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CN111996168A - 一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用 - Google Patents

一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用 Download PDF

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CN111996168A CN202010419904.3A CN202010419904A CN111996168A CN 111996168 A CN111996168 A CN 111996168A CN 202010419904 A CN202010419904 A CN 202010419904A CN 111996168 A CN111996168 A CN 111996168A
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Abstract

本发明涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用，建立方法的步骤如下：(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型；应用为：用于药物敏感性检测。本发明的建立方法简单，能够制备力学稳定且尺寸均一的三维培养模型，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选等的需要。

Description

一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤细胞三维培养领域，涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。
背景技术
采用传统二维培养模拟生命系统的最主要缺点是细胞只能单层培养，该条件下培养环境中的氧气、营养物质和信号分子的分布与真实生理环境不符合，不能准确反映细胞—细胞外基质、细胞—细胞间的相互作用。在过去的几十年中，随着三维细胞培养技术的出现，在癌症及再生医学领域已经出现大量关于三维细胞培养模型的研究。在研究肿瘤细胞与微环境中细胞外基质及其他细胞间的相互作用时，开发和利用三维培养模型是不可或缺的。
现在常用的肿瘤细胞三维培养模型构造方式主要有多细胞肿瘤球体模型(multicellular tumor spheroids，MCTS)及三维支架培养模型。多细胞肿瘤球体模型制作方法多样，通常是利用在低粘附或不粘附表面的条件下培养的细胞悬液，经由聚集和压实作用后制备而成。这种模型目前在商业上已经实现半自动化生产，广泛应用于高通量药物筛选领域，但是该技术制备的多细胞球体尺寸不均一，在一定程度上限制了这种模型的应用。为实现真实的细胞相互作用，亦有研究使用仿生材料和结构，构建类似肿瘤细胞生长微环境的三维支架，利用支架培养细胞形成肿瘤细胞集落。研究人员已经开发了多种支架材料，包括天然生物材料(如纤维素、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、或海藻酸盐)、合成生物材料(如聚己内酯、聚乙烯)和无机材料(如陶瓷、钛)。
在应用时，上述材料通常被加工为水凝胶型，或经3D打印及冷冻干燥成单一支架型。如中国专利CN109022342A介绍了一种以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系，采用海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖等物质作为促凝剂而建立的贴壁细胞三维培养体系，该三维培养体系拥有良好的生物相容性，能最大程度的模拟体内生物环境，但是由于细胞被固定于手性水凝胶支架中，细胞活性不高，细胞生长量仅提高20～40％。支架也是一种常用的构建肿瘤细胞三维培养模型的方法，如中国专利CN104312975B介绍了一种三维胶原支架，将三维胶原支架置于培养基中浸泡进行预处理，再将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，加入内皮培养基共培养若干天后即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，该模型孔径直径为300～500μm，在共培养期间能较好维持细胞的活性，但是由于胶原支架本身力学性能较差且会发生降解，因此不能长时间的维持细胞的高度活性。
已有研究者关注到支架的力学性能并介绍了力学性能有所改善的支架，如中国专利CN106676074A公开了一种多孔纤维素支架，该支架刚度为5～100kPa，可诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化并对肿瘤药物有一定的抗敏感性，但是该纤维素支架形状大小并不能保持高度统一，尺寸并不一致，在应用时会出现数据差异。因此，急需开发一种新型的能够有效制备具有力学稳定、尺寸均一性能的三维培养模型的技术，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选及再生医学的需要。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤如下：
(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，存在“由大变小”或“由小变大”的变化趋势，上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm；孔径过小制备得到的复合支架孔隙率不高，细胞生长效果不理想；孔径过大则会造成支架力学性能不稳定，抗压缩能力变弱；三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型，“灵活变化型”出自江南大学硕士毕业论文：《经编间隔织物压缩性能研究与表征》；
(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；
(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；
(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为90％以上，平均孔径为10～50μm(采用多孔测量仪测得)，厚度为3～15mm，长度为5～20mm，宽度为5～20mm；平均孔径过小细胞很难进入支架中生长，有文献报道平均孔径过大也不利于细胞的增殖生长；厚度太小加工难度大，厚度过大细胞很难深入到支架中增殖；长度和宽度可根据不同需要加工成不同大小，可选范围根据需要的尺寸可进行变动；复合多孔支架的力学性能稳定，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为200～1300cN，在应用时能保持形状不变，复合多孔支架适于肿瘤细胞生长增殖，且给细胞提供了三维生长的空间，传质性能优异；
三维间隔织物的“上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm”使其能够负载生物活性材料，经过预冷冻、冷冻、真空干燥、铰链处理之后就得到了具有三维贯通的大量孔洞结构、孔隙率为90％以上、平均孔径为10～50μm的复合多孔支架，间隔层纱线的排列和纱线本身具有的刚度使复合多孔支架的力学性能优异；
(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型。
本发明选用具有梯度孔径结构的三维间隔织物与生物活性材料复合制备复合多孔支架，再将其与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型，所有的三维间隔织物都具有三明治型结构，三明治型结构具体为上层-间隔层-下层，间隔层连接了上层和下层，这种连接使三维间隔织物具有三层结构且不易松散，从而使得三维间隔织物具有良好的力学稳定性；
此外，间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型，这种排列方式使得三维间隔织物具有良好的力学性能，具体表现在施加外力导致间隔织物变形后，能快速恢复到变形之前的形状及状态，进一步提升了三维间隔织物的力学稳定性；
此外，三明治型结构中上层和下层分布有大量孔洞，纤维与纤维之间也存在一定间隙，三明治型结构导致三维间隔织物具有极高的孔隙率，本发明同时控制了三维间隔织物具有梯度孔径结构，梯度孔径结构能模拟体内肿瘤微环境的物质梯度分布，极高的孔隙率和梯度孔径结构为细胞的三维生长提供了介质(营养物质和代谢废物)流通的环境；
此外，三维间隔织物自身具有尺寸均一的特点，由于其原料为纤维或纱线，使用剪刀等工具易于剪裁成多种形状及尺寸，具体表现在细胞培养时需要用到不同形状及大小的培养板。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(1)中，三维间隔织物中，上层和下层的纤维或纱线的种类相同或不同，选自于丙纶和涤纶，粗细相同或不同；丙纶和涤纶是两种能用于生物医用材料的高分子聚合物，限制于机器的加工要求，能用于被加工成间隔织物的纱线种类最好是这两种。
间隔层的纤维或纱线的种类为锦纶或涤纶，间隔层的纤维或纱线要求具有一定的强度，以支撑织物的两个表面及外界的压力，使支架具有一定的厚度和弹性；
三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成，尺寸均一可控；
三维间隔织物织造过程中采用空穿梳栉工艺(空穿梳栉工艺是加工经编间隔织物的一种工艺，目的在于可以形成间隔织物的不同孔径，这种不同表现在孔径形状、孔径大小、孔径梯度分布)。
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(2)中，生物活性材料溶液的配制过程如下：
(2.1)按照1:99～399的质量比(生物活性材料与乙酸溶液的质量比决定了生物活性材料的浓度，生物活性材料的浓度过低会使复合的效果不理想，较少的生物材料被复合到间隔织物上；浓度过高会导致复合多孔支架的孔隙率变低，孔隙率过低细胞的物质运输以及细胞的增殖成团受到影响)将生物活性材料混合于玻璃瓶内的乙酸溶液(乙酸作为一种能溶解大多数生物活性材料的溶剂，不仅溶解速度快，且易挥发，这样溶解后可通过冷冻干燥等过程完全挥发，不会对细胞产生毒性，其他可替代溶剂可根据生物材料的溶解性不同选择包括以下但不限于此的溶剂：去离子水、乙醇或PBS)中，在常温下，使用磁力搅拌器以400～800r/min的转速(本发明中考虑转速过慢会使溶解时间变长，因为生物活性材料会在溶剂中发生降解，溶解时间越长降解越多，影响后续使用效果；转速过快同理，高转速下会有较大的离心力作用，这种较大的离心力会加快材料降解或破坏材料的性能，因而将转速设置为400～800r/min)搅拌进行溶解；
(2.2)将玻璃瓶倒置后搅拌4～48h，使生物活性材料充分溶解；搅拌时间即溶解时间过短材料溶解不充分，溶解时间过长会使材料降解过多；
(2.3)将玻璃瓶中混合物经离心后取上清液，制备得到生物活性材料溶液；
模具为无菌培养皿，或者为4孔板、6孔板、12孔板、24孔板或48孔板规格的细胞培养板；
复合的方法为浸渍法或涂层法；
生物活性材料溶液与三维间隔织物的比例关系满足：采用浸渍法复合时，以使配制好的生物活性材料溶液刚好没过三维间隔织物即可；采用涂层法复合时，以使配制好的生物活性材料溶液反复涂层3～5次即可；
复合的时间为4～48小时，预冷冻的时间为4～48小时，冷冻的时间为4～48小时，复合时间太短的话复合效果不佳，生物活性材料不能充分与三维间隔织物接触；太长会使材料降解过多，其他时间选择同理。
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，生物活性材料为Ⅰ～Ⅰ型胶原及其衍生物、海藻酸盐及其衍生物、透明质酸及其衍生物、多肽、明胶、壳聚糖或甲壳素，其他具有生物相容性且能促进肿瘤细胞生长的材料如聚乙二醇水凝胶、聚乳酸水凝胶可替代以上材料。
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(3)中，真空干燥的时间为4～48h，干燥时间过短会干燥不充分，有大量水分子残留，影响多孔复合支架隙率；干燥时间过长会使材料降解过多，且达到干燥效果即可，不需要干燥过长时间。
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(4)中，交联的方法为光交联法、辐射交联法、热重交联法或化学试剂交联法；交联的时间为2～48h。
如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(5)中，共培养的过程为：先将肿瘤细胞在平面培养1～7天后经培养基消化重悬得到肿瘤细胞悬浮液，再采用注射器或移液枪将肿瘤细胞悬浮液植入复合多孔支架中培养；
肿瘤细胞的植入密度为1～5×106/200μl；植入密度过高使细胞发生接触抑制现象生长受阻造成浪费，植入密度过低细胞在支架内生长速度过慢，共培养时间需要延长，造成时间精力物力的多余消耗；肿瘤细胞为前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、红白血病K562细胞、人早幼粒白血病细胞、肝癌细胞或宫颈癌细胞，包括但不限于此；培养基为本领域内技术人员熟知的相应细胞所对应的培养基。
本发明还提供了采用如上任一项所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法制得的体外三维肿瘤细胞抗药模型的应用，用于药物敏感性检测，具体过程为：先确定目标药物及其对应的药物敏感性测试方法，再按目标药物对应的药物敏感性测试方法对体外三维肿瘤细胞抗药模型进行测试后，计算体外三维肿瘤细胞抗药模型的细胞增殖能力及生长因子表达水平。
有益效果：
(1)本发明提供的复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，同时具有高孔隙率、适于肿瘤细胞生长增殖的孔径大小等优点，给细胞提供了三维生长的空间，传质性能优异，能够弥补二维平面培养的不足，有利于细胞与细胞、细胞与基质相互作用，更好的模拟细胞生长的肿瘤微环境；
(2)本发明中，具有三明治型结构的复合多孔支架具有良好的力学性能，与其他单一水凝胶支架相比，使本模型具有一定的力学支撑力，在应用时能保持形状不变，不损害共培养细胞的活性，是细胞能够在该模型中长期生长的重要条件；
(3)本发明的复合多孔支架加工制作方便，尺寸可控(可根据不同需要加工成不同大小、形状)，可用于在不同形状反应器中培养肿瘤细胞；
(4)本发明提供的体外三维肿瘤细胞抗药模型，制备过程绿色无毒害，体外培养细胞易操作，细胞增殖快，对肿瘤药物具有很好的抗药性，可用于抗肿瘤药物敏感性测试。
附图说明
图1是实施例1的复合多孔支架的示意图；
图2是设计实施例1的三维间隔织物的垫纱运动图，拟使三维间隔织物获得表面为菱形孔眼组织的结构，其中F、B表示双针床经编机上两个针床，GB表示梳栉；
图3是实施例1的三维间隔织物的表面结构图，由图可知，所制备的三维间隔织物表面具有菱形孔洞结构；
图4是复合多孔支架和纯胶原支架的孔隙率图；
图5是实施例1中得到的细胞培养5天中对细胞核进行荧光染色的共聚焦显微镜叠加图，第一天、第三天、第五天分别表示细胞在支架中培养的天数，在上述时间节点对细胞核染色，染色剂为DAPI，为了观察细胞在支架内部的生长情况，共聚焦显微镜对支架表面及内部进行了不同深度培养层的扫描成像，将各层细胞荧光图叠加而成获得图像，扫描深度为500μm。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤如下：
(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，三维间隔织物的间隔层的纱线的排列规律为V字型；
三维间隔织物中，上层和下层的纱线的种类相同，粗细相同，具体为细度100D(D：旦尼尔)的涤纶；
上层的平均孔径为2mm，下层的平均孔径为1mm；
间隔层的纱线的种类为直径0.15mm的涤纶；
三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成；垫纱运动图如图2所示；
三维间隔织物织造过程中采用空穿梳栉工艺；
最终制得的三维间隔织物如图3所示，上表面为方格孔结构，下表面为菱形孔；
(2)配制质量分数为0.2％的胶原(I型胶原)溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；
胶原溶液的配制过程如下：
(2.1)按照1:300的质量比将胶原混合于玻璃瓶内的乙酸溶液中，在常温下，使用磁力搅拌器以500r/min的转速搅拌进行溶解；
(2.2)将玻璃瓶倒置后搅拌4h；
(2.3)将玻璃瓶中混合物经离心后取上清液，制备得到胶原溶液；
模具为无菌培养皿；
复合的方法为浸渍法；
复合的时间为4小时，预冷冻的时间为4小时，冷冻的时间为4小时；
(3)对支架预构体进行真空干燥24h，制得复合支架预构体；
(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架，如图1所示；
交联的方法为热重交联法；交联的时间为24h；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为93％(如图4所示)，平均孔径为34μm，厚度为5mm，长度为10mm，宽度为10mm，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为1000cN；
按与步骤(2)～(4)相似的操作制备纯胶原支架，制备过程中不加入三维间隔织物，其他参数与步骤(2)～(4)相同，纯胶原支架的孔隙率如图4所示，由图4可知，复合多孔支架相较于同种胶原支架具有更高的孔隙率，更有利于细胞的黏附生长所需营养成分及氧气的运输；
(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型；
共培养的过程为：先将肿瘤细胞在平面培养5天后经培养基消化重悬得到肿瘤细胞悬浮液，再采用注射器将肿瘤细胞悬浮液植入复合多孔支架中培养(气相：空气，95％；二氧化碳，5％；温度：37摄氏度)；
肿瘤细胞的植入密度为2×106/200μl；肿瘤细胞为DU145人前列腺癌细胞(购自中国科学院细胞库，培养及传代方法参见细胞库提供的细胞培养说明书)；
使用共聚焦显微镜对培养结果进行观察，结果如图5所示，图5是对在支架中培养的第一天、第三天、第五天的细胞进行了荧光染色，并对支架表层深入500μm的细胞数量进行了观察，叠加成图，图中所示，使用支架培养5天的细胞，能够有效进行细胞黏附与增殖，且支架表面及内部的细胞数量均有增加。
最终制得的体外三维肿瘤细胞抗药模型用于药物敏感性检测，具体过程为：先确定目标药物(恩杂鲁胺)及其对应的药物敏感性测试方法(参照专利CN109735496A的药物敏感性测试步骤)，再按目标药物对应的药物敏感性测试方法对平面培养的细胞及三维支架培养的细胞(即体外三维肿瘤细胞抗药模型)进行测试，并对药物作用后细胞增殖能力进行计算，可以观察到不同药物浓度下，三维支架培养的细胞增殖能力均高于平面培养的细胞，且三维支架培养的细胞分泌的促血管生长因子IL-8表达水平也比平面培养的细胞高。此外，三维支架培养的细胞对恩杂鲁胺的半抑制浓度高于平面培养的细胞，表明三维支架培养的细胞的抗药性优于平面培养的细胞，而更接近体内实际情况，在药物筛选领域有较大的应用前景。
实施例2
一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤如下：
(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，三维间隔织物的间隔层的纱线的排列规律为V字型；
三维间隔织物中，上层和下层的纱线的种类相同，粗细相同，具体为细度为100D(D：旦尼尔)的涤纶；
上层的平均孔径为2mm，下层的平均孔径为1mm；
间隔层的纱线的种类为直径0.15mm的涤纶；
三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成；
三维间隔织物织造过程中采用空穿梳栉工艺；
最终制得的三维间隔织物的上表面为方格孔结构，下表面为菱形孔；
(2)配制质量分数为1％的胶原(II型)溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；
胶原溶液的配制过程如下：
(2.1)按照1:200的质量比将胶原混合于玻璃瓶内的乙酸溶液中，在常温下，使用磁力搅拌器以500r/min的转速搅拌进行溶解；
(2.2)将玻璃瓶倒置后搅拌4h；
(2.3)将玻璃瓶中混合物经离心后取上清液，制备得到胶原溶液；
模具为24孔板规格的细胞培养板；
复合的方法为涂层法；
涂层的反复次数为3次，复合的时间为4小时，预冷冻的时间为4小时，冷冻的时间为4小时；
(3)对支架预构体进行真空干燥24h，制得复合支架预构体；
(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；
交联的方法为EDC/NHS交联法；交联的时间为4h；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为91％，平均孔径为30μm，厚度为6mm，长度为10mm，宽度为10mm，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为1100cN；
(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型；
共培养的过程为：先将肿瘤细胞在平面培养5天后经培养基消化重悬得到肿瘤细胞悬浮液，再采用移液枪将肿瘤细胞悬浮液植入复合多孔支架中培养(气相：空气，95％；二氧化碳，5％；温度：37摄氏度)；
肿瘤细胞的植入密度为2×106/200μl；肿瘤细胞为MCF-7人乳腺癌细胞(购自中国科学院细胞库，培养及传代方法参见细胞库说明书)；
使用共聚焦显微镜对培养结果进行观察，在第1、3、5天对在支架中培养的细胞进行了荧光染色，并对支架表层深入500μm的细胞数量进行了观察，叠加成图，结果表明经支架培养5天的人乳腺癌细胞，能够有效进行黏附与增殖，且支架表面及内部的细胞数量均有增加。
最终制得的体外三维肿瘤细胞抗药模型用于药物敏感性检测，具体过程为：先确定目标药物(阿霉素)及其对应的药物敏感性测试方法(参照专利CN109735496A的药物敏感性测试步骤)，再按目标药物对应的药物敏感性测试方法对平面培养的细胞和三维支架培养的细胞(即体外三维肿瘤细胞抗药模型)进行测试后，计算细胞活性，可以观察到不同药物浓度下，三维支架培养的细胞中细胞活性均高于平面培养的细胞，且三维支架培养的细胞分泌的促血管生长因子IL-8表达水平也比平面培养的细胞高，此外，三维支架培养的细胞对阿霉素的半抑制浓度为平面培养的细胞的7.3倍，表明三维支架培养的细胞的抗药性优于平面培养的细胞，而更接近体内实际情况，在药物筛选领域有较大的应用前景。

Claims (8)

1.一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征是，步骤如下：
(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；
(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；
(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；
(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为90％以上，平均孔径为10～50μm，厚度为3～15mm，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为200～1300cN；
(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型。
2.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，三维间隔织物中，上层和下层的纤维或纱线的种类相同或不同，选自于丙纶和涤纶，粗细相同或不同；
间隔层的纤维或纱线的种类为锦纶或涤纶；
三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成；
三维间隔织物织造过程中采用空穿梳栉工艺。
3.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，生物活性材料溶液的配制过程如下：
(2.1)按照1:99～399的质量比将生物活性材料混合于玻璃瓶内的乙酸溶液中，在常温下，使用磁力搅拌器以400～800r/min的转速搅拌进行溶解；
(2.2)将玻璃瓶倒置后搅拌4～48h；
(2.3)将玻璃瓶中混合物经离心后取上清液，制备得到生物活性材料溶液；
模具为无菌培养皿，或者为4孔板、6孔板、12孔板、24孔板或48孔板规格的细胞培养板；
复合的方法为浸渍法或涂层法；
复合的时间为4～48小时，预冷冻的时间为4～48小时，冷冻的时间为4～48小时。
4.根据权利要求3所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，生物活性材料为Ⅰ～Ⅰ型胶原及其衍生物、海藻酸盐及其衍生物、透明质酸及其衍生物、多肽、明胶、壳聚糖或甲壳素。
5.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，真空干燥的时间为4～48h。
6.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，交联的方法为光交联法、辐射交联法、热重交联法或化学试剂交联法；交联的时间为2～48h。
7.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，共培养的过程为：先将肿瘤细胞在平面培养1～7天后经培养基消化重悬得到肿瘤细胞悬浮液，再采用注射器或移液枪将肿瘤细胞悬浮液植入复合多孔支架中培养；
肿瘤细胞的植入密度为1～5×106/200μl；肿瘤细胞为前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、红白血病K562细胞、人早幼粒白血病细胞、肝癌细胞或宫颈癌细胞。
8.采用如权利要求1～7任一项所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法制得的体外三维肿瘤细胞抗药模型的应用，其特征是：用于药物敏感性检测，具体过程为：先确定目标药物及其对应的药物敏感性测试方法，再按目标药物对应的药物敏感性测试方法对体外三维肿瘤细胞抗药模型进行测试后，计算体外三维肿瘤细胞抗药模型的细胞增殖能力及生长因子表达水平。
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