CN111961136B

CN111961136B - 一种全人源化中和破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN111961136B
Application number: CN202010669181.2A
Authority: CN
Inventors: 李海浪; 曾凡伟
Original assignee: Xiamen Medical College
Current assignee: Xiamen Medical College
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111961136A

Abstract

本发明提供了一种全人源化具有中和破伤风类毒素的三价特异性抗体，该三价特异性抗体由单链I和II组成，每单链均都包含了2个单链可变片段(scFv)、1个人的IgG1的铰链区和1个Fc片段，这四个单链可变片段(scFv)是由分别命名为A、B和两个C片段组成，均可以分别发挥中和作用。该三价特异性抗体采取在同一株毕赤酵母表达，并用糖苷酶处理纯化后的产物，经过小鼠中和实验表明具有保护作用，该抗体具有药学和作为诊断试剂用途。

Description

一种全人源化中和破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术涉及基因工程技术领域，更具体地，本发明公开了一种全人源化中和抗破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法。

背景技术

破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa蛋白。该蛋白在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链(LC)和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439-S467连接。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端(HCN)和C端(HCC或TTC)。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞质的膜，而TTC负责毒素结合神经元细胞。在TTC一段有两个区域发挥结合神经元的受体，一是以Trp1289、His1271和Try1290为核心所形成的W pocket，二是以Asp1147、Arg1226、Asn1216、Asp1214和Try1229为核心区域的R pocket，以往的文献证明，能够封闭这两个位点的抗体可以有效地发挥保护作用。

破伤风治疗方法最有效的是注射破伤风抗毒素(TAT)、马破伤风免疫球蛋白F(ab)₂或人破伤风免疫球蛋白(TIG)。破伤风抗毒素(TAT)和马破伤风免疫球蛋白均是用破伤风类毒素免疫马匹所制得的抗毒素，其形式有所差异的，这两种形式的抗毒素来源于马匹，有一定程度过敏反应，而人破伤风免疫球蛋白(TIG)是破伤风类毒素免疫人体所制得的抗毒素，虽然无过敏性但具有较昂贵、来源少、制备复杂、供应不足等等缺点。我国临床上广泛使用的仍为TAT，只有在TAT过敏试验阳性或者家属主动要求的情况下才会使用TIG。人们希望找到一种无过敏性且价格低廉的完全人特异性抗体，可以替代目前的抗体来源。

随着杂交瘤单克隆技术和噬菌体展示技术以来，人们逐渐在该领域中使用这些技术进行研究，但是这些研究仍存在的一些问题：①筛选到的序列未进行克隆表达，仅做了序列分析；②克隆表达的序列仅仅进行了体外ELLISA和(或)体外结合实验，未知体内的保护作用；③有的序列表达后进行了小鼠体内中和保护实验，一种常见的思路就是多种单抗混合类似“鸡尾酒”方式，这种思路方案有两种方案，一是分别表达单抗，再混合；一是混合表达单抗。前者是重组单抗的生产成本两倍以上，不具有生产应用价值。而后者具有产物纯度低和得率低导致成本很高的缺点。

毕赤酵母Pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)微生物，具备其他系统不具备的特点，如甲醇利用、高密度发酵、副产物少等，但是毕赤酵母可使蛋白严重o-糖基化，导致了人体的免疫反应，因此很少用于抗体表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是在于提供一种全人源化的抗破伤风三价特异性抗体，该抗体具有中和破伤风毒素的功能。

本发明要解决的技术问题之一是在于提供一种大量生产低价且免疫性低的三价特异性抗体的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取了如下的技术方案：

技术方案之一，前期的工作获得了A、B和C三个ScFV(单链可变片段)序列，在毕赤酵母中表达后，分别具有中和作用，进一步采取混合的方法检测，结果显示混合的ScFV具有协同保护作用。

本发明中第二方面是构建并重组表达了该三价特异性抗体。首先，将上述序列与人的IgG1的铰链区和Fc区链接起来，构建到pPIC₉k载体中，形成ScFV-铰链-Fc型的特异性抗体，并对FC的CH3区域突变，以便两条链形成隆突一入一穴(knobs-into-holes)(见图2)。其次，将含有I和II链的pPIC₉k载体分别采取SalI和BglII限制性酶线性化后，电转方式导入毕赤酵母GS115中，使在GS115染色体上形成His基因和AOX1两个位点定点整合，其表达产物形成特异性抗体的双链。最后，重组表达了该抗体，并采取阳离子层析等方法获得了产物。

本发明第三方面是对该特异性抗体进一步处理。由于毕赤酵母的产物其糖基化为O-型，容易引起人体免疫反应，也会导致产品均一性低，因此，在本发明中采取了体外酶切的方法去除O-糖链。首先，重组表达了糖苷酶(Trichoderma reesei的a-1,2mannosidase)，将毕赤酵母重组表达的三价特异性抗体切除其糖基化，将表达产物纯化后，用小鼠中和实验测定其效价，可达550IU/mg。

本发明的有益效果在于：获得了全人源化的双特异性抗体，相对于马破伤风抗毒素，克服了其异源性，且采取糖苷酶切除毕赤酵母特有的O-糖基化，会降低人体过敏性；相对于马破伤风免疫球蛋白F(ab’)₂，克服了其异源性，会降低人体过敏性，同时可以延长在体内的半衰期。相对于人破伤风免疫球蛋白(TIG)，克服了其来源有限和生产成本高的缺点。相对于采用多个单抗混合的“鸡尾酒”方案，具有降低生产成本和减少临床实验数量的优点。同时，相对于哺乳动物细胞系表达重组抗体，具有操作简单且生产更低的优点。具有显著的经济社会效益。

附图说明

图1：SDS-PAGE图，纯化后的融合表达的a-1,2mannosidase。M:蛋白mark(Bio-Radcatalog：161-0371)；1：6*His-TrMannl；2糖苷酶酶切后的特异性抗体。

图2：特异性抗体分子示意图。该四价特异性抗体由I和II链通过两对二硫键链接，A、B和C分别是三个Fv区域。

图3：特异性抗体的HPLC图谱。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

实施例1糖苷酶的重组表达、纯化。

1.1糖苷酶表达序列质粒构建

Trichoderma reesei的a-1,2mannosidase(Genebank:XP_006962575)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，编码526个氨基酸，由上海捷瑞生物合成该序列，然后在该序列的5端加上MscI酶切位点和3端加上XhoI酶切位点，最后将这些序列装入pET20a载体并转入大肠杆菌BL21(DE)3中，表达后得到的产物命名为6*His-TrMannl(序列1，SEQ ID NO：1)，由于含有Trx和6*His标签，其分子量大约67KD。

SEQ ID NO：1Trichoderma reesei的a-1,2mannosidase(Genebank:XP_006962575)核苷酸序列(Genebank：XM_006962513)，5端加框的CATATG为NdeI酶切位点，3端加框的CTCGAG为XhoI酶切位点。

1.2融合蛋白表达和表达

参考Novagen pET system manual 10th，进行融合蛋白的诱导表达。

参考GE的Affinity Chromatography-Tagged Proteins手则，使用Ni Sepharose^TM6Fast Flow(GE,货号：17-5318-02)纯化表达产物。将纯化产物用30KD超滤管(millopore)3500rpm*20min超滤,将其缓冲液更换为20mM PB，将纯化后的样品，用SDS-PAGE检测(见图1).

1.3参考nano(Thermo公司)操作手则，测定6*His-TrMannl的蛋白浓度。

实施例2全人源化序列的获得

2.1 ScFv序列的获得

根据申请人的先前研究，再经优化，得到下列的优化后的人源序列(A序列、B序列和C序列)，其中，这些经过申请人特别优化后的序列适合在毕赤酵母中表达，且不含EcoRI、SalI、BglII和NotI限制性酶切位点的序列。

A序列

A序列重链可变区蛋白序列(A-H-P序列，SEQ ID NO：2)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYASWVKGRFTISRDNAKNSLYLQXNSLRAEDTALYYCAKDIGYCTGGVCPQA

A序列轻链可变区蛋白序列(A-L-P序列，SEQ ID NO：3)

QFYADSAPLCVGVSGEDGNHLLHPQQWQHCQQLCAVVPTAPGQFPTTVIYEDHQRPSGIPDRFSASIDSSSNSASLIISGLKTEDEADYYCQSYDTNNRVFGGGTKLTVLG

A序列重链可变区核酸序列(A-H-N序列，SEQ ID NO：4)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACTACTACATGAGCTGGATCAGACAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCTACATCAGCAGCAGCGGCAGCACCATCTACTACGCCAGCTGGGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAAGGACATCGGCTACTGCACCGGCGGCGTGTGCCCCCAGGCC

A序列轻链可变区核酸序列(A-L-N序列，SEQ ID NO：5)

CAGTTCTACGCCGACAGCGCCCCCCTGTGCGTGGGCGTGAGCGGCGAGGACGGCAACCACCTGCTGCACCCCCAGCAGTGGCAGCACTGCCAGCAGCTGTGCGCCGTGGTGCCCACCGCCCCCGGCCAGTTCCCCACCACCGTGATCTACGAGGACCACCAGAGACCCAGCGGCATCCCCGACAGATTCAGCGCCAGCATCGACAGCAGCAGCAACAGCGCCAGCCTGATCATCAGCGGCCTGAAGACCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGAGCTACGACACCAACAACAGAGTGTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGGGC

B序列

B序列重链可变区蛋白序列(B-H-P序列，SEQ ID NO：6)

EFGLSWVFLVALLRGVQCQAQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRLTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETSVRRDYRDYPMTDYWGQGTLVTSS

B序列轻链可变区蛋白序列(B-L-P序列，SEQ ID NO：7)

DMGGSKLSFFLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSFLNWYQQKPGKAPKLLIYASSLQSGVPSSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYSTPPRTFGQGTKVEIKR

B序列重链可变区核酸序列(B-H-N序列，SEQ ID NO：8)

GAGTTCGGCCTGAGCTGGGTGTTCCTGGTGGCCCTGCTGAGAGGCGTGCAGTGCCAGGCCCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGAAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGACTGACCATCAGCAGAGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAGAGACCAGCGTGAGAAGAGACTACAGAGACTACCCCATGACCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCAGCAGC

B序列轻链可变区核酸序列(B-L-N序列，SEQ ID NO：9)

GACATGGGCGGCAGCAAGCTGAGCTTCTTCCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGCGCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGAGAATCAGCAGCTTCCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCTACAGCACCCCCCCCAGAACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGA

C序列

C序列重链可变区蛋白序列(C-H-P序列，SEQ ID NO：10)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGFISDYYWNWIRQSPGKGLEWIGNIYNRGSANSSPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLNLSSATAADTAVYYCARTRLYDSGGFSFRQFRQGFDVWGLGTVVT

C序列轻链可变区蛋白序列(C-L-P序列，SEQ ID NO：11)

DMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP

C序列重链可变区核酸序列(C-N-P序列，SEQ ID NO：12)

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCTTCATCAGCGACTACTACTGGAACTGGATCAGACAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAACATCTACAACAGAGGCAGCGCCAACAGCAGCCCCAGCCTGAAGAGCAGAGTGACCATGAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAACCTGAGCAGCGCCACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAACCAGACTGTACGACAGCGGCGGCTTCAGCTTCAGACAGTTCAGACAGGGCTTCGACGTGTGGGGCCTGGGCACCGTGGTGACC

C序列轻链可变区核酸序列(C-L-N序列，SEQ ID NO：13)

GACATGAGAGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGCGCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCAGAGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCTACAGCACCCCC

2.2毕赤酵母表达和纯化ScFv-IgG

2.2.1信号肽：

抗体的信号肽均用鼠kappa链的信号肽，其多肽序列见序列14(SEQ ID NO：14)，相应的核苷酸序列见序列15(SEQ ID NO：15)

鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列(SEQ ID NO：14)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

编码鼠kappa链的前导肽序列核酸序列(SEQ ID NO：15)

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT

2.2.2Fc+铰链区序列

人IgG1(IMGT命名为IGHG1)的氨基酸序列221-446一段(EU编码体系)包含了三区域:221-234为Hinge区域，234-341为C_H2区域和342-446为C_H3区域(其多肽序列见序列16，即SEQ ID NO：16，相应的核苷酸序列见序列17，即SEQ ID NO：17).

IGHG1的氨基酸序列221-446一段(EU编码体系，SEQ ID NO：16)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

IGHG1的氨基酸序列221-446一段(EU编码体系)的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)

GACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

2.2.3VH和VL的链接(linker)

VL和VH之间用链接肽来链接，其氨基酸序列见序列18(SEQ ID NO：18)，相应的核苷酸序列见序列19(SEQ ID NO：19)

VL和VH的链接肽(SEQ ID NO：18)

GGGGSGGGGSGGGGS

VL和VH的链接肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)

GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC

2.2.4抗体ScFv-IgG的分别表达

2.2.4.1表达载体构建

先将各对序列配对：⑴A：SEQ ID NO：15+序列5(A-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列4(A-H-N)；⑵B:SEQ ID NO：15+序列9(B-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列8(B-H-N)；⑶C:SEQID NO：15+序列13(C-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列12(C-H-N)；然后，用序列17将再将上面的各序列对按照顺序连接起来，构建毕赤酵母表达载体。例如构建表达A片段抗体的载体：SEQ ID NO：15+序列5(A-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列4(A-H-N)+SEQ ID NO：17，其余的类推。请上海捷瑞生物分别合成这些序列，在这些序列的5端加上EcoRI酶切位点和3端加上XhoI酶切位点，最后将这些序列装入pPIC9k载体中。

2.2.4.2载体线性化和阳性克隆筛选

参考invitrogen酵母操作手册，将质粒用SalI线性化后，采取电转化导入质粒DNA，且用MD平板筛选阳性克隆。

2.2.4.3抗体ScFv-IgG的表达

A挑选一单菌落，先在10mlYPD培养基中在30℃中250-300rpm培养24小时，再将菌转接至1L摇瓶中，在30℃中250-300rpm培养至OD600＝2-6。

B室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，加入1L的YPM(含甲醇1％)培养基放置于28-30℃中250-300rpm的摇床上诱导表达.

C每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％,一共诱导120h；

D对分泌表达，分离样品的上清液离心，取上清用于下面的纯化；

2.2.4.4抗体的纯化

利用proteinA亲和层析柱(上海博格隆公司)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体。用平衡缓冲液(20mM PB，pH7.0)平衡层析柱后，表达上清用0.22μM滤膜过滤，过亲和层析柱，上样完毕后用平衡缓冲液洗涤至OD280小于0.05后用洗脱缓冲液(20mM甘氨酸/盐酸，pH3.0)洗脱。

洗脱的蛋白通过SP-琼脂糖凝胶阳离子交换层析(上海博格隆公司)，实现目标双特异性抗体与副产物的分离。SP-用平衡缓冲液A(20mM PB，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用纯化水稀释电导至3.0—3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(20mM PB,1.5M NaCLpH 6.0)线性洗脱；

最后超滤浓缩并置换成缓冲液含0.15NaCL，50mM枸橼酸钠(pH 5.5)。

2.3单个或多个抗体的中和活性测定

测定的方法见实施例4.

测定结果显示，A、B和C分别具有中和保护作用，它们的效价分别为200IU/mg、150IU/mg和120IU/mg。组合后具有协同的中和保护作用：①组A+B效价为350IU/mg；②组B+C效价为280IU/mg；③组A+B+C效价为500IU/mg，其中第③组具有最佳的保护作用，其效价高于目前的马抗破伤风F(ab)2效价400-450IU/mg(因为马抗破伤风F(ab)2的分子量小)和人破伤风免疫球蛋白(TIG)的200IU/mg。因此，在接下来的实验中，进一步表达A+B+2C三价抗体。

实施例3三价特异性抗体的获得

3.1三价特异性抗体的表达载体构建

3.1.1Fc+铰链区knob突变体(或hole突变体)序列

在本发明中，采取了文献(nature biotechnology(1998),16(7):677-681)技术，对C_H3区域的氨基酸进行突变，一条链表达S354C、T366W的knob突变体(其多肽序列见SEQID NO：20，相应的核苷酸序列见SEQ ID NO：21)，一条链表达Y349C、T366S、L368A和Y407V的hole突变体(其多肽序列见SEQ ID NO：22，相应的核苷酸序列见SEQ ID NO：23)。

序列20铰链区+Knob突变体(S354C、T366W)的Fc氨基酸序列(SEQ ID NO：20)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

序列21编码铰链区+Knob突变体(S354C、T366W)的Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)GACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGTGGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

序列22铰链区+Hole突变体(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc氨基酸序列(SEQID NO：22)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

序列23编码铰链区+Hole突变体(Y349C、T366S、L368A和Y407V)的Fc的核苷酸序列(，SEQ ID NO：23)

GACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTGCACCCTGCCCCCCAGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGAGCTGCGCCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

3.1.2单元I链和II链的组成

由于C的保护力偏弱，在构建特异性抗体时，增加一份C片段拷贝，使特异性抗体呈现对称结构。

I链的组成：A片段+Fc+铰链区knob突变体+C片段；

I链对应的碱基序列为：

A：SEQ ID NO：15+序列5(A-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列4(A-H-N)；

Fc+铰链区knob突变体：SEQ ID NO：21

C片段：序列12(C-H-N)+SEQ ID NO：19+序列13(C-L-N)

II链的组成：B片段+Fc+铰链区或hole突变体+C片段。

II链对应的碱基序列为：

B：SEQ ID NO：15+序列9(B-L-N)+序列SEQ ID NO：19+序列8(B-H-N)；

Fc+铰链区或hole突变体：SEQ ID NO：23

C片段：序列12(C-H-N)+SEQ ID NO：19+序列13(C-L-N)

其中I和II是对称关系，可以互换，而A、B和C的位置也是对称关系，可以互换。其结构示意图(图2)。

3.1.3三价特异性抗体的阳性克隆筛选及纯化，

参考实施例2.2.4.2，将pPIC₉k载体用SalI和BglII分别线性化，同时转入含G418的MD平板上，一次性筛选出同时表达I和II链的毕赤酵母阳性克隆。

阳性克隆的表达参考实施例2.2.4.3

三价特异性抗体的纯化参考实施例2.2.4.4

参考nano(Thermo公司)操作手则，测定双特异性抗体的蛋白浓度。

3.2糖苷酶(6*His-TrMannl)处理三价特异性抗体

参考文献(appl microbial Biotechnol(2015)99(9):3913–3927)的方法，在含0.4mM Zn2+的20mM NaAC(pH5.0)中，按照抗体和糖苷酶的质量比1：3000加入，在37℃中消化16小时。

将消化后的样品采用2.2.4.4中的protein A亲和层析柱纯化，所得产物见图1。

3.3 HPLC检测

参考安捷伦1200Infinity II的说明书及中国药典2015版，使用色谱柱G3000SW(TOSOH公司，日本)。

1、开启HPLC，待仪器自检，进入工作站，选择方法(设置波长280nm，柱温25℃，流速0.6ml/min，运行时间为40min)。

2.走基线：先用10％乙腈冲洗，再换上流动相含(含1％异丙醇的pH7.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液)，平衡走基线。

3.供试品溶液的制备：用流动相将供试品稀释至每1ml含蛋白质12mg的溶液。

4.各取20μl稀释后的供试品溶液注入高效液相色谱仪进行分析，运行时间为40min，以保留时间定性，用面积归一法计算含量。

结果显示，HPLC检测检测经过纯化和糖苷酶酶切后的三价双特异性抗体，其纯度可达到85％以上(见图3)

实施例4小鼠法测定抗体的效价

参考中国药典2015版通则3508，使用小鼠实验法执行。

1、破伤风抗毒素标准品(购自中国食品药品检定研究院)配制：用硼酸盐缓冲盐水(pH 7.2,50mM硼酸，0.15M氯化钠)稀释，使每ml含0.5IU，当与毒素等量混合后，每0.4ml混合溶液注射量中含0.1IU。

2、破伤风毒素标准品(购自中国食品药品检定研究院)配制：用硼酸盐缓冲盐水稀释，使每ml含5个试验量(0.5L+，L+为破伤风毒素使小鼠100％死亡的最低致死剂量)，即与抗毒素等量混合后每0.4ml注射量中含1个试验量(0.1L+)。

将待检供试品用硼酸盐缓冲盐水稀释成数个稀释度，使每ml约含0.5IU(即0.5IU)或其上下，即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中约含0.1IU或其上下。稀释度之间间隔约为5％。

3、将破伤风抗毒素标准品及不同稀释度的待检供试品分别加入等量的稀释试验毒素，混合均匀，置水浴箱中于37℃结合1小时，立即注射。

注射时，由高稀释度向低稀释度依次注射，每个稀释度各注射0.4ml于17-19g小鼠腹部或大腿根部皮下，每个稀释度各注射小鼠至少3只。

4、结果观察，试验小鼠至少应每日上、下午各观察一次，连续5日，并记录发病及死亡情况。

结果判定方法，对照小鼠应于72～120小时之内全部死亡。待检供试品之效价应为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重者的最高稀释度。

实验结果显示，将该表达产物纯化后，其效价可达600IU/mg。

序列表

<110> 厦门医学院

<120> 一种全人源化中和破伤风毒素的三价特异性抗体及其制备方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei(trichoderma reesei)

<400> 1

catatgagat tccctagcag ctccgtcctt gccctcgggc tcatcggacc tgcgctggcg 60

tatccaaagc cgggcgccac aaaacgtgga tctcccaacc ctacgagggc ggcagcagtc 120

aaggccgcat tccagacgtc gtggaacgct taccaccatt ttgcctttcc ccatgacgac 180

ctccacccgg tcagcaacag ctttgatgat gagagaaacg gctggggctc gtcggcaatc 240

gatggcttgg acacggctat cctcatgggg gatgccgaca ttgtgaacac gatccttcag 300

tatgtaccgc agatcaactt caccacgact gcggttgcca accaaggcat ctccgtgttc 360

gagaccaaca ttcggtacct cggtggcctg ctttctgcct atgacctgtt gcgaggtcct 420

ttcagctcct tggcgacaaa ccagaccctg gtaaacagcc ttctgaggca ggctcaaaca 480

ctggccaacg gcctcaaggt tgcgttcacc actcccagcg gtgtcccgga ccctaccgtc 540

ttcttcaacc ctactgtccg gagaagtggt gcatctagca acaacgtcgc tgaaattgga 600

agcctggtgc tcgagtggac acggttgagc gacctgacgg gaaacccgca gtatgcccag 660

cttgcgcaga agggcgagtc gtatctcctg aatccaaagg gaagcccgga ggcatggcct 720

ggcctgattg gaacgtttgt cagcacgagc aacggtacct ttcaggatag cagcggcagc 780

tggtccggcc tcatggacag cttctacgag tacctgatca agatgtacct gtacgacccg 840

gttgcgtttg cacactacaa ggatcgctgg gtccttgctg ccgactcgac cattgcgcat 900

ctcgcctctc acccgtcgac gcgcaaggac ttgacctttt tgtcttcgta caacggacag 960

tctacgtcgc caaactcagg acatttggcc agttttgccg gtggcaactt catcttggga 1020

ggcattctcc tgaacgagca aaagtacatt gactttggaa tcaagcttgc cagctcgtac 1080

tttgccacgt acaaccagac ggcttctgga atcggccccg aaggcttcgc gtgggtggac 1140

agcgtgacgg gcgccggcgg ctcgccgccc tcgtcccagt ccgggttcta ctcgtcggca 1200

ggattctggg tgacggcacc gtattacatc ctgcggccgg agacgctgga gagcttgtac 1260

tacgcatacc gcgtcacggg cgactccaag tggcaggacc tggcgtggga agcgttcagt 1320

gccattgagg acgcatgccg cgccggcagc gcgtactcgt ccatcaacga cgtgacgcag 1380

gccaacggcg ggggtgcctc tgacgatatg gagagcttct ggtttgccga ggcgctcaag 1440

tatgcgtacc tgatctttgc ggaggagtcg gatgtgcagg tgcaggccaa cggcgggaac 1500

aaatttgtct ttaacacgga ggcgcacccc tttagcatcc gttcatcatc acgacggggc 1560

ggccaccttg ctctcgag 1578

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Xaa Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gly Tyr Cys Thr Gly Gly Val Cys Pro Gln Ala

100 105 110

<210> 3

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Phe Tyr Ala Asp Ser Ala Pro Leu Cys Val Gly Val Ser Gly Glu

1 5 10 15

Asp Gly Asn His Leu Leu His Pro Gln Gln Trp Gln His Cys Gln Gln

20 25 30

Leu Cys Ala Val Val Pro Thr Ala Pro Gly Gln Phe Pro Thr Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Glu Asp His Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr

85 90 95

Asn Asn Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 4

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgaagc ccggcggcag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gactactaca tgagctggat cagacaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagcagca gcggcagcac catctactac 180

gccagctggg tgaagggcag attcaccatc agcagagaca acgccaagaa cagcctgtac 240

ctgcagaaca gcctgagagc cgaggacacc gccctgtact actgcgccaa ggacatcggc 300

tactgcaccg gcggcgtgtg cccccaggcc 330

<210> 5

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagttctacg ccgacagcgc ccccctgtgc gtgggcgtga gcggcgagga cggcaaccac 60

ctgctgcacc cccagcagtg gcagcactgc cagcagctgt gcgccgtggt gcccaccgcc 120

cccggccagt tccccaccac cgtgatctac gaggaccacc agagacccag cggcatcccc 180

gacagattca gcgccagcat cgacagcagc agcaacagcg ccagcctgat catcagcggc 240

ctgaagaccg aggacgaggc cgactactac tgccagagct acgacaccaa caacagagtg 300

ttcggcggcg gcaccaagct gaccgtgctg ggc 333

<210> 6

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly Val

1 5 10 15

Gln Cys Gln Ala Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

20 25 30

Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Glu Thr Ser Val Arg Arg Asp Tyr Arg Asp Tyr Pro

115 120 125

Met Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ser Ser

130 135 140

<210> 7

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Met Gly Gly Ser Lys Leu Ser Phe Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

20 25 30

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Arg Ile Ser Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg

130

<210> 8

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagttcggcc tgagctgggt gttcctggtg gccctgctga gaggcgtgca gtgccaggcc 60

cagctggtgg agagcggcgg cggcgtggtg cagcccggca gaagcctgag actgagctgc 120

gccgccagcg gcttcacctt cagcagctac ggcatgcact gggtgagaca ggcccccggc 180

aagggcctgg agtgggtggc cgtgatctgg tacgacggca gcaacaagta ctacgccgac 240

agcgtgaagg gcagactgac catcagcaga gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300

atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccagaga gaccagcgtg 360

agaagagact acagagacta ccccatgacc gactactggg gccagggcac cctggtgacc 420

agcagc 426

<210> 9

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacatgggcg gcagcaagct gagcttcttc ctgggcctgc tgctgctgtg gctgagaggc 60

gccagatgcg acatccagat gacccagagc cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac 120

agagtgacca tcacctgcag agccagccag agaatcagca gcttcctgaa ctggtaccag 180

cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg atctacgcca gcagcctgca gagcggcgtg 240

cccagcagca gattcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 300

ctgcagcccg aggacgtggc cacctactac tgccagcaga gctacagcac cccccccaga 360

accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aagaga 396

<210> 10

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Phe Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Asn Arg Gly Ser Ala Asn Ser Ser Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Asn Leu Ser Ser Ala Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Thr Arg Leu Tyr Asp Ser Gly Gly Phe Ser Phe Arg Gln Phe Arg

100 105 110

Gln Gly Phe Asp Val Trp Gly Leu Gly Thr Val Val Thr

115 120 125

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu

1 5 10 15

Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Tyr Ser Thr Pro

115

<210> 12

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctggtgaagc ccagcgagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgagcggcgg cttcatcagc gactactact ggaactggat cagacagagc 120

cccggcaagg gcctggagtg gatcggcaac atctacaaca gaggcagcgc caacagcagc 180

cccagcctga agagcagagt gaccatgagc gtggacacca gcaagaacca gttcagcctg 240

aacctgagca gcgccaccgc cgccgacacc gccgtgtact actgcgccag aaccagactg 300

tacgacagcg gcggcttcag cttcagacag ttcagacagg gcttcgacgt gtggggcctg 360

ggcaccgtgg tgacc 375

<210> 13

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacatgagag tgcccgccca gctgctgggc ctgctgctgc tgtggctgag aggcgccaga 60

tgcgacatcc agatgaccca gagccccagc agcctgagcg ccagcgtggg cgacagagtg 120

accatcacct gcagagccag ccagagcatc agcagctacc tgaactggta ccagcagaag 180

cccggcaagg cccccaagct gctgatctac gccgccagca gcctgcagag cggcgtgccc 240

agcagattca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaccatcag cagcctgcag 300

cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagagctaca gcaccccc 348

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

<210> 16

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 17

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 60

ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 240

agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 360

ggccagccca gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccca gcagggacga gctgaccaag 420

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 540

gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 600

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 660

ctgagcctga gccccggcaa g 681

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagc 45

<210> 20

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 21

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 60

ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 240

agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 360

ggccagccca gggagcccca ggtgtacacc ctgcccccct gcagggacga gctgaccaag 420

aaccaggtga gcctgtggtg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 540

gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 600

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 660

ctgagcctga gccccggcaa g 681

<210> 22

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 23

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg 60

ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gcaggacccc cgaggtgacc 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggagg agcagtacaa cagcacctac 240

agggtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatcag caaggccaag 360

ggccagccca gggagcccca ggtgtgcacc ctgcccccca gcagggacga gctgaccaag 420

aaccaggtga gcctgagctg cgccgtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggacagc 540

gacggcagct tcttcctggt gagcaagctg accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 600

aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 660

ctgagcctga gccccggcaa g 681

Claims

1.一种全人源化具有中和破伤风类毒素的三价特异性抗体，其特征在于，

该三价特异性抗体包括单链I和单链II，每条单链分别包含2个单链可变片段、1个人的IgG1的铰链区和1个Fc片段，这四个单链可变片段分别由命名为A、B和C片段组成，均可以分别发挥中和作用；

其中，单链I的组成：A片段+ Fc+铰链区knob突变体+C片段；

单链I对应的氨基酸序列为：

所述A片段：SEQ ID NO：14+ SEQ ID NO：3+ SEQ ID NO：18+ SEQ ID NO：2；

所述Fc+铰链区knob突变体：SEQ ID NO：20；

所述C片段：SEQ ID NO：10+ SEQ ID NO：18+ SEQ ID NO：11；

单链II的组成：B片段+Fc+铰链区或hole突变体+C片段；

单链II对应的氨基酸序列为：

所述B片段：SEQ ID NO：14+ SEQ ID NO：7+ SEQ ID NO：18+ SEQ ID NO：6；

Fc+铰链区或hole突变体：SEQ ID NO：22；

C片段：SEQ ID NO：10+ SEQ ID NO：18+ SEQ ID NO：11。

2.如权利要求1所述的一种全人源化具有中和破伤风类毒素的三价特异性抗体，其特征在于，所述的三价特异性抗体在同一株毕赤酵母菌中表达，并用糖苷酶处理纯化后的产物而获得。

3.根据权利要求1所述的三价特异性抗体，其特征在于，①单链I和单链II的铰链区通过两个二硫键相连接；②单链I的人IgG Fc段和所述单链II的人IgG Fc通过隆突 knobs-into-holes连接。

4.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1或2中任一项所述的三价特异性抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2中任一项所述的三价特异性抗体。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子。

7.根据权利要求1或2任一项所述的三价特异性抗体在制备检测破伤风类毒素抗原的诊断试剂中的应用；和/或

作为替代破伤风抗毒素、马破伤风免疫球蛋白或人破伤风免疫球蛋白的被动免疫试剂中的应用。

8.如权利要求1或2任一项所述的三价特异性抗体的制备方法，包括步骤：

1）根据抗体序列，合成抗体序列对应的核苷酸序列，

2）采用载体，将步骤1）合成的序列转到毕赤酵母中，并选出毕赤酵母阳性克隆；

3）在毕赤酵母表达成三价特异性抗体；

4）采用重组表达的糖苷酶处理三价特异性抗体，所述糖苷酶为Trichoderma reesei的a-1,2mannosidase；

其中，步骤1）所述的核苷酸序列包括：

单链I链的组成：A片段+ Fc+铰链区knob突变体+C片段；

I链对应的碱基序列包括：

A：SEQ ID NO：15+ SEQ ID NO：5+ SEQ ID NO：SEQ ID NO：19+ SEQ ID NO：4；

Fc+铰链区knob突变体：SEQ ID NO：21

C片段：SEQ ID NO：12+ SEQ ID NO：19+ SEQ ID NO：13；

II链的组成：B片段+Fc+铰链区或hole突变体+C片段；

II链对应的碱基序列为：

B：SEQ ID NO：15+ SEQ ID NO：9+ SEQ ID NO：19+ SEQ ID NO：8；

Fc+铰链区或hole突变体：SEQ ID NO：23

C片段：SEQ ID NO：12+ SEQ ID NO：19+ SEQ ID NO：13；

步骤1）中，单链I和单链II的核苷酸序列是分别合成的，步骤3）筛选出同时表达单链I和单链II的毕赤酵母阳性克隆。