CN112007155A - 一种光热免疫纳米纤维、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种光热免疫纳米纤维、其制备方法及用途。所述光热免疫纳米纤维包括免疫活性肽和光热试剂，所述免疫活性肽与光热试剂的摩尔比为4‑50:1。所述光热免疫纳米纤维是通过将免疫活性肽溶液和光热试剂溶液混合，在氢键、静电等相互作用下，利用免疫活性分子对光热试剂的调控组装而形成。本发明提供的光热免疫纳米纤维能够同时发挥光热治疗和免疫调节的优势，具有光热转化效果好，免疫调节作用温和持久，吸收波长可调的优点，能够用于制备肿瘤的光热免疫联合治疗药物。

Description

一种光热免疫纳米纤维、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种光热免疫纳米纤维、其制备方法及用途。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗学快速发展，对恶性肿瘤的治疗攻关提供了强有力的武器。然而，目前其温和的调节效果，在临床应用中仅能发挥20％的治疗效果，因此，免疫调节联合其他治疗模式成为提高临床治疗效果的主要策略。其中，光热治疗便是一种操作简单、生物安全的治疗模式，该治疗方法利用光热试剂对吸收光能进行快速的热量转化，造成肿瘤病灶的局部高温，实现肿瘤细胞的坏死或凋亡。基于此，光热免疫联合在恶性肿瘤的治疗中显示出独特的优势。一方面，光疗可以实现主体肿瘤的快速消融；另一方面，免疫调节则可以在肿瘤后期扩散、转移、复发等过程中发挥长效的抑制作用，联合两种治疗模式，可以延长患者生存期，提高患者生存质量，甚至有望根治肿瘤。

光热免疫联合治疗中光热试剂的选择是核心问题之一。光热转化率高、穿透深度高、代谢机制明确的有机光热小分子在应用过程中显示出高效且安全的优势，如已公开一种基于胆绿素的光热试剂的制备及应用(CN 109224073 A)，生物内源性且具有近红外吸收的的胆绿素有机小分子，验证了其在光热治疗中的有效性，但对于较深的肿瘤治疗，该色素分子的治疗波长需要进一步修饰实现延长。

光热免疫联合治疗的另一核心问题在于免疫分子的选择和设计。目前临床预临床实验中，对于免疫调节分子的选择往往是结构复杂的蛋白质大分子，该类大分子在应用过程中存在着细胞穿透性差、免疫原性高、副作用不明、合成复杂等问题。因此，对于寻求具有高活性、结构明确、作用途径清晰的小分子，成为亟待解决的科学问题；此外，对于免疫分子与其他治疗模式的耦合，往往是采用将不同种活性药物的包载或前后分开注射的方式，其较低的药物包载浓度、辅料用量大及繁琐的注射、治疗模式，限制了进一步应用。

因此，在本领域，期望寻求效力高的光热及免疫小分子，采取简单的方法实现二者的有机整合，最终达到在肿瘤治疗过程中疗效联合增强的目的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种光热免疫纳米纤维、其制备方法及用途。本发明提供的制备方法简单，组装效率高，制备的纳米纤维能够同时发挥光热治疗和免疫调节的优势，具有光热转化效果好，免疫调节作用温和持久，吸收波长可调的优点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种光热免疫纳米纤维，所述光热免疫纳米纤维包括免疫活性肽和光热试剂，所述免疫活性肽和光热试剂的摩尔比为4-50:1(例如可以是4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、15:1、18:1、20:1、22:1、25:1、28:1、30:1、32:1、35:1、38:1、40:1、42:1、45:1或50:1等)。

本发明通过免疫活性肽和光热试剂之间的氢键、静电等相互作用，使二者自组装形成了一种纤维状纳米材料，其同时具有光热效应和免疫活性，能够同时发挥光热治疗和免疫调节的优势，具有光热转化效果好，免疫调节作用温和持久的优点，能够用于肿瘤的光热免疫联合治疗。

本发明提供的纳米纤维增强了光热试剂分子在治疗波长处的光热转化能力；同时，组装效应提高了药物对光降解的抵御能力。而且，该纳米纤维的吸收波长(治疗穿透深度)还能够通过改变免疫活性肽和光热试剂的比例进行调节，从而适应不同深度肿瘤的治疗。

本发明中，若免疫活性肽和光热试剂的摩尔比过低，则不利于纤维结构的形成；若免疫活性肽和光热试剂的摩尔比过高，则免疫活性肽会因自身的分子间弱相互作用形成组装结构，不利于其与光热试剂的共组装。

作为本发明的优选技术方案，所述免疫活性肽包含2-30个(例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、12个、15个、18个、20个、22个、25个、28个或30个等)氨基酸片段。

优选地，所述免疫活性肽选自胸腺肽、组氨酸脱羧酶抑制剂肽、抗原肽和免疫检查点阻断肽中的任意一种或至少两种的组合。出于结构及效果明确的考虑，所述免疫活性肽进一步优选为胸腺肽和/或组氨酸脱羧酶抑制剂肽。

优选地，所述胸腺肽为胸腺肽α1和/或胸腺五肽，进一步优选为胸腺五肽。

优选地，所述组氨酸脱羧酶抑制剂肽为含有N端完整的组氨酸-苯丙氨酸二肽结构的肽。

优选地，所述组氨酸脱羧酶抑制剂肽选自组氨酸-苯丙氨酸二肽、组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸三肽和组氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸三肽中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为组氨酸-苯丙氨酸二肽。

作为本发明的优选技术方案，所述光热试剂的吸收波长≥680nm；例如可以是680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm、740nm、750nm、760nm等。

选用吸收波长较长的光热试剂，有利于提高治疗穿透深度，有利于对位置较深的肿瘤的治疗。

优选地，所述光热试剂选自吲哚菁绿、近红外花菁IR140、近红外花菁IR806、黑色素和黑色素衍生物中的任意一种或至少两种的组合。吲哚菁绿作为已获得美国食品和药物管理局批准用于临床成像的试剂，不仅源于生命有机体，且具有更长的近红外吸收波长，是一种极佳的光热分子，因此所述光热试剂进一步优选为吲哚菁绿。

作为本发明的优选技术方案，所述光热免疫纳米纤维的直径为2-200nm；例如可以是2nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、80nm、100nm、120nm、150nm、180nm或200nm等。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的光热免疫纳米纤维的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备免疫活性肽溶液和光热试剂溶液；

(2)将所述免疫活性肽溶液和光热试剂溶液混合，其中免疫活性肽和光热试剂的摩尔比为4-50:1，调节pH至6.5-7.5(例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等)，得到混合溶液；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液避光老化，得到光热免疫纳米纤维。

本发明的光热免疫纳米纤维是通过免疫活性分子对光热试剂的调控组装(主要是氢键和静电作用)实现的，该方法操作简单，组装效率高，制备的纳米纤维光热转化效果好，免疫调节作用温和持久。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述光热试剂溶液的浓度为0.1-4mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL或4mg/mL等；进一步优选为0.1-2mg/mL。

优选地，所述免疫活性肽为胸腺肽，步骤(1)中所述免疫活性肽溶液的溶剂为水。

优选地，所述免疫活性肽为组氨酸脱羧酶抑制剂肽，步骤(1)中所述免疫活性肽溶液的溶剂为摩尔浓度为0.01-1mol/L的NaOH水溶液。

作为本发明的优选技术方案，步骤(2)所述混合溶液中，光热试剂的浓度为0.1-2mg/mL；例如可以是0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL或2mg/mL等。

本发明中，所述混合溶液中光热试剂的浓度保持在上述范围内，有助于纳米纤维的形成。若光热试剂的浓度过低，则分子间氢键作用力低，免疫活性肽和光热试剂不易于组装成纤维，可能形成类球形结构；若光热试剂的浓度过高，由于光热试剂分子的自聚集效应，可能形成自聚物或不规则聚集体。

本发明对混合溶液中免疫活性肽的浓度没有特殊限制，其与光热试剂的摩尔比保持在4-50:1范围内即可。

优选地，所述免疫活性肽为胸腺肽，步骤(2)中所述混合溶液的pH为6.8-7.3；例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3等。

优选地，所述免疫活性肽为组氨酸脱羧酶抑制剂肽，步骤(2)中所述混合溶液的pH为6.5-7.5；例如可以是6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5等。

作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中所述老化的温度为0-25℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、8℃、10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、22℃或25℃等；进一步优选为0-4℃。

优选地，步骤(3)中所述老化的时间为4-72h，例如可以是4h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、50h、60h、70h或72h等；进一步优选为12-24h。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的光热免疫纳米纤维的用途，其特征在于，所述光热免疫纳米纤维用于制备肿瘤的光热免疫联合治疗药物，优选用于制备食道瘤、膀胱瘤、胰腺瘤或黑色素瘤的光热免疫联合治疗药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的纳米纤维增强了光热试剂分子在治疗波长处的光热转化能力；同时，组装效应提高了药物对光降解的抵御能力。而且，可以通过改变免疫活性肽和光热试剂的比例，调节纳米纤维的吸收波长，从而调节治疗穿透深度。

2、本发明提供的光热免疫纳米纤维同时具有光热效应和免疫活性，其中，光热试剂能够快速杀伤主体肿瘤，免疫活性成分在光热消融主体肿瘤后，对于残余肿瘤细胞的消除、肿瘤复发转移的抑制具有长效的调节效果，对于治疗在体位置较深，且易于复发、转移的肿瘤具有独特的优势。

3、本发明采用的制备方法为组装调控，整个制备过程绿色简单，无需辅料成分的添加，活性组分完全参与结构形成，效力高。

附图说明

图1为实施例1所得胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维溶液的实物图；

图2为实施例2所得胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维的透射电子显微镜照片；

图3为实施例3所得样品的紫外可见吸收光谱图；

图4为实施例4所得组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维、吲哚菁绿单体及控制组的光热转化曲线图；

图5为实施例4所得组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维、吲哚菁绿单体及生理盐水控制组的在体光热转化曲线图；

图6为经实施例1所得胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维、吲哚菁绿单体及生理盐水控制组处理的胰腺癌小鼠模型的荧光成像照片；

图7为经实施例4所得组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维、吲哚菁绿单体及生理盐水控制组处理的黑色素瘤小鼠模型的免疫细胞因子含量图；

图8为实施例8所得的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-近红外花菁IR806纳米纤维的透射电子显微镜照片；

图9为对比例1所得的胸腺五肽-吲哚菁绿形成的类球形组装结构的透射电子显微镜照片；

图10为对比例2所得的胸腺五肽-吲哚菁绿形成的不规则聚集体结构的透射电子显微镜照片；

图11为对比例3所得的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿混合沉底溶液的实物图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维，其制备方法如下：

分别配制体积质量浓度为8mg/mL的胸腺五肽水溶液，体积质量浓度为0.4mg/mL的吲哚菁绿水溶液；将500μL胸腺五肽水溶液加入到500μL吲哚菁绿水溶液中，并混合混匀，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维，其中，胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为23.3:1。

图1为本实施例得到的胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维溶液的光学照片，从图1可以看出，所得纳米纤维分散均匀、乳光良好。

实施例2

本实施例提供一种胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维，其制备方法如下：

分别配制体积质量浓度为16mg/mL的胸腺五肽水溶液，体积质量浓度为4mg/mL的吲哚菁绿水溶液；将500μL胸腺五肽水溶液与500μL吲哚菁绿水溶液混合后，用1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在25℃下避光老化12h，得到胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维，其中胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为4.7:1。

用透射电子显微镜对本实施例提供的胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维进行表征，结果如图2所示，可以看出，纳米纤维形貌均一，纤维直径<50nm。

实施例3

分别配制体积质量浓度为8mg/mL的胸腺五肽水溶液，体积质量浓度为0.2mg/mL的吲哚菁绿水溶液；

样品1：将500μL胸腺五肽水溶液和500μL吲哚菁绿水溶液混合，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到胸腺五肽4mg/mL-吲哚菁绿0.1mg/mL的样品1(胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为46.5:1)。

样品2：将20μL胸腺五肽水溶液与500μL吲哚菁绿水溶液混合，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2，用超纯水定容至1mL并分散均匀；在25℃下避光老化12h，得到胸腺五肽0.16mg/mL-吲哚菁绿0.1mg/mL的样品2(胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为1.9:1)；

样品3：将500μL吲哚菁绿水溶液与500μL超纯水混合，得到0.1mg/mL吲哚菁绿水溶液控制组。

对本实施例得到的3组样品进行紫外-可见吸收光谱表征测试，光谱如图3所示，可以看出，样品2中胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比<2:1，吲哚菁绿光谱位置没有移动，说明没有组装体形成；而样品1中胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为46.5:1，吲哚菁绿光谱呈现出明显红移，说明形成了纤维状组装体，红移的波长有利于提高后续的治疗穿透深度。

实施例4

本实施例提供一种组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维，其制备方法如下：

配制体积质量浓度为1mg/mL的吲哚菁绿水溶液；以摩尔浓度为1mol/L的NaOH水溶液为溶剂，配制体积质量浓度为8mg/mL的组氨酸-苯丙氨酸二肽溶液；将500μL组氨酸-苯丙氨酸二肽溶液与500μL吲哚菁绿水溶液混合并分散均匀，加入1mol/L的HCl水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维，其中，组氨酸脱羧酶抑制剂肽/吲哚菁绿摩尔比为20.9:1。

将500μL吲哚菁绿水溶液与500μL超纯水混合，得到0.5mg/mL吲哚菁绿水溶液控制组。

对本实施例所得的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维进行光热测试，以吲哚菁绿吲哚菁绿水溶液及超纯水作为控制组，选用808nm波长、功率为1W/cm²的激光分别对三组样品连续照射10min，绘制升温曲线，结果如图4所示，可以看出，组氨酸-苯丙氨酸二肽调节吲哚菁绿形成纳米纤维后，并不影响吲哚菁绿分子本身的光热转化。

实施例5

将实施例4所得的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维进行超滤浓缩：取200μL纳米纤维溶液加入10kDa的超滤管中，进行1000rpm，10min超滤浓缩，浓缩后纳米纤维体积约为100μL，并进行活体层次的光热转化效果测试。

活体肿瘤模型建立如下：C57BL/6雄性小鼠原位胰腺癌模型，将培养并重悬好的Pan02小鼠胰腺癌细胞按照1×10⁶个细胞的密度接种于小鼠胰腺位置，当肿瘤体积长至50±10mm³的时候，对小鼠进行开腹、原位药物注射(50μL超滤浓缩后的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维、50μL,1mg/mL吲哚菁绿单体溶液、50μL生理盐水)，待药物扩散25min后，对小鼠进行激光照射(808nm，0.6W/cm²，10min)，同时使用热红外成像仪对于小鼠原位肿瘤温度进行监测。

测试结果如图5所示：使用组氨酸-苯丙氨酸二肽调控吲哚菁绿形成的纳米纤维，在体升温效果优于吲哚菁绿单体组，这是因为形成的纤维结构可以增强吲哚菁绿在808nm激光处的吸收，且形成的纤维结构可以增强药物在肿瘤病灶的保留浓度，所以具有更高效的光热转化效率。

实施例6

将实施例2中所得的胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维进行超滤浓缩：取200μL纳米纤维加入10kDa的超滤管中，进行1000rpm，10min超滤浓缩，浓缩后纳米纤维体积约为100μL，并进行活体层次的光热治疗效果测试。

活体肿瘤模型建立如下：C57BL/6雄性小鼠原位胰腺癌模型，对Pan02小鼠胰腺癌细胞进行荧光素酶(Luciferase，Luc)标记得到Pan02-luc细胞，将培养并重悬好的细胞按照1×10⁶个细胞的密度接种于小鼠胰腺位置，当肿瘤体积长至50±10mm³的时候，对小鼠进行开腹、原位药物注射(50μL超滤浓缩后的胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维溶液、50μL 0.2mg/mL吲哚菁绿单体溶液、50μL生理盐水)，待药物扩散25min后，对小鼠进行激光照射(808nm，0.6W/cm²，10min)，并对小鼠的肿瘤变化进行监测，为期21d。小鼠肿瘤大小变化可以通过荧光强度判断，注射荧光素钾为底物，在ATP和荧光素酶的氧化作用下，荧光素钾发光，由此作为肿瘤强度变化的标志。

测试结果如图6所示：胸腺五肽-吲哚菁绿纳米纤维组的小鼠肿瘤荧光消失，吲哚菁绿单体组的荧光强度居中，生理盐水控制组肿瘤荧光强度最强，说明纳米纤维的抑瘤效果最好，原因包括光热转化效果的增强以及后期机体的抗肿瘤免疫调节两方面。

实施例7

将实施例4所得的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维进行免疫效果验证，设置同浓度的吲哚菁绿单体、PBS磷酸盐缓冲液为控制组。

活体肿瘤模型建立如下：建立雌性小鼠皮下黑色素瘤模型，将培养并重悬好的B16-F10小鼠黑色素肿瘤细胞按照5×10⁶个细胞的密度接种于小鼠背部左下，每待肿瘤体积长到100±30mm³的时候对小鼠光热免疫治疗：尾静脉注射200μL体积药物(组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维溶液、吲哚菁绿单体溶液、PBS磷酸盐缓冲液)，8h后对肿瘤进行激光照射(808nm，0.4/W cm²，10min)，21d后取小鼠脾脏进行红细胞裂解，离心，清洗并将脾脏细胞分散于培养基中孵育24h，孵育结束后进行特异性抗体染色、并用流式细胞仪测试白介素4和干扰素γ的含量，白介素4用于指示CD4⁺细胞的激活，干扰素γ用于指示CD8⁺细胞的激活。

测试结果如图7所示：组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿纳米纤维组的白介素4以及γ干扰素均高于其他两组控制组，说明注射纳米纤维组的小鼠免疫系统激活，发挥了更佳的抗肿瘤治疗效果。

实施例8

本实施例提供一种组氨酸脱羧酶抑制剂肽-近红外花菁IR806纳米纤维，其制备方法如下：

配制体积质量浓度为2mg/mL的近红外花菁IR806水溶液；以摩尔浓度为0.1mol/L的NaOH水溶液为溶剂，配制体积质量浓度为4mg/mL的组氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸三肽溶液；将500μL组氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸三肽溶液与500μL近红外花菁IR806水溶液混合并分散均匀，加入0.1mol/L的HCl水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到组氨酸脱羧酶抑制剂肽-近红外花菁IR806纳米纤维，其中，组氨酸脱羧酶抑制剂肽/近红外花菁IR806摩尔比为3.4:1。

用透射电子显微镜对本实施例提供的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-近红外花菁IR806纳米纤维进行表征，结果如图8所示，可以看出，纳米纤维形貌均一，纤维直径<50nm。

对比例1

分别配制体积质量浓度为2mg/mL的胸腺五肽水溶液，体积质量浓度为0.1mg/mL的吲哚菁绿水溶液；将500μL胸腺五肽水溶液加入到500μL吲哚菁绿水溶液中，并混合混匀(吲哚菁绿浓度为0.05mg/mL)，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到胸腺五肽-吲哚菁绿混合溶液，其中，胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为23.3:1。

用透射电子显微镜对对比例1提供的胸腺五肽-吲哚菁绿混合溶液进行表征，结果如图9所示，可以看出，由于吲哚菁绿浓度低于0.1mg/mL，与胸腺五肽氢键结合位点低，疏水作用较强，因此形成类球形的组装结构，未形成纤维状结构。

对比例2

分别配制体积质量浓度为24mg/mL的胸腺五肽水溶液，体积质量浓度为6mg/mL的吲哚菁绿水溶液；将500μL胸腺五肽水溶液加入到500μL吲哚菁绿水溶液中，并混合混匀(吲哚菁绿浓度为3mg/mL)，用0.1mol/L的NaOH水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在25℃下避光老化12h，得到胸腺五肽-吲哚菁绿混合溶液，其中，胸腺五肽与吲哚菁绿摩尔比为4.7:1。

用透射电子显微镜对对比例2提供的胸腺五肽-吲哚菁绿混合溶液进行表征，结果如图10所示，可以看出，由于吲哚菁绿浓度过高(>2mg/mL)，自聚效应比较明显，分散体系中多为不规则聚集体，未形成纤维结构。

对比例3

配制体积质量浓度为0.2mg/mL的吲哚菁绿水溶液；以摩尔浓度为0.1mol/L的NaOH水溶液为溶剂，配制体积质量浓度为10mg/mL的组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸三肽溶液；将500μL组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸三肽溶液与500μL吲哚菁绿水溶液混合并分散均匀，加入0.1mol/L的HCl水溶液调节混合溶液pH值至7.2；在4℃下避光老化24h，得到组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿混合液，其中，组氨酸脱羧酶抑制剂肽/吲哚菁绿摩尔比为125.4:1。

图11为本对比例得到的组氨酸脱羧酶抑制剂肽-吲哚菁绿混合溶液的实物光学照片，从图11中可以看出，由于组氨酸脱羧酶抑制剂肽和光热试剂的摩尔比过高，则肽分子会因自身的弱相互作用，如疏水作用力，形成沉淀物，不利于其与光热试剂的共组装。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种光热免疫纳米纤维，其特征在于，所述光热免疫纳米纤维包括免疫活性肽和光热试剂，所述免疫活性肽与光热试剂的摩尔比为4-50:1。

2.根据权利要求1所述的光热免疫纳米纤维，其特征在于，所述免疫活性肽包含2-30个氨基酸片段；

优选地，所述免疫活性肽选自胸腺肽、组氨酸脱羧酶抑制剂肽、抗原肽和免疫检查点阻断肽中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为胸腺肽和/或组氨酸脱羧酶抑制剂肽；

优选地，所述胸腺肽为胸腺肽α1和/或胸腺五肽，进一步优选为胸腺五肽；

优选地，所述组氨酸脱羧酶抑制剂肽为含有N端完整的组氨酸-苯丙氨酸二肽结构的肽；

优选地，所述组氨酸脱羧酶抑制剂肽选自组氨酸-苯丙氨酸二肽、组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸三肽和组氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸三肽中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为组氨酸-苯丙氨酸二肽。

3.根据权利要求1或2所述的光热免疫纳米纤维，其特征在于，所述光热试剂的吸收波长≥680nm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的光热免疫纳米纤维，其特征在于，所述光热试剂选自吲哚菁绿、近红外花菁IR140、近红外花菁IR806、黑色素和黑色素衍生物中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为吲哚菁绿。

5.根据权利要求1-4任一项所述的光热免疫纳米纤维，其特征在于，所述光热免疫纳米纤维的直径为2-200nm。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的光热免疫纳米纤维的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备免疫活性肽溶液和光热试剂溶液；

(2)将所述免疫活性肽溶液和光热试剂溶液混合，其中免疫活性肽和光热试剂的摩尔比为4-50:1，调节pH至6.5-7.5，得到混合溶液；

(3)将步骤(2)得到的混合溶液避光老化，得到光热免疫纳米纤维。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述光热试剂溶液的浓度为0.1-4mg/mL，优选为0.1-2mg/mL；

优选地，所述免疫活性肽为胸腺肽，步骤(1)中所述免疫活性肽溶液的溶剂为水；

优选地，所述免疫活性肽为组氨酸脱羧酶抑制剂肽，步骤(1)中所述免疫活性肽溶液的溶剂为摩尔浓度为0.01-1mol/L的NaOH水溶液。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述混合溶液中，光热试剂的浓度为0.1-2mg/mL；

优选地，所述免疫活性肽为胸腺肽，步骤(2)中所述混合溶液的pH为6.8-7.3；

优选地，所述免疫活性肽为组氨酸脱羧酶抑制剂肽，步骤(2)中所述混合溶液的pH为6.5-7.5。

9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述老化的温度为0-25℃，进一步优选为0-4℃；

优选地，步骤(3)中所述老化的时间为4-72h，进一步优选为12-24h。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的光热免疫纳米纤维的用途，其特征在于，所述光热免疫纳米纤维用于制备肿瘤的光热免疫联合治疗药物，优选用于制备食道瘤、膀胱瘤、胰腺瘤或黑色素瘤的光热免疫联合治疗药物。

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