CN111999878B - 一种显微成像系统及其实时对焦方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种显微成像系统及其实时对焦方法，其中显微成像系统，包括：主光源；聚光镜，所述聚光镜位于所述主光源的上方，且所述聚光镜的光轴与所述主光源的光轴相互重合设置；成像单元，所述成像单元位于所述聚光镜的上方，且所述成像单元的光轴与所述聚光镜的光轴相互重合设置；还包括：辅助光源，用于在所述成像单元获取的图像中产生衍射环；所述辅助光源位于所述聚光镜下方的焦平面上，且所述辅助光源偏离所述聚光镜的光轴。通过采用本发明，保证了显微成像系统对焦的精度和效率。

Description

一种显微成像系统及其实时对焦方法

本申请是申请日为2017年11月16日，申请号为201711133587.3，发明名称：一种显微成像系统及其实时对焦方法的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种成像系统及其对焦方法，尤其涉及一种显微成像系统及其对焦方法。

背景技术

显微成像过程中，需要时刻保持物镜能够对样品进行清晰成像。因此，显微成像系统中对焦是前提。现有技术中，自动对焦技术主要分为两类：一类是基于图像灰度对比度分析法的被动对焦方法。另一类是基于测距法的主动对焦方法。被动对焦方法是通过改变相机与目标物间的距离获取多幅图像，分析图像特征实现的。这种方法需要使镜头的移动距离长，以及连续采集多幅图像计算相应位置清晰度来构成一条曲线，根据该曲线极大值判定焦点位置。被动对焦方法计算量较大，需要镜头多次位移，难以满足实时对焦过程中快速精准的要求。主动对焦方法通过添加额外的信号发射接收装置实现对焦，常见的有红外测距、超声波测距和三角测距法等。当被测目标对红外光或超声波有较强的吸收作用时，主动对焦方法容易失灵或对焦不准确。特别是对于显微对焦而言，高倍率物镜的使用使得焦深大幅降低(微米级)，红外测距、超声测距以及三角测距的精度都很难满足该要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种显微成像系统及其对焦方法，解决显微成像系统对焦精度差的问题。

为实现上述发明目的，本发明提供一种显微成像系统，包括：

主光源；

聚光镜，所述聚光镜位于所述主光源的上方，且所述聚光镜的光轴与所述主光源的光轴相互重合设置；

成像单元，所述成像单元位于所述聚光镜的上方，且所述成像单元的光轴与所述聚光镜的光轴相互重合设置；

还包括：

辅助光源，用于在所述成像单元获取的图像中产生衍射环；

所述辅助光源位于所述聚光镜下方的焦平面上，且所述辅助光源偏离所述聚光镜的光轴。

根据本发明的一个方面，所述成像单元包括：

物镜，所述物镜位于所述聚光镜的上方，且所述物镜的光轴与所述聚光镜的光轴相互重合设置；

聚合镜，所述聚合镜位于所述物镜的上方，且所述聚合镜的光轴与所述物镜的光轴相互重合设置。

根据本发明的一个方面，还包括：

载物台，所述载物台位于所述物镜与所述聚光镜之间；

成像相，所述成像相机位于所述聚合镜的上方，且所述成像相机的光轴与所述聚合镜的光轴相互重合设置；

中央控制单元，所述中央控制单元与所述成像单元相连接；

驱动装置，用于调节所述物镜与载物台之间的距离。

为实现上述发明目的，本发明提供一种实时对焦方法，包括：

S1.使载物台位于物镜的焦点位置；

S2.以预定间隔距离调整所述物镜与所述载物台之间的距离，通过所述物镜获取样品离焦图像；

S3.根据所述样品离焦图像生成具有衍射环的离焦自相关图像，并获取所述衍射环的半径值；

S4.重复S2-S3，根据所述半径值与所述预定间隔距离获取离焦关系曲线；

S5.获取样品图像，并根据所述样品图像获取其衍射环的半径值；

S6.根据所述离焦关系曲线，控制所述载物台(5)保持在所述物镜(31)的焦点位置。

根据本发明的一个方面，S1步骤中包括：

S11.打开主光源，使所述载物台位于所述物镜的焦点位置；

S12.关闭所述主光源，打开辅助光源，通过成像相机获取所述载物台上样品的在焦图像。

根据本发明的一个方面，S3步骤中，包括：

S31.将所述样品离焦图像进行傅里叶变换，获取所述样品离焦图像的功率谱信息；

S32.将所述样品离焦图像的功率谱信息进行逆傅里叶变换获取中间图像；

S33.对所述中间图像进行自相关处理，生成离焦光强分布图；

S34.根据所述离焦光强分布图中光强主极大和光强次极大之间的像素差获取所述衍射环的半径值。

根据本发明的一种方案，通过采用本发明的衍射光发生单元，使显微成像系统在离焦状态下能够根据对离焦图像进行自相关处理即可获取衍射环的半径。根据自相关处理后的离焦自相关图像生成光强分布图，根据光强分布图中的光强主极大和光强次级大之间的像素值，就可计算一级衍射环的半径值。根据光强主极大和光强次级大之间的像素值得出的一级衍射环的半径值快速准确，实现对显微成像系统的实时对焦，保证了显微成像系统对焦的精度和效率。

根据本发明的一种方案，衍射光发生单元结构简单，装拆方便。通过上述衍射光发生单元的设置方式，将衍射光发生单元安装到显微成像系统中时，对显微成像系统的改动小，从而保证了限位成像系统的成像稳定，以及显微成像系统的结构稳定。同时，采用本发明的衍射光发生单元节省成本，易于实现。

附图说明

图1示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的结构图；

图2示意性表示根据本发明的一种实施方式的实时对焦方法的步骤框图；

图3示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的样品在焦自相关图；

图4示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的样品在焦光强分布图；

图5示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的不同衍射光发生单元位置与样品在焦光强分布图；

图6示意性表示根据本发明的一种实施方式的实时对焦方法的离焦图像处理步骤框图；

图7示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的样品离焦自相关图；

图8示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的样品离焦光强分布图；

图9示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的不同离焦量下样品离焦光强分布图；

图10示意性表示根据本发明的一种实施方式的显微成像系统的离焦曲线的坐标图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

在针对本发明的实施方式进行描述时，术语″纵向″、″横向″、″上″、″下″、″前″、″后″、″左″、″右″、″竖直″、″水平″、″顶″、″底″″内″、″外″所表达的方位或位置关系是基于相关附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细地描述，实施方式不能在此一一赘述，但本发明的实施方式并不因此限定于以下实施方式。

如图1所示，根据本发明的一种实施方式，本发明的显微成像系统包括主光源1、聚光镜2、成像单元3、衍射光发生单元4、载物台5、成像相机6、中央控制单元7和驱动装置8。在本实施方式中，聚光镜2的光轴与主光源1的光轴相互重合，并且聚光镜2位于主光源1的上方。成像单元3的光轴与聚光镜2的光轴相重合，并且成像单元3位于聚光镜2的上方。载物台5位于成像单元3和聚光镜2之间。成像相机6的光轴与成像单元3的光轴相重合，并且成像相机6位于成像单元3的上方。中央控制单元7分别与成像相机6和驱动装置8相连接。通过中央控制单元7可以获取成像相机6摄取的图像，并且通过中央控制单元7控制驱动装置8调整载物台5和成像单元3之间的距离，使成像单元3能够进行调焦。

如图1所示，根据本发明的一种实施方式，成像单元3包括物镜31和聚合镜32。在本实施方式中，物镜31的光轴与聚光镜2的光轴相重合，并且物镜31位于聚光镜2的上方。聚合镜32的光轴与物镜31的光轴相重合，并且聚合镜32位于物镜31的上方。在本实施方式中，通过物镜31对载物台5上的样品A进行成像，并通过聚合镜32将所成的图像传输到成像相机6中。

如图1所示，根据本发明的一种实施方式，衍射光发生单元4位于聚光镜2的下方。在本实施方式中，衍射光发生单元4包括辅助光源41。辅助光源41位于聚光镜2下方的焦平面上，并且辅助光源41偏离聚光镜2的光轴。

为进一步详细说明本发明，结合附图对本发明的成像系统的对焦方法进行详细阐述。

如图2所示，根据本发明的实时对焦方法包括：

S1.使载物台5位于物镜31的焦点位置；

S2.以预定间隔距离调整物镜31与载物台5之间的距离，获取离焦图像；

S3.根据离焦图像生成具有衍射环的离焦自相关图像，并获取衍射环的半径值；

S4.重复S2-S3，根据半径值与预定间隔距离获取离焦关系曲线；

S5.根据物镜31获取样品图像，并根据样品图像获取其衍射环的半径值

S6.根据离焦关系曲线，控制载物台5保持在物镜31的焦点位置。结合图1和图2所示，根据本发明的一种实施方式，S1步骤中，包括：

S11.打开主光源1，使载物台5位于物镜31的焦点位置。在本实施方式中，打开主光源1使载物台5上的样品A成像，中央控制单元7通过成像相机6获取样品A的图像。中央控制单元7根据预先设定的MTF曲线，控制驱动装置8运动，调整载物台5和物镜31之间的距离，使调整载物台5位于物镜31的焦点位置，使成像相机6获取样品A的图像最清晰。在本实施方式中，驱动装置8可以驱动载物台5或者物镜31沿竖直方向运动，使载物台5位于物镜31的焦点位置。

S12.关闭主光源1，打开辅助光源41，通过成像相机6获取载物台5上样品A的在焦图像。在本实施方式中，关闭主光源1，将位于聚光镜2下方的焦平面位置的辅助光源41打开，辅助光源41发出倾斜光。中央控制单元7通过成像相机6获取样品A的在焦图像并在自相关处理后获取在焦自相关图像(即图3中的亮点位置)，通过在焦自相关图像获取在焦光强分布图(参见图4)。如图4所示，辅助光源41发出倾斜光时，中央控制单元7获取的样品在焦图像的在焦光强分布图中的光强主极大B的两侧出现阶跃台阶C。通过改变辅助光源41在聚光镜2下方的焦平面上的位置(聚光镜2的光轴与焦平面的垂直交点除外)，光强主极大B的值和光强主极大B两侧的阶跃台阶C也随之改变。如图5所示，图中的子图片依次由(a)至(d)可看出，辅助光源41在聚光镜2下方的焦平面上的位置距离聚光镜2的光轴越远，其光强主极大B的值随之减小，并且阶跃台阶C的宽度随之增加。

在本实施方式中，在焦图像进行自相关处理之前，将在焦图像进行傅里叶变换，并获取在焦图像的功率谱信息。根据获取的功率谱信息进行逆傅里叶变换。在焦图像进行自相关处理之后，求取自相关处理后的图像中的光强，从而生成在焦光强分布图。

结合图1和图2所示，根据本发明的一种实施方式，S2步骤中，以预定间隔距离调整物镜31与载物台5之间的距离。在本实施方式中，将预定间隔距离设置为1微米。辅助光源41的位置固定，中央控制单元7控制驱动装置8沿竖直方向驱动载物台5或者物镜31移动1微米。中央控制单元7通过成像相机6获取样品A的样品离焦图像。

结合图1、图2和图6所示，根据本发明的一种实施方式，S3步骤中，根据样品离焦图像生成具有衍射环的离焦自相关图像。在本实施方式中，还包括：

S31.将样品离焦图像进行傅里叶变换，获取样品离焦图像的功率谱信息；

S32.将样品离焦图像的功率谱信息进行逆傅里叶变换获取中间图像；

S33.对中间图像进行自相关处理，生成离焦光强分布图；

S34.根据离焦光强分布图中光强主极大和光强次极大之间的像素差获取衍射环的半径值。

在本实施方式中，对中间图像进行自相关处理生成离焦自相关图像(参见图7)，对比图3和图7可知，在离焦自相关图像中的样品A的图像周围出现了半圆形衍射环，在本实施方式中，通过前述衍射光发生单元4，半圆形的衍射环为一级衍射环。根据离焦自相关图像生成离焦光强分布图(参见图8)，如图8中所示，光强主极大B的两侧出现了光强次极大D。通过计算光强主极大B和光前次级大D之间的距离就可以得出衍射环的半径值。

如图7所示，根据本发明的一种实施方式，通过调整辅助光源41的位置，调整在离焦自相关图像中两个衍射半环弦的中线与样品所成像中心对齐，使衍射半环弦的中线与CCD像面平行，即衍射半环弦中线与离焦自相关图像的边缘平行，方便后续的衍射环半径测量，使衍射环的半径计算更加方便。

如图1所示，根据本发明的一种实施方式，通过改变辅助光源41的位置，在离焦自相关图像中的样品A的图像周围出现的半圆形衍射环为一个或两个。

结合图1和图2所示，根据本发明的一种实施方式，S4步骤中，重复S2-S3，根据半径值与预定间隔距离获取离焦关系曲线。在本实施方式中，重复步骤S2，中央控制单元7控制驱动装置8以1微米的距离间隔，沿同一方向多次(两次、三次或者更多)移动物镜31或者载物台5，中央控制单元7通过成像相机6获取多张(两张、三张或者更多)样品A的样品离焦图像。驱动装置8每移动一次，则中央控制单元7获取一张样品A的样品离焦图像。通过采用S3步骤中的实施方式，获取多张(两张、三张或者更多)离焦自相关图像，根据多张(两张、三张或者更多)离焦自相关图像生成多张(两张、三张或者更多)离焦光强分布图。如图9所示，同种具有四张不同离焦距离下的离焦光强分布图，由图中子图片依次按(a)至(d)的顺序，驱动装置8驱动物镜31与载物台5之间的距离逐渐增大，光强次级大D与光强主极大B之间的距离逐渐增大，并且光强主极大B的值组件减小。在本实施方式，中央控制单元7需要通过成像相机6获取30张样品A的样品离焦图像，即驱动装置8需要沿同一方向行进的总长度为30微米。

在本实施方式中，将获取的30张样品A的样品离焦图像均进行自相关处理生成离焦自相关图像，并获取光强分布图。根据获取的30张光强分布图，获取30个光强次级大D与光强主极大B之间的像素差值(即衍射环的半径值)。如图10所示，按照离焦量(即驱动装置8以预定间隔距离行进的长度)与半径值(即光强次级大D与光强主极大B之间的像素差值)在直角坐标戏中绘制坐标点E，将绘制的坐标点E通过曲线进行拟合生成离焦关系曲线F。

在本实施方式中，拟合生成的离焦关系曲线F满足：

y＝kx+b

其中，y为离焦量，x为衍射环半径值。在测得衍射环半径后即可利用前述离焦关系曲线拟合所解出的k和b的值。根据上述公式，获取衍射环半径x的值，即可得出相应的离焦量的值。

根据本发明的一种实施方式，S5步骤中，根据半径值与离焦关系曲线F，使载物台5保持在物镜3的焦点位置。在本实施方式中，中央控制单元7通过成像相机6获取的样品A的图像并进行自相关处理，获取处理后图像中的衍射环的半径值(即光强次级大D与光强主极大B之间的距离)，并根据生成的离焦关系曲线F就可以获取当前显微成像系统的离焦量。根据获取的离焦量，中央控制单元7控制驱动装置8调整物镜31与载物台5之间的距离，使载物台5始终位于物镜31的焦点上，从而实现了成像系统的实时对焦。

根据本发明，衍射光发生单元4结构简单，装拆方便。通过上述衍射光发生单元4的设置方式，将衍射光发生单元4安装到显微成像系统中时，对显微成像系统的改动小，从而保证了限位成像系统的成像稳定，以及显微成像系统的结构稳定。同时，采用本发明的衍射光发生单元4节省成本，易于实现。

根据本发明，通过采用本发明的衍射光发生单元4，使显微成像系统系统在离焦状态下能够根据对离焦图像进行自相关处理即可获取衍射环的半径，通过计算衍射环的半径值，实现对显微成像系统的实时对焦，保证了显微成像系统对焦的精度和效率。

上述内容仅为本发明的具体方案的例举，对于其中未详尽描述的设备和结构，应当理解为采取本领域已有的通用设备及通用方法来予以实施。

以上所述仅为本发明的一个方案而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种显微成像系统，包括：

主光源(1)；

聚光镜(2)，所述聚光镜(2)位于所述主光源(1)的上方，且所述聚光镜(2)的光轴与所述主光源(1)的光轴相互重合设置；

成像单元(3)，所述成像单元(3)位于所述聚光镜(2)的上方，且所述成像单元(3)的光轴与所述聚光镜(2)的光轴相互重合设置；

其特征在于，还包括：

辅助光源(41)，用于在所述成像单元(3)获取的图像中产生衍射环；

所述辅助光源(41)位于所述聚光镜(2)下方的焦平面上，且所述辅助光源(41)偏离所述聚光镜(2)的光轴。

2.根据权利要求1所述的显微成像系统，其特征在于，所述成像单元(3)包括：

物镜(31)，所述物镜(31)位于所述聚光镜(2)的上方，且所述物镜(31)的光轴与所述聚光镜(2)的光轴相互重合设置；

聚合镜(32)，所述聚合镜(32)位于所述物镜(31)的上方，且所述聚合镜(32)的光轴与所述物镜(31)的光轴相互重合设置。

3.根据权利要求2所述的显微成像系统，其特征在于，还包括：

载物台(5)，所述载物台(5)位于所述物镜(31)与所述聚光镜(2)之间；

成像相机(6)，所述成像相机(6)位于所述聚合镜(32)的上方，且所述成像相机(6)的光轴与所述聚合镜(32)的光轴相互重合设置

中央控制单元(7)，所述中央控制单元与所述成像单元(3)相连接；

驱动装置(8)，用于调节所述物镜(31)与载物台(5)之间的距离。

4.一种采用权利要求3所述的显微成像系统的实时对焦方法，包括：

S1.使载物台(5)位于物镜(31)的焦点位置；

S2.以预定间隔距离调整所述物镜(31)与所述载物台(5)之间的距离，通过所述物镜(31)获取样品离焦图像；

S3.根据所述样品离焦图像生成具有衍射环的离焦自相关图像，并获取所述衍射环的半径值；

S4.重复S2-S3，根据所述半径值与所述预定间隔距离获取离焦关系曲线；

S5.获取样品图像，并根据所述样品图像获取其衍射环的半径值；

S6.根据所述离焦关系曲线，控制所述载物台(5)保持在所述物镜(31)的焦点位置。

5.根据权利要求4所述的显微成像系统的实时对焦方法，其特征在于，S1步骤中包括：

S11.打开主光源(1)，使所述载物台(5)位于所述物镜(31)的焦点位置；

S12.关闭所述主光源(1)，打开辅助光源(41)，通过成像相机(6)获取所述载物台(5)上样品的在焦图像。

6.根据权利要求5所述的显微成像系统的实时对焦方法，其特征在于，S3步骤中，包括：

S31.将所述样品离焦图像进行傅里叶变换，获取所述样品离焦图像的功率谱信息；

S32.将所述样品离焦图像的功率谱信息进行逆傅里叶变换获取中间图像；

S33.对所述中间图像进行自相关处理，生成离焦光强分布图；

S34.根据所述离焦光强分布图中光强主极大和光强次极大之间的像素差获取所述衍射环的半径值。

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