CN112011446A - 一种用于细菌裂解的微流控芯片、细菌裂解装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于细菌裂解的微流控芯片、细菌裂解装置及其应用，属于细胞生物学技术领域；所述芯片为三层的层叠结构，由上至下，第一层为亚克力盖板1，第二层为3M双面胶2，第三层为载玻片4；所述载玻片4上固定有叉指电极3。本发明的微流控芯片能够用于纯电场裂解细菌，对比目前使用广泛的化学法(如碱裂解法)裂解细菌，本发明的方法无需添加任何化学试剂，避免了化学试剂对细菌细胞内容物的损害以及后续除去化学试剂的操作，更加方便。本发明的微流控芯片制作工艺简单，所用成本低。本发明的芯片避免了使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)等材料带来的价格昂贵等缺陷，产品体积小，方便携带，并且在功能上完全能够实现细菌电致裂解。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种用于细菌裂解的微流控芯片、细菌裂解装置及其应用。
背景技术
微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。
目前，有研究将微流控技术应用于电致裂解细菌。Poudineh等利用三维尖端电极(3DSTE)裂解大肠杆菌，并实现了生物标记物RNA的释放，同时测定并优化了在该电极下细菌裂解的条件(Poudineh M,Mohamadi RM,Sage A,Mahmoudian L,Sargent EH,KelleySO.Three-dimensional,sharp-tipped electrodes concentrate applied fields toenable direct electrical release of intact biomarkers from cells[J].Lab on aChip.2014,14(10):1785-1790.)。Abdossamad Talebpour等在经表面增强的高阻抗电极的裂解室中实现了包括大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的电致裂解，并证明施加的电场与高温环境同时作用于细菌裂解(Talebpour A,Maaskant R,Khine AA,AlavieT.Use of Surface Enhanced Blocking(SEB)Electrodes for Microbial Cell Lysis inFlow-Through Devices[J].PLoS One.2014,9(7))。在低水平大肠杆菌的快速检测方面，为克服由于细胞内mRNA浓度低从而导致的检测时间缓慢等问题，Besant等人使用电化学的方法在芯片上裂解大肠杆菌，获取mRNA并使其短距离接触传感器，从而大大提高了低水平细菌检测的性能(Justin D.Besant,Jagotamoy Das,Edward H.Sargent.ProximalBacterial Lysis and Detection in Nanoliter Wells Using Electrochemistry[J].ACS nano,2013,7(9):8183-8189.)。但是目前相关电致裂解的研究仍然存在裂解装置结构复杂的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细菌裂解的微流控芯片、细菌裂解装置及其应用，本发明的细菌裂解的微流控芯片和细菌裂解装置结构简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于细菌裂解的微流控芯片，所述芯片为三层的层叠结构，由上至下，第一层为亚克力盖板1，第二层为3M双面胶2，第三层为载玻片4；所述亚克力盖板1设置有进样口1-1和出样口1-2；所述进样口和出样口贯通亚克力盖板1；所述3M双面胶2上开设有微通道2-1以及微通道两端的微通道入口2-2和微通道出口2-3；所述微通道2-1贯通所述3M双面胶2；所述微通道入口2-2和进样口1-1上下对应；所述微通道出口2-3和出样口1-2上下对应；所述载玻片4上固定有叉指电极3；所述微通道2-1粘于叉指电极3上。
优选的，所述微通道2-1的长度为4～5mm，宽度为2～2.2mm，深度为75～85μm。
优选的，所述微通道入口2-2的直径为0.8～1.2mm；所述微通道出口2-3的直径为1.8～2mm。
本发明还提供了一种细菌裂解装置，包括上述方案所述微流控芯片6、菌液注射组件7、裂解液收集组件8和任意函数发生器9；所述菌液注射组件7通过管道和微流控芯片6的进样口1-1连通；所述裂解液收集组件8通过管道和微流控芯片6的出样口1-2连通；所述叉指电极3和任意函数发生器9连接。
本发明还提供了上述方案所述微流控芯片或者所述细菌裂解装置在细菌裂解中的应用。
优选的，所述细菌包括大肠杆菌。
优选的，所述应用包括以下步骤：
1)将包含细菌的菌液从进样口1-1注入，通过微通道入口2-2进入微通道2-1；
2)在叉指电极3通入交流电，对微通道2-1内的细菌进行电裂解，得到裂解液；
3)所述电裂解后的裂解液通过微通道出口2-3从出样口1-2输出，进行收集。
优选的，步骤1)中所述菌液的注入流速为0.5～2μL/min。
优选的，步骤2)中所述交流电的电压为5～10VP-P、频率为1～1000kHz。
优选的，步骤2)中所述叉指电极3和任意函数发生器9电连接；所述任意函数发生器的波形为方波，相位差为180°。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于细菌裂解的微流控芯片，所述芯片为三层的层叠结构，由上至下，第一层为亚克力盖板1，第二层为3M双面胶2，第三层为载玻片4；所述亚克力盖板1设置有进样口1-1和出样口1-2；所述进样口和出样口贯通亚克力盖板1；所述3M双面胶2上开设有微通道2-1以及微通道两端的微通道入口2-2和微通道出口2-3；所述微通道2-1贯通所述3M双面胶2；所述微通道入口2-2和进样口1-1上下对应；所述微通道出口2-3和出样口1-2上下对应；所述载玻片4上固定有叉指电极3；所述微通道2-1粘于叉指电极3上。
本发明的微流控芯片能够用于纯电场裂解细菌，对比目前使用广泛的化学法(如碱裂解法)裂解细菌，本发明的方法无需添加任何化学试剂，避免了化学试剂对细菌细胞内容物的损害以及后续除去化学试剂的操作，更加方便。本发明的微流控芯片制作工艺简单，所用成本低。本发明的芯片避免了使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)等材料带来的价格昂贵等缺陷，产品体积小，方便携带，并且在功能上完全能够实现细菌电致裂解。
本发明还提供了一种细菌裂解装置，包括上述方案所述微流控芯片6、菌液注射组件7、裂解液收集组件8和任意函数发生器9；所述菌液注射组件7通过管道和微流控芯片6的进样口1-1连通；所述裂解液收集组件8通过管道和微流控芯片6的出样口1-2连通；所述任意函数发生器9和微流控芯片6的叉指电极3电连接。
本发明利用菌液注射组件7控制菌液流速将菌液通过微通道入口2-2注射入微通道2-1中进行裂解，裂解液通过微通道出口2-3流入用于收集的裂解液收集组件8，裂解过程无需人工操作，能够随时调节参数或者决定裂解过程的继续或暂停，自动化程度高，裂解过程持续可控。
本发明的细菌裂解装置能够实现高效的细菌裂解，裂解效率可达90％以上。
附图说明
图1为本发明所述微流控芯片的结构图，其中亚克力盖板1，3M双面胶2，叉指电极3，载玻片4，进样口1-1，出样口1-2，微通道2-1，微通道入口2-2，微通道出口2-3；
图2为本发明所述叉指电极的结构图；
图3为本发明所述细菌裂解装置的结构图，其中微流控芯片6，菌液注射组件7，裂解液收集组件8，任意函数发生器9；
图4为微流控细菌电致裂解结果，其中a是未经裂解的菌液涂板结果，b是在频率为500kHz、流速2μL/min下，电压为4Vp-p的细菌裂解结果，c是在频率为500kHz、流速2μL/min下，电压为8Vp-p的细菌裂解结果；
图5为施加不同电压时的细菌裂解效率；
图6为施加不同交流电频率时的细菌裂解效率；
图7为不同流速情况下细菌裂解效率。
具体实施方式
本发明提供了一种用于细菌裂解的微流控芯片，所述芯片为三层的层叠结构，由上至下，第一层为亚克力盖板1，第二层为3M双面胶2，第三层为载玻片4；所述亚克力盖板1设置有进样口1-1和出样口1-2；所述进样口和出样口上下贯通亚克力盖板1；所述3M双面胶2上开设有微通道2-1以及微通道两端的微通道入口2-2和微通道出口2-3；所述微通道2-1上下贯通所述3M双面胶2；所述微通道入口2-2和进样口1-1上下对应；所述微通道出口2-3和出样口1-2上下对应；所述载玻片4上固定有叉指电极3；所述微通道2-1粘于叉指电极3上。
本发明所述微流控芯片的结构图参见图1，其中亚克力盖板1，3M双面胶2，叉指电极3，载玻片4，进样口1-1，出样口1-2，微通道2-1，微通道入口2-2，微通道出口2-3。
在本发明中，所述叉指电极3来源于常规市售；所述叉指电极的间距优选为100μm，每根电极宽度优选为100μm；所述叉指电极的结构图参见图2。
在本发明中，所述亚克力盖板紧密覆盖于微通道上层，用于使微流控芯片保持密封的环境；所述亚克力盖板的长度优选为20mm，宽度优选为20mm，厚度优选为1mm。
在本发明中，所述进样口1-1和出样口1-2的形状分别优选为圆形，本发明具体实施过程中，所述进样口1-1和出样口1-2用钻孔器钻孔得到；所述进样口1-1的直径优选的和微通道入口2-2的直径一致；所述出样口1-2的直径优选的和微通道出口2-3的直径一致。
在本发明中，所述微通道2-1的长度优选为4～5mm，更优选为4.5mm，宽度优选为2～2.2mm，深度优选为75～85μm，更优选为80μm；所述微通道2-1用于通入细菌悬液。
在本发明中，所述微通道入口2-2的直径优选为0.8～1.2mm，更优选为1mm；所述微通道出口2-3的直径优选为1.8～2mm。
在本发明中，所述叉指电极3在载玻片4上固定的方式优选的通过3M双面胶紧密粘贴固定；所述叉指电极3用于提供电场，裂解细菌。
在本发明中，所述载玻片在使用前优选的采用体积浓度为70％～80％的乙醇水溶液进行喷洗，并用擦镜纸擦净。
本发明还提供了一种细菌裂解装置，包括上述方案所述微流控芯片6、菌液注射组件7、裂解液收集组件8和任意函数发生器9；所述菌液注射组件7通过管道和微流控芯片6的进样口1-1连通；所述裂解液收集组件8通过管道和微流控芯片6的出样口1-2连通；所述任意函数发生器9和微流控芯片6的叉指电极3电连接。在本发明中，所述菌液注射组件7通过管道和微流控芯片6的进样口1-1优选的通过软管连通；所述裂解液收集组件8通过管道和微流控芯片6的出样口1-2优选的通过软管连通。
本发明所述细菌裂解装置的结构图参见图3，其中微流控芯片6，菌液注射组件7，裂解液收集组件8，任意函数发生器9。
在本发明中，所述菌液注射组件7优选的包括注射器；所述注射器优选的连接有注射泵；所述注射泵优选为购自于兰格公司(longerPump)的注射泵(Harvard PHD 2000)；所述注射泵的作用是用于固定注射器以及调节菌液流速；所述菌液注射组件7在使用前优选的经过消毒处理，更优选的经过体积浓度为75％的乙醇水溶液消毒处理。
在本发明中，所述裂解液收集组件8优选的包括EP管。
在本发明中，所述任意函数发生器9优选为购自于Tektronix公司的型号AFG3102；所述任意函数发生器9用于提供电信号。
本发明还提供了上述方案所述微流控芯片或者所述细菌裂解装置在细菌裂解中的应用；所述细菌优选的包括大肠杆菌，更优选为大肠杆菌JM109。
在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：
1)将包含细菌的菌液从进样口1-1注入，通过微通道入口2-2进入微通道2-1；
2)在叉指电极3通入交流电，对微通道2-1内的细菌进行电裂解，得到裂解液；
3)所述电裂解后的裂解液通过微通道出口2-3从出样口1-2输出，进行收集。
本发明首先将包含细菌的菌液从进样口1-1注入，通过微通道入口2-2进入微通道2-1；所述菌液的注入流速优选为0.5～2μL/min；
本发明中，所述菌液优选的采用包括如下步骤的方法制备得到：
S1.对待裂解细菌进行活化培养，得到种子液；
S2.将所述种子液接种至LB培养基，进行扩大培养，培养液离心、取沉淀、重悬沉淀和稀释10-5～10-6倍，得到菌液。
本发明首先对待裂解细菌进行活化培养，得到种子液；所述种子液的OD值优选为0.8～1.2，更优选为1；所述活化培养的条件依据所培养的细菌而定；当所述细菌为大肠杆菌时，所述活化培养的温度优选为37℃，时间优选为16～20h，更优选为18h，所述活化培养的方式优选为摇床培养；所述摇床培养的转速优选为180～200rpm；所述种子液的储藏温度优选为-80℃。
得到种子液后，本发明将所述种子液接种至LB培养基，进行扩大培养，离心，取沉淀，重悬沉淀，稀释10-5～10-6倍，得到菌液；所述种子液和LB培养基的比例优选为50μL：5mL；所述扩大培养的条件依据所培养的细菌而定；当所述细菌为大肠杆菌时，所述扩大培养的温度优选为37℃，时间优选为10～14h，更优选为12h，所述扩大培养的方式优选为摇床培养；所述摇床培养的转速优选为180～200rpm；所述重悬沉淀采用的试剂优选为超纯水。
当菌液注入微通道2-1后，本发明在叉指电极3通入交流电，对微通道2-1内的细菌进行电裂解，得到裂解液；所述交流电的电压优选为5～10VP-P，频率优选为1～1000kHz，更优选为50～300kHz，最优选为100～200kHz。
在本发明中，所述任意函数发生器9通过铜丝向叉指电极3提供电信号；所述任意函数发生器的波形优选为方波，相位差优选为180°；所述5～10VP-P指的是任意函数发生器9的单通道电压；每个通道输出电压相同，共两个通道。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种大肠杆菌裂解的方法
步骤1：微流控芯片的设计及制作
微流控芯片结构示意图如图1所示。
由上到下：
第一层为亚克力盖板1，其上用钻孔器钻孔，分别为进样口1-1和出样口1-2，进样口1-1和出样口1-2的间距为微通道2-1的长度。将其紧密覆盖于微通道2-1上层，进样口1-1与出样口1-2的位置与微通道入口2-2与微通道出口2-3一一对应。
第二层使用3M双面胶2刻蚀的微通道2-1。取另一载玻片用酒精喷洗并擦净，取一定长度的3M双面胶贴于其上，用手术刀在3M双面胶上刻出一条笔直的微通道，长4～5mm，宽2mm，包括一个入口(直径1mm)一个出口(直径1.8mm)。将刻好的微通道2-1置于显微镜下观察，保证微通道2-1平整。将微通道2-1粘于叉指电极3上，使其紧密粘合。
第三层为载玻片4，载玻片4使用前用自行配置的体积浓度为75％的乙醇水溶液喷洗，并用擦镜纸擦净。载玻片4上用3M双面胶紧密固定叉指电极3。
步骤2：大肠杆菌培养及处理方法
所用菌株为大肠杆菌JM109，培养基为LB培养基。将已有菌液于LB固体培养基上平板划线，于37℃培养箱中恒温培养过夜，挑单克隆于5mL LB液体培养基中振荡培养18h，恒温摇床设定为37℃，200rpm培养至OD值约为1.0。将菌液置于-80℃冰箱冷冻储藏。实验之前取菌液50μL接种于5mL LB培养基中，与上述条件相同恒温震荡约12h，13000r/min 1min离心弃上清液，用1mL超纯水重悬，稀释10-5～10-6倍，即可准备进行电致裂解。
步骤3：细菌裂解装置的连接及使用
细菌裂解装置示意图如图3所示。将稀释好的菌液注入提前采用体积浓度为75％的乙醇水溶液消毒后用超纯水冲洗净的注射器中，任意函数发生器(Tektronix型号AFG3102)与叉指电极微流控芯片连接，注射器通过软管与微通道入口连接，微通道出口处用软管连接EP管。注射器用注射泵(Harvard PHD 2000)固定。
步骤4：细菌裂解及细菌裂解效率测试
实验前将微通道以及使用的注射器及软管用酒精灭菌并用超纯水冲洗净，将稀释好的菌液吸入注射器中，连接好实验装置后，调节任意函数发生器为方波，相位差为180°，在0～10Vp-p(单通道电压，每个通道输出电压相同，共两个通道)范围内改变交流电压，在1kHz～50MHz范围内改变交流电频率，在0.5～10μL/min范围内改变注射泵流速。将收集到的裂解液与未经裂解的原菌液各100μL涂布平板后进行比较，统计琼脂平板上菌落数目，从而判断裂解效果。
裂解结果参见图4(微流控细菌电致裂解结果)，其中a是未经裂解的菌液涂板结果，b是在频率为500kHz、流速2μL/min下，电压为4Vp-p的细菌裂解结果，c是在频率为500kHz、流速2μL/min下，电压为8Vp-p的细菌裂解结果。当有电场施加在芯片上时，琼脂平板上的大肠杆菌菌落数目明显减少，可见本发明的方法能够有效地裂解大肠杆菌，且当电压为8Vp-p时，琼脂平板上的菌落数明显减少，说明电压为8Vp-p时能够提高细菌的裂解效果。
本项目中的细菌裂解效率定义如下：
η＝(n0-n)/n0×100％ (1)
其中，n为裂解液大肠杆菌菌落数，n0为原菌液中菌落数，两者均取100μL涂布平板，η为n0-n与n0之比，即为细菌裂解效率。
细菌裂解效率计算结果参见图5和图6，其中图5为施加不同电压时的细菌裂解效率；图6为施加不同交流频率时的细菌裂解效率。由图5可以看出，电压为10Vp-p时，细菌裂解效率最高；由图6可以看出，1～1000kHz范围内，细菌裂解效率较高。
较小流速(0.5～2μL/min)情况下大肠杆菌裂解效率高。具体参见图7。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于细菌裂解的微流控芯片，所述芯片为三层的层叠结构，由上至下，第一层为亚克力盖板(1)，第二层为3M双面胶(2)，第三层为载玻片(4)；
所述亚克力盖板(1)设置有进样口(1-1)和出样口(1-2)；所述进样口和出样口上下贯通亚克力盖板(1)；
所述3M双面胶(2)上开设有微通道(2-1)，所述微通道两端开设有微通道入口(2-2)和微通道出口(2-3)；所述微通道(2-1)上下贯通所述3M双面胶(2)；所述微通道入口(2-2)和进样口(1-1)上下对应；所述微通道出口(2-3)和出样口(1-2)上下对应；
所述载玻片(4)上固定有叉指电极(3)；所述微通道(2-1)粘于叉指电极(3)上。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微通道(2-1)的形状为长方形；所述微通道(2-1)的长度为4～5mm，宽度为2～2.2mm，深度为75～85μm。
3.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述微通道入口(2-2)的直径为0.8～1.2mm；所述微通道出口(2-3)的直径为1.8～2mm。
4.一种细菌裂解装置，包括权利要求1所述微流控芯片(6)、菌液注射组件(7)、裂解液收集组件(8)和任意函数发生器(9)；所述菌液注射组件(7)通过管道和微流控芯片(6)的进样口(1-1)连通；所述裂解液收集组件(8)通过管道和微流控芯片(6)的出样口(1-2)连通；所述任意函数发生器(9)通过铜丝和微流控芯片(6)的叉指电极(3)连接。
5.权利要求1～3任意一项所述微流控芯片或者权利要求4所述细菌裂解装置在细菌裂解中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)将包含细菌的菌液从进样口(1-1)注入，通过微通道入口(2-2)进入微通道(2-1)；
2)在叉指电极(3)通入交流电，对微通道(2-1)内的细菌进行电裂解；
3)所述电裂解后的裂解液通过微通道出口(2-3)，从出样口(1-2)输出，进行收集。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述菌液的注入流速为0.5～2μL/min。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述交流电的电压为5～10VP-P、频率为1～1000kHz。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述叉指电极(3)和任意函数发生器(9)连接；所述任意函数发生器的波形为方波，相位差为180°。
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