CN112007156A - 大麻素受体药物在制备治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及大麻素受体药物的新用途，具体涉及1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂及2型大麻素受体(CB2R)激动剂在制备治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用。本发明还提供了相应的试剂盒。喹硫平是一种常见的非典型抗精神病药，用于治疗精神分裂症，双相情感障碍和重度抑郁症等精神障碍。本发明经实验证实，喹硫平促使心肌细胞炎性浸润及纤维化重构，喹硫平具有促进RIP3及MLKL的作用，激活心肌细胞坏死性凋亡通路，而1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂及2型大麻素受体(CB2R)激动剂可显著抑制坏死性凋亡通路，从而用于治疗喹硫平心肌毒性。本发明提供了1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂及2型大麻素受体(CB2R)激动剂的新应用，本发明为心肌细胞毒性治疗药物的开发提供了新的参考数据。

Description

大麻素受体药物在制备治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及坏死性凋亡调控药物，具体涉及大麻素受体药物的新用途，尤其涉及1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂及2型大麻素受体(CB2R)激动剂在心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用。

背景技术

非典型抗精神病药，包括氯氮平，奥氮平和喹硫平，是治疗精神分裂症，双相情感障碍和重度抑郁症等精神疾病的常用药物。喹硫平在化学结构上与氯氮平和奥氮平类似，于1997年在精神分裂症患者的临床试验基础上获得批准。根据Astra Zeneca的统计，全球有超过2200万人使用喹硫平，这是美国最常规的非典型抗精神病药物。喹硫平可有效用于重症抑郁症和广泛性焦虑症的急性和维持治疗，这两种精神疾病远比精神分裂症或双相情感障碍更常见。然而，美国食品和药物管理局(FDA)的顾问因为喹硫平潜在的不良反应，尤其是代谢问题，迟发性运动障碍和心源性猝死而对扩大喹硫平的使用持谨慎态度。

迄今为止，越来越多的报道显示，喹硫平的临床应用伴随心血管系统的副作用，甚至导致心源性猝死。与非用药组相比，喹硫平导致心源性猝死的风险增加了72％(OR＝1.72,95％CI：1.33-2.23)。这与另一项基于人群的病例交叉研究结果基本相似，该研究发现使用抗精神病药如喹硫平与室性心律失常和/或心源性猝死的风险增加1.53倍有关。此外，在第7天，14天和28天的时间窗期间，上述关联在短期使用者中显著较高。临床和法医解剖报道的喹硫平致心律失常等病理改变很大程度上归因于喹硫平诱发的心肌毒性。根据世界卫生组织发布的国际药物监测计划，喹硫平诱导的心肌炎和心肌病是病理形态学上的常见表现。喹硫平诱导的心肌炎和心肌病有时类似于急性ST段抬高的心肌梗死病例，易在临床上引起误诊误治。广泛报道的喹硫平心血管毒副作用也引起了丹麦医学会及欧洲医药机构的关注，这些机构因此在授权使用喹硫平方面非常谨慎。这些研究报道表明，喹硫平心肌毒性需引起足够重视，有待深入的实验研究。

虽然喹硫平心脏毒性已被临床大量报道，但其毒理学机制仍研究较少。考虑到药物毒性的根本原因是导致细胞死亡，因此迫切需要揭示喹硫平诱导的心肌细胞死亡类型及其调节机制。

坏死性凋亡是一种新发现的程序性细胞死亡，已被证实是多种疾病发生发展的重要途径。坏死性凋亡是由受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)触发，RIP1在磷酸化后激活受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)使其磷酸化，活化的RIP3进而磷酸化下游混合谱系激酶结构域类似蛋白(MLKL)，磷酸化的MLKL活化，并易位至细胞膜，从而导致质膜孔形成，引起细胞破裂。除了膜完整性的破坏外，坏死性凋亡细胞的特征还在于自噬过量活化，线粒体功能丧失和活性氧生成。虽然坏死性凋亡可能已经演变为抵抗细胞内感染的一道防线，但最近的研究表明，它可以在多种疾病状态中发挥作用。越来越多的证据表明坏死性凋亡在药物毒性中的显著作用。细胞坏死性凋亡是药物诱导的多种细胞如原代肾细胞，神经元，视网膜细胞和肝细胞死亡的基础。特别是对于心肌细胞，化疗药物达沙替尼通过HMGB1介导的坏死性凋亡而最终诱导心脏毒性。另一项研究发现坏死性凋亡介导子RIP1/RIP3在急性病毒感染时心肌细胞中表达高显著升高，使用坏死性凋亡特异性阻断剂Necrostatin-1(Nec-1)可显著阻断病毒引起的心肌炎损伤。

发明内容

本发明的目的是提供新的坏死性凋亡调控药物，具体涉及大麻素受体药物的新用途，尤其涉及1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂及2型大麻素受体(CB2R)激动剂在制备喹硫平诱导的心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用。

本申请基于之前的研究报道喹硫平以及其他抗精神病药氯氮平，氯丙嗪和奥氮平等可引起炎性疾病(即肺炎或心肌炎)；如氯氮平诱导的心脏毒性对大麻素受体(CB1R和CB2R)表达产生相反的作用，等。本发明基于现有技术，进一步评估了大麻素受体拮抗剂/激动剂在用于制备治疗喹硫平诱导的心肌细胞死亡药物中的潜力，经试验，获得的数据显示了喹硫平心脏毒性与诱导的细胞坏死性凋亡密切相关，并提出选择性CB1R拮抗剂或CB2R激动剂作为坏死性凋亡通路的新的调控药物，能为喹硫平心脏毒性的治疗开辟有益的思路。本发明在上述基础上完成。

本发明提供了大麻素受体药物在制备治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用。

本发明中，所述的心肌细胞坏死性凋亡尤其是喹硫平诱导的心肌细胞坏死性凋亡。

在本发明的优选例中，所述的细胞是心肌细胞。

在本发明的一个实施例中，喹硫平促使心肌细胞炎性浸润或者纤维化。

本发明还提供了使用所述药剂的方法，即将大麻素受体药物与所述的细胞共同孵育。

其中，所述的药剂具有增强RIP3或者MLKL活化的作用。

同时，所述的坏死性凋亡药剂具有促进MLKL易位的作用。

另一方面，本发明提供了一种用于心肌细胞坏死性凋亡的试剂盒，所述的试剂盒含有喹硫平标准品。

所述的试剂盒具有激活心肌细胞坏死性凋亡的作用，其活性成分为喹硫平。

本发明的试剂盒中，可以含有喹硫平的抑制剂，标准样品，说明书等等。

所述的试剂盒还可以含有CB1R的拮抗剂或者CB2R的激动剂。

由于其具有有效的药理功能，喹硫平可作为非典型抗精神病药物使用，但近年来由于其对心肌的副作用而引起临床医生的注意和警惕处方。与其他抗精神病药类似，喹硫平诱导的心脏毒性在临床上表现为QTc间期延长，心动过速，甚至心源性猝死。在病理学上，药物诱导的心肌损伤是非特异性的并且表现为炎症浸润和/或纤维化积聚，病理学上称之为心肌炎和心肌病。本发明使用临床治疗剂量的喹硫平连续注射到小鼠中以建立喹硫平慢性心脏毒性的小鼠模型。与安慰剂组相比，喹硫平暴露引起显著的炎症细胞积聚和血管周围纤维化病变和心肌间质纤维化。随着暴露时间延长或剂量加大，喹硫平显著损害心肌细胞的活力。喹硫平暴露的心肌细胞在透射电子显微镜下显示出坏死样形态变化。所有这些实验证据证实了喹硫平在体内和体外诱导的心脏毒性。

药物毒性的根本影响是导致细胞死亡。经喹硫平处理的心肌细胞显示为胞膜完整性破坏，线粒体肿胀和内质网扩张，所有这些都是细胞坏死性死亡的表现。因此，检测了目前定义的细胞死亡类型，包括细胞凋亡，自噬和细胞坏死性凋亡。结果显示，喹硫平诱导细胞坏死性凋亡通路关键分子活化，但对参与细胞凋亡、自噬通路的分子影响较小。与氯氮平和奥氮平(另外两种非典型抗精神病药)相比，喹硫平最能稳定地激活心肌细胞坏死性凋亡。由于已证实坏死性凋亡涉及多种药物毒性并且坏死性凋亡特异性抑制剂可减缓药物的毒性作用，因此在体内使用坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1。Nec-1预处理确实抑制了坏死性凋亡过程。通过心重/胫骨长(HW/T)L比率测量，Nec-1显著减弱心脏水肿和病理性重塑，并显著抑制喹硫平诱导的纤维化病变(p<0.01)。这些数据证实了坏死性凋亡抑制剂Nec-1在心脏毒性中的治疗潜力。

值得注意的是，Nec-1预处理后喹硫平引起的炎症细胞浸润未能有效缓解。这可能与Nec-1的药物临床特点有关。Nec-1是第一个通过变构靶向RIP1被鉴定为坏死性凋亡抑制剂的化合物。然而，Nec-1的代谢稳定性较低(小鼠微粒体测定中半衰期<5min)。后来也有研究指出Nec-1具有脱靶效应。因此寻找其他的坏死性凋亡通路调控药物显得尤其重要。

基于细胞坏死性凋亡的上游调节药物有望提供新的药理学靶标，作为一个大的细胞表面受体家族，G蛋白偶联受体受到广泛关注，超过30％的现有商业药物是通过靶向G蛋白偶联受体而开发的。大麻素受体属于G蛋白偶联受体的超家族，并且已被认为是心血管疾病的重要潜在治疗靶点。我们报道了两种亚型的CBR(CB1R和CB2R)作为关键膜受体，在氯氮平诱导的心肌损伤中具有极其重要作用。在本发明中，检测到主要的内源性大麻素(AEA和2-AG)在喹硫平损伤时水平下降。喹硫平损伤时CB1R受体内化至胞浆，而CB2R保持在细胞膜表面，表明不同CBR受体亚型转导细胞外信号的方式相反。CB1R的药理学抑制或选择性激活CB2R赋予细胞对喹硫平毒性的强烈保护，这可通过心脏中缓解的炎症浸润和纤维化损伤来证明。特别地，本发明中用到的选择性CB1R拮抗剂包括Rimonabant和AM281，选择性CB2R激动剂包括JWH-133和AM1241。四种药物中任一种药物均可抑制喹硫平诱导的坏死性凋亡通路，表明是大麻素受体可调控坏死性凋亡通路，而非大麻素受体特定的某个药物因为脱靶效应而调控坏死性凋亡通路。这些数据因此说明，大麻素受体CBR是坏死性凋亡的上游调节受体。大麻素受体药物(CB1R拮抗剂和CB2R激动剂)是坏死性凋亡通路的新的调控药物，可用于喹硫平慢性心肌毒性的治疗。

实验数据显示，CB1R拮抗剂或CB2R激动剂显著降低了HW/TL比值、心脏炎症指数和纤维化程度这三个心脏功能障碍的重要指标。相比之下，坏死性凋亡抑制剂Nec-1对心脏炎症浸润指数抑制作用较小。Nec-1非常短的半衰期可能是一种原因。另一种解释是，就治疗功效而言，CB1R拮抗剂和CB2R激动剂优于RIP1靶向的小分子抑制剂。虽然坏死性凋亡通路的特异性抑制剂已得到改良，并且已经开发出具有更长半衰期或更高特异性的改良型抑制剂，但这些抑制剂都没有被证实是完美的临床药剂。然而，大麻素受体的药理学调节剂在临床应用方面取得了很大进展。例如，以Rimonabant为代表的CB1R拮抗剂是很好的减肥剂，可使体重降低。长期使用抗精神病药是体重增加的风险因素。因此，在使用喹硫平患者中采用CB1R拮抗剂可能产生至少两种有益的结果：一种是抑制喹硫平诱导的体重增加，另一种是抑制喹硫平的心肌毒性。此外，CB2R激动剂也被发现具有多种其他功效，如抑制疼痛，用于麻醉等。本发明提出了CB1R拮抗剂和CB2R激动剂的新功效，可作为坏死性凋亡通路的新的抑制剂。

喹硫平是一种常见的非典型抗精神病药，用于治疗精神分裂症，双相情感障碍和重度抑郁症等精神障碍。越来越多的报告描述了它的心脏毒性；然而，喹硫平诱导的心肌损伤的分子机制仍然很大程度上未知。本发明公开了一种新的细胞死亡类型，喹硫平诱导的坏死性凋亡，它解释了小鼠喹硫平的心脏毒性机制并提出了新的治疗策略。在连续21天注射后，喹硫平处理的心脏显示出炎症细胞浸润和明显的纤维化。RIP3，MLKL蛋白水平的特异性增加和MLKL的磷酸化显示喹硫平诱导了心肌细胞坏死性凋亡。使用特异性抑制剂Nec-1对坏死性凋亡的药理学阻断减弱了喹硫平诱导的小鼠心肌损伤。此外，喹硫平使内源性大麻素系统失衡，并对两种大麻素受体(CB1R和CB2R)产生相反的作用。CB1R的特异性拮抗剂(AM281，Rimonabant)，但不是其激动剂ACEA，显著改善了慢性喹硫平暴露引起的心脏组织病理学改变。相反，CB2R的特异性激动剂(JWH-133，AM1241)，但不是其拮抗剂AM630对喹硫平心脏毒性作用也发挥有益作用。因此，本发明提出CBR药物(CB1R拮抗剂和CB2R激动剂)是坏死性凋亡的调控药物。CB1R的药理学抑制或CB2R的激活代表了治疗喹硫平心脏毒性的新的治疗策略。

附图说明

图1显示喹硫平诱导的心肌细胞坏死性凋亡实验图。

图2显示CB2R激动剂和CB1R拮抗剂调控了坏死性凋亡通路，可用于治疗喹硫平的心肌毒性。

具体实施方式

本发明实施例中具体的实验材料、方法和步骤如下：

1.动物实验

所有动物实验均根据NIH指南的实验动物护理和使用(NIH出版物No.85-23，1996年修订)进行。动物实验的方案由复旦大学基础医学院的实验动物伦理委员会批准(编号：20170223-004)。实验中尽了最大努力以减少动物痛苦。

年龄为～4周龄的雄性Balb/C小鼠购自SLAC Inc.(中国上海)并且适应性喂养1周。将所有小鼠圈养在无菌实验室动物繁殖条件下并保持在适当的温度下，以光照-黑暗各12小时来处理。所有动物可获得食物和水。在每天的15:00，向小鼠腹腔内注射100μLPBS(对照组)或喹硫平(60mg/kg)。对于其他分组的实验动物(额外注射其他药物)，在注射喹硫平或PBS之前约1小时提前腹腔注射。每天于药物处理小鼠前记录小鼠体重。治疗持续21天。在第21天，所有小鼠通过眼眶静脉采集血液以制备血清样品，同时测量左侧胫骨长度(TL)和心脏重量(HW)。将心脏横向切开，并将部分心脏组织进行福尔马林固定和石蜡包埋以制作心脏切片。剩余的心脏组织保存在-80℃直至使用。

2.组织学检查

心脏切片用苏木精和伊红(H&E)染色和PicroSirius Red(PSR)染色分别用于炎症浸润和纤维化病变的组织学观察。为了本研究的目的，心肌炎定义为≥1个炎症细胞集合，每个集合至少10个炎症细胞。根据细胞浸润程度对炎性浸润进行分类，并按照我们之前描述的方法，对0至4+(炎症浸润指数)采用5分制进行分级：0，无或可疑的炎症浸润；1+，1-2个炎症灶；2至3+，3个或以上的炎症灶；4+，整个心脏组织炎症灶集结成大片状，或广泛性、弥漫性炎症灶

在PSR染色后，为了定量纤维化的程度，从每组小鼠心脏中随机选择5个视野并拍照。然后使用Image J软件(National Institute of Health，Bethesda，MD，USA)与切片面积成比例地自动分析纤维化区域所占百分比。

使用OpalTMmulticolor IHC试剂盒(PerkinElmer Inc.，Boston，MA，USA)进行多重免疫组织化学(IHC)染色分析。其中RIP3一抗(目录号：17563-1-AP)和MLKL单克隆抗体(目录号：66675-1-Ig)购自Proteintech(Rosemont，IL，USA)。RIP3和MLKL染出后分别呈现为粉红色和棕色信号。

3.抗体

CB1R(目录号：93815)和RIP1(目录号：3493)的兔单克隆一抗购自Cell SignalingTechnology(Boston，MA，USA)。小鼠IL1β单克隆抗体购自Cell Signaling Technology(目录号：12242)。抗Bax(目录号：2272)和抗-GAPDH(目录号：5174)抗体也购自Cell SignalingTechnology。兔CB2R多克隆抗体购自Gene Tex Inc.(目录号：GTX23561，Irvine，CA，USA)。LC3-B(目录号：192890)，IL-18(目录号：207323)和磷酸化MLKL(S345)(目录号：196436)的单克隆抗体购自Abcam。Caspase 3(目录号：19677-1-AP)，Bcl-2(目录号：12789-1-AP)，RIP3(目录号：17563-1-AP)，MLKL(目录号)的一抗购自Proteintech。Beclin 1(目录号：11306-1-AP)和RIP 1(目录号：17519-1-AP)购自Proteintech Inc.(Rosemont，IL，USA)。针对β-actin的小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(目录号：sc-47778，SantaCruz，CA，USA)。HRP交联的二抗购自Jackson laboratories Inc.(West Grove，PA，USA)。山羊抗兔二抗Alexa Fluor 555(目录号：A-21428)和Alexa Fluor 488(目录号：A-11008)购自Invitrogen Inc.(Carlsbad，CA，USA)。所有本试验中应用的一抗均由制造商验证。

4.化学试剂

抗精神病药氯氮平购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。将氯氮平溶于0.1MHCl中并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡pH以制备氯氮平(80mM)的储备溶液。然后根据使用剂量稀释储备溶液。选择性CB1拮抗剂Rimonabant和选择性CB2拮抗剂AM 630从Sigma-Aldrich商购获得。选择性CB1拮抗剂AM281(目录号：B6603)和选择性CB1R激动剂ACEA(目录号：1319)分别购自APExBio Technology(Boston，MA，USA)和Tocris Bioscience(Abingdon，OX，UK)。另一种CB2激动剂JWH-133购自MedChemExpress(目录号：259869-55-1，Monmouth Junction，NJ，USA)。ACEA，Rimonabant和AM 630分别制备成1mg/mL，0.6mg/mL和1mg/mL工作溶液，分别配制在由DMSO，吐温-20和PBS组成的溶剂中。选择性CB2激动剂AM1241购自Selleck Chemicals(Houston，TX，USA)，并在由DMSO和PBS组成的溶剂中制备成10mg/mL工作溶液。溶液中DMSO的最高终浓度≤1％，该浓度对小鼠存活率没有影响。富马酸喹硫平和奥氮平(目录号：S2493)购自Selleck Chemicals并溶于添加有1％乙酸的生理盐水中以制备储备溶液(分别为12mg/ml，0.5mg/ml)。Necrostatin-1(Nec-1)购自Santa CruzBiotechnology(目录号：4311-88-0)并溶解至1mg/ml以达到工作浓度。体内实验的最终使用剂量为Rimonabant(3mg/kg)，AM 281(2.5mg/kg)，ACEA(5mg/kg)，AM 1241(5mg/kg)，JWH-133(5mg/kg)和AM 630(5mg/kg)。

5.细胞培养

将心肌HL-1细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。对于喹硫平毒性的体外考察模型，HL-1细胞用不同剂量的喹硫平处理，从低剂量(LD，1μM)，中剂量(MD，2μM)到高剂量(HD，4μM)在培养箱中在37℃下培养持24小时，或者将HL-1细胞采用固定剂量(2μM)的喹硫平处理，但喹硫平暴露时间分别为0,2,4,8,12,24至36小时。为了评估Nec-1(60μM)或CBR药物对喹硫平毒性的影响，用Nec-1或特定的CBR调节剂预处理HL-1细胞。具体而言，在给予喹硫平之前30分钟将Nec-1(60μM)，Rimonabant(2μM)，AM 281(2μM)，AM 1241(5μM)，JWH-133(1μM)分别添加到培养基中，而后再添加喹硫平。

6.蛋白质印迹分析

用RIPA缓冲液(Beyotime，Nantong，China)与蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合液(CellSignal Technology)混合裂解心肌细胞培养物。根据制造商的方案使用BCA试剂盒(ThermoScientific，CA，USA)对总蛋白质定量。然后在10％SDS-PAGE凝胶上将等量的蛋白质加载到每个泳道并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后将PVDF膜在5％脱脂牛奶中封闭1小时，在室温下用含有0.1％Tween-20的TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟，添加一抗稀释液，在4℃过夜孵育。然后将印迹膜在含有0.1％tween-20的TBST中洗涤两次，并添加二抗稀释液(1：50,000稀释，Jackson Laboratories)，37°孵育一小时。同时用β-actin作为内参。而后进行化学发光、显影、拍照。

7.免疫荧光试验

将小鼠心肌HL-1细胞在24孔板中培养，并单独或与指定的试剂共孵育。温育24小时后，将细胞用纯丙酮固定10分钟，并用冰PBS洗涤三次。用山羊血清封闭1小时后，将细胞与针对MLKL的一抗在4℃下共孵育过夜。以Alexa Fluor山羊抗小鼠IgG作为二抗。在室温下将DAPI以1：1000的稀释度复染10分钟以显示细胞核。

8.透射电子显微镜

将心肌HL-1细胞与喹硫平(2μM)或PBS在6-cm培养皿中孵育24小时。然后弃去培养基并用胰蛋白酶处理细胞并以1000rpm离心5分钟以获得细胞沉淀。然后将细胞沉淀物浸入2％戊二醛中。通过透射电子显微镜(TEM)(FEI/PHILIPS CM120TEM，Philips ElectronOptics B.V.)拍摄图像。

9.细胞活力测定

为了评估喹硫平对心肌细胞活力的影响，将细胞接种到96孔板中。通过检测每个孔的吸光度监测细胞数。在每个监测的时间点，将10μL/孔的CCK-8溶液(Beyotime，Nantong，China)加入培养孔中。然后将细胞在37℃再培养2小时。在酶标仪(BioTek，Winooski，VT，USA)上检测波长450nm处的吸光度。

10.通过LC-MS/MS检测主要的内源性大麻素水平

将心肌HL-1细胞在6孔板中培养，并在细胞达到约80％密度时用喹硫平(2μM)处理24小时。将提取的细胞或血清样品通过LC-MS/MS定量测定anandamide(AEA)和2-花生四烯酰甘油(2-AG)的水平。

11.统计分析

数据显示为平均值±标准误差(SEM)。Students't-检验用于数值型变量的组间平均值比较，而单因素方差分析(ANOVA)用于≥3组的比较，并采用最小显著性差异(LSD)进行两组间差异检验。p值小于0.05被认为是统计学显著差异。

实施例1喹硫平的慢性暴露在体内和体外诱导心肌毒性

抗精神病药在临床上已被广泛报道可延长QT间期甚至导致心源性猝死。喹硫平心脏毒性的组织病理学改变仍然很少报道。在我们实验研究中，我们使用60mg/kg喹硫平(与临床治疗剂量相当)腹腔内注射小鼠。连续处理21天后，收获小鼠心脏用于组织学分析。与PBS处理的对照心脏相比，H&E染色显示喹硫平处理的心脏显示出较为明显的多灶性炎症细胞积聚。PicroSirius Red(PSR)染色进一步显示纤维结缔组织在喹硫平处理的心脏血管周围和间质区域中显著积聚。心脏重量与胫骨长度的比率(HW/TL)是反映心肌间质水肿和心脏病变的指标。计算结果显示，在慢性喹硫平处理后，HW/TL显著增加约2倍。与对照小鼠相比，炎症浸润指数显著增加(p<0.01)。纤维结缔组织染色定量分析显示喹硫平暴露的心脏中纤维化组织的面积约为对照心脏的3倍(p<0.001)。在培养的心肌细胞中，透射电子显微镜显示对照细胞显示正常的亚细胞结构，而喹硫平处理的细胞显示细胞膜的崩解，线粒体肿胀和内质网扩张。另外，喹硫平诱导的细胞死亡呈剂量依赖性和时间依赖性，符合临床观察发现长期使用或较高剂量的喹硫平易致心脏毒性；结果表明，喹硫平可诱导心脏毒性。

实施例2喹硫平诱导了心肌细胞坏死性凋亡

鉴于喹硫平诱导线粒体肿胀，细胞膜崩解和内质网扩张，符合细胞坏死性改变。坏死性凋亡的特征在于RIP的级联激活和MLKL的磷酸化并最终易位至细胞膜而导致膜孔形成，本申请中用三种常见的非典型抗精神病药(氯氮平，奥氮平和喹硫平)处理心肌细胞，并检测坏死性凋亡的激活情况，结果显示，任一种药物均可增加RIP1，RIP3和MLKL的表达以及磷酸化的MLKL(p-MLKL)，特别是喹硫平对坏死性凋亡通路相关蛋白表达产生最强的促进作用(图1A)，表明喹硫平可诱导细胞坏死性凋亡。然后我们将心肌HL-1细胞与不同剂量的喹硫平一起孵育(图1B)或与同一浓度的喹硫平孵育不同时间(图1C)，结果显示，喹硫平激活心肌细胞坏死性凋亡通路呈剂量和时间依赖性。进一步本申请采用多重免疫组化IHC分析以共染色RIP3和MLKL(图1D)，结果显示，RIP3(粉红色)和MLKL(棕色)在心肌内表达显著增加，并且重要的是，观察到MLKL从对照组心脏中的细胞质定位转移到喹硫平刺激的心脏中的细胞膜上(图1D)；通过细胞的免疫荧光染色进一步证实喹硫平诱导了MLKL易位(图1E)；细胞膜阳性MLKL计数进一步胞显示，喹硫平暴露24小时后，膜MLKL阳性的心肌细胞百分比增加约5倍(图1F)，结果表明，当引起心肌毒性时，喹硫平诱导了心肌细胞坏死性死亡。

实施例3喹硫平对细胞凋亡，自噬通路的影响很小

本发明研究了喹硫平对其他类型细胞死亡的影响；在与上述相同的条件下孵育细胞；细胞凋亡标志物如半胱天冬酶3(caspase3)和Bcl-2在不同喹硫平处理中保持稳定，LC3B-I向LC3B-II的转化是自噬激活的标志，本发明观察到喹硫平不同剂量或不同处理时间下LC3B-II水平增加非常轻微，在所有不同处理下中，Beclin 1也没有显著变化。

实施例4药理学抑制坏死性凋亡通路可防治喹硫平心脏毒性

Necrostatin-1(Nec-1)是一种公认的坏死性凋亡抑制剂，它特异性地抑制RIP1的活化，在本申请培养的心肌细胞中也证实了Nec-1阻断了坏死性凋亡通路；动物实验中，在喹硫平注射开始前将Nec-1预处理于小鼠，在治疗结束时，对心脏切片进行组织学检查，结果显示Nec-1缓解了喹硫平诱导的心肌损伤，作为心脏病变的反映，HW/TL在Nec-1处理后显著降低(p<0.01)，炎症浸润指数在Nec-1处理前后改变不显著，但Nec-1处理明显减轻了喹硫平引起的心脏纤维化聚集，实验数据提示抑制坏死性凋亡通路可减弱喹硫平的心脏毒性。

实施例5喹硫平处理后引起内源性大麻素系统失衡

据报道，内源性大麻素系统与药物毒性密切相关，为了进一步探讨大麻素受体(CBRs)是否会将细胞外喹硫平毒性信号转导至胞内，本申请收集了来自对照和喹硫平处理的小鼠血清样本，基于LC-MS/MS方法检测了anandamide(AEA)和2-花生四烯酰甘油(2-AG)的水平，结果显示喹硫平暴露后AEA含量下降，喹硫平处理的小鼠中2-AG也显著降低；同样，在培养的心肌细胞中，在喹硫平处理24小时后，2-AG的水平降低了几乎50％；此外，本申请评估了喹硫平对两种CBR亚型(CB1R和CB2R)的影响。结果显示喹硫平处理使得CB1R的总蛋白水平下调，而CB2R的蛋白水平随喹硫平剂量增加或处理时间延长而上调，CBR主要通过胞膜和胞质之间的穿梭来发挥作用；因此本申请进而分别提取胞膜和胞质蛋白并进行蛋白质印迹分析，结果显示随着喹硫平作用，CB1R的蛋白质水平在细胞膜上逐渐减少但在细胞质中增加累，相反，随着喹硫平作用，CB2R富集在细胞膜上而细胞质内含量则减少，结果表明，喹硫平在心肌中以对两种CBR亚型具有反式效应。

实施例6选择性CB1R拮抗剂而不是其激动剂可减轻喹硫平诱导的心肌毒性

本申请比较了选择性CB1R拮抗剂AM281和Rimonabant(Rimo)及其激动剂ACEA对喹硫平心肌毒性的影响，在CB1R拮抗剂的处理中，Rimo或AM281减弱了喹硫平诱导的心脏组织病理改变，在CB1R拮抗剂预处理后，HW/TL显著降低，CB1R拮抗剂也显著缓解了心脏炎症和纤维化重构过程；相反，ACEA的预处理显著恶化了喹硫平诱导的心肌损伤，表现为HW/TL显著增加，炎症浸润增强，在ACEA预处理的心脏中，纤维组织似乎也更加弥漫；结果表明抑制CB1R可以治疗喹硫平心脏毒性。

实施例7选择性CB2R激动剂而不是其拮抗剂可减弱喹硫平诱导的心肌毒性

本申请进一步检测选择性CB2R激动剂JWH-133和AM1241及其拮抗剂AM630对喹硫平心肌毒性的影响，在CB2R激动剂处理后，JWH-133或AM1241减弱了由喹硫平诱导的心脏组织病理学改变，通过CB2R激动剂预处理，喹硫平诱导的HW/TL也显著降低，CB2R激动剂也抑制心肌炎症浸润和纤维化积聚；相反，选择性CB2R拮抗剂AM 630似乎不能缓解炎症，反而使血管周围中纤维结缔组织增多；结果表明CB2R激动剂对喹硫平心脏毒性具有保护作用。

实施例8CBRs药剂调节了坏死性凋亡通路

鉴于观察到喹硫平特异性诱导了心肌细胞坏死性凋亡和CBRs药剂在其心脏毒性中发挥保护作用，本申请然后评估CBR药物是否调节了细胞坏死性凋亡过程；最初，检测了单独的CBR药剂对坏死性凋亡的影响，在不含喹硫平的细胞中，单独的JWH-133可以降低MLKL的蛋白质水平并抑制其磷酸化，AM1241，AM281或Rimonabant(Rimo)的单一处理对坏死性凋亡没有显著影响(图2A)；在喹硫平的刺激下，CB1R拮抗剂和CB2R激动剂一致地降低了RIP1，RIP3，MLKL的蛋白质水平并抑制了MLKL(p-MLKL)的磷酸化(图2B)；为了进一步证实上述观察结果，通过免疫荧光试验揭示了喹硫平使得MLKL易位至胞膜，而任一种CBR药剂(JWH-133，AM1241，AM281或Rimo)恢复了MLKL胞浆定位(图2C)，多重IHC分析还发现，单独使用喹硫平导致MLKL易位至细胞膜(黑色箭头)，同时RIP3(粉红色信号)和MLKL(棕色信号)表达升高；上述任一种CBR试剂(JWH-133，AM1241，AM281或Rimo)处理后使RIP3和MLKL不再升高并稳定了MLKL的胞浆定位(图2D)；实验数据表明，CB1R拮抗剂和CB2R激动剂抑制了喹硫平诱导的心肌细胞坏死性凋亡。

Claims (6)

1.大麻素受体药物在制备治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂中的应用；

所述的大麻素受体药物是1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂或2型大麻素受体(CB2R)激动剂。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的大麻素受体药物抑制心肌细胞坏死性凋亡通路。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗心肌细胞坏死性凋亡药剂具有抑制RIP3或者MLKL活化的作用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的大麻素受体药物抑制MLKL易位。

5.一种用于心肌细胞坏死性凋亡的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有喹硫平标准品和含有喹硫平的抑制剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的喹硫平的抑制剂选自1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂或2型大麻素受体(CB2R)激动剂。

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