CN111996291A

CN111996291A - 用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用

Info

Publication number: CN111996291A
Application number: CN202010852040.4A
Authority: CN
Inventors: 吴江; 林彦星; 黄超华; 史卫军; 花群义; 阮周曦; 贾鹏; 曹琛福; 曾少灵; 林永涛
Original assignee: Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Current assignee: Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本申请公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。本申请试剂包括引物对和探针，引物对上/下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；探针中，第30碱基修饰荧光基团6‑FAM‑Dt，第31碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1‑dT，3’末端修饰C3 Spacer。本申请试剂，能通过RT‑RPA对WNV进行敏感、特异、高效检测，耗时短、灵敏度高、硬件设备要求低，不需复杂的样本处理，特别适于现场快速检测；这对WNV快速防控，防止疫情传播，减少经济损失，保障畜牧业养殖生产安全具有重大意义。

Description

用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及西尼罗河病毒检测领域，特别是涉及一种用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

西尼罗河病毒(WestNile virus，WNV)是一种虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种单链RNA病毒，可影响鸟类、人类和马。该疾病最大的危害就是造成人和马患上致命的脑炎，鸡、鸟等小型动物死亡等，会导致严重的公共卫生问题。因此，快速准确的诊断西尼罗河病毒对疫病的防控意义重大。

野鸟是西尼罗河病毒的自然宿主，库蚊是主要传播媒介，病毒通过“鸟—蚊—鸟、人、其它动物”的生物传播链在自然界生存。1937年，该病毒在西尼罗河地区的乌干达被发现，因此而得名。2000年，在以色列中部和北部发现的439例神经侵袭性疾病，其中29人死亡。2017年，美国发生的2000多例西尼罗病毒感染病例，其中接近2/3的患者表现为严重的神经侵袭性疾病。该病对人类的健康和畜牧业的发展造成了极大的危害，世界卫生组织已将其列为当前全球的重大流行病之一。

随着经济发展，频繁的国际旅行、候鸟的迁徙及进口动物及动物产品贸易，各国都存在WNV的传入风险。为防止西尼罗病毒的病毒株从国外传入我国，建立一种简便、快速、准确的诊断方法，有利于尽早切断病原传播，降低经济损失。

目前，该病的病原检测方法包括病毒分离试验、RT-PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、LAMP、二代测序技术等，抗体检测方法有ELISA、蚀斑减少中和试验(PRNT)。但这些检测技术方法操作复杂、对操作人员的技术要求高、检测时间长、难以适用于现场检测。因此亟需建立一种能够更好的适用于现场快速检测的WNV检测方法，以防止WNV传入或扩散，避免严重的公共卫生问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT-3’

Seq ID No.2：5’-AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC-3’

Seq ID No.3：

5’-CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC-3’

Seq ID No.3所示序列的探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer。

需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针都是针对西尼罗河E基因的保守片段设计的，特别用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的引物和探针。一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，缩写RT-RPA，是在重组酶聚合酶扩增反应体系的基础上添加逆转录酶，使其可以直接对RNA模板进行一步法快速扩增。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了6条上游引物和6条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出Seq ID No.1所示序列和Seq ID No.2所示序列的引物组，以及SEQ ID No.3所示序列的探针，作为本申请的西尼罗河病毒检测试剂。

还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQ ID No.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqID No.1和Seq ID No.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。

本申请的一种实现方式中，探针的5’端标记有FAM荧光基团，探针的3’端标记有BHQ1淬灭基团。

可以理解，FAM和BHQ1只是本申请的一种实现方式中具体采用的荧光基团和淬灭基团，不排除还可以采用其它荧光基团或淬灭基团，例如荧光基团还可以采用TET、JOE、HEX、CY3、CY5等，荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，例如BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra等。

本申请的另一面公开了用于西尼罗河病毒检测的试剂在制备西尼罗河病毒检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片中的应用。

可以理解，本申请的试剂，实际上就针对西尼罗河病毒设计的特异性探针和引物对，当然可以制备成各种用于西尼罗河病毒检测的试剂盒、试纸条或检测芯片。

本申请的再一面公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于西尼罗河病毒检测的试剂。

本申请的一种实现方式中，试剂盒中还含有冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。其中，冻干酶粉为用于RT-RPA的多种酶的混合冻干粉；再水化缓冲液为用于RT-RPA的浓缩反应液。使用时，先将冻干酶粉按使用需求配制成酶溶液，同时向再水化缓冲液中添加去离子水，配制成反应液，然后再添加醋酸镁溶液，以及本申请的引物和探针，最后添加待测样品，即可进行检测反应。

需要说明的是，本申请的试剂盒，是特别针对西尼罗河病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂盒中完全可以进一步的包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为Rehydration Buffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc；另外，考虑到一步法逆转录的实现，本申请的一种实现方式中还包括了反转录酶MMLV Reverse Transcriptase和RNA酶抑制剂Recombinant RNaseInhibitor。

本申请的再一面公开了一种非诊断治疗目的的检测西尼罗河病毒的方法，包括采用本申请的用于西尼罗河病毒检测的试剂，或者本申请的用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，对待测样品进行一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，并采用荧光检测仪收集荧光。

需要说明的是，本申请的检测方法，通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增对西尼罗河病毒进行快速检测，一方面，一步法逆转录重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要15～20分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于西尼罗河病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。

可以理解，本申请的西尼罗河病毒的检测试剂、试剂盒和方法，虽然可以为西尼罗河热病的诊断或治疗提供参考依据；但是，本申请的目的并非通过本申请的试剂或方法对西尼罗河热病进行诊断，本申请的目的是采用本申请的试剂、试剂盒或方法对相关的动物产品或动物源产品进行检测，以避免其携带西尼罗河病毒，造成西尼罗河病毒的传播或扩散。另外，本申请的试剂、试剂盒和方法也可以应用于西尼罗河病毒的基础研究。

本申请的一种实现方式中，一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应条件为，39℃恒温反应15分钟。

需要说明的是，RPA所采用的酶的活性最适合温度范围为37℃-42℃，RPA通常二十分钟内就可以完成检测；本申请优选的方案中，引物探针扩增效率较高，优选在39℃恒温反应15分钟。

本申请的有益效果在于：

本申请用于西尼罗河病毒检测的试剂，能够通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，对西尼罗河病毒进行敏感、特异、高效的检测。采用本申请的试剂对西尼罗河病毒进行检测，耗时短、灵敏度高、对硬件设备要求低，不需要复杂的样本处理，特别适合于现场快速检测，并且可以快速的获得检测结果；这对于西尼罗河病毒的快速防控，防止疫情传播，减少或避免经济损失，保障人类健康和畜牧业养殖生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中西尼罗河病毒RT-RPA特异性检测结果；

图2是本申请实施例中西尼罗河病毒RT-RPA灵敏度检测结果；

图3是本申请实施例中作为对比的实时荧光定量PCR扩增结果图。

具体实施方式

近年来，多种恒温核酸扩增技术的出现解决了传统PCR技术成本高、耗时长、依赖精密温度循环仪器等局限。其中，重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是一种新型的等温核酸扩增技术，被视为“最可能替代传统PCR”的恒温扩增技术。

RPA技术主要依赖三种酶：单链DNA结合蛋白(Single-stranded DNA Bingding，SSB)、重组酶、链置换DNA聚合酶。该技术原理是在恒温下，重组酶与引物结合形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，循环进行从而实现DNA的指数增长。反应体系中增加反转录酶则可以对RNA模板进行一步法快速扩增，即本申请采用的一步法逆转录重组酶聚合酶扩增。RPA最佳反应温度范围是37℃至42℃，反应时间少于二十分钟。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可在便携式恒温扩增荧光检测仪中实现检测结果的直接读取，极大简化了反应程序，检测时间和便利性优于传统PCR法，非常适用于设备简配的基层或现场实验室；因此，本申请研发了用于西尼罗河病毒快速检测的试剂。该试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的西尼罗河病毒特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq IDNo.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3 Spacer。

本申请的西尼罗河病毒检测试剂，在本申请的一种实现方式中，其灵敏度可以达到5×10²copies/μL，可用于对西尼罗河病毒的现场快速检测，防止疫情传入，从而更有效的保障人类健康和动物养殖生产安全。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.试验用质粒及核酸样品

本例根据NCBI GenBank中公布的西尼罗河病毒的囊膜蛋白(E)基因，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因片段并克隆到PUC15载体中，命名为WNV-Seg5，作为阳性质粒对照。本例所用的灭活抗原核酸包括西尼罗河病毒(WNV-1)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、蓝舌病毒(BTV)。

2.主要的试剂和仪器

TwistAmp exo kit(TwistDx)，MMLV Reverse Transcriptase(Takara)，Recombinant RNase Inhibitor(Takara)，恒温扩增仪(Axxin)，5415R型高速离心机(Eppendorf)，7500Fast荧光PCR仪(ABI)，微量核酸定量Qubit 4荧光计(Invitrogen)等。

3.RT-RPA引物和探针的设计与筛选

本例根据西尼罗河病毒因组中序列的囊膜蛋白(E)基因序列，设计了多条特异性的引物和探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1重组酶聚合酶扩引物和探针

引物或探针名称	序列(5’→3’)	SEQ ID No.
			WNVF1	CTTTGGCTGGAGCCATTCCTGTGGAATTTTCAAGC	4
WNVF2	CAAGCTTTGGCTGGAGCCATTCCTGTGGAATTTTC	5
			WNVF3	CTCTGCATCAAGCTTTGGCTGGAGCCATTCCTGTG	6
WNVF4	CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT	1
			WNVF5	GTCCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTC	7
WNVF6	CAAGGTCCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAG	8
			WNVR1	ACTTGAAAGCCTTTGAACAGACGCCGTAGGTTGTT	9
WNVR2	CAAGAAACTTGAAAGCCTTTGAACAGACGCCGTAG	10
			WNVR3	GAGTCCCAAGAAACTTGAAAGCCTTTGAACAGACG	11
WNVR4	CCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTCTGCG	12
			WNVR5	AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC	2
WNVR6	CCTCCAACTGATCCAAAGTCCCAAGCTGTATCTCC	13
			WNVRPA1	CACTGTCAAGTTGACGTCGGGTCATTTGAAGAGAGTGAAGATGGA	14
WNVRPA2	CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC	3

表1中，WNVF1、WNVF2、WNVF3、WNVF4、WNVF5和WNVF6为上游引物，WNVR1、WNVR2、WNVR3、WNVR4、WNVR5和WNVR6为下游引物，WNVRPA1和WNVRPA2为设计的两条特异性探针；其中，SEQ ID No.14所示序列的WNVRPAP1探针中，第32个碱基修饰荧光基团6-FAM-dT，第33个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer；SEQ ID No.3所示序列的WNVRPAP2探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3 Spacer。

需要说明的是，RT-RPA引物和探针的设计实际上与RPA引物和探针是一样的，只是在反应体系中增加了反转录酶及RNA酶抑制剂，从而实现一步法逆转录重组酶聚合酶扩增。在对实际样品进行检测时，是提取样品的RNA用于检测，其余步骤和条件都与RPA相同。

4.反应体系和反应条件

本例采用TwistAmp exo Kit试剂盒进行RT-RPA扩增。

反应体系为50μL。将RehydrationBuffer 29.5μL、两条浓度为10μM的引物各2.1μL、浓度为10μM的探针0.6μL、200U/μL MMLV Reverse Transcriptase 1μL、40U/μLRecombinant RNase Inhibitor 1μL、DEPC水9.2μL、核酸模板2μL混合均匀后加入到RPA冻干酶粉的反应管中，混匀，最后加入浓度为280mM的MgAc溶液2.5μL，混匀。将上述反应管置于Axxin恒温扩增仪中，39℃反应15分钟，反应过程中实时读取荧光信号。

其中，两条浓度为10μM的引物是指上游引物和下游引物。本例的反应体系与常规的RPA反应体系不同的是，增加了反转录酶MMLV Reverse Transcriptase和RNA酶抑制剂Recombinant RNase Inhibitor，其余组份和反应条件都与RPA相同。本例的反应体系可以对DNA进行检测，也可以直接检测RNA。如果是对DNA进行检测，则反转录酶和RNA酶抑制剂不发挥作用。如果是对RNA进行检测，则反转录酶在反应过程中同时进行反转录，将RNA反转录为cDNA，然后进行重组酶聚合酶扩增，该过程是在一个反应体系中同步进行。

5.引物和探针筛选

在筛选的过程中，先采用其中一条上游引物，对下游引物进行筛选，然后再根据筛选出来的下游引物，再去筛选上游引物，以获得最佳的西尼罗河病毒检测用引物探针组合。引物和探针筛选采用“4.反应体系和反应条件”。

6.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“4.反应体系和反应条件”，对WNV-Seg5和WNV-1，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、蓝舌病毒(BTV)等几种核酸模板进行检测。并设置一个阴性对照和空白水对照，其中阴性对照是指从阴性的猪血中提取的RNA样品。

7.灵敏度试验

本例将WNV-Seg5按10倍梯度稀释至10^-6，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏度。

同时，与李林海等建立的实时荧光定量PCR法进行比较，即采用相同的稀释核酸模板，按照李林海等建立的实时荧光定量PCR法对各稀释核酸模板进行检测。其中，李林海等建立的实时荧光定量PCR法详见参考文献：李林海.陈丽丹,廖杨.西尼罗河病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用研究[J].实用医学杂志,2012,28(19):3288-3291.。

8.重复性试验

用10^-1～10^-3稀释的三种不同浓度的WNV-1核酸作为模板分别按“4.反应体系和反应条件”进行RPA试验，重复检测6次分析所建立方法的稳定性。

9.样品的检测

对实验室保存的159份牛血及猪血样品按照“4.反应体系和反应条件”进行检测，并设置WNV-1阳性对照、阴性对照和水空白对照，同时用OIE推荐的实时荧光RT-PCR法进行检测。所有样品均由深圳海关动植中心提供和保藏。各血样品采用RNA提取试剂盒提取RNA后直接进行检测。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物WNV-F4、Seq ID No.2所示序列的下游引物WNV-R5和Seq ID No.3所示序列的探针WNV-RPAP2，该引物和探针组合可用于对西尼罗河病毒进行特异性检测。

根据筛选结果可见，即使是相同的探针，不同的上游和下游引物组合，对重组酶聚合酶扩增的扩增效率、特异性和灵敏度都有影响。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为WNV-Seg5的检测结果，曲线2-8分别牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、蓝舌病毒(BTV)、阴性对照和水空白对照的检测结果。可见，仅重组质粒WNV-Seg5有荧光曲线呈阳性；而其它病原核酸和阴性对照、水空白对照都没有荧光曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能对WNV进行特异性检测，与BVDV、JEV、PRRSV、CSFV、BTV灭活抗原核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.灵敏度试验结果

本例的引物和探针对WNV的灵敏度检测结果如图2所示，图2中，曲线1至曲线4依序为WNV-Seg5稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的扩增曲线，曲线5至曲线7依序为10^-5、10^-6以及水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中RPA最低可以检测到WNV-Seg510^-4稀释度。测得质粒WNV-Seg5原始浓度后，换算成拷贝数为5.25×10⁶copies/μL，10^-4稀释度对应的质粒浓度为5.25×10²copies/μL。

对相同的稀释核酸模板，使用李林海等建立的实时荧光定量PCR法进行灵敏度检测，检测结果如图3所示，图3中，曲线1至曲线6依序为WNV-Seg5稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的扩增曲线。由检测结果可知，实时荧光PCR法最低可以检测到WNV-Seg510^-5稀释度，对应的质粒浓度为5×10¹copies/μL。

可见，相对于李林海等建立的实时荧光定量PCR法，本例的WNV RT-RPA检测方法可以达到相近的灵敏度；但是，本例的检测方法，其检测时间短，不需要大型仪器设备，大大缩短了检测时间，提升了检测效率。

4.重复性试验结果

将10^-1、10^-2、10^-3三种不同浓度的稀释核酸分别用RT-RPA法重复检测6次，均可观察到相应的荧光曲线，相同浓度核酸模板检测结果一致，表明该法重复性良好。

5.样品的检测

样品检测结果显示，采用本例的引物和探针对159份牛血和猪血样品进行RT-RPA检测，阳性对照出现荧光扩增曲线，阴性对照、水空白对照及样品均无扩增曲线出现，样品检测结果为阴性，与OIE推荐的实时荧光RT-PCR法检测结果相同。

本例的西尼罗河病毒检测方法和试剂，检测时间短，反应条件简单且无需大型仪器设备，大大提升了检测效率。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳海关动植物检验检疫技术中心

<120> 用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用

<130> 20I29588

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctgattgaa ttggaaccac cctttggaga ctcat 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtcccaagc tgtatctcct agggcggcta atctc 35

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catagtggtg ggcagaggag aacaacagat taatcaccat tggcacaagt c 51

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttggctgg agccattcct gtggaatttt caagc 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagctttgg ctggagccat tcctgtggaa ttttc 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctgcatca agctttggct ggagccattc ctgtg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcctgattg aattggaacc accctttgga gactc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaggtcctg attgaattgg aaccaccctt tggag 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acttgaaagc ctttgaacag acgccgtagg ttgtt 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caagaaactt gaaagccttt gaacagacgc cgtag 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gagtcccaag aaacttgaaa gcctttgaac agacg 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccaagctgta tctcctaggg cggctaatct ctgcg 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctccaactg atccaaagtc ccaagctgta tctcc 35

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cactgtcaag ttgacgtcgg gtcatttgaa gagagtgaag atgga 45

Claims

1.一种用于西尼罗河病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT-3’

Seq ID No.2：5’-AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC-3’

Seq ID No.3：5’-CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC-3’

Seq ID No.3所示序列的探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3 Spacer。

2.根据权利要求1所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂，其特征在于：所述探针的5’端标记有FAM荧光基团，探针的3’端标记有BHQ1淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂在制备西尼罗河病毒检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片中的应用。

4.一种用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂。

5.根据权利要求4所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。

6.一种非诊断治疗目的的检测西尼罗河病毒的方法，其特征在于：包括采用权利要求1或2所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂，或者权利要求4或5所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，对待测样品进行一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，并采用荧光检测仪收集荧光。

7.根据权利要求6所述的检测西尼罗河病毒的方法，其特征在于：所述一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应条件为，39℃恒温反应15分钟。