CN111965094B - 一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法 - Google Patents

Abstract

一种比较体外诱导的PGC‑like细胞迁移效率的方法，属于生物技术领域。前期通过不同的诱导体系将ESCs或iPS细胞诱导分化形成PGC‑like细胞，将获得的PGC‑like细胞进行PKH26细胞膜表面标记，然后注射至孵化2.5天的受体鸡胚血管，封口后继续孵化至4.5天，分离鸡胚生殖嵴，进行冰冻切片后在荧光显微镜下观察红色荧光，并通过流式细胞术分析PKH26红色荧光的比例，从而比较不同体系诱导形成的PGC‑like细胞的迁移能力。结果发现能够明确对比出体外不同体系诱导的PGC‑like细胞的迁移能力的差异。本发明切实可靠，严谨准确，成效显著，为研究分析体外诱导的PGCs迁移归巢至生殖嵴的能力提供了一种新颖可行且高效的实验方法。

Description

一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法

技术领域

本发明涉及一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法，属于生物技术领域。

背景技术

PGCs移植技术是通过生殖细胞保存实现物种恢复的有效途径，Chuma S等将小鼠的PGCs移植进出生后小鼠的睾丸中使移植的PGCs分化为了精原干细胞并得到了后代。鸟类上由于PGCs能够通过血液迁移的特点，Tagami T等将白来航鸡PGCs注射至受体后成功获得后代，成功复原了隐性白羽鸡，陆阳清等通过相同的方法在白来航鸡中成功实现东兰乌鸡和白来航鸡的PGCs移植，并产生纯种黑羽鸡。PGCs由于其生殖细胞的发育潜能，能够作为种质资源进行保护和利用，也可以作为基因编辑的目的细胞生产基因编辑动物。

目前ESCs和iPS等多能干细胞可在适当的条件下被诱导分化获得PGC-like细胞。本课题组前期建立了BMP4/BMP8b/EGF体系将ESCs和iPS分别诱导分化形成PGC-like细胞，并利用VPA/VK3/5-Aza等小分子诱导了这一诱导体系，同时也建立了原代PGCs迁移归巢模型且成功产生了后代。但体外诱导形成的PGC-like细胞是否具有原代PGCs同样的迁移归巢至性腺的能力仍不清楚，因此，亟需对体外诱导形成的PGC-like细胞迁移效率进行分析，研究通过体外诱导的PGCs 迁移归巢至生殖嵴并产生后代的可行性和准确性，为实现PGCs在禽类资源保护过程中的广泛应用奠定基础。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供一种新型的比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法。本发明切实可靠，严谨准确，成效显著，为研究分析体外诱导的PGCs 迁移归巢至生殖嵴的能力提供了一种新颖可行且高效的实验方法。

本发明的技术方案如下：

一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法，具体如下：

前期通过不同的诱导体系将ESCs或iPS细胞诱导分化形成PGC-like细胞，将获得的PGC-like细胞进行PKH26细胞膜表面标记，然后注射至孵化2.5天的受体鸡胚血管，封口后继续孵化至4.5天，分离鸡胚生殖嵴，进行冰冻切片后在荧光显微镜下观察红色荧光，并通过流式细胞术分析PKH26红色荧光的比例，从而比较不同体系诱导形成的PGC-like细胞的迁移能力。结果发现能够明确对比出体外不同体系诱导的PGC-like细胞的迁移能力的差异。

本发明严谨准确，切实可行，应用广泛。 PGCs由于其生殖细胞的发育潜能，能够作为种质资源进行保护和利用，也可以作为基因编辑的目的细胞生产基因编辑动物，通过禽类ESCs/iPS诱导形成的PGC-like细胞异体/异种间移植产生后代。鸡是非哺乳动物中研究遗传学最重要的模式生物之一。因此本发明的实验方法不仅在家禽上种质资源保护过程中可行，在脊椎动物的其他研究领域也可应用。这一发明将为体外诱导的PGC-like细胞介导后代鸡的生产研究提供更多的理论基础和技术支撑，也有利于对禽类种质资源进行保护和利用，同时也有利于转基因鸡的生产研究。

具体实施方式

一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法，通过将不同诱导体系的PGC-like进行鸡胚血管，继续孵化至4.5天时分离生殖嵴，显微镜下观察比较PGC-like的迁移能力，并通过流式细胞分析比较迁移效率，具体实施步骤如下：

1.1 PKH26红色荧光细胞膜表面标记

将不同体系诱导分化形成的PGC-like细胞收集于15ml离心管中，用不含血清的DMEM清洗。1400转/分钟，离心8分钟，弃上层清液。加入1ml的稀释液C，轻轻吹打，制备2×的细胞悬液。将4μl的PKH26加入1ml稀释液C中，充分混匀，配制2×染色液。将染色液和细胞悬液混匀染色5分钟。加入等体积的血清终止染色反应，孵育1分钟。1400转/分钟，离心8分钟，加入10ml完全培养基清洗两遍除去多于的染料。1400转/分钟，离心8分钟，弃去所有清洗液，培养基成悬细胞，重新接种于培养皿中。

鸡胚血管注射

取发育至2.5天的种蛋，用酒精棉球小心擦拭其钝端。在钝端开口放置在体式显微镜下，找到鸡胚血管。用显微注射针向血管中注射1μl PGC-like细胞悬液(5000个/μl)。将20μl青链霉素溶液从开口中轻轻滴入。用医用纸胶带将开口封住。将种蛋移回孵化箱中钝端朝上孵化。

冰冻切片

将注射了PKH26红色荧光标记的PGC-like细胞的鸡胚继续孵化至第4.5天，分离鸡胚生殖嵴，将其放入冰冻切片托架上加入包埋剂涂抹均匀，使样品托保持平整。迅速将样品托放入液氮，冷冻固定至无气泡产生，约20秒。将冷冻固定好的样品放入冰冻切片机中使温度平衡。安装好刀片，以20μm的厚度进行修片。修到样品处后，以8μm的厚度进行切片，用载玻片附着，显微镜下观察PKH26红色荧光，比较不同诱导体系获得的PGC-like在生产后代过程中的差异。

流式细胞分析PGC-like移植后迁移的数量

分别收集不同体系诱导形成的PGC-like，用PHK26红色荧光标记后按相同的数量注射到孵化至2.5天的鸡胚血管内，继续孵化至4.5天时收集生殖嵴分离PGC，并通过PHK26红色荧光进行流式细胞分析，比较不同体系诱导形成的PGC-like在受体鸡胚的迁移效率。

Claims (1)

1.一种比较体外诱导的PGC-like细胞迁移效率的方法，其特征是，包括以下步骤：

1)PKH26红色荧光细胞膜表面标记；即，前期通过不同的诱导体系将ESCs或iPS细胞诱导分化形成PGC-like细胞，将获得的PGC-like细胞进行PKH26细胞膜表面标记；具体为：

将不同体系诱导分化形成的PGC-like细胞收集于15ml离心管中，用不含血清的DMEM清洗；1400转/分钟，离心8分钟，弃上层清液；加入1ml的稀释液C，轻轻吹打，制备2×的细胞悬液；将4μl的PKH26加入1ml稀释液C中，充分混匀，配制2×染色液；将染色液和细胞悬液混匀染色5分钟；加入等体积的血清终止染色反应，孵育1分钟；1400转/分钟，离心8分钟，加入10ml完全培养基清洗两遍除去多于的染料；1400转/分钟，离心8分钟，弃去所有清洗液，培养基成悬细胞，重新接种于培养皿中；

2)鸡胚血管注射；即，注射至孵化2.5天的受体鸡胚血管，封口后继续孵化至4.5天，分离鸡胚生殖嵴；

3)冰冻切片；进行冰冻切片后在荧光显微镜下观察红色荧光；具体为：

将注射了PKH26红色荧光标记的PGC-like细胞的鸡胚继续孵化至第4.5天，分离鸡胚生殖嵴，将其放入冰冻切片托架上加入包埋剂涂抹均匀，使样品托保持平整；迅速将样品托放入液氮，冷冻固定至无气泡产生，20秒；将冷冻固定好的样品放入冰冻切片机中使温度平衡；安装好刀片，以20μm的厚度进行修片；修到样品处后，以8μm的厚度进行切片，用载玻片附着，显微镜下观察PKH26红色荧光，比较不同诱导体系获得的PGC-like在生产后代过程中的差异；

4)流式细胞分析PGC-like移植后迁移的数量；通过流式细胞术分析PKH26红色荧光的比例，从而比较不同体系诱导形成的PGC-like细胞的迁移能力；具体为：

分别收集不同体系诱导形成的PGC-like，用PHK26红色荧光标记后按相同的数量注射到孵化至2.5天的鸡胚血管内，继续孵化至4.5天时收集生殖嵴分离PGC，并通过PHK26红色荧光进行流式细胞分析，比较不同体系诱导形成的PGC-like在受体鸡胚的迁移效率。