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CN111979167A - 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN111979167A CN202010824130.2A CN202010824130A CN111979167A CN 111979167 A CN111979167 A CN 111979167A CN 202010824130 A CN202010824130 A CN 202010824130A CN 111979167 A CN111979167 A CN 111979167A
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Abstract

本发明提供了一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。具体地，重组丙丁梭菌为Clostridium acetobutylicum TXYL，其于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2020107。本发明提供的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌应用于秸秆水解液发酵生产丁醇，发酵周期缩短至24h，葡萄糖与木糖消耗速率加快，木糖利用率提高，实现了秸秆葡萄糖与木糖碳源的高效转化，丁醇得率与生产强度显著提高。

Description

一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。
背景技术
丁醇是重要的化工原料，可用作工业化学品合成前体及重要溶剂，在医药工业、塑料工业、有机工业、印染等方面具有广泛应用。丁醇也是一种公认的新型可再生能源，可有效替代化石燃料，具有与汽油相容性性好、安全系数高、能量密度高以及抗爆性好等性能优势，以发酵法生产的生物丁醇可作为化石燃料的绿色替代品，发展潜力巨大，可以为摆脱化石燃料铺平道路。
木质纤维素原料是世界上最为丰富的生物质资源，全球每年木质纤维素产量约为100亿吨，我国高达7.5亿吨，就地焚烧将造成严重的环境污染问题，而利用这些秸秆原料生产生物丁醇被认为是替代现有汽油和柴油等石油基燃料的经济型能源发展策略，将凸显可观的社会与环境效益。事实上，秸秆生物质主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，通过必要预处理及纤维素酶水解释放多种可发酵碳源，秸秆生物质碳源主要包括木糖和葡萄糖。
丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(简称丙丁梭菌，Clostridium acetobutylicum)广泛应用于丁醇发酵，为严格厌氧革兰氏阳性细菌，底物利用广泛，能够利用包括葡萄糖与木糖等在内的多种碳源。然而在葡萄糖存在的条件下，丙丁梭菌会优先消耗葡萄糖后，再继续利用木糖，不具备天然同步利用葡萄糖与木糖能力。另一方面，木糖被转运至丙丁梭菌胞内后，首先通过两步(木糖异构酶和木酮糖激酶)或三步(木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶)催化反应生成5-磷酸-木酮糖，进入磷酸戊糖途径(Pentose Phosphate Pathway，PPP)，涉及转醛酶、转酮酶、5-磷酸-核糖异构酶以及5-磷酸-核酮糖差向异构酶等关键酶，先后形成核糖-5磷酸、核酮糖-5磷酸、景天庚酮糖-7磷酸、赤藓糖-4磷酸、果糖-6磷酸、 3-磷酸甘油醛等多种中间代谢产物，伴随ATP消耗，再进入后续丁醇合成途径。综上，丙丁梭菌木糖代谢途径冗长低效，木糖转化丁醇得率与效率严重受限。
近年来，针对丙丁梭菌木糖转运转化途径开展了大量研究工作，例如，Xiao 等[1]敲除了丙丁梭菌中葡萄糖依赖型磷酸转移酶系统编码基因g1cG，重组丙丁梭菌可以同步利用葡萄糖与木糖，随后与木糖代谢关键基因xylT，xylA及xylB 协同过表达，发酵生产丁醇产量进一步提高；Ren等[2]敲除了丙丁梭菌中多效调控因子ccpA，重组丙丁梭菌能够同步利用葡萄糖与木糖发酵生产丁醇；Gu 等[3]在丙丁梭菌中异源表达大肠杆菌转醛醇酶基因talA，木糖消耗与丁醇产量具有所提高；Gu等[4]在丙丁梭菌中协同过表达木糖代谢关键酶基因xylA、xylB、 tal以及tkl；Jin等[5]在丙丁梭菌中协同过表达木糖代谢关键基因tal，tkt，rpe 及rpi，所构建的重组丙丁梭菌木糖消耗与丁醇产量均有效提高。尽管这些研究工作一定程度提高了丙丁梭菌转运转化木糖能力，但局限于利用含有葡萄糖与木糖的合成培养基，且发酵周期大多长达60～120小时(h)，丁醇得率为0.1～0.2 g/g，丁醇生产强度为0.1～0.2g/L/h，葡萄糖与木糖转化效率依然存在不足。
因此，亟需一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。在丙丁梭菌内过表达木糖转运蛋白编码基因xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶编码基因xylB与木糖内酯酶编码基因xylC，其中过表达xylT增强转运木糖能力；过表达xylB与xylC引入木糖酸合成途径，木糖经木糖脱氢酶和木酮糖内酯酶2步转化为木糖酸，提高木糖转化效率，同时不额外消耗ATP，且每利用1分子木糖生成1分子木糖酸过程中将额外生成1分子NADH，可促进丁醇合成代谢，提高丁醇得率与生产强度。事实上，假单胞菌属、醋杆菌属、气杆菌属、葡萄杆菌属、欧文氏菌属等好氧微生物能够天然合成木糖酸，大肠杆菌及酵母等好氧微生物经过基因工程改造，能够促进重组菌株利用木糖并合成木糖酸，本发明在严格厌氧微生物丙丁梭菌中，首次异源表达木糖酸合成途径，以解决现有技术中丙丁梭菌利用木质纤维素生物质碳源葡萄糖与木糖过程中，木糖转运转化效率低，发酵周期长，丁醇得率与生产强度低的技术问题。
本发明的技术方案为：
一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。
在一个具体的实施方案中，通过构建丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的表达载体，并将所述表达载体导入到野生型出发菌株丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum以获得所述的重组丙丁梭菌。
在一个具体的实施方案中，所述的表达载体为原核表达载体。
在一个具体的实施方案中，所述的原核表达载体为载体质粒pIMP1。
在一个具体的实施方案中，木糖内酯酶核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为Clostridiumacetobutylicum TXYL，其于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2020107。
另一方面，本发明提供了上述高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌的构建方法，具体包括以下步骤：
1)通过酶切连接方法，将如SEQ ID NO:3所示的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列、如SEQ ID NO:2所示的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列和如 SEQ ID NO:1所示的木糖内酯酶核苷酸序列连接入载体质粒pIMP1中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的5’端均连接有如SEQ ID NO:4所示的丙丁梭菌启动子，获得重组质粒pIMP1-XylTBC。
2)将步骤1)中获得的重组质粒pIMP1-XylTBC转入E.coli DH10B中，得到甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC。
3)将步骤2)中经甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC转化至野生型出发菌株丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum)，经培养、筛选获得丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的重组丙丁梭菌。
另一方面，本发明提供了一种厌氧发酵生产丁醇的方法，其基于上述的重组丙丁梭菌或上述的重组丙丁梭菌的构建方法制备的重组丙丁梭菌，包括以下步骤：
1)重组丙丁梭菌活化培养：将重组丙丁梭菌接种至液体活化培养基中，置于厌氧环境中静置培养，培养温度为37℃，静置活化培养16～24h用于种子培养；
2)重组丙丁梭菌种子培养：将步骤1)中活化的菌种按10％(v/v)接种量接种于液体种子培养基中，置于厌氧环境中摇瓶培养，培养温度为37℃，转速为 130～200rpm，培养18～24h用于发酵培养；
3)重组丙丁梭菌发酵培养：采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵温度控制在33～ 39℃，搅拌转速为130～200rpm，接种前发酵罐通入N2以除去发酵培养基中的溶氧，发酵24～72h。
其中，在步骤3)中，通过添加稀硫酸或氢氧化钾溶液将接种后发酵培养基初始pH调至5.5；或者，接种后，添加碳酸钙以控制发酵全程在pH5～6范围内。
其中，在步骤3)中，所述的发酵培养基为液体发酵培养基：其包含葡萄糖 20～60g/L，木糖10～30g/L，酵母粉2g/L，乙酸铵3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，生物素0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L；或者所述的发酵培养基为秸秆水解液发酵培养基，所述的秸秆水解液发酵培养基为秸秆经过物理、化学、生物或联合预处理及纤维素酶酶解后获得的水解液，所述的水解液主要包含葡萄糖20～60g/L，木糖10～30g/L。
在一个可选的实施方案中，所述的秸秆选自玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆以及稻草秸秆中的一种或几种，所述的秸秆预处理前粉粹至0.1～0.5 mm。
其中，在步骤1)中，所述的液体种子培养基包含胰蛋白胨30g/L，葡萄糖 20g/L，酵母粉10g/L，自然pH。
其中，在步骤2)中，所述的液体种子培养包含葡萄糖60g/L，酵母粉2g/L，乙酸铵3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L， MnSO4·H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，生物素0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01 g/L，自然pH。
另一方面，本发明提供了上述的重组丙丁梭菌或上述的重组丙丁梭菌的构建方法制备的重组丙丁梭菌厌氧发酵生产丁醇的应用。
本发明的效果和益处是：本发明提供一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。在丙丁梭菌内过表达木糖转运蛋白编码基因 xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶编码基因xylB与木糖内酯酶编码基因xylC，其中过表达xylT增强转运木糖能力；过表达xylB与xylC引入木糖酸合成途径，木糖经木糖脱氢酶和木酮糖内酯酶2步转化为木糖酸，提高木糖转化效率，同时不额外消耗ATP，且每利用1分子木糖生成1分子木糖酸过程中将额外生成1分子NADH，可促进丁醇合成代谢，提高丁醇得率与生产强度。该重组菌株应用于含有葡萄糖与木糖的合成培养基以及秸秆水解液发酵生产丁醇，发酵周期缩短至24h，葡萄糖与木糖消耗速率加快，木糖利用率提高，丁醇得率提高至0.24 g/g，较对照菌株提高了14.2％～84.6％，丁醇生产强度提高至0.44～0.50g/L/h，较对照菌株提高了85.2％～238.5％。实现了葡萄糖与木糖碳源的高效转化，发酵效率显著提高。
附图说明
图1：所构建包含基因xylT、xylB及xylC的载体质粒图谱。
图2：无控pH条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用葡萄糖与木糖生产丁醇。
图3：无控pH条件下重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL利用葡萄糖与木糖生产丁醇与木糖酸。
图4：添加10g/L碳酸钙条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用葡萄糖与木糖生产丁醇。
图5：添加10g/L碳酸钙条件下重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL 利用葡萄糖与木糖生产丁醇与木糖酸。
图6：添加10g/L碳酸钙条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用玉米秸秆水解液生产丁醇。
图7：添加10g/L碳酸钙条件下重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL 利用玉米秸秆水解液生产丁醇与木糖酸。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验材料
1、菌种
本发明所用原始野生型出发菌株为丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum ATCC824(购自美国典型菌株保藏中心)，所涉及重组菌株为Clostridium acetobutylicumTXYL，为所构建的丙丁梭菌木糖转运蛋白基因xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶基因xylB与木糖内酯酶基因xylC协同过表达菌株，该重组菌株于 2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌种保藏编号为 CCTCC NO：M 2020107。
2、培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，自然pH，用于大肠杆菌培养。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉 15g/L，自然pH，用于大肠杆菌培养。
液体活化培养基：胰蛋白胨30g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，自然pH，用于丙丁梭菌培养。
液体种子培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉2g/L，乙酸铵3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，生物素0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，自然pH，用于丙丁梭菌培养。
固体种子培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉2g/L，乙酸铵3.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L， FeSO4·7H2O 0.01g/L，生物素0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，琼脂粉20g/L，自然pH，用于丙丁梭菌培养。
液体发酵培养基：葡萄糖40g/L，木糖20g/L，酵母粉2g/L，乙酸铵3.0 g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，生物素0.01g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，用于丙丁梭菌培养。
秸秆水解液发酵培养基：秸秆经过物理、化学、生物或联合预处理及纤维素酶酶解后获得的水解液，其主要包含葡萄糖20～60g/L，木糖10～30g/L；秸秆选自玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆以及稻草秸秆中的一种或几种秸秆预处理前粉粹至0.1～0.5mm。在以下实施例中选用基于玉米秸秆水解液的发酵培养基。
实施例1：重组质粒及丙丁梭菌的构建
1、基因片段合成与重组质粒构建
根据NCBI检索信息(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)，所涉及的启动子thl、丙丁梭菌木糖转运蛋白编码基因xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶编码基因xylB与xylC序列信息如下所示，基因片段xylT-thl与xylB-thl-xylC 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中xylB-thl-xylC选取酶切位点 KpnI/EcoRI连入载体质粒pIMP1[Mermelstein L.D.,Welker N.E.,Bennett G.N., Papoutsakis E.T.Expression ofcloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC824.Nature Biotechnology,1992,10(2):190-5.]， xylT-thl选取酶切位点XbaI/BamHI连入载体质粒pIMP1。通过酶切、PCR和测序等方法进行验证，所产生的正确重组质粒命名为pIMP1-XylTBC。图1为所构建包含基因xylT、xylB及xylC的重组质粒图谱。
新月柄杆菌Caulobacter crescentus木糖内酯酶基因xylC序列(870bp)
ATGACCGCTCAAGTCACTTGCGTATGGGATCTGAAGGCCACGTTGGGC GAAGGCCCGATCTGGCATGGCGACACCCTGTGGTTCGTCGACATCAAGCA GCGTAAAATCCACAACTACCACCCCGCCACCGGCGAGCGCTTCAGCTTCG ACGCGCCGGATCAGGTGACCTTCCTCGCGCCGATCGTCGGCGCGACCGGC TTTGTCGTCGGTCTGAAGACCGGGATTCACCGCTTCCACCCGGCCACGGG CTTCAGCCTGCTGCTCGAGGTCGAGGACGCGGCGCTGAACAACCGCCCCA ACGACGCCACGGTCGACGCGCAAGGCCGTCTGTGGTTCGGCACCATGCAC GACGGGGAAGAGAACAATAGCGGCTCGCTCTATCGGATGGACCTCACCGG CGTCGCCCGGATGGACCGCGACATCTGCATCACCAACGGCCCGTGCGTCT CGCCCGACGGCAAGACCTTCTACCACACCGACACCCTGGAAAAGACGATC TACGCCTTCGACCTGGCCGAGGACGGCCTGCTGTCGAACAAGCGCGTCTT CGTGCAGTTCGCCCTGGGCGACGATGTCTATCCGGACGGTTCGGTCGTCGA TTCCGAAGGCTATCTGTGGACCGCCCTGTGGGGCGGTTTCGGCGCGGTCC GCTTCTCGCCGCAAGGCGACGCCGTGACGCGCATCGAACTGCCCGCCCCC AACGTCACCAAGCCCTGCTTCGGCGGGCCTGACCTGAAGACCCTCTATTTC ACCACCGCCCGCAAGGGCCTGAGCGACGAGACCCTGGCCCAGTACCCGCT GGCCGGCGGTGTGTTCGCCGTTCCGGTCGATGTGGCCGGCCAACCCCAGC ATGAGGTCCGCCTTGTCTAA(SEQ ID NO:1)
新月柄杆菌Caulobacter crescentus木糖脱氢酶基因xylB序列(747bp)
ATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCCTGAAGGGCAAGCGCGTCGTCATC ACCGGCGGCGGCTCGGGCATCGGGGCCGGCCTCACCGCCGGCTTCGCCCG TCAGGGCGCGGAGGTGATCTTCCTCGACATCGCCGACGAGGACTCCAGGG CTCTTGAGGCCGAGCTGGCCGGCTCGCCGATCCCGCCGGTCTACAAGCGC TGCGACCTGATGAACCTCGAGGCGATCAAGGCGGTCTTCGCCGAGATCGG CGACGTCGACGTGCTGGTCAACAACGCCGGCAATGACGACCGCCACAAG CTGGCCGACGTGACCGGCGCCTATTGGGACGAGCGGATCAACGTCAACCT GCGCCACATGCTGTTCTGCACCCAGGCCGTCGCGCCGGGCATGAAGAAGC GTGGCGGCGGGGCGGTGATCAACTTCGGTTCGATCAGCTGGCACCTGGGG CTTGAGGACCTCGTCCTCTACGAAACCGCCAAGGCCGGCATCGAAGGCAT GACCCGCGCGCTGGCCCGGGAGCTGGGTCCCGACGACATCCGCGTCACCT GCGTGGTGCCGGGCAACGTCAAGACCAAGCGCCAGGAGAAGTGGTACAC GCCCGAAGGCGAGGCCCAGATCGTGGCGGCCCAATGCCTGAAGGGCCGCA TCGTCCCGGAGAACGTCGCCGCGCTGGTGCTGTTCCTGGCCTCGGATGAC GCGTCGCTCTGCACCGGCCACGAATACTGGATCGACGCCGGCTGGCGTTG A(SEQ ID NO:2)
丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum木糖转运基因xylT序列(1368bp)
ATGAATAAAAAAATATCTCCAGCACTAATTTATTTCTTTGGAGCCTTCG GTGGATTTATGTTTGGATATGATATTGGAATAATTAATGGTGCTTTACCTGGA ATTAATGCAACTTGGCACGTAAGTTCTTGGTTAGAAGGATTTATCACTTCTG GATTGTTTGTTGGAGCTATGATAGGAGCCTCATTAATGGCTTCACTAGCAGA TAGGTTTGGTCGTCGTAGAATGATTATGTGGAGTGCAATTGTGTTTGCACTT GGTGCATTAGGTTCTGCCGTTTCTACTAGTACTAATCTTTTAATCGGTGCTC GTGTTATTTTAGGAGTAGCTGTAGGTGGAGCTTCTGCTTTAGTTCCAATGTA TATGGGAGAAATTAGCCCTGCTGAAACACGTGGAAAACTATCTGGTTTAAA TCAATTAATGATAACTGTTGGAATGCTTTTCTCATATGGTGTAAATTTTGCGT TTGCTGGTGCATTTGAAGGATGGCGTTGGATGCTTGGAGGAGCTATGGTAC CTGCAATGGTACTATTAATTGGAACATTTATACTTCCAGAGTCACCAAGATT TTTAGCTAGAATAGGAAAGACAGAATTAGCAAAACAAGTACTTCAGACTTT ACGTTCAAAGGAAGAGGCAGAAACTGAATATCAAGAGATTATTAATTCAA AACATACTGAAACAGGTTCTTTTGGAGATTTATTTGCAAAACAGGCTTTGC CAGCTGTAATTGCAGGCTGTGGGTTAACACTTCTTCAACAAATTCAAGGTG CAAACACTATTTTCTACTATTCATCACAAATTTTATCCAATGTTTTTGGATCA GCAAATGGTGGAACTATTAGTACTGTTGGAATTGGTGTGGTTCTAGTATTAG CAACTATTGTAACTTTATTGGTTGTAGACAAATTCAAACGTCGTACATTATTT ATGACTGGTTCTATTGGAATGGGCGCATCTCTATTATTAGTTGGATTAATTTA TCCATACTCTGAAGCTAAACATGCGTGGGCAACTTGGTTAGTATTCTTCTTC ATATGTTTATACGTTGTTTTCTATGCATACTCTTGGGCAGCTACTACATGGAT TGTTGTTGGAGAATTATTCCCAAGTAATGTTAGAGGACTTGCAACAGGTAT TGCATCAGCAGTAAACTGGTTTGGTAACATTTTAGTTGCTTTATTCTTCCCA GTATTACTTGAAACTGTAGGTTTATCTGTAATCTTCTTCGGTTTTGCTGCAAT TTGTATCATAGGATTTTTATTTGCAAAATATGTTCTTTATGAAACAAAAGGA AAATCTTTAGAAGAAATTGAGACATATTTGTACAATCGTTCTATTGGAAAAG TTAGAGGATTAAATGAGTAG(SEQ ID NO:3)
丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum启动子基因thl序列(153bp)
TTTTTAACAAAATATATTGATAAAAATAATAATAGTGGGTATAATTAAGT TGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGA TTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGA (SEQ ID NO:4)
3、重组丙丁梭菌的构建
将-80℃保存的丙丁梭菌在固体种子培养基平板上划线，于37℃厌氧环境下静置培养18～24h；挑取单菌落接种于液体种子培养基中，于37℃厌氧环境下静置培养12～16h；将预培养菌液接入液体种子培养基中，于37℃厌氧环境下振荡培养至620nm吸光值为0.6～1.0，所获丙丁梭菌菌体在4℃预冷，用于制备丙丁梭菌感受态细胞。
将构建的重组质粒pIMP1-XylTBC转入到E.coli DH10B[Mermelstein,L.D. &Papoutsakis,E.T.In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillussubtilis phage phi 3T Imethyltransferase to protect plasmids from restrictionupon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824.Applied andEnvironmental Microbiology,1993,59(4),1077-1081.]感受态细胞中，经转化、复壮、挑取单菌落培养后，提取甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC；再将上述甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC电转至制备的丙丁梭菌感受态细胞中，复壮后，涂布于含有红霉素抗性的固体种子培养基上，于37℃厌氧环境下静置培养36h 后，所获单菌落，即为丙丁梭菌木糖转运蛋白基因xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶基因xylB与木糖内酯酶基因xylC协同过表达的重组丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum TXYL；单菌落接种于液体种子培养基(含红霉素抗性)中，于 37℃厌氧环境下静置培养16～24h后，再转接至玉米醪培养基中，于37℃厌氧扩培40～48h，所获菌液与等体积40％甘油溶液混合均匀，分装并冻藏于实验室-80℃环境中备用。
实施例2：无控pH条件下，对照菌株Clostridium acetobutylicum与重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL利用葡萄糖与木糖发酵比较
具体地，本实施例包括以下步骤：
1、活化培养：将实施例1中构建的重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL与对照菌株Clostridium acetobutylicum分别接种至液体活化培养基(实验组含红霉素抗性)中，置于厌氧环境中静置培养，培养温度为37℃，静置活化培养24h用于种子培养；
2、种子培养：将步骤1中活化的菌种按10％(v/v)接种量接种于液体种子培养基(实验组含红霉素抗性)中，置于厌氧环境中摇瓶培养，培养温度为37℃，转速为150rpm，培养24h用于厌氧发酵培养；
3、发酵培养：采用Biotec-3BG-4发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司) 进行厌氧发酵，液体发酵培养基装液量为1L(实验组含红霉素抗性)，发酵温度控制在37℃，搅拌转速为150rpm，通过添加稀硫酸或氢氧化钾溶液将接种后发酵培养基初始pH调至5.5，接种前发酵罐通入N2以除去发酵培养基中的溶氧，发酵72h。
图2为无控pH条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用葡萄糖与木糖生产丁醇。图3为无控pH条件下重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL 利用葡萄糖与木糖生产丁醇与木糖酸。本实施例实验结果参见图2和图3，对照菌株Clostridiumacetobutylicum利用葡萄糖与木糖过程中，发酵全程pH在 4.7～5.5范围内变化，葡萄糖平均消耗速率为0.84g/L/h，木糖平均消耗速率为 0.16g/L/h，发酵60h检测到最高丁醇浓度为10.3g/L，丁醇得率为0.21g/g，丁醇生产强度为0.18g/L/h。相比，重组菌株Clostridiumacetobutylicum TXYL利用葡萄糖与木糖过程中，发酵全程pH在3.8～5.5范围内变化，葡萄糖利用加快，平均消耗速率为1.67g/L/h，较对照菌株提高了98.8％；木糖利用加快，消耗量由对照菌株9.5g/L提高至12g/L，平均消耗速率为0.50g/L/h，较对照菌株提高了212.5％；发酵36h检测到最高木糖酸浓度为6g/L，期间丁醇合成加快，发酵仅24h即检测到最高丁醇浓度为10.6g/L，最终丁醇得率为0.24g/g，较对照菌株提高了14.2％，丁醇生产强度为0.47g/L/h，较对照菌株提高了161.1％。显而易见的，本实施例利用所构建的重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL实现了葡萄糖与木糖碳源的高效转化，丁醇得率与生产强度显著提高。
实施例3：添加10g/L碳酸钙条件下，对照菌株Clostridium acetobutylicum 与重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL利用葡萄糖与木糖发酵比较
具体地，本实施例包括以下步骤：
1、活化培养：同实施例2的活化培养步骤。
2、种子培养：同实施例2的种子培养步骤。
3、发酵培养：采用Biotec-3BG-4发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司) 进行厌氧发酵，液体发酵培养基装液量为1L(实验组含红霉素抗性)，发酵温度控制在37℃，搅拌转速为150rpm，接种前发酵罐通入N2以除去发酵培养基中的溶氧。接种后，添加10g/L碳酸钙以控制发酵全程在pH5～6范围内，发酵72 h。
图4为添加10g/L碳酸钙条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用葡萄糖与木糖生产丁醇。图5为添加10g/L碳酸钙条件下重组菌株Clostridium acetobutylicumTXYL利用葡萄糖与木糖生产丁醇与木糖酸。本实施例实验结果参见图4和图5，对照菌株Clostridium acetobutylicum利用葡萄糖与木糖过程中，发酵全程pH在5～6范围内变化，葡萄糖平均消耗速率为1.68g/L/h，木糖平均消耗速率为0.39g/L/h，发酵36h检测到最高丁醇浓度为9.6g/L，丁醇得率为 0.18g/g，丁醇生产强度为0.27g/L/h。相比，重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL利用葡萄糖与木糖过程中，发酵全程pH在5～6范围内变化，葡萄糖平均消耗速率为1.70g/L/h，木糖平均消耗速率为0.71g/L/h；发酵36h检测到最高木糖酸浓度为9.6g/L，期间丁醇合成加快，发酵仅24h即检测到最高丁醇浓度为12.0g/L，最终丁醇得率为0.24g/g，较对照菌株提高了33.3％，丁醇生产强度为0.50g/L/h，较对照菌株提高了85.2％。显而易见的，本实施例利用所构建的重组菌株Clostridiumacetobutylicum TXYL实现了葡萄糖与木糖碳源的高效转化，丁醇得率与生产强度显著提高。
实施例4：添加10g/L碳酸钙条件下，对照菌株Clostridium acetobutylicum 与重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL利用玉米秸秆水解液发酵比较
本实施例包括以下步骤：
1、活化培养：同实施例2的活化培养步骤；
2、种子培养：同实施例2的种子培养步骤；
3、发酵培养：采用Biotec-3BG-4发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司) 进行厌氧发酵，秸秆水解液发酵培养基装液量为1L(实验组含红霉素抗性)，其中，在本实施例中，玉米秸秆(0.1～5mm)经过稀硫酸预处理及纤维素酶酶解后制备秸秆水解液发酵培养基，主要碳源葡萄糖浓度为～35g/L，木糖浓度为～15 g/L，发酵温度控制在37℃，搅拌转速为150rpm，接种前发酵罐通入N2以除去发酵培养基中的溶氧。接种后，添加10g/L碳酸钙以控制发酵全程在pH5～6范围内，发酵72h。
图6为添加10g/L碳酸钙条件下对照菌株Clostridium acetobutylicum利用玉米秸秆水解液生产丁醇。图7为添加10g/L碳酸钙条件下重组菌株Clostridiumacetobutylicum TXYL利用玉米秸秆水解液生产丁醇与木糖酸。本实施例实验结果参见图6和图7，对照菌株Clostridium acetobutylicum利用水解液过程中，葡萄糖平均消耗速率为0.94g/L/h，木糖平均消耗速率为0.29g/L/h，发酵48h检测到最高丁醇浓度为6.3g/L，丁醇得率为0.13g/g，丁醇生产强度为0.13g/L/h。相比，重组菌株Clostridium acetobutylicumTXYL利用水解液过程中，葡萄糖平均消耗速率为1.4g/L/h，木糖平均消耗速率为0.58g/L/h；发酵36h检测到最高木糖酸浓度为7.5g/L，期间丁醇合成加快，发酵仅24h即检测到最高丁醇浓度为10.5g/L，最终丁醇得率为0.24g/g，较对照菌株提高了84.6％，丁醇生产强度为0.44g/L/h，较对照菌株提高了238.5％。显而易见的，本实施例利用所构建的重组菌株Clostridium acetobutylicum TXYL实现了秸秆生物质碳源葡萄糖与木糖碳源的高效转化，丁醇得率与生产强度显著提高。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。
参考文献：
[1]Xiao H,Gu Y,Ning Y,et al.Confirmation and elimination of xylosemetabolism bottlenecks in glucose phosphoenolpyruvate-dependentphosphotransferase system-deficient Clostridium acetobutylicum forsimultaneous utilization of glucose,xylose,and arabinose.Applied andEnvironmental Microbiology,2011,77(22):7886-7895.
[2]Ren C,Gu Y,Hu S,et al.Identification and inactivation ofpleiotropic regulator CcpA to eliminate glucose repression of xyloseutilization in Clostridium acetobutylicum.Metabolic Engineering,2010,12(5):446-454.
[3]Gu Y,Li J,Zhang L,et al.Improvement of xylose utilization inClostridium acetobutylicum via expression of the talA gene encodingtransaldolase from Escherichia coli.Journal of Biotechnology,2009,143(4):284-287.
[4]Gu Y,Ding Y,Ren C,et al.Reconstruction of xylose utilizationpathway and regulons in Firmicutes.BMC genomics,2010,11(1):255.
[5]Jin L,Zhang H,Chen L,et al.Combined overexpression of genesinvolved in pentose phosphate pathway enables enhanced D-xylose utilizationby Clostridium acetobutylicum.Journal of Biotechnology,2014,173:7-9.
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用
<130> 2020
<141> 2020-08-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> 新月柄杆菌Caulobacter crescentus()
<400> 1
atgaccgctc aagtcacttg cgtatgggat ctgaaggcca cgttgggcga aggcccgatc 60
tggcatggcg acaccctgtg gttcgtcgac atcaagcagc gtaaaatcca caactaccac 120
cccgccaccg gcgagcgctt cagcttcgac gcgccggatc aggtgacctt cctcgcgccg 180
atcgtcggcg cgaccggctt tgtcgtcggt ctgaagaccg ggattcaccg cttccacccg 240
gccacgggct tcagcctgct gctcgaggtc gaggacgcgg cgctgaacaa ccgccccaac 300
gacgccacgg tcgacgcgca aggccgtctg tggttcggca ccatgcacga cggggaagag 360
aacaatagcg gctcgctcta tcggatggac ctcaccggcg tcgcccggat ggaccgcgac 420
atctgcatca ccaacggccc gtgcgtctcg cccgacggca agaccttcta ccacaccgac 480
accctggaaa agacgatcta cgccttcgac ctggccgagg acggcctgct gtcgaacaag 540
cgcgtcttcg tgcagttcgc cctgggcgac gatgtctatc cggacggttc ggtcgtcgat 600
tccgaaggct atctgtggac cgccctgtgg ggcggtttcg gcgcggtccg cttctcgccg 660
caaggcgacg ccgtgacgcg catcgaactg cccgccccca acgtcaccaa gccctgcttc 720
ggcgggcctg acctgaagac cctctatttc accaccgccc gcaagggcct gagcgacgag 780
accctggccc agtacccgct ggccggcggt gtgttcgccg ttccggtcga tgtggccggc 840
caaccccagc atgaggtccg ccttgtctaa 870
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 新月柄杆菌Caulobacter crescentus()
<400> 2
atgtcctcag ccatctatcc cagcctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggc 60
tcgggcatcg gggccggcct caccgccggc ttcgcccgtc agggcgcgga ggtgatcttc 120
ctcgacatcg ccgacgagga ctccagggct cttgaggccg agctggccgg ctcgccgatc 180
ccgccggtct acaagcgctg cgacctgatg aacctcgagg cgatcaaggc ggtcttcgcc 240
gagatcggcg acgtcgacgt gctggtcaac aacgccggca atgacgaccg ccacaagctg 300
gccgacgtga ccggcgccta ttgggacgag cggatcaacg tcaacctgcg ccacatgctg 360
ttctgcaccc aggccgtcgc gccgggcatg aagaagcgtg gcggcggggc ggtgatcaac 420
ttcggttcga tcagctggca cctggggctt gaggacctcg tcctctacga aaccgccaag 480
gccggcatcg aaggcatgac ccgcgcgctg gcccgggagc tgggtcccga cgacatccgc 540
gtcacctgcg tggtgccggg caacgtcaag accaagcgcc aggagaagtg gtacacgccc 600
gaaggcgagg cccagatcgt ggcggcccaa tgcctgaagg gccgcatcgt cccggagaac 660
gtcgccgcgc tggtgctgtt cctggcctcg gatgacgcgt cgctctgcac cggccacgaa 720
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<213> 丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum()
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gcaattgtgt ttgcacttgg tgcattaggt tctgccgttt ctactagtac taatctttta 300
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tatatgggag aaattagccc tgctgaaaca cgtggaaaac tatctggttt aaatcaatta 420
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ccagctgtaa ttgcaggctg tgggttaaca cttcttcaac aaattcaagg tgcaaacact 780
attttctact attcatcaca aattttatcc aatgtttttg gatcagcaaa tggtggaact 840
attagtactg ttggaattgg tgtggttcta gtattagcaa ctattgtaac tttattggtt 900
gtagacaaat tcaaacgtcg tacattattt atgactggtt ctattggaat gggcgcatct 960
ctattattag ttggattaat ttatccatac tctgaagcta aacatgcgtg ggcaacttgg 1020
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<213> 丙丁梭菌Clostridium acetobutylicum()
<400> 4
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aacgtataaa ttagggataa actatggaac ttatgaaata gattgaaatg gtttatctgt 120
taccccgtat caaaatttag gaggttagtt aga 153

Claims (10)

1.一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。
2.根据权利要求1所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，通过构建丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的表达载体，并将所述表达载体导入到野生型出发菌株丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum)以获得所述的重组丙丁梭菌。
3.根据权利要求2所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的木糖内酯酶核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为Clostridium acetobutylicumTXYL，于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M2020107。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过酶切连接方法，将如SEQ ID NO:3所示的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列、如SEQ ID NO:2所示的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列和如SEQ ID NO:1所示的木糖内酯酶核苷酸序列连接入载体质粒pIMP1中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的5’端均连接有如SEQ ID NO:4所示的丙丁梭菌启动子，获得重组质粒pIMP1-XylTBC；
2)将步骤1)中获得的重组质粒pIMP1-XylTBC转入E.coli DH10B中，得到甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC；
3)将步骤2)中经甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC转化至野生型出发菌株丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum)，经培养、筛选获得丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的重组丙丁梭菌。
6.一种厌氧发酵生产丁醇的方法，其特征在于，所述的方法基于权利要求1-4中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌或如权利要求5所述的方法制备的重组丙丁梭菌，其特征在于，包括以下步骤：
1)重组丙丁梭菌活化培养：将重组丙丁梭菌接种至液体活化培养基中，置于厌氧环境中静置培养，培养温度为37℃，静置活化培养16～24h用于种子培养；
2)重组丙丁梭菌种子培养：将步骤1)中活化的菌种按10％(v/v)接种量接种于液体种子培养基中，置于厌氧环境中摇瓶培养，培养温度为37℃，转速为130～200rpm，培养18～24h用于厌氧发酵培养；
3)重组丙丁梭菌发酵培养：采用发酵罐进行厌氧发酵，发酵温度控制在33～39℃，搅拌转速为130～200rpm，接种前发酵罐通入N2以除去发酵培养基中的溶氧，发酵24～72h。
7.根据权利要求6所述的生产丁醇的方法，其特征在于，在步骤3)中，通过添加稀硫酸或氢氧化钾溶液将接种后发酵培养基初始pH调至5.5；或者，接种后，添加碳酸钙以控制发酵全程在pH5～6范围内。
8.根据权利要求6或7所述的生产丁醇的方法，其特征在于，
在步骤3)中，所述的发酵培养基为秸秆水解液发酵培养基，所述的秸秆水解液发酵培养基为秸秆经过物理、化学、生物或联合预处理及纤维素酶酶解后获得的水解液，所述的水解液主要包含葡萄糖20～60g/L，木糖10～30g/L。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的生产丁醇的方法，其特征在于，所述的秸秆选自玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆及稻草秸秆中的一种或几种，所述的秸秆预处理前粉粹至0.1～0.5mm。
10.权利要求1-4中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌或如权利要求5所述的方法制备的重组丙丁梭菌用于厌氧发酵生产丁醇的应用。
CN202010824130.2A 2020-08-17 2020-08-17 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用 Active CN111979167B (zh)

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