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CN111956658B - miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用 - Google Patents

miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用 Download PDF

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CN111956658B CN202010738200.2A CN202010738200A CN111956658B CN 111956658 B CN111956658 B CN 111956658B CN 202010738200 A CN202010738200 A CN 202010738200A CN 111956658 B CN111956658 B CN 111956658B
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Abstract

本发明公开了miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用。本发明提供miRNA 148簇的微小RNA在认知障碍相关疾病诊断、治疗方面的应用，通过认知障碍疾病模型，利用针对miRNA 148簇的微小RNA标志物的引物检测其表达量，发现miRNA 148簇的微小RNA在认知障碍相关疾病进程中表达显著降低，通过PTEN基因负向调控并且靶向p35抑制AD病变中tau蛋白过度磷酸化，改善AD病理进程。因此miRNA 148簇的微小RNA可以作为一种新的认知障碍相关疾病的标志物，用于认知障碍相关疾病的辅助诊断和治疗。

Description

miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及miRNA148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用。
背景技术
神经认知障碍(NCD)是一组以认知缺陷为主要临床表现的综合征，涉及思维、推理、记忆和解决问题的障碍。根据《精神障碍诊断和统计手册》第五版(DSM-5)将其分为轻度认知障碍和重度认知障碍(痴呆)。认知障碍涉及许多脑部和躯体疾病，其中阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VaD)是最为常见的认知障碍相关的疾病。虽然认知障碍更可能影响老年人，但它不是正常衰老过程的一部分，而是潜在的脑部病理性受损后产生的疾病，因此也会对年轻人产生影响。
AD的患病率约占痴呆的50％以上，主要病理学特征为细胞外淀粉样蛋白沉积形成的老年斑和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结；VaD的发病率仅次于AD，约占痴呆的15％-20％，是由缺血性卒中、出血性卒中和脑缺血缺氧等原因导致的。这两种疾病的发病机制都比较复杂、缺乏治疗效果良好的药物、缺乏简单无创的早期诊断筛查手段，因此寻求可靠的诊断标志物和有效的治疗药物是目前防治AD和VaD亟待解决的科学问题。但是绝大多数AD和VaD尚无相关的基因报道，这给疾病的筛查与预防带来了极大的难度。因此研究疾病中相关基因的变化对认知障碍相关疾病的防治及临床生物标志物的发现具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明提供miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供miRNA 148簇或其表达促进物作为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)的应用，
(a)制备抑制tau蛋白磷酸化的物质；
(b)制备缓解神经退变和具有神经保护作用的物质；
(c)制备作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病的物质；
(d)制备减少p35、p25和CDK5的表达的物质。
本发明的一个实施例中，所述miRNA148簇选自hsa-miR-148a，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；
所述miRNA 148簇选自hsa-miR-148a-3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种产品，其活性成分为miRNA 148簇或其表达促进物；所述产品的用途为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)：
(a)抑制tau蛋白磷酸化；
(b)缓解神经退变和具有神经保护作用；
(c)诊断和/或治疗认知障碍相关疾病；
(d)减少p35、p25和CDK5的表达。
本发明的一个实施例中，所述诊断认知障碍相关疾病的产品为检测试剂盒；
所述试剂盒包括所述的miRNA 148簇的引物，所述检测试剂盒用于提供在患有或有风险形成认知障碍相关疾病的患者中诊断认知障碍相关疾病，预测形成认知障碍相关疾病的风险，或预测认知障碍相关疾病的结果。
本发明的一个实施例中，所述引物用于测定样品中所述miRNA148簇的表达水平。
本发明的一个实施例中，所述miRNA148簇的表达水平是以患者的miRNA148簇物表达水平与健康miRNA 148簇参照表达水平；
若所述miRNA 148簇的表达水平与健康人miRNA 148簇参照表达水平相比显著降低，则提示该患者患有或有风险形成认知障碍疾病。
本发明的一个实施例中，所述miRNA148簇的表达水平的测定是基于测序的方法、基于阵列的方法或基于PCR的方法。
本发明的一个实施例中，所述miRNA148簇的表达促进物为促进Akt表达或激活的试剂、药物、制剂及基因序列，促进CREB表达或激活的试剂、药物、制剂及基因序列和抑制PTEN表达或激活的试剂、药物、制剂及基因序列中的至少一种；
其中，所述Akt和CREB为正向调控所述miRNA 148簇的表达；所述PTEN反向调控所述miRNA 148簇的表达。
miRNA 148簇的激动剂在制备治疗认知障碍相关疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围
miRNA 148簇的互作长链非编码RNA(lncRNA)在制备治疗认知障碍相关疾病中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明中，miRNA 148簇的微小RNA在AD和VaD中表达降低，并在AD中通过靶向抑制p35降低tau蛋白磷酸化水平，起到改善认知功能障碍的作用。其中，miRNA 148簇的微小RNA为：
(1)miRNA 148簇的微小RNA选自如下特征：(a)miRNA类微小RNA，miRNA148a类微小RNA选自hsa-miR-148a，其序列如SEQ ID NO.1gaggcaaagu ucugagacac uccgacucugaguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc所示，其默认成熟体(hsa-miR-148a-3p)序列如SEQ ID NO.2：ucagugcacuacagaacuuugu所示；(b)经修饰的miRNA类微小RNA衍生物；或长度为18-26nt、功能与miRNA类微小RNA相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
本发明还提供一种制剂和药物，该制剂和药物为(1)中的微小RNA的激动剂。
本发明还提供一种lncRNA，该lncRNA为与(1)中的微小RNA特异性互作的lncRNA。
本发明具有如下优点：
本发明发现miRNA 148簇的微小RNA在认知障碍相关疾病诊断、治疗方面具有作用，通过认知障碍疾病模型，利用针对miRNA 148簇的微小RNA标志物的引物和/或探针，检测其在疾病模型中的表达量，发现miRNA 148簇的微小RNA在认知障碍相关疾病进程中表达显著降低，因此miRNA 148簇的微小RNA可以作为一种新的认知障碍相关疾病标志物，用于认知障碍相关疾病的辅助诊断；
本发明发现miRNA 148簇的微小RNA参与AD和VaD的病理进程，并在AD和VaD细胞模型具有神经保护作用。miRNA 148簇在AD病理进程中可以通过直接结合p35 mRNA的3’UTR端，调控p35的翻译，进而继发性调控p25、CDK5的表达，降低tau蛋白磷酸化水平，改善小鼠认知障碍；CREB可以直接结合miR-148a的启动子区，正向调控miR-148a的转录，PTEN/Akt信号通路可以通过调控CREB调节miR-148a的表达，进而影响tau蛋白磷酸化水平，改善小鼠的学习记忆能力。
本发明对miRNA 148簇的微小RNA的功能研究深入系统，基于以上发现，miRNA 148簇的微小RNA可以作为认知障碍相关疾病新的治疗靶点，以miRNA 148簇的微小RNA作为认知障碍相关疾病生物标志物的靶向治疗提供了新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为miRNA芯片技术检测miR-148a在APP/PS1双转基因动物及野生型动物脑组织中的差异表达；
图2为本发明的miR-148a在认知障碍疾病模型中的表达检测；
图3为本发明的miR-148a对神经细胞保护作用以及对tau蛋白磷酸化抑制作用的影响；
图4为本发明的miR-148a与p35 mRNA 3’UTR特异性结合并负向调控其表达，进而调控CDK5及tau蛋白磷酸化水平；
图5为本发明的miR-148a改善AD模式动物认知与记忆功能障碍，并依赖p35显著降低AD小鼠脑内的tau蛋白磷酸化水平；
图6为mRNA芯片技术检测PTEN基因在AD模式动物和自然老化动物脑内的表达变化，并且AD细胞中上调PTEN表达水平导致tau蛋白磷酸化；
图7为本发明的miR-148a的表达受PTEN/Akt信号通路调控；
图8为CREB与本发明的miR-148a启动子区特异结合并调控其转录，并且PTEN/Akt信号通路调控CREB的表达；
图9为AD小鼠脑内PTEN基因的表达变化对小鼠的学习记忆能力的影响，以及AD小鼠脑内PTEN的表达抑制可提高miR-148a的表达、激活Akt/CREB信号通路、降低tau蛋白磷酸化水平。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，术语“表达水平”是指与来自参照核酸(例如来自对照)比较，或与计算的平均表达值(例如在RNA芯片分析中)比较的测定表达水平。某个“表达水平”也可作为结果(result)并通过下文公开的几种感兴趣核酸的比较和测量来测定，并展示出这些转录物彼此的相对丰度。表达水平还可相对于不同组织，患者对健康对照等中的表达来评估。
在本发明的上下文中，“样品”或“生物样品”是源自生物学生物体或已经与生物学生物体接触的样品。生物样品的例子是：细胞、组织、体液、活组织检查样本、血液、尿液、唾液、痰液、血浆、血清、细胞培养上清液等。
“基因”是含有以受控方式产生功能性RNA产物必需的信息的核酸区段。“基因产物”是通过基因转录或表达产生的生物分子，例如mRNA或翻译蛋白。
“miRNA”是短的、天然存在的RNA分子，并且应当具有本领域技术人员所理解的一般含义。“源自miRNA的分子”是以化学方法或酶促方法自miRNA模板获得的分子，诸如cDNA。
“lncRNA”是长度超过200个碱基的不编码或少量编码的RNA分子，并且应当具有本领域技术人员所理解的一般含义。lncRNA可以作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA相互作用，参与靶基因的调控，在疾病发生发展中发挥重要的作用。
本发明中，术语“阵列”指装置(例如芯片装置)上可寻址位置的排列。位置的数目可从几个变化到至少几百或几千个。每个位置代表独立的反应位点。阵列包括但不限于核酸阵列、蛋白质阵列和抗体阵列。“核酸阵列”指含有核酸探针(诸如寡核苷酸、多核苷酸或基因的较大部分)的阵列。阵列上的核酸优选为单链的。
“基于PCR的方法”指包含聚合酶链式反应PCR的方法。这是通过利用一种、两种或更多种引物在体外酶促复制指数扩增核酸“例如DNA或RNA”的方法。对于RNA扩增，可使用逆转录作为第一步。基于PCR的方法包含动力学或定量PCR(qPCR)，其特别适宜于分析表达水平。当其实现表达水平的测定时，可以例如使用基于PCR的方法以检测给定mRNA的存在，其在逆转录酶的帮助下将完整的mRNA库(所谓的转录物组)逆转录为cDNA，并在相应引物的帮助下检测给定cDNA的存在。此方法通常称为逆转录酶PCR(rtPCR)。
本发明中，术语“基于PCR的方法”包含端点PCR应用及应用特殊的荧光团或嵌入染料的动力学/实时PCR技术两者，所述荧光团或嵌入染料发射荧光信号作为扩增靶标的函数，并允许靶标的监测和定量。
本发明中，术语“标志物”或“生物标志物”指其存在或浓度可进行检测并与已知的状况(诸如疾病状态)或临床结果(诸如对治疗的响应)相关联的生物分子，例如核酸、肽、蛋白质、激素等。
本发明中，miRNA具有内源性、体积小易于通过血脑屏障等优点，不仅能够通过结合靶基因调控翻译表达，还可以与lncRNA相互作用，同时单个的miRNA可能与多个靶基因和lncRNA相互作用，而多个miRNAs也可能与同一个靶基因或lncRNA互作，在脑内形成复杂的调控网络。
实施例1、miRNA芯片技术检测miR-148a在AD模式动物及野生型动物脑组织中的差异表达
分别提取1、3、6、9月龄APP/PS1双转基因小鼠及其野生型对照小鼠脑组织RNA并使用miRCURYTM Array Power Labeling kit对miRNA进行荧光标记。本发明的miRNA 148簇的微小RNA为hsa-miR-148a，其序列如SEQ ID NO.1所示：gaggcaaagu ucugagacacuccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac uuugucuc。其默认成熟体(hsa-miR-148a-3p)序列如SEQ ID NO.2：ucagugcacuacagaacuuugu所示。其中，成熟体(hsa-miR-148a-3p)miRNA逆转录引物：SEQ ID NO.3：gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattcgcactggata cgacacaaag；qPCR正向引物：SEQ ID NO.4：gcgcgtcagt gcactacagaa；反向引物：SEQ ID NO.5：agtgcagggt ccgaggtatt。而后将样品与miRCURYTM Array芯片杂交，使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪进行图片扫描，使用GenePix pro V6.0软件进行原始数据分析。如图1芯片结果所示，有9个miRNAs在1、3、6、9月龄APP/PS1小鼠脑内持续变化，可能参与AD的病理全程。其中miR-148a在1、3、6、9月龄APP/PS1小鼠脑内表达持续下调且变化差异最大(mean±SEM，n＝3，fold change＞2)，提示miR-148a与AD密切相关。
实施例2、miR-148a在AD模式细胞中的表达变化
在SH-SY5Y细胞中稳定转染进瑞典型突变APP基因，构建APPswe细胞稳转株。本发明利用300μM铜离子损伤APPswe细胞建立AD细胞模型，并提取细胞RNA检测miR-148a的表达量。如图2中A所示，与正常对照SH-SY5Y细胞对比，miR-148a在AD模型细胞中的表达显著下调(mean±SEM,n＝3,*P<0.05)。
实施例3、miR-148a在AD模式动物和自然老化动物中的表达变化
应用qPCR对APP/PS1双转基因小鼠及其野生型(WT)对照小鼠、SAMP8小鼠及其对照小鼠(SAMR1)脑内的miR-148a表达量进行检测。如图2中B-C所示，在3、6、9月龄APP/PS1小鼠的皮层与海马中，miR-148a表达水平均呈现下降趋势，其中6、9月龄APP/PS1小鼠与同月龄WT小鼠相比出现统计学差异(mean±SEM,n＝4,*P<0.05,***P<0.001)。如图2中D-E所示，在SAMP8小鼠的海马中，仅9月龄小鼠海马内的miR-148a表达水平显著低于同龄SAMR1对照(mean±SEM,n＝4,*P<0.05)；而在皮层中，6、9月龄SAMP8小鼠的miR-148a表达水平均明显低于SAMR1对照小鼠(mean±SEM,n＝4,*P<0.05,***P<0.001)。由此推断，miR-148a在AD病变或衰老中表达呈现下降趋势。
实施例4、miR-148a在AD患者血清中的表达变化
为了进一步证实miR-148a与AD的相关性，抽取了14名AD患者的血液以及5名年纪相仿的正常志愿者的血液，并从血清中提取miRNA，采用qPCR检测miR-148a的表达量。结果如图2中F所示，AD患者血清中游离的miR-148a与健康人相比在显著下降，说明miR-148a的表达变化与AD密切相关(mean±SEM,n＝5～14,**P<0.01)。
实施例5、miR-148a在VaD细胞模型中的表达变化
应用5mM连二亚硫酸钠(Na2S2O4)损伤SH-SY5Y细胞建立糖氧剥夺细胞模型，模拟VaD的病理状态。细胞损伤2小时后提取RNA采用qPCR的方法检测miR-148a的表达变化。实验结果如图2中G所示，经Na2S2O4损伤后的细胞miR-148a的表达量相比对照组细胞显著下降(mean±SEM,n＝4,*P<0.05)。
实施例6、miR-148a在VaD动物模型中的表达变化
在SD大鼠上采用双侧颈总动脉结扎(2VO)的方法建立VaD动物模型，并分别检测大鼠脑组织皮层和海马miR-148a的表达变化。结果如图2中H所示，2VO大鼠皮层和海马中miR-148a的表达量相较sham组大鼠显著下调(mean±SEM,n＝6,*P<0.05)，说明miR-148a在VaD病变中表达呈现下降趋势。
实施例7、miR-148a表达变化对神经细胞活力的影响
为了探究miR-148a在AD和VaD中发挥神经保护作用，分别在2种细胞模型中转染了miR-148a mimics或inhibitor，选用CCK-8的方法对细胞活力进行检测。结果如图3中A-B所示，miR-148a表达上调显著提高了细胞的存活率(mean±SEM,n＝4,*P<0.05,**P<0.01)，miR-148a表达下调显著降低了细胞的存活率(mean±SEM,n＝4,*P<0.05,**P<0.01)，说明miR-148a在AD和VaD细胞模型上都具有神经保护作用。
实施例8、miR-148a表达变化对神经细胞凋亡的影响
通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，进一步确证miR-148a在AD中发挥的作用。如图3中C-D所示，miR-148a过表达显著抑制了APPswe细胞的凋亡率(mean±SEM,n＝4,**P<0.01)，抑制miR-148a的表达下调则提高了细胞的凋亡率(mean±SEM,n＝4)。
实施例9、miR-148a-3p对tau蛋白磷酸化的抑制作用
为了探究miR-148a在tau蛋白磷酸化过程中发挥的作用，在APPswe细胞中转染了miR-148a mimics或inhibitor，应用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)的方法检测tau蛋白各个位点的磷酸化水平。结果如图3中E-F所示，过表达miR-148a可以显著抑制tau蛋白AT8、Ser199、Ser396及Ser404位点的磷酸化水平；反之，抑制miR-148a的表达可以显著提高这些位点的磷酸化水平(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)，说明miR-148a对tau蛋白磷酸化具有很好的抑制作用。
实施例10、miR-148a与p35(细胞周期蛋白依赖性激酶5调节亚基1)的结合情况
为了探究miR-148a抗tau蛋白磷酸化的机制，首先利用生物信息学软件探究其作用靶点，发现miR-148a可以特异性的与p35 mRNA3’UTR端结合，结合位点如图4中A所示，且结合位点在人和小鼠中具有保守性。
如图4中B所示，根据结合位点构建双荧光素酶报告基因质粒。将原结合位点或者突变后的结合位点克隆到luciferase片段的后面，与Renilla质粒和miR-148a mimics共转染到HEK293细胞中。结果如图4中C所示，miR-148a显著降低了野生型位点的发光值但对突变位点的发光值没有影响(mean±SEM,n＝6,***P<0.001)。由此证明，miR148a可以与p35mRNA 3’UTR特异性结合。
实施例11、miR-148a对p35的调控作用
进一步，运用qPCR和WB的方法检测miR-148a对p35 mRNA和蛋白表达的调控作用。结果如图4中D-F所示，相较于对照组，miR-148a的表达上调显著降低了p35蛋白的表达，而抑制miR-148a的表达则显著提高了p35蛋白的表达(mean±SEM,n＝6,***P<0.001)；然而，miR-148a对p35 mRNA的表达没有影响(mean±SEM,n＝6)。说明miR-148a影响p35的翻译过程，不影响p35 mRNA的稳定性。
实施例12、p35直接结合CDK5(细胞周期蛋白依赖性激酶5)，调控CDK5的表达CDK5是细胞周期调控激酶家族成员，但并不调控细胞周期，是神经细胞中重要的tau蛋白磷酸化酶。而p35是脑内CDK5的特异性的激活剂。为了研究p35对CDK5的作用，在SH-SY5Y细胞中过表达p35质粒，并通过免疫共沉淀(CO-IP)和WB实验检测CDK5的表达变化。结果如图4中G-I所示，p35确实与CDK5存在相互作用(mean±SEM,n＝6)，且过表达p35显著提高了细胞内CDK5的表达(mean±SEM,n＝6,**P<0.01)。由此证明，p35可能通过与CDK5直接作用，调控CDK5的表达，并进一步影响tau蛋白磷酸化的水平。
实施例13、miR-148a调控CDK5的表达及tau蛋白磷酸化依赖于对p35的调控
为了进一步研究miR-148a调控tau蛋白磷酸化的潜在机理，在细胞内上调miR-148a的表达进行检测p35、p25和CDK5的表达水平。结果如图4中J-K所示，上调细胞内的miR-148a的表达会显著降低p25和CDK5的表达水平，而抑制miR-148a的表达，细胞内p25和CDK5的表达水平较对照组明显升高(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)。当miR-148a表达上调时，p35降低的水平最高，p25次之，CDK5表达下降的幅度最少；同样，当抑制miR-148a表达时，p35升高的幅度最大，p25次之，CDK5表达增加的幅度最少。由此推断，miR-148a通过直接调控p35的表达，继发性影响p25及CDK5，从而对细胞内的tau蛋白磷酸化水平进行调节。
为了验证上述推断，在细胞中同时转染miR-148a和p35。结果如图4中L-N所示，p35的表达上调逆转了miR-148a表达上调所致的tau蛋白磷酸化水平的降低。同样，p35表达上调还可以逆转p35、p25及CDK5表达水平的降低(mean±SEM,n＝4,**P<0.01,***P<0.001,$P<0.05,$$P<0.01,$$$P<0.001)。由此得出结论，miR-148a通过靶向p35进而抑制CDK5所致tau蛋白过度磷酸化最终发挥神经保护作用。
实施例14、APP/PS1小鼠脑内过表达miR-148a改善小鼠认知障碍
APP/PS1小鼠是常用的AD动物模型，可较好的模拟AD进展期病变。选取6月龄的APP/PS1小鼠进行实验。在APP/PS1小鼠脑内注射了腺相关病毒包裹的miR-148a上调小鼠脑内miR-148a的表达，采用Morris水迷宫实验探究miR-148a对小鼠认知的作用。如图5中A-D所示，APP/PS1小鼠所出现的空间学习和记忆障碍可以被miR-148a缓解与改善，具体表现为：在水迷宫定位航行试验中，APP/PS1小鼠的5天潜伏期与WT对照组相比显著延长，而miR-148a处理组的小鼠潜伏期与APP/PS1小鼠相比缩短，在第五天出现显著性差异(mean±SEM,n＝10,*P<0.05)；在空间探索实验中，与WT对照组相比，APP/PS1小鼠停留时间和穿越次数均明显降低，而miR-148a处理组的小鼠与APP/PS1对照小鼠相比，停留时间和穿越次数显著提高(mean±SEM,n＝10,*P<0.05,**P<0.01,$P<0.05,$$$P<0.001)。此外，在5天的定向航行实验中三组小鼠的游泳速度没有差异(mean±SEM,n＝10)。由此可知，miR-148a可以提高AD小鼠的空间学习能力和记忆能力。
实施例15、miR-148a依赖p35显著降低APP/PS1小鼠脑内的tau蛋白磷酸化
基于在细胞水平miR-148a与p35、p25及CDK5调控关系的发现，在整体动物水平进一步检测miR-148a与p35、p25及CDK5的相关性。结果如图5中E-F所示，与WT对照小鼠相比，APP/PS1小鼠海马组织内p35和CDK5的水平显著升高，而miR-148a表达上调的小鼠海马组织内p35及CDK5蛋白水平显著降低(mean±SEM,n＝5,*P<0.05,**P<0.01,$P<0.05,$$$P<0.001)，说明miR-148a在AD模式动物脑中可以调控p35及CDK5的表达。
由于之前在AD模型细胞中发现miR-148a影响tau蛋白过度磷酸化这一病理变化，进一步在AD小鼠海马中观察tau蛋白磷酸化受miR-148a的调控情况。如图5中E&G所示，在APP/PS1小鼠海马中tau蛋白磷酸化水平较野生型小鼠显著增强，而miR-148a表达上调可以显著降低APP/PS1小鼠海马内tau蛋白AT8、Ser199、Ser396及Ser404位点的磷酸化水平(mean±SEM,n＝5,**P<0.01,***P<0.001,$$$P<0.001)。以上结果说明，miR-148a通过调控p35的表达，进而抑制p25及CDK5的表达，改善tau蛋白过度磷酸化水平，改善AD小鼠的认知障碍。
实施例16、mRNA芯片技术检测PTEN(10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物)在AD模式动物及野生型动物脑组织中的差异表达
分别提取1、3、6、9月龄APP/PS1双转基因小鼠及其野生型对照小鼠脑组织RNA并使用Quick Amp Labeling Kit对mRNA进行荧光标记。本实施例涉及的PTEN基因qPCR正向引物：SEQ ID NO.6：attggctgctgtcctgctgtt；反向引物：SEQ ID NO.7：ggttaagtcattgctgctgtgtct。而后利用Agilent Microarray Scanner对芯片进行扫描，利用Agilent Feature Extraction软件进行数据采集与分析。图6中A芯片结果展示了包括PTEN基因在内的6个AD相关基因在不同月龄APP/PS1小鼠中的差异表达情况。其中PTEN基因在1、3、6、9月龄的APP/PS1小鼠脑内显著下调，3月龄的小鼠脑内相对上调幅度最大(mean±SEM，n＝3，fold change＞2)。
实施例17、PTEN在AD模式动物和自然老化动物中的表达变化
为了进一步确证PTEN在AD动物脑组织内的表达变化，对3、6、9月龄APP/PS1小鼠和SAMP8小鼠脑内PTEN蛋白的表达量进行检测。如图6中B-E所示，虽然3、6、9月龄APP/PS1小鼠脑内PTEN蛋白的总量变化不大，但是6、9月龄APP/PS1小鼠脑内磷酸化PTEN蛋白显著降低(mean±SEM,n＝5,*P<0.05)，因此非磷酸化的PTEN蛋白含量所占比例显著提高，证明PTEN活性形式表达增加。同样地，在SAMP8小鼠脑内，3、6、9月龄的小鼠脑内磷酸化PTEN蛋白表达显著下降(mean±SEM,n＝5,*P<0.05)，因此PTEN活性形式表达显著增加。因此推测，PTEN在AD中活性显著上调，可能在AD病变中发挥重要作用。
实施例18、PTEN表达水平的变化对tau蛋白磷酸化的影响
为了探究PTEN与tau蛋白磷酸化的关系，首先使用免疫荧光技术对细胞内PTEN及磷酸化的tau蛋白的定位情况进行分析。结果如图6中F所示，磷酸化的tau蛋白PHF-1主要存在于细胞质中，突触的位置分布较少，而PTEN在细胞质和突触的位置均有分布，两者的表达具有重叠的位置，说明PTEN与磷酸化的tau蛋白含量与分布均密切相关。
为了进一步探究PTEN对tau蛋白磷酸化的影响，在APPswe细胞中导入了PTEN基因。结果如图6中G-H，与对照组相比，PTEN表达上调可以显著提高细胞内tau蛋白AT8、Ser199、Ser396和Ser404位点的磷酸化水平(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)；同样，细胞内PTEN表达下调之后，这些位点的磷酸化水平显著降低(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)。由此推断，PTEN可调控细胞中的tau蛋白磷酸化水平，进而影响AD的病理进程。
实施例19、PTEN信号通路负向调控miR-148a的表达
为了探究PTEN与miR-148a的关系，在APPswe细胞中转染质粒或siRNA以过表达或抑制PTEN基因的表达，采用qPCR的方法检测miR-148a的表达变化。结果如图7中A所示，当PTEN基因过表达时，细胞内的miR-148a表达显著降低；而当PTEN基因表达抑制时，miR-148a表达显著提高(mean±SEM,n＝4,***P<0.001)。提示PTEN可能负向调控miR-148a的表达。
实施例20、PTEN信号通路负向调控Akt(蛋白激酶B)信号通路的表达
PTEN作为Akt信号通路的抑制剂，反向调控Akt下游通路。如图7中B-D所示，在细胞中转染PTEN质粒可以显著降低p-PTEN/PTEN和p-Akt/Akt的比重(mean±SEM,n＝6,**P<0.01)。由此证明，PTEN质粒转染可以提高PTEN的活性而降低Akt的活性。反之，PTEN siRNA可以明显提高p-PTEN/PTEN和p-Akt/Akt的比重，证明PTEN siRNA可以降低PTEN的活性而提高Akt的活性(mean±SEM,n＝6,***P<0.001)。
实施例21、Akt信号通路正向调控miR-148a的表达
为了探究Akt信号通路对miR-148a表达的影响，在细胞中转染Akt表达质粒和AktsiRNA以改变Akt的表达。结果如图7中E所示，Akt表达上调时，miR-148a的表达显著提高，而Akt表达降低时，miR-148a的表达显著下降(mean±SEM,n＝4,**P<0.01,***P<0.001)。同样地，在细胞中加入IGF-1(Akt信号通路的激活剂)和LY294002(Akt信号通路的抑制剂)以提高或降低Akt的表达。结果如图7中F所示，IGF-1处理的细胞与海藻糖处理的细胞相比，miR-148a的表达水平提高了2.5倍；而LY294002处理的细胞，与对照组相比，miR-148a的表达水平降低了一倍(mean±SEM,n＝4,**P<0.01)。由此可知，Akt信号通路的激活能够促进miR148a的表达，即Akt信号通路与miR-148a的表达水平呈现正向调控关系。
实施例22、PTEN/Akt信号通路调控miR-148a的转录
上述实验提示，PTEN/Akt信号通路可能通过调控miR-148a的转录过程从而影响miR-148a的表达。因此构建miR-148a启动子区luciferase质粒，当化学发光值增加时，证明miR-148a转录被促进；而化学发光值降低时，证明miR-148a转录被抑制。结果如图7中G-H所示，与对照组相比，PTEN表达上调显著抑制了miR-148a的转录水平，而PTEN表达下调则显著提高了miR-148a的转录水平(mean±SEM,n＝4,*P<0.05,$$$P<0.001)。过表达Akt将化学发光值提高了2.8倍，加入IGF-1激活Akt信号通路也可以提高2.2倍发光值；反之，抑制Akt的表达显著降低了发光值，加入LY294002抑制Akt信号通路也明显下调了化学发光值(mean±SEM,n＝4,**P<0.01,***P<0.001,$$P<0.01)。上述结果说明，PTEN/Akt信号通路调控miR-148a的转录。
实施例23、CREB(环磷腺苷效应元件结合蛋白)与miR-148a启动子区特异性结合由于PTEN/Akt信号通路可以调控miR-148a的转录，因此对miR-148a的启动子区进行分析。通过Promoter Scan软件发现miR-148a的启动子区可能与CREB结合，图8中A显示CREB与miR-148a的启动子区可能的结合位点。针对预测出的5个位点(图8B)设计引物并应用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验寻找可能直接结合的位点。实验结果如图8中C-D所示，ChIP实验中使用CREB抗体拉下来的DNA进行qPCR后结果证实，CREB抗体拉下的DNA是IgG抗体的5倍以上；琼脂糖凝胶电泳实验证实CREB抗体拉下的DNA的量显著多于IgG抗体，且片段的长度与引物扩增长度一致(mean±SEM,n＝3)。由此推断，CREB可能在转录起始位点后第1217个碱基处与miR-148a启动子区结合。
实施例24、CREB正向调控miR-148a的转录和表达
为了进一步验证CREB能否调控miR-148a的转录，根据结合位点设计双荧光素酶报告基因。结果如图8中E所示，CREB可以提高miR-148a启动子区野生型luciferase质粒的发光值，而对突变型质粒的发光值没有影响(mean±SEM,n＝6,***P<0.001)。应用CREB过表达质粒和CREB siRNA改变细胞内CREB的表达，并应用qPCR的方法检测miR-148a的表达。如图8中F所示，上调CREB的表达水平可将miR-148a的表达提高5倍；反之，当抑制CREB表达时，miR-148a的表达水平显著降低(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)。上述结果提示，CREB不仅可以直接结合miR-148a的启动子区，并且可以调控miR-148a的转录及表达水平。
实施例25、PTEN/Akt信号通路调控CREB的表达
由于CREB可以直接结合miR-148a启动子区，调控miR-148a的转录。结合上述实验结果，进一步研究PTEN/Akt信号通路对CREB的调控作用。首先在细胞中转染PTEN表达质粒和PTEN siRNA，应用WB的方法检测CREB的活性水平的变化。结果如图8中G-H显示，PTEN表达上调时，p-CREB/CREB比重降低一倍；当PTEN表达下降时，p-CREB/CREB比重显著提高(mean±SEM,n＝6,*P<0.05,**P<0.01)。
其次改变细胞中Akt的表达检测CREB的表达变化。实验结果如图8中I-M所示，当Akt表达增加时，或使用IGF-1激活Akt时，p-CREB/CREB比重明显提高，当Akt表达抑制或使用LY294002抑制Akt信号通路时，pCREB/CREB比重显著下调(mean±SEM,n＝6,**P<0.01,***P<0.001)。由此推测PTEN/Akt信号通路是通过调控CREB的表达，进一步影响miR-148a的转录，从而影响tau蛋白的磷酸化。
实施例26、APP/PS1小鼠脑内抑制PTEN的表达可提高小鼠的学习记忆能力
为了进一步研究PTEN在AD中的作用，在APP/PS1小鼠的脑内注射了腺病毒包裹的PTEN siRNA质粒和对照组质粒，注射30天后应用Morris水迷宫实验测试PTEN对AD小鼠学习记忆能力的影响。如图9中A-D所示，5天定向航行试验中，APP/PS1小鼠平台潜伏期便远远超过WT小鼠，证明APP/PS1小鼠出现了学习记忆的障碍；但注射了PTEN siRNA的小鼠显著改善了APP/PS1小鼠的记忆障碍，该组小鼠找到平台的潜伏期明显缩短(mean±SEM,n＝10,*P<0.05)。此外各组小鼠的游泳速度没有差异，排除了由于小鼠身体因素导致的平台潜伏期的差异(mean±SEM,n＝10)。空间探索试验中，APP/PS1对照组小鼠穿越原平台位置的次数及停留在原平台所在象限的时间均显著低于WT对照组，而PTEN siRNA处理的APP/PS1小鼠明显提高了穿越次数与停留时间。证明PTEN基因的抑制可以提高痴呆小鼠的空间学习能力和记忆能力(mean±SEM,n＝10,*P<0.05,***P<0.001,&P<0.05)。
实施例27、抑制APP/PS1小鼠脑内PTEN的表达可提高miR-148a的表达
应用qPCR的方法检测小鼠脑内的miR-148a的表达水平，结果如图9中E-F所示，APP/PS1小鼠的皮层和海马内miR-148a的表达均显著降低，而PTEN siRNA处理后miR-148a的表达显著增加(mean±SEM,n＝5,*P<0.05,&P<0.05,&&P<0.01)，提示在AD小鼠脑内抑制PTEN的表达可以提高miR-148a的表达水平。
实施例28、抑制APP/PS1小鼠脑内PTEN的表达可降低tau蛋白磷酸化水平
应用WB的方法检测上述3组小鼠海马中的tau蛋白磷酸化水平。实验结果如图9中G-H所示，APP/PS1小鼠海马中tau蛋白AT8、Ser396、Ser404及Ser199磷酸化位点的水平显著提高，而PTEN siRNA处理的小鼠海马中上述磷酸化位点的磷酸化水平显著下降(mean±SEM,n＝5,**P<0.01,***P<0.001,&&&P<0.001)。证明在AD小鼠脑中抑制PTEN的表达可以改善tau蛋白过度磷酸化。
实施例29、抑制APP/PS1小鼠脑内PTEN的表达可激活Akt/CREB信号通路
同样地，应用WB的方法检测小鼠海马中Akt/CREB信号通路的表达变化。结果如图9中G&I所示，在APP/PS1小鼠脑内，PTEN活性形式显著增加，Akt/CREB信号通路显著抑制；PTEN siRNA处理组的小鼠的海马组织p-Akt及p-CREB的表达显著增加，Akt/CREB信号通路激活(mean±SEM,n＝5,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,&P<0.05)。由此可知，在脑内抑制PTEN的表达，可以激活Akt/CREB信号通路，促进细胞的存活和学习记忆的改善。
本发明实施例1至实施例29的试验结果表明，miRNA148簇的微小RNA在认知障碍相关疾病AD和VaD病理进程中表达显著降低，而外源性提高miRNA 148a的表达会起到神经保护的作用。
特别地，在AD病理过程中，表达上调的PTEN能够抑制Akt的磷酸化，继而遏制CREB的磷酸化，减少miR-148a的转录表达，增加p35、p25和CDK5的表达，促进tau蛋白磷酸化，导致认知障碍；而抑制PTEN的表达能够激活Akt/CREB的磷酸化，促进miR-148a的转录，遏制p35、p25和CDK5的表达，从而抑制tau蛋白磷酸化，改善认知功能障碍。因此，miRNA 148簇的微小RNA有望成为认知障碍相关疾病诊治的新靶点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Figure BDA0002605880250000181
Figure BDA0002605880250000191
序列表
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用
<130> GG20803788A
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaggcaaagu ucugagacac uccgacucug aguaugauag aagucagugc acuacagaac 60
uuugucuc 68
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ucagugcacu acagaacuuu gu 22
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacaaag 50
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
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<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
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<210> 7
<211> 24
<212> DNA
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<400> 7
ggttaagtca ttgctgctgt gtct 24

Claims (2)

1.miRNA 148作为制备诊断血管源性痴呆的物质的应用，所述miRNA148是hsa-miR-148a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.miRNA 148作为制备诊断血管源性痴呆的物质的应用，所述miRNA148是hsa-miR-148a-3p，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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