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CN111973635A - 一种牡蛎促进泌乳作用研究方法 - Google Patents

一种牡蛎促进泌乳作用研究方法 Download PDF

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CN111973635A
CN111973635A CN202010896389.8A CN202010896389A CN111973635A CN 111973635 A CN111973635 A CN 111973635A CN 202010896389 A CN202010896389 A CN 202010896389A CN 111973635 A CN111973635 A CN 111973635A
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ethanol
tissue
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xylene
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CN202010896389.8A
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秦小明
谌素华
章超桦
曹文红
郑惠娜
林海生
高加龙
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Guangdong Ocean University
Original Assignee
Guangdong Ocean University
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Abstract

本发明公开了一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，包括以下步骤，S1、实验材料，牡蛎、母鼠和公鼠。本实验使用均为SPF级健康SD大鼠，母鼠和公鼠比例为2：1，且母鼠和公鼠均为8周龄未配种大鼠，SD母鼠的体重范围：180g～200g，SD公鼠的体重范围：200g～250g。S2、主要实验试剂，硼酸、无水碳酸钠、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、葡萄糖、正丁醇。该牡蛎促进泌乳作用研究方法，建立超负荷哺乳模型，以SD大鼠为实验对象，探究牡蛎粉是否有促进泌乳作用，利用牡蛎粉组和正常组的大鼠的泌乳量比较，说明牡蛎粉可以提高哺乳母鼠的泌乳量，牡蛎粉组和正常组母鼠的脏器指数相比，牡蛎粉组母鼠的脏器指数均高于正常组，符合哺乳母鼠正常健康的生理水平。

Description

一种牡蛎促进泌乳作用研究方法
技术领域
本发明涉及牡蛎的应用研究技术领域，具体为一种牡蛎促进泌乳作用研究方法。
背景技术
牡蛎是世界第一大养殖贝类，也是我国第四大养殖贝类之一，牡蛎蛋白质含量丰富，氨基酸营养组成完善，富含不饱和脂肪酸、多种维生素及微量元素，有“海洋牛奶”之称，牡蛎是我国批准的既可以作为食品又可以作为药品的保健食材，经过研究表明，柴胡加龙骨牡蛎汤治疗失眠患者取到很好的治疗效果，桂枝龙骨牡蛎汤可以治疗多种儿科疾病等，随着对牡蛎应用的研究，牡蛎的药用作用种类越来越多。
随着生活提高，科技的发展，人们越来越注重保健，其中牡蛎的研究也在逐渐拓展，在现代医学对乳汁的合成和分泌的研究的当下，人们对治疗产后缺乳的影响因素进行分析，至今未有很全面的牡蛎促进泌乳作用的研究方法对牡蛎治疗产后缺乳效果进行研究。
针对上述问题，急需通过建立超负荷哺乳大鼠模型，探究牡蛎是否能促进泌乳作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，以解决上述背景技术中提出的在现代医学对乳汁的合成和分泌的研究的当下，人们对治疗产后缺乳的影响因素进行分析，至今未有很全面的牡蛎促进泌乳作用的研究方法对牡蛎治疗产后缺乳效果进行研究的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，包括以下步骤：
S1、实验材料
(1)牡蛎、母鼠和公鼠。
(2)本实验使用均为SPF级健康SD大鼠，母鼠和公鼠比例为2：1，且母鼠和公鼠均为8周龄未配种大鼠，SD母鼠的体重范围：180g～200g，SD公鼠的体重范围：200g～250g。
S2、主要实验试剂
硼酸、无水碳酸钠、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸铜硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、酒石酸钠、氢氧化钠、氯化钠、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、乙酸锌、福林酚、牛血清蛋白。
S3、牡蛎粉的制取
(1)将新鲜的牡蛎利用清洗机或清洗池清洗干净，接着将清洗干净的牡蛎滤干，制粉。
(2)在20℃的温度下预冻，预冻3h后，便可放入-80℃超低温冰箱中深冻，对经过冷冻干燥的牡蛎粉进行干燥保存。
S4、牡蛎蛋白的制取
(1)牡蛎冻干粉50g溶于1L蒸馏水。
(2)0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至12～13。
(3)4℃下搅拌3小时，在10000r/min、4℃下离心15min，提取上层清液。
(4)0.1mol/L盐酸溶液调节上层清液pH至4.5～5.1，在10000r/min、 4℃下离心15min，收集沉淀物。
(5)将沉淀物转入12ku孔纤维透析袋，透析48小时，收集沉淀，并冷冻干燥，进行干燥保存。
S5、牡蛎酶解粉的制取
(1)将新鲜的牡蛎清洗干净，并进行沥干、匀浆，匀浆∶水为1∶3加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入动物蛋白水解酶。
(2)将1000U/g牡蛎肉在53℃水浴锅恒温6h，并以500r/min的速度离心20min，提取上清液，旋蒸除水，接着冷冻干燥，进行干燥保存。
S6、超负荷哺乳大鼠模型的建立
(1)调整每一窝母鼠所哺育的仔鼠数量，通过增加或减少仔鼠数量，使得每一窝仔鼠数量相同，母鼠哺乳同样数量的仔鼠，不能满足一窝仔鼠的摄食需要，为超负荷大鼠模型。
(2)平均分为正常组和牡蛎全粉组，正常组的灌胃蒸馏水，1mL/100g，每天一次，连续20天，牡蛎全粉组的同时灌胃0.8mg/mL牡蛎全粉溶液，每天一次，连续20天。
S7、血清采集和保存
实验结束后，所有母鼠麻醉，眼球取血于离心管中，37℃静置20min，置于高速离心机离心，温度4℃，3000r/min离心15min，收集上清液，于-20℃冰箱中冻存待测。
S8、样品检测
(1)取出血清样品解冻，试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡15-30分钟后使用。
(2)操作步骤：
标准品的稀释：
加样：分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品稀释度为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：使用封板膜封板后置37℃温育30 分钟；
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水3倍稀释后备用；
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次拍干；
加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，温育，洗涤；
显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
终止：每孔加入终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
(3)数据处理
S9：乳腺组织结构观察
将麻醉后的母鼠仰卧置于解剖手术盘上，沿腹正中线切开胸腹部皮肤，分离胸腹部皮下的乳腺组织，称量并记录乳腺的重量，然后切取距乳腺顶端 1cm的乳腺相同部位，放入大约10倍体积的4％中性多聚甲醛中固定24-72h，过两夜。
S10：组织蜡块制作
(1)固定组织修整与水洗
1、先将组织块置于固定液中固定24h～72h，再取出组织块。
2、取出组织块后用手术刀修整形状，置于脱水框中做好标记，自来水流动清洗组织块2小时以上洗去固定液。
(2)组织脱水
将洗去固定液的组织块按照如下步骤置于梯度浓度酒精中，进行脱水：
50％乙醇：30min。
70％乙醇：30min。
80％乙醇：30min。
95％乙醇：30min。
无水乙醇Ⅰ：30min。
无水乙醇Ⅱ：40min。
(3)透明
将脱水完成后的组织块按如下步骤操作：
1、置于二甲苯：酒精1:1溶液：15min。
2、二甲苯Ⅰ：15min。
3、二甲苯Ⅱ：40min。
(4)浸蜡
将完全透明后的组织块取下脱水篮，将石蜡融化后将组织块按以下步骤浸蜡，石蜡温度在64℃左右，根据石蜡形态调整温度。
1、石蜡：二甲苯1:1混合：30min。
2、石蜡Ⅰ：1h。
3、石蜡Ⅱ：1h。
4、石蜡Ⅲ：1h。
(5)组织包埋
将浸好的组织块置于包埋盒中，将融化好的包埋石蜡注入包埋盒中，让石蜡完整包裹住组织块，同时避免石蜡凝固后与包埋盒有缝隙。
(6)修整蜡块
将包埋盒置于通风处待蜡液完全凝固，凝固后将包埋盒放入冰箱中 -20℃冷冻30min。
冷冻完成后，小心取出蜡块，先在蜡块一侧做好清晰的组织标记，然后用刀片切除组织块周围的石蜡，组织块周围要保留1～2mm的石蜡，蜡块修整为正方形。
S11：制作组织切片
(1)切片
蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。
(2)展片
预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。
(3)组织切片的脱蜡和水化
完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：
1、二甲苯Ⅰ：5min。
2、二甲苯Ⅱ：5min。
3、1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。
脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：
1、无水乙醇：2min。
2、95％乙醇：2min。
3、90％乙醇：2min。
4、80％乙醇：2min。
5、70％乙醇：2min。
6、蒸馏水浸洗：2min。
将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡 2min，最后用蒸馏水浸洗2min。
(4)组织切片的苏木素染色
首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。
(5)组织切片的伊红染色
将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：
1、70％乙醇：2min。
2、80％乙醇：2min。
3、95％乙醇：20min。
4、100％乙醇Ⅰ：2min。
脱色完成后，将组织切片置于95％乙醇和0.5％伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。
1、95％乙醇：2min。
2、无水乙醇Ⅰ：2min。
3、无水乙醇Ⅱ：2min。
4、1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。
5、二甲苯Ⅰ：10min。
6、二甲苯Ⅱ：10min。
(6)组织切片的封片
将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。
(7)观察组织切片
玻片置于显微成像系统进行观察，拍照保存。
S12：样品分析
S13：数据处理和结果判定
实验组和对照组比较差异有显著性，可判定该受试样品促进泌乳功能作用动物实验结果阳性。
优选的，所述采集的牡蛎原料应为新鲜的材料，根据牡蛎表面附着的脏污程度，对牡蛎进行不同程度的清洗。
优选的，所述选用的鼠类需要严格选用特定的重量、性别和鼠龄的实验鼠，利用特选的实验鼠建立超负荷哺乳大鼠模型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该牡蛎促进泌乳作用研究方法；
1.建立超负荷哺乳模型，以SD大鼠为实验对象，探究牡蛎粉是否有促进泌乳作用，利用牡蛎粉组和正常组的大鼠的泌乳量比较，说明牡蛎粉可以提高哺乳母鼠的泌乳量，牡蛎粉组和正常组母鼠的脏器指数相比，牡蛎粉组母鼠的脏器指数均高于正常组，符合哺乳母鼠正常健康的生理水平。
2.两组血清PRL浓度对比，牡蛎粉组高于正常组，催乳素浓度可以启动和维持泌乳，从而说明牡蛎粉有促进泌乳作用，牡蛎粉组的腺泡在显微镜下观察比正常组的腺泡充盈，数目多且密集，说明牡蛎粉促进了哺乳母鼠乳腺的发育，进而说明牡蛎粉可以哺乳母鼠的泌乳量，本实验初步科学的证明牡蛎粉对哺乳母鼠的泌乳具有促进作用，对牡蛎促泌乳后续深入研究有基础意义。
附图说明
图1为本发明体外模拟胃肠消化过程牡蛎蛋白和牡蛎酶解粉的水解度变化结构示意图；
图2为本发明牡蛎蛋白和牡蛎酶解粉的氮释放量变化示意图；
图3为本发明平均泌乳量数据分析结构示意图；
图4为本发明均值仔鼠体增重数据分析结构示意图；
图5为本发明PRL含量数据分析结构示意图。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，包括以下步骤：
S1、实验材料
(1)牡蛎、母鼠和公鼠。
(2)本实验使用均为SPF级健康SD大鼠，母鼠和公鼠比例为2：1，且母鼠和公鼠均为8周龄未配种大鼠，SD母鼠的体重范围：180g～200g，SD公鼠的体重范围：200g～250g。
S2、主要实验试剂
硼酸、无水碳酸钠、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸铜硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、酒石酸钠、氢氧化钠、氯化钠、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、乙酸锌、福林酚、牛血清蛋白。
S3、牡蛎粉的制取
(1)将新鲜的牡蛎利用清洗机或清洗池清洗干净，接着将清洗干净的牡蛎滤干，制粉。
(2)在20℃的温度下预冻，预冻3h后，便可放入-80℃超低温冰箱中深冻，对经过冷冻干燥的牡蛎粉进行干燥保存。
S4、牡蛎蛋白的制取
(1)牡蛎冻干粉50g溶于1L蒸馏水。
(2)0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至12～13。
(3)4℃下搅拌3小时，在10000r/min、4℃下离心15min，提取上层清液。
(4)0.1mol/L盐酸溶液调节上层清液pH至4.5～5.1，在10000r/min、 4℃下离心15min，收集沉淀物。
(5)将沉淀物转入12ku孔纤维透析袋，透析48小时，收集沉淀，并冷冻干燥，进行干燥保存。
S5、牡蛎酶解粉的制取
(1)将新鲜的牡蛎清洗干净，并进行沥干、匀浆，匀浆∶水为1∶3加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入动物蛋白水解酶。
(2)将1000U/g牡蛎肉在53℃水浴锅恒温6h，并以500r/min的速度离心20min，提取上清液，旋蒸除水，接着冷冻干燥，进行干燥保存。
S6、超负荷哺乳大鼠模型的建立
(1)调整每一窝母鼠所哺育的仔鼠数量，通过增加或减少仔鼠数量，使得每一窝仔鼠数量相同，母鼠哺乳同样数量的仔鼠，不能满足一窝仔鼠的摄食需要，为超负荷大鼠模型。
(2)平均分为正常组和牡蛎全粉组，正常组的灌胃蒸馏水，1mL/100g，每天一次，连续20天，牡蛎全粉组的同时灌胃0.8mg/mL牡蛎全粉溶液，每天一次，连续20天。
(3)体外模拟胃肠消化过程牡蛎蛋白和牡蛎酶解粉的水解度变化(见图 1)。
(4)牡蛎蛋白和牡蛎酶解粉的氮释放量变化(见图2)
S7、血清采集和保存
实验结束后，所有母鼠麻醉，眼球取血于离心管中，37℃静置20min，置于高速离心机离心，温度4℃，3000r/min离心15min，收集上清液，于-20℃冰箱中冻存待测。
S8、样品检测
(1)取出血清样品解冻，试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡15-30分钟后使用。
(2)操作步骤：
标准品的稀释：
加样：分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品稀释度为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：使用封板膜封板后置37℃温育30 分钟；
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水3倍稀释后备用；
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次拍干；
加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，温育，洗涤；
显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
终止：每孔加入终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
(3)数据处理(见图2、图4和图5)
S9：乳腺组织结构观察
将麻醉后的母鼠仰卧置于解剖手术盘上，沿腹正中线切开胸腹部皮肤，分离胸腹部皮下的乳腺组织，称量并记录乳腺的重量，然后切取距乳腺顶端 1cm的乳腺相同部位，放入大约10倍体积的4％中性多聚甲醛中固定24-72h，过两夜。
S10：组织蜡块制作
(1)固定组织修整与水洗
1、先将组织块置于固定液中固定24h～72h，再取出组织块。
2、取出组织块后用手术刀修整形状，置于脱水框中做好标记，自来水流动清洗组织块2小时以上洗去固定液。
(2)组织脱水
将洗去固定液的组织块按照如下步骤置于梯度浓度酒精中，进行脱水：
50％乙醇：30min。
70％乙醇：30min。
80％乙醇：30min。
95％乙醇：30min。
无水乙醇Ⅰ：30min。
无水乙醇Ⅱ：40min。
(3)透明
将脱水完成后的组织块按如下步骤操作：
1、置于二甲苯：酒精1:1溶液：15min。
2、二甲苯Ⅰ：15min。
3、二甲苯Ⅱ：40min。
(4)浸蜡
将完全透明后的组织块取下脱水篮，将石蜡融化后将组织块按以下步骤浸蜡，石蜡温度在64℃左右，根据石蜡形态调整温度。
1、石蜡：二甲苯1:1混合：30min。
2、石蜡Ⅰ：1h。
3、石蜡Ⅱ：1h。
4、石蜡Ⅲ：1h。
(5)组织包埋
将浸好的组织块置于包埋盒中，将融化好的包埋石蜡注入包埋盒中，让石蜡完整包裹住组织块，同时避免石蜡凝固后与包埋盒有缝隙。
(6)修整蜡块
将包埋盒置于通风处待蜡液完全凝固，凝固后将包埋盒放入冰箱中 -20℃冷冻30min。
冷冻完成后，小心取出蜡块，先在蜡块一侧做好清晰的组织标记，然后用刀片切除组织块周围的石蜡，组织块周围要保留1～2mm的石蜡，蜡块修整为正方形。
S11：制作组织切片
(1)切片
蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。
(2)展片
预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。
(3)组织切片的脱蜡和水化
完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：
1、二甲苯Ⅰ：5min。
2、二甲苯Ⅱ：5min。
3、1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。
脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：
1、无水乙醇：2min。
2、95％乙醇：2min。
3、90％乙醇：2min。
4、80％乙醇：2min。
5、70％乙醇：2min。
6、蒸馏水浸洗：2min。
将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡 2min，最后用蒸馏水浸洗2min。
(4)组织切片的苏木素染色
首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。
(5)组织切片的伊红染色
将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：
1、70％乙醇：2min。
2、80％乙醇：2min。
3、95％乙醇：20min。
4、100％乙醇Ⅰ：2min。
脱色完成后，将组织切片置于95％乙醇和0.5％伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。
1、95％乙醇：2min。
2、无水乙醇Ⅰ：2min。
3、无水乙醇Ⅱ：2min。
4、1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。
5、二甲苯Ⅰ：10min。
6、二甲苯Ⅱ：10min。
(6)组织切片的封片
将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。
(7)观察组织切片
玻片置于显微成像系统进行观察，拍照保存。
S12：样品分析
S13：数据处理和结果判定
实验组和对照组比较差异有显著性，可判定该受试样品促进泌乳功能作用动物实验结果阳性。
采集的牡蛎原料应为新鲜的材料，根据牡蛎表面附着的脏污程度，对牡蛎进行不同程度的清洗。
选用的鼠类需要严格选用特定的重量、性别和鼠龄的实验鼠，利用特选的实验鼠建立超负荷哺乳大鼠模型。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、实验材料
（1）牡蛎、母鼠和公鼠。
（2）本实验使用均为SPF级健康SD大鼠，母鼠和公鼠比例为2：1，且母鼠和公鼠均为8周龄未配种大鼠，SD母鼠的体重范围：180g～200g，SD公鼠的体重范围：200g～250g。
S2、主要实验试剂
硼酸、无水碳酸钠、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸铜硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、酒石酸钠、氢氧化钠、氯化钠、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、乙酸锌、福林酚、牛血清蛋白。
S3、牡蛎粉的制取
（1）将新鲜的牡蛎利用清洗机或清洗池清洗干净，接着将清洗干净的牡蛎滤干，制粉。
（2）在20℃的温度下预冻，预冻3h后，便可放入-80℃超低温冰箱中深冻，对经过冷冻干燥的牡蛎粉进行干燥保存。
S4、牡蛎蛋白的制取
（1）牡蛎冻干粉50g溶于1L蒸馏水。
（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至12～13。
（3）4℃下搅拌3小时，在10000r/min、4℃下离心15min，提取上层清液。
（4）0.1mol/L盐酸溶液调节上层清液pH至4.5～5.1，在10000r/min、4℃下离心15min，收集沉淀物。
（5）将沉淀物转入12ku孔纤维透析袋，透析48小时，收集沉淀，并冷冻干燥，进行干燥保存。
S5、牡蛎酶解粉的制取
（1）将新鲜的牡蛎清洗干净，并进行沥干、匀浆，匀浆∶水为1∶3加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入动物蛋白水解酶。
（2）将1000U/g牡蛎肉在53℃水浴锅恒温6h，并以500r/min的速度离心20min，提取上清液，旋蒸除水，接着冷冻干燥，进行干燥保存。
S6、超负荷哺乳大鼠模型的建立
（1）调整每一窝母鼠所哺育的仔鼠数量，通过增加或减少仔鼠数量，使得每一窝仔鼠数量相同，母鼠哺乳同样数量的仔鼠，不能满足一窝仔鼠的摄食需要，为超负荷大鼠模型。
（2）平均分为正常组和牡蛎全粉组，正常组的灌胃蒸馏水，1mL/100g，每天一次，连续20天，牡蛎全粉组的同时灌胃0.8mg/mL牡蛎全粉溶液，每天一次，连续20天。
S7、血清采集和保存
实验结束后，所有母鼠麻醉，眼球取血于离心管中，37℃静置20min，置于高速离心机离心，温度4℃，3000r/min离心15min，收集上清液，于-20℃冰箱中冻存待测。
S8、样品检测
（1）取出血清样品解冻，试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡15-30分钟后使用。
（2）操作步骤：
标准品的稀释：
加样：分别设置空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同）、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL（样品稀释度为5倍），加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
温育：使用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水3倍稀释后备用；
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次拍干；
加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，温育，洗涤；
显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
终止：每孔加入终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）；
测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。
（3）数据处理
S9：乳腺组织结构观察
将麻醉后的母鼠仰卧置于解剖手术盘上，沿腹正中线切开胸腹部皮肤，分离胸腹部皮下的乳腺组织，称量并记录乳腺的重量，然后切取距乳腺顶端1cm的乳腺相同部位，放入大约10倍体积的4%中性多聚甲醛中固定24-72h，过两夜。
S10：组织蜡块制作
（1）固定组织修整与水洗
1、 先将组织块置于固定液中固定24h～72h，再取出组织块。
2、取出组织块后用手术刀修整形状，置于脱水框中做好标记，自来水流动清洗组织块2小时以上洗去固定液。
（2）组织脱水
将洗去固定液的组织块按照如下步骤置于梯度浓度酒精中，进行脱水：
50%乙醇：30min。
70%乙醇：30min。
80%乙醇：30min。
95%乙醇：30min。
无水乙醇Ⅰ：30min。
无水乙醇Ⅱ：40min。
（3）透明
将脱水完成后的组织块按如下步骤操作：
1、置于二甲苯：酒精1:1溶液：15min。
2、二甲苯Ⅰ：15min。
3、二甲苯Ⅱ：40min。
（4）浸蜡
将完全透明后的组织块取下脱水篮，将石蜡融化后将组织块按以下步骤浸蜡，石蜡温度在64℃左右，根据石蜡形态调整温度。
1、石蜡：二甲苯1:1混合 ：30min。
2、石蜡Ⅰ：1h。
3、石蜡Ⅱ：1h。
4、石蜡Ⅲ：1h。
（5）组织包埋
将浸好的组织块置于包埋盒中，将融化好的包埋石蜡注入包埋盒中，让石蜡完整包裹住组织块，同时避免石蜡凝固后与包埋盒有缝隙。
（6）修整蜡块
将包埋盒置于通风处待蜡液完全凝固，凝固后将包埋盒放入冰箱中-20℃冷冻30min。
冷冻完成后，小心取出蜡块，先在蜡块一侧做好清晰的组织标记，然后用刀片切除组织块周围的石蜡，组织块周围要保留1～2mm的石蜡，蜡块修整为正方形。
S11：制作组织切片
（1）切片
蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。
（2）展片
预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。
（3）组织切片的脱蜡和水化
完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：
1、二甲苯Ⅰ：5min。
2、二甲苯Ⅱ：5min。
3、1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。
脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：
1、无水乙醇：2min。
2、95%乙醇：2min。
3、90%乙醇：2min。
4、80%乙醇：2min。
5、70%乙醇：2min。
6、蒸馏水浸洗：2min。
将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡2min，最后用蒸馏水浸洗2min。
（4）组织切片的苏木素染色
首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。
（5）组织切片的伊红染色
将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：
1、70%乙醇：2min。
2、80%乙醇：2min。
3、95%乙醇：20min。
4、100%乙醇Ⅰ：2min。
脱色完成后，将组织切片置于95%乙醇和0.5%伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。
1、95%乙醇：2min。
2、无水乙醇Ⅰ：2min。
3、无水乙醇Ⅱ：2min。
4、1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。
5、二甲苯Ⅰ：10min。
6、二甲苯Ⅱ：10min。
（6）组织切片的封片
将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。
（7）观察组织切片
玻片置于显微成像系统进行观察，拍照保存。
S12：样品分析
S13：数据处理和结果判定
实验组和对照组比较差异有显著性，可判定该受试样品促进泌乳功能作用动物实验结果阳性。
2.根据权利要求1所述的一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，其特征在于：所述采集的牡蛎原料应为新鲜的材料，根据牡蛎表面附着的脏污程度，对牡蛎进行不同程度的清洗。
3.根据权利要求1所述的一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，其特征在于：所述选用的鼠类需要严格选用特定的重量、性别和鼠龄的实验鼠，利用特选的实验鼠建立超负荷哺乳大鼠模型。
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