CN111965354A - Ho-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒、诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了HO‑1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒、诊断试剂盒中的应用，属于生物技术领域，它解决了现有HO‑1在乳腺癌中的表达以及其细胞核染色在乳腺癌发生、发展中的作用尚未见详细报道等问题，HO‑1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒中的应用,以HO‑1蛋白作为分子标记，利用HO‑1单克隆抗体或HO‑1多克隆抗体，结合实验试剂，检测HO‑1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。本发明具有HO‑1蛋白与乳腺癌的发生发展联系密切等优点。

Description

HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒、诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒、诊断试剂盒中的应用。

背景技术

乳腺癌具有极大的异质性，难以进行准确的诊断和治疗。乳腺癌患者有不同的受体表达谱，临床上应用最广的包括雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)，孕激素受体(Progesterone Receptor，PR)以及人表皮生长因子受体2(Human Epidermal GrowthFactor Receptor-2，Her-2)。Her-2作为酪氨酸激酶受体属于EGFR/ErbB家族的被发现经常在乳腺癌中被上调。Her-2基因与乳腺癌相关性最大，其与ER、PR共同决定了乳腺癌分子类型分类，ER、PR和Her-2均阴性的乳腺癌定义为三阴性乳腺癌，至少其中之一阳性的统称为非三阴性乳腺癌，可根据其表达情况进一步分为Lumina A型、Lumina B型及Her-2过表达型。乳腺癌分子分型在预后评估及靶向治疗等方面发挥极其重要的作用。

由于乳腺癌(尤其是三阴性乳腺癌)的治疗手段有限，患者的预后相对较差，目前尚缺少评价其预后的有效指标和工具，为了实现个性化或更精确的治疗，更加细化的肿瘤分子特征系统需要得到建立。乳腺癌预后检测手段的提高和试剂盒的开发会填补这样的空白。因此，本领域迫切需要为乳腺癌的诊断和治疗提供新的标志物，寻找乳腺癌预后的基因和/或蛋白，该研究对临床乳腺癌预后评估具有重要意义。

虽然现在有大量新的抗癌试剂正在开发和临床试验中，但对乳腺癌的治疗仍局限在ER，PR，Her-2等靶标上。例如针对ER，PR阳性患者使用内分泌治疗，针对Her-2高表达的患者应用曲妥珠单抗等。所以，为了在乳腺癌诊断、治疗和预后评估上有所突破，寻找新的标记物和靶标具有十分重要的临床意义。

血红素氧化酶(Heme Oxygenase,HO)在血红素代谢过程中起到至关重要的作用，它可以将血红素分解转化为胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，是血红素代谢中的限速酶。HO-1是一种应激反应酶系统成员，在应激(如炎症，凋亡，缺血和缺氧)条件下的组织器官中，HO-1存在过度表达情况，这是细胞重要的保护机制。在肿瘤细胞中，多项研究提示其表达增高在癌症进展中发挥作用。HO-1在肿瘤细胞中会产生抗凋亡作用，有利于肿瘤细胞生长,且在癌细胞的恶性转化中起重要作用。同时，HO-1与肿瘤对化学治疗，放射治疗和光动力疗法产生抵抗性有关。抑制HO-1能够使癌细胞重新恢复对上述治疗的敏感性。

HO-1是一种内质网锚定蛋白质，大多数情况下表达在细胞质中，但是在特定情况下也可转移到细胞核中。目前研究发现，HO-1核定位现象也在前列腺癌，肺癌和口腔癌细胞中可见，并与肿瘤进展有关。HO-1在乳腺癌中的研究也有报道，Rui Deng等人发现HO-1抑制剂ZnPPIX在接种乳腺癌细胞株4T1小鼠中有抑制小鼠肿瘤生长的作用，同时有HO-1表达下降趋势，提示HO-1和肿瘤生长相关。但HO-1在乳腺癌中的表达以及其细胞核染色在乳腺癌发生、发展中的作用尚未见详细报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒、诊断试剂盒中的应用。

本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒中的应用,其特征在于，以HO-1蛋白作为分子标记，利用HO-1单克隆抗体或HO-1多克隆抗体，结合实验试剂，检测HO-1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。

优选的，所述的实验试剂为免疫组化实验试剂。

优选地，所述的免疫组化实验试剂包括磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸盐缓冲液、无水乙醇、无水甲醇、山羊血清、DAB显色液、生物素标记羊抗鼠IgG。

优选地，使用所述的试剂盒在体外检测HO-1蛋白在乳腺癌组织中的表达量，其检测方法包括以下步骤：

S01：利用所述试剂盒中的磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸盐缓冲液、无水乙醇、无水甲醇、山羊血清、DAB显色液、生物素标记羊抗鼠IgG将乳腺癌组织切片进行免疫组化染色；

S02：在双向显微镜下观察染色结果；

S03：免疫组化积分打分法对染色结果分别进行评分；

S04：根据评分将乳腺癌组织中HO-1蛋白分子分为高表达量和低表达量。

本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：HO-1蛋白在乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌诊断试剂盒以HO-1蛋白作为诊断标记物。

本发明的原理：本发明的主要内容是提供HO-1蛋白的新应用，采用免疫组化方法检测HO-1蛋白在乳腺癌组织中的表达，分析HO-1的表达和乳腺癌临床病理指标之间的相关性，基于HO-1蛋白的相对表达量与乳腺癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标记对其表达量进行检测可以用于指导乳腺癌的预后判断，在此基础上完成了本发明。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明阐述一种在乳腺癌细胞中高表达的蛋白HO-1(而在良性组织中表达较低)，HO-1表达的显著增高提示乳腺癌的存在，为乳腺癌的诊断提供新的标志物。与非三阴性乳腺癌相比，HO-1在三阴性乳腺癌中表达较高，提示其表达与乳腺肿瘤分子分型相关。

2、本发明通过回顾性分析证明HO-1蛋白与乳腺癌临床病理因素之间存在相关性，提示HO-1蛋白与乳腺癌的发生发展联系密切。

3、本发明评估了HO-1在肿瘤亚细胞层次的染色情况，发现少数乳腺癌标本中也存在细胞核染色。将此与患者临床病理因素做方差分析比较发现其并与肿瘤组织学分级相关，组织学分级三级的患者HO-1染色明显较一级和二级较低。在分子分型上，非三阴性乳腺癌HO-1细胞核染色率较三阴性乳腺癌高。提示HO-1在乳腺癌中的核定位倾向于降低肿瘤的恶性程度，作为一种保护机制改善患者预后。

4、本发明进一步通过OSbrca数据库验证，证明HO-1表达量呈现与不良预后正相关性，包括总体生存期与无病生存期。

5、本发明采用免疫组织化学染色技术检测临床乳腺癌及纤维腺瘤病理组织包括胞浆和胞核中HO-1表达的情况，并回顾分析HO-1与乳腺癌临床病理特征和预后的关系，开发HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒中的应用，为未来研究HO-1在乳腺癌的分子机制及进一步指导临床诊疗提供研究基础。

附图说明

图1是本发明纤维腺瘤染色呈阴性的显微镜图；

图2是本发明纤维腺瘤染色呈阳性的显微镜图；

图3是本发明非三阴乳腺癌染色呈阴性的显微镜图；

图4是本发明非三阴乳腺癌染色呈阳性的显微镜图；

图5是本发明三阴性乳腺癌染色呈阴性的显微镜图；

图6是本发明三阴性乳腺癌染色呈阳性的显微镜图；

图7是本发明非三阴乳腺癌核染呈阴性的显微镜图；

图8是本发明图7的放大图；

图9是本发明非三阴乳腺癌核染阳性的显微镜图；

图10是本发明图9的放大图；

图11是本发明三阴性乳腺癌核染呈阴性的显微镜图；

图12是本发明图11的放大图；

图13是本发明三阴性乳腺癌核染呈阳性的显微镜图；

图14是本发明图13的放大图；

图15是本发明在统计的172例所有类型乳腺癌中，HO-1表达最高的25％患者与最低的25％患者预后评估对比图；

图16是本发明乳腺癌患者无病生存期数据中，HO-1表达最高的25％患者与其余75％患者差预后评估对比图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

临床病例信息收集

自2012年至2016年收集于我院乳腺癌改良根治术标本，术后病理科明确乳腺癌者139例，2012年行乳腺肿块切除术标本，术后明确诊断纤维腺瘤者10例，随访时间从每个患者术后至2019年10月，最长随访时间为93个月，最短随访时间为7个月。

病理组织标本

本研究的139例乳腺癌及10例乳腺纤维腺瘤的病理切片取自温州医科大学第二附属医院病理科2012年至2016年的石蜡标本。入组病例均满足以下条件：(1)入组病例均接受乳腺癌改良根治术；(2)所有标本经过HE染色，专业病理科医师在光镜下病理确诊乳腺癌及纤维腺瘤；(3)所有病例送检超过8枚淋巴结进行术后病理诊断；(4)所有病例术前均未接受放疗、化疗。患者联系方式通过医院住院病历信息系统获取，通过电联的方式随访患者乳腺癌改良根治术手术后后续化疗治疗方式、门诊复查及生存情况，并通过病历系统详细记录患者基本信息及标本病理详细信息。研究方案获得温州医科大学第二附属医院研究伦理委员会批准。所有患者均获得书面知情同意书，并授权手术切除组织用于科学目的。

实验试剂耗材及来源

鼠抗人HO-1单克隆抗体(英国Abcam公司)

防脱载玻片(中杉金桥)

盖玻片(中杉金桥)

磷酸缓冲盐溶液(北京索莱宝)

柠檬酸盐缓冲液(北京索莱宝)

无水乙醇(上海国药)

无水甲醇(上海国药)

山羊血清(中杉金桥)

生物素标记羊抗鼠IgG(中杉金桥)

DAB显色剂(中杉金桥)

免疫组化染色法

(1)将组织蜡块冰台上预冷，1小时后将其切成4μm厚的薄片，将其置于40℃温水中平展后固定于防脱载玻片上备用。

(2)60℃烘烤2小时后经过二甲苯脱蜡，100％、95％、85％、75％酒精依次浸泡5分钟水化，用PBS冲洗3遍后，使用3％过氧化氢在室温下避光孵育25min以灭活组织内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次。

(3)将切片浸泡入柠檬酸钠缓冲液并放入微波炉，中高火热修复抗原半小时。修复结束放置于室温条件下待其自然降至室温。

(4)PBS冲洗3遍后滴加100μL 10％山羊血清充分覆盖组织，封闭非特异性抗原，在室温下孵育20min后甩去血清，PBS冲洗3次。

(5)依次滴加一抗(鼠抗人HO-1单克隆抗体)后冰箱冷藏室4℃过夜，第二日清晨将其置于室温下缓慢复温，PBS冲洗后加入增强剂(为小鼠二步法检测试剂盒中的试剂2反应增强液，ZSGB-BIO PV-9002，购买自中杉金桥)，置于37℃恒温水浴箱20分钟后拿出，PBS冲洗3遍后，滴加二抗(生物素标记羊抗鼠IgG)，置于37℃恒温水浴箱30分钟后取出，PBS冲洗3遍后，进行DAB显色，自来水冲洗终止显色反应后滴加苏木素复染1分钟，依次在75％、85％、95％、100％酒精中浸泡脱水，二甲苯中固定后风干，中性树胶封片。

免疫组化判定标准

HO-1主要位于细胞浆光滑内质网，少数细胞核中也有染色，阳性表达为棕色颗粒状物体。免疫组化的染色结果由两位具有五年以上工作经验的病理科医师，对于诊断不一致的病例，在双向显微镜下讨论后确定统一结果。HO-1免疫组织化学染色评分为染色强度及染色面积的乘积，染色强度分为0-3分，阴性评定为0分，弱阳性评定为1分，阳性评定为2分，强阳性评定为3分；染色面积评分为0-4分，镜下无明显阳性细胞评定为0分；0-25％评定为1分；25-50％评定为2分；50-75％评定为3分；≥75％评定为4分。总分取两者乘积，范围0-12分，≤4分评定为低表达，＞4分评定为高表达。其中细胞核出现棕色颗粒者为细胞核染色阳性，细胞核无棕色颗粒者为细胞核染色阴性。

数据统计方法

使用SPSS(18.0版)对数据进行分析。HO-1表达与乳腺癌其他计数资料指标的关系用卡方检验，与乳腺癌生存率的关系用Kaplan–Meier方法绘制，P值小于0.05被认为是有意义的统计标准。

乳腺癌数据库分析

OSbrca乳腺癌基因数据库中基因表达谱和临床数据由美国微软SQL Server数据库存储和管理，乳腺癌基因表达谱数据集主要由肿瘤基因图谱(The Cancer GenomeAtlas，TCGA)和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)组成，数据纳入分析根据以下四个标准：(1)队列必须至少有50例乳腺癌病例；(2)队列必须包含个体临床随访信息；(3)探针注释应该完成，或者探针可以通过ID转换转换为基因符号；(4)如果队列具有多个平台，则只选择具有50个以上单个样本的平台。对OSbrca中报告的生物标记物HO-1进行生存分析，将数据分为“高25％VS低25％”的表达，根据ER、PR、Her-2的表达情况将数据分为三阴性乳腺癌及非三阴性乳腺癌两组，分别生成具有对数秩P值的Kaplan-Meier生存曲线，并用单因素Cox回归分析计算HR和95％可信区间(95％CI)。

HO-1在乳腺良性组织、非三阴性乳腺癌、三阴性乳腺癌中的表达

免疫组化结果显示HO-1主要表达在细胞浆中，为胞浆阳性，如图1-6所示为H0-1在细胞中的表达，图1是纤维腺瘤染色呈阴性的显微镜图；图2是纤维腺瘤染色呈阳性的显微镜图；图3是非三阴乳腺癌染色呈阴性的显微镜图；图4是非三阴乳腺癌染色呈阳性的显微镜图；图5是三阴性乳腺癌染色呈阴性的显微镜图；图6是三阴性乳腺癌染色呈阳性的显微镜图。在纤维腺瘤患者组织中，HO-1的高表达有1例，患者高表达率为10％，低表达有9例，低表达率为90％。在139例乳腺癌患者组织中，高表达的病例数为67例，高表达率为48.2％，乳腺癌患者HO-1染色较浅或不表达者有72例，低表达率为51.8％。相较于纤维腺瘤组织，HO-1在乳腺癌组织中的表达升高(P＝0.022)(表1)。其中非三阴性乳腺癌64例，高表达者23例，高表达率为35.9％，低表达者41例，低表达率64.1％。三阴性乳腺癌患者75例，高表达者44例，高表达率为58.7％，低表达者31例，低表达率41.3％。相比于非三阴性乳腺癌，三阴性乳腺癌HO-表达更高，有统计学意义(P＝0.008)(表1)。

表1 HO-1表达与肿瘤良恶性的关系(n＝149)

HO-1的表达与相关临床病理特征的关系

为探讨HO-1表达的临床病理学意义，我们分析了139例乳腺癌中的HO-1的表达与临床病理数据的相关性。HO-1在乳腺癌组织中的表达与不同年龄、肿瘤大小、淋巴结转移数、组织学分级、ER、PR和Ki67之间均无统计学意义(P＞0.05)(表2)；在110例Her-2^-或Her-2⁺低表达的病例中，HO-1高表达为59例，占有53.6％，低表达为51例，占有46.4％。在29例Her-2⁺⁺和Her-2⁺⁺⁺高表达的病例中HO-1高表达为8例，占27.6％，低表达为21例，占72.4％。上述结果可以看出，HO-1的表达和Her-2表达程度相关(P＝0.013)(表2)。

表2 HO-1表达与乳腺癌患者临床病理因素的关系(n＝139)

HO-1的细胞核染色与乳腺癌患者病理因素的关系

HO-1在大部分乳腺癌细胞核中无明显表达，但在少数病例中可见细胞核表达，如图7-14所示，为H0-1在细胞核中的染色的显微镜图。图7是非三阴乳腺癌核染呈阴性的显微镜图；图8为图7的放大图；图9是非三阴乳腺癌核染阳性的显微镜图；图10是图9的放大图；图11是三阴性乳腺癌核染呈阴性的显微镜图；图12是图11的放大图；图13是三阴性乳腺癌核染呈阳性的显微镜图；图14是图13的放大图。

为探讨HO-1细胞核染色与乳腺癌患者病理因素之间的临床意义，我们统计分析了139例乳腺癌中的HO-1在细胞核中的表达与临床病理数据的相关性。HO-1在乳腺癌细胞核中的表达与Her-2、Ki67之间无统计学意义(P＞0.05)(表3)；部分患者术后病理标本为导管内癌、小叶癌、基底细胞亚型、髓样癌等，无组织学分级信息，予排除统计分析，所以HO-1细胞核染色与组织学分级统计纳入118病例，其中≤2级(共有三级，≤2级表示一级和二级)有69例，核染阳性为17例，阳性率24.6％，核染阴性为52例。在49例＞2级(共有三级，＞2级表示三级)病例中，核染阳性为3例，阳性率6.1％。统计可知两者之间组织学分级较低者核染阳性率更高，有统计学意义(P＝0.008)。在139个病例中，非三阴性乳腺癌64例，核染阳性者14例，阳性率为21.9％。三阴性乳腺癌患者75例，核染阳性者7例，阳性率为9.3％。相比于非三阴性乳腺癌，三阴性乳腺癌HO-1核染率更低，有统计学意义(P＝0.040)。ER阴性乳腺癌89例，核染阳性者9例，阳性率为10.1％。ER阳性乳腺癌患者50例，核染阳性者12例，阳性率为24.0％。相比于ER阴性乳腺癌，ER阳性乳腺癌HO-1核染率更高，有统计学意义(P＝0.028)。PR阴性乳腺癌93例，核染阳性者9例，阳性率为9.7％。PR阳性乳腺癌患者46例，核染阳性者12例，阳性率为26.1％。相比于PR阴性乳腺癌，PR阳性乳腺癌HO-1核染率更高，有统计学意义(P＝0.011)。

表3 HO-1细胞核染色与乳腺癌患者病理因素的关系(n＝139)

HO-1在OSbrca数据库中的表达差异与预后分析

在OSbrca数据库中使用现有的高通量数据分析HO-1基因在乳腺癌中的预后价值。GSE26338_GPL1390数据库结果显示，在统计的172例所有类型乳腺癌中，HO-1表达最高的25％患者预后较表达最低的25％患者差，OS更短，风险比(Hazard Ratio，HR)为12.1614(95％Cl，1.5191-97.3582)，差异具有统计学意义(P＝0.0186)(图15)。同样，在GSE4922_GPL96数据库中，统计了249例乳腺癌患者无病生存期(Disease-Free Survival，DFS)数据，其中HO-1表达最高的25％患者预后较其余75％患者差，平均风险比为1.5791(95％Cl，1.0135-2.4603)，差异具有统计学意义(P＝0.0435)(图16)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (5)

1.HO-1蛋白在乳腺癌预后评估试剂盒中的应用,其特征在于，以HO-1蛋白作为分子标记，利用HO-1单克隆抗体或HO-1多克隆抗体，结合实验试剂，检测HO-1蛋白在乳腺癌组织中的相对表达量。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于，所述的实验试剂为免疫组化实验试剂。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于，所述的免疫组化实验试剂包括磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸盐缓冲液、无水乙醇、无水甲醇、山羊血清、DAB显色液、生物素标记羊抗鼠IgG。

4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于，使用所述的试剂盒在体外检测HO-1蛋白在乳腺癌组织中的表达量，其检测方法包括以下步骤：

S01：利用所述试剂盒中的磷酸缓冲盐溶液、柠檬酸盐缓冲液、无水乙醇、无水甲醇、山羊血清、DAB显色液、生物素标记羊抗鼠IgG将乳腺癌组织切片进行免疫组化染色；

S02：在双向显微镜下观察染色结果；

S03：免疫组化积分打分法对染色结果分别进行评分；

S04：根据评分将乳腺癌组织中HO-1蛋白分子分为高表达量和低表达量。

5.HO-1蛋白在乳腺癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的乳腺癌诊断试剂盒以HO-1蛋白作为诊断标记物。

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