性片段。
在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自KIR-S家族，优选选自KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1，更优选KIR2DS4。杀伤细胞Ig样受体(KIR)是I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，其结构包括膜外区、跨膜区和胞质区。根据膜外区包含的Ig样结构域的数量，KIR还可以分为KIR2D和KIR3D亚家族。此外，根据胞质区的长短，KIR可以分为长型(KIR-L)和短型(KIR-S)。KIR-S的胞质区不含ITIM，与NCR类似，同样通过带电荷的跨膜残基与衔接蛋白DAP12或FcεRIγ结合，进而招募酪氨酸激酶，并介导下游的活化信号。
在一个实施方案中，所述NK激活性受体选自协同受体，优选选自2B4、DNAM-1、CD2和LFA-1。2B4也称为CD244，是一种膜蛋白，其胞外区具有一个V型免疫球蛋白结构域和一个C2型免疫球蛋白样结构域，跨膜区不含任何带电荷的氨基酸，胞内区含有免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory switch motif,ITSM)，该基序可被衔接蛋白SAP、EAT-2、DRT等的胞质SH2区域识别。DNAM-1也称为CD226，是启动NK细胞发挥功能的主要辅助性活化受体。DNAM-1含有2个免疫球蛋白V样结构域的胞膜外区、1个跨膜区，以及含有酪氨酸和丝氨酸残基潜在磷酸化位点的胞质区。CD2也称为LFA-2，是由327个氨基酸组成的单链糖蛋白，表达于成熟T细胞、大部分胸腺细胞以及部分NK细胞表面。LFA-1由两条多肽链通过非共价键连接而成：α亚单位(CD11a)和β亚单位(CD18)。这些协同受体不能单独活化NK细胞，而是依赖于其他NK激活性受体例如NCR启动激活信号，然后共同参与放大激活信号，更加有效地促进NK细胞活化。本领域已知的靶向2B4、DNAM-1、CD2或LFA-1的抗体，或2B4、DNAM-1、CD2或LFA-1的天然配体及其功能性片段均可用作本发明的嵌合抗原受体的抗原结合区。
在一个实施方案中，除了靶向NK激活性受体的抗原结合区外，本发明的新型嵌合抗原受体还包含第二抗原结合区，其与选自以下的肿瘤抗原结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。优选地，所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、AFP、Folate受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL13Ra2、GD2、NKG2D、EGFRvIII、CS1、BCMA、间皮素和它们的任意组合。本领域已知的靶向上述肿瘤抗原的抗体均可用作本发明中的第二抗原结合区。
在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合区包含靶向CD19的抗体，其包含：
(i)分别如SEQ ID NO：49、50和51所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：52、53和54所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或
(ii)分别如SEQ ID NO：55、56和57所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ IDNO：58、59和60所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
优选地，本发明的嵌合抗原受体包含靶向NK激活性受体的抗体和靶向CD19的抗体，所述靶向CD19的抗体包含与SEQ ID NO：1第1-107位或SEQ ID NO：25第1-107位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：1第123-242位或SEQ ID NO：25第123-238位所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的重链可变区序列。更优选地，本发明的嵌合抗原受体包含靶向NK激活性受体的抗体和靶向CD19的抗体，所述靶向CD19的抗体包含如SEQ ID NO：1或25所示的氨基酸序列。
术语“功能性变体”或“功能性片段”是指基本上包含亲本的氨基酸序列但与该亲本氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)的变体，条件是所述变体保留亲本氨基酸序列的生物活性。在一个实施方案中，所述氨基酸修饰优选是保守型修饰。
如本文所用，术语“保守性修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
因此，“功能性变体”或“功能性片段”与亲本氨基酸序列具有至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且保留亲本氨基酸的生物活性，例如结合活性。
如本文所用，术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154及其功能性片段。或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD8α链或CD28，其与SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:4或6所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还可以包含位于配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链区。如本文所用，术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至配体结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为配体结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链区包含CD8α链、CD28、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选来自CD8α、CD28或IgG4的铰链，其与SEQ ID NO:19、21或23所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或者其编码序列与SEQ ID NO:20、22或24所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
如本文所用，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行指定功能的蛋白质部分。胞内信号传导结构域负责在配体结合结构域结合抗原以后的细胞内初级信号传递，从而导致免疫细胞和免疫反应的活化。换言之，胞内信号传导结构域负责活化其中表达CAR的免疫细胞的正常的效应子功能的至少一种。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含的胞内信号传导结构域可以是T细胞受体和共受体的细胞质序列，其在抗原受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞内信号传导结构域可以包含许多免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-basedActivation Motifs,ITAM)。本发明的胞内信号传导结构域的非限制性施例包括但不限于源自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，本发明CAR的信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域，该信号传导结构域与SEQ ID NO:11或13所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:12或14所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，其包含所述共刺激分子的整个细胞内部分，或其功能片段。“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应(例如增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域的非限制性施例包括但不限于源自以下蛋白质的共刺激信号传导结构域：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18(LFA-1)、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM1)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、CD94、LTB以及ZAP70以及它们的组合。
在一个优选的实施方案中，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。例如，在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含DAP12的胞内区。更优选地，所述共刺激结构域包含两个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和CD28的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含4-1BB的胞内区和DAP12的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区和DAP10的胞内区。在一个实施方案中，所述共刺激结构域包含CD28的胞内区和DAP12的胞内区。
在一个实施方案中，4-1BB的胞内区与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，CD28的胞内区与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，DAP10的胞内区与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:46所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一个实施方案中，DAP12的胞内区与SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或其编码序列与SEQ ID NO:48所示的核苷酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自CD8α、IgG1、GM-CSFRα、B2M等的信号肽。在一个实施方案中，可用于本发明的信号肽与SEQ ID NO:15或17所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或该信号肽的编码序列与SEQ ID NO:16或18所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。
在一个实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。
核酸和载体
本发明还提供编码如上所述的新型嵌合抗原受体的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。
如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA，更优选mRNA。
核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链CAR可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一个实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。
可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。
如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV、多瘤病毒和腺相关病毒(AAV)等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
工程化免疫细胞
在第二个方面，本发明还提供表达如上所述的新型嵌合抗原受体的工程化免疫细胞。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞。在一个实施方案中，免疫细胞衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离从受试者的血液获得T细胞。
在一个实施方案中，除了靶向NK激活性受体的嵌合抗原受体外，所述工程化免疫细胞还表达包含第二抗原结合区的第二嵌合抗原受体，其中第二抗原结合区的定义如上所述。
采用本领域已知的常规方法(如通过转导、转染、转化等)可以将编码嵌合抗原受体的核酸序列以及外源性基因引入免疫细胞。“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。将核酸或载体引入免疫细胞后，本领域技术人员可以通过常规技术对所得免疫细胞进行扩增和活化。
在一个实施方案中，为减少移植物抗宿主病的风险，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、dCK、TCR/CD3基因(例如TRAC、TRBC、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ)、MHC相关基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、HLA-DPA、HLA-DQ、HLA-DRA、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA)和免疫检查点基因，如PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。优选地，所述工程化免疫细胞还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA、PD1、LAG3、TIM3、CTLA4，更优选TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA。
在一个实施方案中，为减少工程化免疫细胞之间的互相杀伤，所述工程化免疫细胞中被嵌合抗原受体靶向的相应内源性NK激活性受体的表达被抑制或沉默。例如，在靶向NKG2D的工程化免疫细胞(例如CAR-T或CAR-NK细胞)中，其内源性NKG2D的表达被抑制或沉默；靶向NKp46的工程化免疫细胞(例如CAR-T或CAR-NK细胞)中，其内源性NKp46的表达被抑制或沉默。
抑制基因表达或使基因沉默的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用反义RNA、RNA诱饵、RNA适体、siRNA、shRNA/miRNA、反式显性阴性蛋白(TNP)、嵌合/融合蛋白、趋化因子配体、抗感染性细胞蛋白、细胞内抗体(sFv)、核苷类似物(NRTI)、非核苷类似物(NNRTI)、整合酶抑制剂(寡核苷酸、二核苷酸和化学剂)和蛋白酶抑制剂来抑制基因的表达。另外，也可以通过例如大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE核酸酶或CRISPR系统中的Cas酶介导DNA断裂，从而使基因沉默。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的嵌合抗原受体、核酸分子、载体或工程化免疫细胞作为活性剂，和一种多种药学上可接受的赋型剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。
根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
治疗应用
本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的免疫细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述嵌合抗原受体、核酸分子、载体、工程化免疫细胞以及药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
在一个实施方案中，直接向受试者施用有效量的本发明的免疫细胞和/或药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明的治疗方法是离体治疗。具体地，该方法包括以下步骤：(a)提供样品，所述样品包含免疫细胞；(b)在体外将本发明的嵌合抗原受体以及外源性基因(如果存在)引入所述免疫细胞，并任选地抑制或沉默所述免疫细胞中特定基因的表达(如果需要)，获得经修饰的免疫细胞，(c)向有此需要的受试者施用所述经修饰的免疫细胞。优选地，步骤(a)中提供的免疫细胞选自巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞和/或NKT细胞；并且所述免疫细胞可以通过本领域已知的常规方法从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，也可以使用能够表达本发明的嵌合抗原受体并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它免疫细胞。此外，通常选择的免疫细胞与受试者的免疫系统相容，即优选所述免疫细胞不引发免疫原性响应。例如，可以使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的可在体外生长和扩增的淋巴细胞。使用此类细胞将不需要获得和/或提供受试者自身淋巴细胞。步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入免疫细胞或通过用病毒载体感染免疫细胞来实施，所述病毒载体为如前所述的慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时RNA转染。
在一个实施方案中，所述免疫细胞是自体或同种异体的细胞，优选T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，更优选T细胞、NK细胞或NKT细胞。
如本文所用，术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。
如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。
如本文所用，术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。
在一个实施方案中，所述癌症选自：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤等)、NK细胞淋巴瘤、侵袭性NK细胞白血病、白血病(包括急性白血病，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病诸如急性粒细胞白血病(包括未分化型和部分分化型)、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、红白血病、急性巨核细胞白血病；慢性白血病，例如慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞白血病；和其他特殊类型的白血病例如毛细胞白血病、幼淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、成人T细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病等)、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、恶性淋巴组织增生疾病、骨髓发育不良、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)。优选地，可以用本发明的工程化免疫细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。
在一个实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。
在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
图1：实施例1中构建的CAR结构示意图。
图2：包含不同NKG2D scFv的CAR-T细胞中的scFv表达水平。
图3：包含不同NKG2D scFv的CAR-T细胞对NK92细胞的杀伤效果。
图4：靶向NKG2D的CAR-T细胞中的scFv表达水平。
图5：靶向NKG2D的CAR-T细胞对NK92细胞的杀伤效果。
图6：靶向NKG2D的CAR-T细胞与NK92细胞共培养后的CD107表达水平。
图7：靶向NKG2D的CAR-T细胞的细胞因子释放水平。
图8：其中内源性NKG2D被敲除的靶向NKG2D的CAR-T细胞群体中的CD8+T细胞比例。
图9：NKG2D-CD19双靶点CAR-T细胞中的scFv表达水平。
图10：NKG2D-CD19双靶点CAR-T细胞对NK92细胞和Nalm6细胞的杀伤效果。
图11：NKG2D-CD19双靶点CAR-T细胞与Nalm6细胞共培养后的CD107表达水平。
图12：NKG2D-CD19双靶点CAR-T细胞与NK92细胞共培养后的CD107表达水平。
图13：NKG2D-CD19双靶点CAR-T细胞与Nalm6细胞和NK92细胞共培养后的细胞因子释放水平。
图14：包含不同NKp46scFv的CAR-T细胞中的scFv表达水平。
图15：包含不同NKp46scFv的CAR-T细胞对NK92细胞的杀伤效果。
图16：NKp46-CD19双靶点CAR-T细胞中的scFv表达水平。
图17：NKp46-CD19双靶点CAR-T细胞对NK92细胞和Nalm6细胞的杀伤效果。
图18：NKp46-CD19双靶点CAR-NK细胞对NK92细胞和Nalm6细胞的杀伤效果。
图19：其中内源性NKp46被敲除的NKp46-CD19双靶点CAR-NK细胞对NK92细胞和Nalm6细胞的杀伤效果。
具体实施方式
本发明所有实施例中使用的T细胞是通过Ficoll-PaqueTM PREMIUM(GEHealthcare，货号17-5442-02)采用白细胞分离术从健康供体分离的原代人CD4+CD8+T细胞。
以下实施例中所用的scFv序列、其包含的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)在相应scFv中的位置，以及其包含的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0002661862920000261
实施例1.制备包含不同scFv的CAR T细胞并验证功能
1.1 CAR T细胞制备
合成编码以下蛋白的序列，并将其克隆至pLVX载体(Public Protein/PlasmidLibrary(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：17)、抗NKG2D scFv、CD8α铰链区(SEQ ID NO：19)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：3)、4-1BB胞内区(SEQ ID NO：9)、CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：11)，并通过测序确认目标序列的正确插入。其中，NKG2D-1CAR包含的抗NKG2D scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；NKG2D-2CAR包含的抗NKG2D scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；NKG2D-3CAR包含的抗NKG2D scFv的氨基酸序列如SEQ IDNO：31所示；NKG2D-4CAR包含的抗NKG2D scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。
在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco，货号31985-070)稀释上述质粒后，再根据质粒:病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体psPAX2(Addgene，货号12260)和包膜载体pMD2.G(Addgene，货号12259)。然后，加入120ul X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。
用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco,货号40203D)激活T细胞，并在37℃和5％CO2下培养1天。然后，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得表达不同scFv的CAR T细胞。未经修饰的野生型T细胞用作阴性对照(NT)。结果如图2所示
可以看出，本发明制备的CAR T细胞中的scFv均可以有效表达。
1.2 CAR-T细胞对NK92靶细胞的杀伤效果
为了检测CAR-T细胞体外较长久的杀伤能力，首先以5x105/孔将NK92靶细胞铺入24孔板中，然后分别以2：1的效靶比(即效应T细胞与靶细胞之比)将表达如上制备的表达不同scFv的CAR T细胞铺入24孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图3所示。
可以看出，包含靶向NKG2D的4个不同scFv的CAR T细胞对NK92细胞均具有显著杀伤，其中NKG2D-1CAR T细胞的杀伤能力最强，将其用于后续实验，并重命名为2Dbbz-CAR T细胞。
实施例2：CAR T细胞制备及对NK92靶细胞的杀伤效果和细胞因子释放
2.1 CAR T细胞制备
合成编码以下蛋白的序列，并将其克隆至pLVX载体(Public Protein/PlasmidLibrary(PPL)，货号:PPL00157-4a)：CD8α信号肽(SEQ ID NO：17)、抗NKG2D scFv(SEQ IDNO：27)、CD8α铰链区(SEQ ID NO：19)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO：3)、共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：11)，其中共刺激结构域包含CD28胞内区(SEQ ID NO：7)，或4-1BB胞内区(SEQ ID NO：9)+DAP10胞内区(SEQ ID NO：45)，获得2D28z-CAR和2Dbb10z-CAR，并通过测序确认目标序列的正确插入。图1示出了本实施例中构建的CAR结构。
根据实施例1所述的方法完成CAR T细胞的制备，并使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs SrProt)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BDPharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测2Dbbz-CAR T细胞、2D28z-CAR T细胞、2Dbb10z-CAR T细胞上的scFv的表达水平，结果如图4所示。
可以看出，本发明制备的CAR T细胞中的scFv均可以有效表达。
2.2 CAR-T细胞对NK92靶细胞的杀伤效果
为了检测CAR-T细胞体外较长久的杀伤能力，首先以5x105/孔将NK92靶细胞铺入24孔板中，然后分别以2：1的效靶比(即效应T细胞与靶细胞之比)将表达2Dbbz-CAR、2D28z-CAR和2Dbb10z-CAR的CAR-T细胞铺入24孔板进行共培养(D0)，并分别在D2、D4和D8按照2：1的效靶比持续加入靶细胞，然后于D2和D10采用PE-mouse anti-human CD56通过流式细胞仪检测NK92细胞的残留，以此计算CAR T细胞的杀伤率，结果如图5所示。
可以看出，与NT相比，三种CAR T细胞对NK92靶细胞均具有显著的特异性杀伤。且随着培养时间的延长，2Dbbz-CAR T细胞的杀伤活性逐渐变弱，而2Dbb10z-CAR T细胞仍能维持较高的杀伤能力，在D10两者的杀伤活性出现显著性差异。这表明，DAP10胞内区作为共刺激结构域的加入能显著提高CAR T细胞杀伤活性的持续性。
2.3检测CD107a的表达
细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒，溶酶体相关膜蛋白I(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。CTL细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子被转运到细胞膜表面)，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。因此，CD107a分子是CTL细胞脱颗粒的一种敏感标志，可反应细胞杀伤活性。
以1x105个细胞/孔的浓度将靶细胞(NK92细胞)铺于96孔板中，然后每孔以1:1的比例加入本发明的CAR-T和NT细胞，同时加入10μl PE-anti-human CD107a(BDPharmingen，货号555801)，于37℃，5％CO2培养条件下共培养。1h后，加入Goigstop(BDPharmingen，货号51-2092KZ)继续孵育2.5小时。然后向每孔加入5μl APC-anti human CD8(BD Pharmingen，货号：555369)和5μl FITC-anti human CD4(BD Pharmingen，货号：561005)，于37℃孵育30分钟后，用流式细胞仪检测CD107a的表达情况，结果如图6所示。
可以看出，本发明制备的2Dbbz-CAR T细胞、2D28z-CAR T和2Dbb10z-CAR T细胞与靶细胞共培养后，CD107a的表达显著上调，表明本发明的CAR-T细胞可显著杀伤NK细胞。此外，2Dbb10z-CAR T细胞在CD8+T细胞中的CD107a表达显著高于2Dbbz-CAR T细胞，表明2Dbb10z-CAR T细胞比2Dbbz-CAR T细胞有着更强的杀伤能力。
2.4 CAR-T细胞的细胞因子释放
T细胞杀伤靶细胞时，靶细胞数量减少的同时也会释放细胞因子IL-2和IFN-γ等。根据以下步骤，使用酶联免疫吸附法(ELISA)来测定CAR T细胞杀伤靶细胞时细胞因子IL-2和IFN-γ的释放水平。
(1)收集细胞共培养上清液
以1x105/孔的浓度将靶细胞NK92铺于96孔板中，然后以1:1的比例将本发明的CART细胞和NT细胞分别与靶细胞共培养，18-24小时后收集细胞共培养上清液。
(2)ELISA检测上清中IL-2和IFN-γ的分泌量
使用捕获抗体Purified anti-human IL2 Antibody(Biolegend，货号500302)或Purified anti-human IFN-γAntibody(Biolegend，货号506502)包被96孔板4℃孵育过夜，然后移除抗体溶液，加入250μL含有2％BSA(sigma，货号V900933-1kg)的PBST(含0.1％吐温的1XPBS)溶液，37℃孵育2小时。然后用250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)清洗板3次。每孔加入50μL细胞共培养上清液或标准品，并在37℃孵育1小时，然后用250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)清洗板3次。然后向各孔分别加入50μL检测抗体Anti-Interferongamma抗体[MD-1](Biotin)(abcam，货号ab25017)，在37℃孵育1小时后，用250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)清洗板3次。再加入HRP Streptavidin(Biolegend，货号405210)，在37℃孵育30分钟后，弃上清液，加入250μL PBST(含0.1％吐温的1XPBS)，清洗5次。向各孔加入50μL TMB底物溶液。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向各孔中加入50μL 1mol/L HSO以停止反应。在停止反应的30分钟内，使用酶标仪检测450nm处吸光度，并根据标准曲线(根据标准品的读值和浓度绘制)计算细胞因子的含量，结果如图7所示。
可以看出，本发明的2Dbbz-CAR T细胞、2D28z-CAR T和2Dbb10z-CAR T细胞的细胞因子释放水显著高于对照的NT细胞。此外，2Dbb10z-CAR T细胞的IL-2和IFN-γ的释放水平均显著低于2Dbbz-CAR T细胞，这表明前者的安全性优于后者，因为过高的细胞因子释放可能导致严重的副作用，例如细胞因子风暴。
以上结果表明，靶向NK激活性受体的CAR-T细胞能够持续有效的杀伤NK细胞。此外，与传统的仅包含4-1BB共刺激结构域的CAR相比，进一步包含DAP10胞内区可以提高CAR-T细胞的持续杀伤活性，同时分泌较少的细胞因子，提高安全性。
实施例3.制备其中靶向的NK激活性受体被敲除的CAR-T细胞
通过CRISP/Cas9系统敲除NT、2Dbbz-CAR T细胞、2D28z-CAR T和2Dbb10z-CAR T细胞中的内源性NKG2D，并通过流式细胞仪用PE mouse anti-human NKG2D(biolegend货号302806)检测敲除后CAR T细胞中的NKG2D的表达水平(表1)，用APC-anti human CD8(BDPharmingen，555369)检测CAR-T细胞中CD8+T细胞的比例(图8)。未敲除的NT细胞作为对照。
表1.CAR-T细胞中的NKG2D表达水平
基因名称 2DbbzKO-CAR 2Dbb10zKO-CAR 2D28zKO-CAR NT
NKG2D 5.00％ 6.20％ 6.50％ 39.40％
表1的结果表明，NKG2D在各CAR-T细胞中均被有效敲除。
从图8可以看出，当表达靶向NKG2D的CAR时，进一步敲除内源性NKG2D可显著提高CAR T细胞群体中CD8+T细胞比例，这可能是由于降低了CAR-T细胞之间的互相杀伤。由于CD8+T细胞是细胞毒性淋巴细胞，因此这种升高的CD8+T细胞比例可以在总体上增强CAR T细胞的体内体外杀伤效果。
实施例4.制备双靶点CAR-T细胞并验证其功能
根据实施例1中所述的方法制备19CAR T细胞和2D19CAR T细胞。19CAR T细胞与2Dbbz-CAR T细胞的区别仅在于用抗CD19scFv(SEQ ID NO：1)替代抗NKG2D scFv。2D19CART细胞与2Dbbz-CAR T细胞的区别仅在于CAR进一步包含抗CD19scFv。
此外，还通过CRISP/Cas9系统制备了其中TCR和MHC相关基因(例如HLA-I类分子，如B2M和HLA-II类分子，如RFX5)被敲除的通用型CAR-tKO T细胞，并用FITC Mouse Anti-Human CD3(BD Pharmingen，货号555916)抗体、PE mouse anti-human HLA-I(R&D货号FAB7098P)和APC anti-human DR,DP,DQ(biolegend，货号361714)抗体，通过流式细胞仪检测敲除后的CAR T细胞中的TCR/CD3(TCRα)、HLA-I(B2M)、HLA-II(RFX5)的表达效率，结果如下表2所示。未敲除的NT细胞作为对照。
表2.CAR-T细胞中TCR和MHC相关基因的表达水平
敲除基因名称 TCR/CD3 HLA-I(B2M) HLA-II(RFX5)
19CAR-tKO 5.60％ 14％ 11％
2D19CAR-tKO 3.90％ 16.30％ 10.40％
NT 97％ 98％ 82％
表2的结果表明，TCR/CD3、HLA-I和HLA-II基因在各CAR-T细胞中均被有效敲除。
此外，还用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测CAR-T细胞上的scFv的表达水平，结果如图9所示。
可以看出，本实施例制备的CAR T细胞中的scFv均可以有效表达，并且敲除TCR和MHC相关基因不会影响CAR的表达。
根据实施例1中1.2所述的方法检测上述细胞对NK92靶细胞的杀伤效果，同时按照以下方法检测CAR T细胞对靶细胞Nalm6的杀伤能力：首先以1x104/孔将携带荧光素基因的Nalm6靶细胞铺入96孔板中，然后以4:1的效靶比(即效应T细胞与靶细胞之比)将CAR T细胞和未转染T细胞(NT)铺入到96孔板进行共培养，16-18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图10所示。
可以看出，19CAR T细胞和2D19CAR T细胞对Nalm6均有明显的杀伤。仅包含抗CD19scFv的两种CAR-T细胞由于不能识别NK92，因此对其没有杀伤；而包含抗NKG2D scFv的2D19CAR T细胞和2D19CAR-tKO T细胞均能有效杀伤NK92细胞。此外，与2D19CAR T细胞相比，TCR/MHC相关基因敲除的2D19CAR-tKO T细胞对靶细胞的杀伤有所下降，可能是因为在CAR-T细胞杀伤NK细胞的同时，这些基因的敲除也使得NK细胞对CAR-T细胞产生了一定程度的杀伤。
根据实施例2中2.3所述的方法检测上述细胞分别与靶细胞Nalm6(表达CD19)和NK92(表达NKG2D)共培养后的CD107a表达水平，结果如图11和图12所示。可以看出，与NT细胞相比，19CAR T细胞和19CAR-tKO T细胞仅在与Nalm6共培养后检测到显著升高的CD107a水平；2D19CAR T细胞和2D19CAR-tKO T细胞与Nalm6和NK92细胞共培养后均能检测到显著升高的CD107a水平。
根据实施例2中2.4所述的方法检测上述细胞与分别靶细胞Nalm6(表达CD19)和NK92(表达NKG2D)共培养后的IFN-γ释放水平，结果如图13所示。可以看出，仅包含抗CD19scFv的CAR-T细胞只在与Nalm6共培养后检测到显著升高的IFN-γ水平，而在与不表达CD19的NK92细胞共培养后几乎检测不到IFN-γ的释放。然而，包含抗CD19scFv和抗NKG2DscFv两者的CAR-T细胞则在与两种靶细胞共培养后均可以检测到IFN-γ的释放。
以上结果表明，本发明制备的识别CD19和NKG2D双靶点的CAR-T细胞以及其中MHC相关基因被敲除的通用型CAR-T细胞均能够有效杀伤表达CD19或NKG2D的靶细胞。这种同时靶向NK激活性受体和肿瘤抗原的双靶点CAR设计使得一方面可以杀伤NK细胞从而延长CAR-T细胞的存活，同时另一方面高效地对表达肿瘤抗原的靶细胞进行杀伤。
实施例5.制备包含靶向NKp46的不同scFv序列的CAR细胞并验证其功能
根据实施案例1的方法制备CAR T细胞，其与2Dbbz-CAR T细胞的区别仅在于用抗NKp46scFv替代抗NKG2D scFv。其中，NKp46-1CAR包含的抗NKp46scFv的氨基酸序列如SEQID NO：35所示；NKp46-2CAR包含的抗NKp46scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示；NKp46-3CAR包含的抗NKp46scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示；NKp46-4CAR包含的抗NKp46scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示；NKp46-5CAR包含的抗NKp46scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示。
使用Biotin-SP(long spacer)AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,F(ab')Fragment Specific(min X Hu,Bov,Hrs Sr Prot)(jackson immunoresearch，货号115-065-072)作为一抗，APC Streptavidin(BD Pharmingen，货号554067)或PE Streptavidin(BD Pharmingen，货号554061)作为二抗，通过流式细胞仪检测CAR-T细胞上的scFv的表达水平，结果如图14所示。
可以看出，包含不同NKp46scFv的CAR-T细胞均可有效表达scFv。
根据实施例1中1.2所述的方法检测上述CAR T细胞对NK92细胞的杀伤效果，结果如图15所示。可以看出，包含靶向NKp46的5个不同scFv的CAR T细胞对NK92细胞均具有显著杀伤，其中NKp46-5-CAR T细胞的杀伤能力最强，将其用于后续实验，并重命名为46CAR-T细胞。
发明人还制备了靶向NKp46和CD19双靶点的4619CAR-T细胞，其与2D19bbz-CAR T细胞的区别仅在于用抗NKp46scFv(SEQ ID NO:43)替代抗NKG2D scFv。通过流式细胞仪检测19CAR-T细胞、46CAR-T细胞和4619CAR-T细胞中的scFv表达，结果如图16所示。根据实施例1中所述的方法检测上述三种CAR T细胞对NK92细胞和Nalm6的杀伤效果，结果如图17所示。
可以看出，19CAR-T细胞、46CAR-T细胞和4619CAR-T细胞中的CAR均可有效表达，并且46CAR T细胞仅对NK92靶细胞有杀伤，19CAR T细胞仅对Nalm6靶细胞有杀伤，而4619CART对两种靶细胞均能有效杀伤。
实施例6.制备靶向NKp46的CAR-NK细胞并验证其功能
制备靶向NKp46、CD19或两者的CAR-NK细胞，以及其中NKp46被敲除的KO-CAR NK细胞，方法如下：首先通过CRISPR/Cas9系统敲除NK92细胞中的内源性NKp46，并通过流式细胞仪确认NK92细胞中的NKp46被有效敲除(表3)。
表3.敲除前后NK92细胞中的NKp46表达水平
基因名称 NK92KO NK92
NKp46 23.00％ 92.00％
然后，根据实施例1中的病毒包装方法将包含CD19scFv(SEQ ID NO:1)的19CAR、包含NKp46scFv(SEQ ID NO:43)的46CAR以及包含CD19scFv(SEQ ID NO:1)和NKp46scFv(SEQID NO:43)的4619CAR载体用病毒包装完毕后，将病毒分别和NK92细胞或NK92KO细胞离心共感染(1000g，90min)，获得19CAR NK、46CAR NK、4619CAR NK和19KO-CAR NK、46KO-CAR NK、4619KO-CAR NK细胞。
根据实施例2和实施例3中所述的方法检测上述CAR-NK细胞对NK92细胞和Nalm6细胞的杀伤效果，结果如图18和图19所示。可以看出，46CAR NK细胞和46KO-CAR NK仅对NK92靶细胞有杀伤，19CAR NK和19KO-CAR NK细胞仅对Nalm6靶细胞有杀伤，而4619CAR NK和4619KO-CAR NK对两种靶细胞均能有效杀伤。
需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120> 靶向NK激活性受体的嵌合抗原受体
<130> BHCN25
<160> 110
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 scFv-1
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 scFv-1
<400> 2
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720
tcctca 726
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 3
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
20 25
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α跨膜结构域
<400> 4
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaa 75
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 5
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 6
ttttgggtcc tcgtcgtagt tggaggggta cttgcctgtt atagcctcct ggttaccgta 60
gcatttatta tattctgggt g 81
<210> 7
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 7
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 8
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28共刺激结构域
<400> 8
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 9
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
1 5 10 15
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 10
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 60
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 120
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 11
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 12
<211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 12
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 13
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 13
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Phe Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
65 70 75 80
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Phe Gln Gly Leu Ser
85 90 95
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Phe Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
100 105 110
Pro Arg
<210> 14
<211> 342
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 14
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctttaacg agctcaatct aggacgaaga gaggagttcg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 180
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 240
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc cttttccagg gtctcagtac agccaccaag 300
gacacctttg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 342
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B2M信号肽
<400> 15
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala
20
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> B2M信号肽
<400> 16
atgtcccgct ctgttgcttt ggctgtgctg gcccttttgt cccttagcgg actggaggcc 60
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 17
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 18
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 19
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α铰链区
<400> 19
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 20
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8α铰链区
<400> 20
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 21
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 21
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 22
<211> 117
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD28铰链区
<400> 22
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG4铰链区
<400> 24
gaaagcaaat acgggccgcc gtgtccaccc tgtccg 36
<210> 25
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 scFv-2
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Met Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu Thr Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Lys Val Ser Gly Asp Thr Ile Thr Phe Tyr Tyr Met His Phe Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu
165 170 175
Asp Glu Ser Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Lys Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr Tyr
210 215 220
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 26
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD19 scFv-2
<400> 26
gacatccaga tgacccagag ccctgccagc ctgtctacca gcctgggcga gacagtgacc 60
atccagtgtc aggccagcga ggacatctac tctggcctgg cttggtatca gcagaagccc 120
ggcaagagcc ctcagctgct gatctacggc gccagcgacc tgcaggacgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggaacccag tacagcctga agatcaccag catgcagacc 240
gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcaa ggcctgacct accctagaac cttcggagga 300
ggcaccaagc tggaactgaa gggcggaggc ggaagtggag gcggaggatc tggcggcgga 360
ggctctgaag tgcagctgca gcagtctggc gctgaactgg tccggcctgg cactagcgtg 420
aagctgtcct gcaaggtgtc cggcgacacc atcaccttct actacatgca cttcgtgaag 480
cagaggccag gacagggcct ggaatggatc ggcagaatcg accctgagga cgagagcacc 540
aagtacagcg agaagttcaa gaacaaggcc accctgaccg ccgacaccag cagcaacacc 600
gcctacctga agctgtctag cctgacctcc gaggacaccg ccacctactt ttgcatctac 660
ggcggctact acttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcaccgtgtc cagc 714
<210> 27
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-1
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro
180 185 190
Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 28
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-1
<400> 28
caggtccagt tggttgaaag tggaggaggg ttggtgaaac ccggaggatc cttgcgactg 60
tcttgcgcag ctagtggctt cacgttcagt tcctatggca tgcattgggt gagacaagct 120
cctggtaaag gcttggaatg ggtggccttc ataaggtatg acggttcaaa taaatattac 180
gccgactccg tcaagggtcg atttaccatt tccagggaca attcaaaaaa tacattgtac 240
ttgcagatga atagccttag agcggaggac acggccgtct actactgcgc gaaggatcga 300
gggttgggcg acggcactta ctttgactac tggggacagg gaacgacggt cacagtctcc 360
tcaggcggtg gtgggagcgg tggtggagga agtggaggtg gtggttcaca gtccgcactc 420
actcagccag cgtccgttag tggttcccct ggccagagta tcaccattag ttgcagtggc 480
agttcctcaa atattgggaa taacgcagtg aattggtatc agcaattgcc tggcaaagcg 540
cccaaattgc ttatttatta cgacgatctc cttccctctg gagtttccga tcggttctca 600
ggctctaaga gcggtacctc tgcgtttctc gccatatctg gtcttcaatc agaagatgaa 660
gccgactatt actgcgctgc atgggatgac agccttaatg gtccggtttt tgggggcgga 720
accaaactta cagtcctg 738
<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-2
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Thr Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly
165 170 175
Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Glu Leu Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 30
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-2
<400> 30
gaaatcgttc ttacacaaag ccctggtact ttgtctctgt cccctggaga gcgagcgact 60
ctgagctgta gagcatccca atctgttagt agcagttacc tggcttggta ccaacagaaa 120
ccaggccagg cgccgcgctt gctcatttac ggtgctagta gtagagcaac aggaatcccc 180
gaccgcttta gtgggtcagg aagtggtact gactttacgc tgacgatcag cagactggaa 240
ccagaggatt tcgccgttta ttactgccaa cagtatggca gttcaccctt caccttcgga 300
cctggtacaa aagtggacat taaacgaggt gggggaagcg gaggagggtc aggaggtggt 360
tcagaggttc agctcgtgga gagtgggggt ggcgtagtac gaccaggtgg ttccctccga 420
ctgagctgcg ccgctagtgg ttttactttc gacgattacg gaatgacctg ggtcaggcaa 480
gcaccaggca agggtttgga gtgggtttct gggattaact ggaatggggg ttctacggga 540
tacgcagact ctgttaaggg gcggtttaca atatcacgag ataacgctaa aaactccttg 600
tatttgcaga tgaacagttt gcgggctgaa gacactgctc tttactactg cgcacgggaa 660
cgagaattgt actattatta ttacgggctc gatgtttggg gccaagggac aacagtgact 720
gtttccagc 729
<210> 31
<211> 236
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-3
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val His Leu Gln Glu Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
130 135 140
Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln
145 150 155 160
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly
165 170 175
Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val
180 185 190
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala
195 200 205
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn
210 215 220
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 32
<211> 708
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-3
<400> 32
gaaattgtgc ttacccagtc ccctggcaca ctcagcctca gtccagggga acgcgcgacg 60
ctgtcatgta gggcctcaca atctgtgagt tccagctatc tggcgtggta tcagcaaaag 120
ccgggtcaag cccctcgctt gcttatttac ggagcaagca gtagagccac tggtattcct 180
gatcgcttca gcggcagcgg aagcggcacc gacttcacgt tgaccattag ccggcttgaa 240
ccggaagatt ttgcagttta ctattgccaa caatatgggt cctctccctg gactttcgga 300
caggggacga aggtggaaat aaagcgaggg ggcggcagtg gcggaggcag tggaggagga 360
agccaagtac acctgcagga atctggcccg ggtctcgtca aaccttccga aacattgagt 420
cttacttgta cagtttcaga tgatagcatt tccagctact attggtcttg gattaggcaa 480
ccccccggaa aaggtttgga atggattggt cacattagtt attcagggtc agctaattat 540
aatccttctt tgaaatcaag ggtaacaata tcagtggaca cgagtaaaaa ccagtttagt 600
cttaaactta gcagcgtaac agcagcggat actgccgtat attactgtgc aaattgggac 660
gacgccttta atatctgggg acaggggacg atggttacgg tatctagc 708
<210> 33
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKGD scFv-4
<400> 33
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
115 120 125
Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Asn
130 135 140
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
165 170 175
Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
180 185 190
Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
195 200 205
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg Leu Thr Met Phe Arg Gly
210 215 220
Ile Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Val Ser Ser
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gggaccaagg ttgaaatcaa gaggggaggc ggttccggcg gaggatcagg aggaggctca 360
gaagttcagt tggtgcaatc tggagcggag gtaaaagaac cgggggaatc attgaaaata 420
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ccgggtaagg gactggagtg gatggggata atctatccag gcgactcaga cactcgctat 540
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile
145 150 155 160
Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr
165 170 175
Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser Arg Ile Ser Ile
180 185 190
Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val
195 200 205
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210 215 220
Gly Ser Ser Trp Gly Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln
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Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys
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Ser Ala Val Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
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Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Thr Met His Trp Val Lys
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Leu Ala Trp Cys Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
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Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile
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Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr
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Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile
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Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val
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Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Cys Trp Asp Tyr
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Ala Leu Tyr Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
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Ser Ser
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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
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Ser Gly Ile Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
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Asp Asp Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Gly Gly Arg Phe Asp Asp
1 5

Claims (20)

1.一种新型嵌合抗原受体，其包含抗原结合区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述嵌合抗原受体包含靶向NKG2D或NKp46的抗体，所述靶向NKG2D的抗体包含:
(i)分别如SEQ ID NO：61、62和63所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：64、65和66所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)分别如SEQ ID NO：67、68和69所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：70、71和72所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iii)分别如SEQ ID NO：67、68和73所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：74、75和76所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或
(iv)分别如SEQ ID NO：77、78和79所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：80、81和82所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
所述靶向NKp46的抗体包含：
(i)分别如SEQ ID NO：83、84和85所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：86、87和88所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(ii)分别如SEQ ID NO：89、90和91所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：92、93和94所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iii)分别如SEQ ID NO：95、96和97所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：98、99和100所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；
(iv)分别如SEQ ID NO：101、84和102所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：103、87和104所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或
(v)分别如SEQ ID NO：105、106和107所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和如SEQ ID NO：108、109和110所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向NKG2D的抗体包含与SEQ ID NO：27第1-121位、SEQ ID NO：29第1-109位、SEQ ID NO：31第1-109位或SEQ ID NO：33第1-108所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：27第137-246位、SEQ ID NO：29第122-243位、SEQ ID NO：31第122-236位或SEQ ID NO：33第121-243位所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区序列；
所述靶向NKp46的抗体包含与SEQ ID NO：35第1-107位、SEQ ID NO：37第1-107位、SEQID NO：39第1-107位、SEQ ID NO：41第1-107位或SEQ ID NO：43第1-107位所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的轻链可变区序列和与SEQ ID NO：35第123-244位、SEQ IDNO：37第123-238位、SEQ ID NO：39第123-238位、SEQ ID NO：41第123-242位或SEQ ID NO：43第123-237位所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重链可变区序列。
3.权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合区选自免疫球蛋白分子、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段和线性抗体。
4.权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
5.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域选自以下蛋白的信号传导结构域：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
6.权利要求5所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域是包含CD3ζ的信号传导结构域。
7.权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体进一步包含共刺激结构域，所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18(LFA-1)、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD270(HVEM)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、NKG2D、SLP76、PD-1、LIGHT、TRIM、CD94、LTB、ZAP70以及它们的组合。
8.权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD134、4-1BB或CD278。
9.权利要求1-8任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含第二抗原结合区，其与选自以下的肿瘤抗原结合：TSHR、CD19、CD123、CD22、BAFF-R、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、GPRC5D、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、AFP、Folate受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、CS1、CD138、NCAM、Claudin18.2、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gploo、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、Fucosyl GMl、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、Folate受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白和端粒酶、PCTA-l/Galectin 8、MelanA/MARTl、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、Cyclin Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠道羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、PD1、PDL1、PDL2、TGFβ、APRIL、NKG2D和它们的任意组合。
10.一种核酸分子，其编码权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体。
11.包含权利要求10所述的核酸分子的载体。
12.一种工程化免疫细胞，其包含权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10所述的核酸分子或权利要求11所述的载体。
13.权利要求12所述的工程化免疫细胞，其进一步包含靶向肿瘤抗原的第二嵌合抗原受体。
14.权利要求12-13任一项所述的工程化免疫细胞，其还包含至少一种选自以下的基因的表达被抑制或沉默：TRAC、TRBC、HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、RFX5、RFXAP、RFXANK、CIITA、PD1、LAG3、TIM3、CTLA4。
15.权利要求12-14任一项所述的工程化免疫细胞，其中被嵌合抗原受体靶向的相应内源性NK激活性受体的表达被抑制或沉默。
16.权利要求15所述的工程化免疫细胞，其中所述NK激活性受体是NKG2D或NKp46。
17.权利要求12-16任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞选自T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。
18.权利要求12-17任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞衍生自干细胞。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体、或权利要求12-18任一项所述的工程化免疫细胞，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
20.权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10所述的核酸分子、权利要求11所述的载体、权利要求12-18任一项所述的工程化免疫细胞或权利要求19所述的药物组合物在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
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