[go: up one dir, main page]

CN111944778B - 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111944778B
CN111944778B CN202010817256.7A CN202010817256A CN111944778B CN 111944778 B CN111944778 B CN 111944778B CN 202010817256 A CN202010817256 A CN 202010817256A CN 111944778 B CN111944778 B CN 111944778B
Authority
CN
China
Prior art keywords
arg
gly
ala
asp
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN202010817256.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111944778A (zh
Inventor
宋小平
王雅洁
王蔷
蔡晶晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University filed Critical Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Priority to CN202010817256.7A priority Critical patent/CN111944778B/zh
Publication of CN111944778A publication Critical patent/CN111944778A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111944778B publication Critical patent/CN111944778B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用。通过对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生酶进行S2P、S23V、Y24N、R215A、K294L；S2P、S23V、Y24N、R215A、H289Y；或S23V、Y24N、R215A、K269D、H289Y定点突变获得所述突变体。三个突变酶的比活分别是野生酶MTG‑WT的1.9倍、2.4倍、1.4倍，热稳定性优于野生酶。

Description

谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase，TG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰基转移反应，是一种有效的蛋白质交联剂。TG广泛分布于人体、哺乳动物、植物和微生物等体内，其中，微生物的谷氨酰胺转胺酶（MicrobialTransglutaminase，MTG）由于具有低蛋白分子量、非Ca2+依赖性和较广的底物范围等较优的酶学性质，在食品工业、生物医药、组织工程、定点蛋白交联和同源抗体偶联药物的构建等行业均具有广泛的应用价值。对于一些应用，包括热塑性加工的挤压和热稳定微胶囊产生固定化酶，在较高的温度和较高的活性下进行交联反应更有利。因此，具有更高活性和热稳定性的突变体不仅有望在当前工艺中使用，而且有望扩大新应用的范围。
谷氨酰胺转胺酶的分子改良方面主要集中在热稳定性机理研究及改良。现有关于谷氨酰胺转胺酶的热稳定性研究主要集中在单点突变，组合突变的研究偏少，对于毕赤酵母分泌重组MTG中发生蛋白降解的研究未见报道，减少分泌蛋白降解是否会影响酶活及热稳定性、影响机制是什么，这些问题均未见报道。
发明内容
基于已报道的谷氨酰胺转胺酶的热稳定性偏低、发酵过程目的蛋白易降解等问题，本发明提供了一种谷氨酰胺转胺酶突变体。
本发明的目的是提供热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体。
本发明的再一目的是提供编码上述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供制备热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体的应用。
根据本发明的热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型谷氨酰胺转胺酶进行以下定点突变而得：
S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L；
S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y；或
S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y。
根据本发明的具体实施方式的突变体Mut1（S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L）的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据本发明的具体实施方式的突变体Mut2（S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y）的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
根据本发明的具体实施方式的突变体Mut3（S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y）的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因。
本发明还提供了包含上述编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组载体。
本发明还提供了包含上述编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组细胞。
根据本发明的制备所述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，包括以下步骤：
构建包含编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组载体；
将所述重组载体导入宿主细胞中，诱导表达，获得高催化效率谷氨酰胺转胺酶。
根据本发明的具体实施方式，对成熟的谷氨酰胺转胺酶MTG-WT的S2、S23、Y24、K269、R215、H289、K294等位点突变，组合成含五个氨基酸突变位点的突变体三个，将突变体重组载体转化毕赤酵母pPIC9k-pro/GS115，小摇管诱导表达，结果显示三个突变体的小管上清的活性都比野生酶高。
对酶活高的克隆进行1L摇瓶表达，诱导72h，每24h取样，SDS-PAGE检测。结果显示，215位点未突变的三个突变体MTG-Mut（R215），在诱导24h开始出现降解，72h降解明显，而215位点突变的突变体MTG-Mut（A215），在诱导48h内没有降解，诱导72h开始出现少量降解。研究表明，将R215突变成A215，诱导时间控制在72h，分泌蛋白的降解大大减少。为该酶的产业化生产提供发酵工艺参数。
对三个突变酶和野生酶的蛋白浓缩纯化后进行了基本酶学性质的测定，以N-CBZ-Gln-Gly为底物测定发现，三个突变体最适反应温度都是 55ºC。三个突变酶的比活分别是野生酶MTG-WT的1.9倍、2.4倍、1.4倍。三个突变酶在60ºC的酶活均是其最高酶活60%以上；当反应温度为70ºC时酶活仍达到最高酶活的10%以上。在50ºC半衰期分别是野生酶的9.4倍、11.6倍、9.8倍，60ºC半衰期分别是野生酶的6.1倍、10.2倍和8.7倍。Mut2的热稳定性最高，60ºC下半衰期为27.6min。
本发明证明确认了成熟酶MTG的关键催化相关的位点为S2、H289，并证明了该位点对于该酶高催化效率的重要性，即S2、H289位点在该酶的高催化效率中扮演着重要的角色；确认了S23、24N、K269、H289位点与该酶的热稳定性有关。同时发现R215突变为A215，有效地抑制了源于毕赤酵母的Kex2蛋白酶对目的蛋白的水解。对于毕赤酵母表达含KR(aagaga)序列的分泌蛋白，若该序列位于蛋白表面，可能会被来源于毕赤酵母的Kex2蛋白酶水解，导致分泌蛋白在发酵液中不稳定。对目的蛋白中的KR氨基酸序列进行突变，避免了Kex2蛋白酶特异性识别并切割分泌蛋白表面的碱性氨基酸残基对中的羧基端肽键，解决了毕赤酵母分泌蛋白中的降解问题。
附图说明
图1为 MTG-WT（R215）和MTG-MUT（A215）的215位氨基酸突变示意图；
图2为 215位氨基酸未突变的三个突变体MTG-Mut（R215）发酵上清的电泳图；
图3为 215位氨基酸突变的MTG-Mut2（A215）发酵上清的电泳图；
图4显示温度对酶活性的影响；
图5为50℃，60℃保温不同时间的残余活力-时间关系图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的描述。
材料与方法
1、菌株和质粒：质粒载体pPIC9k-pro，pPICZa-mtg和重组菌株pPIC9k-pro/GS115及pro/ mtg(GS115)；
2、酶、抗体及其他生化试剂：N-carboxybenzoyl-L-glutaminyl-glycine (N-CBZ-Gln-Gly)和L-谷氨酸-γ-单羟胺酸购自Sigma-Aldrich公司；anti-MTG购自Eurogentec 公司。MUT ExpressⅡ Fsat Mutagenesis kit V2 购自南京诺唯赞生物科技公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)；
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1 .34％YNB，0.00004％Biotin；
(4)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1.0％甲醇(V/V)。）。
实施例1 谷氨酰胺转胺酶突变基因的获得
表1 以人工合成的Mut1的基因（mtg1）为模板的突变体构建引物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Mut1的基因（mtg 1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，mtg 1基因的5'端引入XhoⅠ位点(CTCGAG)和Kex2肽链内切酶识别位点（aaaaga），3'端引入NotⅠ位点(GCGGCCGC)和6×His标签序列(ATGGTGATGGTGATGATG)，标签序列主要是便于纯化重组蛋白。人工合成mtg 1基因克隆到pUC57载体中，mtg为993bp。
Mut2，Mut3基因（mtg 2， mtg 3）是以pUC57-mtg1为模板，使用Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增目标质粒，目标质粒扩增产物经DpnI消化、ClonExpress®重组环化后直接进行转化，具体操作步骤参照突变试剂盒(MUT ExpressⅡ FsatMutagenesis kit V2)使用说明。挑选阳性转化子，提取质粒测序，将测序正确的突变体质粒（pUC57-mtg1, PUC57-mtg2, PUC57-mtg3)转化感受态细胞E. coli TOP10。
实施例2 谷氨酰胺转胺酶突变体重组载体的构建
分别使用限制性内切酶XhoⅠ和NotI双酶切突变体质粒和表达载体pPICza，胶回收酶切产物，连接酶连接回收产物，转至E. coli TOP10感受态细胞，均匀涂布到含50 μg/mLZeocin抗性的LLB平板上，37 oC培养过夜，长出单克隆。测序正确的质粒命名为pPICZα-mtg1,其余3个依次编号。将测序正确的突变体重组载体转化表达宿主pPIC9k-pro/GS115（表达前导肽pro peptide或PRO)。
实施例3 谷氨酰胺转胺酶突变体重组菌株的构建
将构建成功的三个突变体重组载体pPICZα-mtg-mut分别用SpeⅠ线性化并电转化到pPIC9k-pro/GS115（提前制备感受态），获得重组酵母菌株GS115（pro/mtg-mut）。
挑取含有重组质粒的菌株GS115（pro/mtg-mut），接种于4mL BMGY培养基的培养小管中，置于28℃，200rpm摇床培养48h；然后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用4mL含有1.0％甲醇的BMMY培养基重悬，并置于25℃，200rpm条件下诱导培养48h。最后取上清检测酶活性。小摇管诱导表达结果显示三个突变体的小管上清的活性都比野生酶高。
挑取上清酶活最高的GS115（pro/mtg-mut）菌液60μL到5 mL YPD液体培养基中，摇瓶过夜培养，全部转接到50mL BMGY（pH=6.0）的摇瓶中，28 ℃、200 r/min培养过夜，24 h后测OD600，当OD600达到6时，3000g离心5min收集菌体，用200 mL的BMMY（甲醇1%，pH = 6.0）重悬菌体后诱导表达，初始OD600 = 1.0–1.5，诱导温度25 ℃，诱导72h，每隔24 h补加一次甲醇至终浓度为1% (V/V )，同时取上清检测酶活性。发酵结束，对重组谷氨酰胺转胺酶突变酶和野生酶进行纯化。结果显示，215位点未突变的三个突变体MTG-Mut（R215），在诱导24h开始出现降解，72h降解明显（如图2）。而215位点突变的突变体MTG-Mut（A215），在诱导48h内没有降解，诱导72h开始出现少量降解（如图3）。研究表明，将R215突变成A215，诱导时间控制在72h，分泌蛋白的降解大大减少。为该酶的产业化生产提供发酵工艺参数。
实施例4 重组谷氨酰胺转胺酶突变体和野生型的表达活性分析
为了比较突变体MTG和野生型MTG的酶活性，以N-苄基羰基- L-谷氨酰胺-甘氨酸(N-CBZ-Gln-Gly, Sigma)为底物，采用异羟肟酸比色法测定MTG酶活。异羟肟酸比色法测定MTG酶活，1个单位的酶活定义为：37oC时MTG每分钟催化底物 (α-N-CBZ-Gln-Gly, Sigma)生成1µmoL L-谷氨酸-单羟胺酸（氧肟酸）所用的酶量（U/mL）。将实施例3的纯化的重组谷氨酰胺转胺酶突变酶和野生酶进行酶学性质检测。
1、重组谷氨酰胺转胺酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下：
最适反应温度检测：MTG及其突变体的最适温度是通过测定20~70ºC范围内，分别测定 20、30、37、50、60、70ºC 的MTG酶活，并确定出一个较窄的最适反应温度范围，然后再以5ºC为梯度确定最适反应温度。测活方法按照上述方法进行，底物 N-CBZ-Gln-Gly 终浓度为30mmol/L，20mmol/L Tris 缓冲液在各自的温度下调节pH值至6.0。以温度对活力作图，得到温度-活力曲线（图4）。结果表明，三个突变体Mut1、Mut2和Mut3在20~70ºC 的酶活变化情况基本一致，最适反应温度都是 55ºC，而野生型MTG的最适反应温度为50°C。
2、重组谷氨酰胺转胺酶突变体和野生型的热稳定性和半衰期检测方法如下：
热稳定性测定：将纯化后的MTG及其突变体稀释到同一浓度，分别在50℃，60℃水浴保温不同时间，然后置于冰上冷却10min，按照上述方法测定酶的残余活力。分别作50℃，60℃保温不同时间的残余活力-时间关系图（图5）。结果表明所有突变酶在50℃处理5h后，酶活均是其最高酶活的50%以上；而野生型在50ºC处理1h后，酶活已降至其最高酶活的50%。所有突变酶在60℃处理10min，酶活仍达到最高酶活的60%以上；而野生型在60ºC处理10min，酶活达不到其最高酶活的10%。在50ºC和60ºC下的残余酶活百分比下降规律为：Mut2＜Mut3＜Mut1＜WT。上述结果表明，与WT相比，所有突变体的热稳定有不同程度的升高，Mut2的热稳定性最高，Mut3次之。
半衰期检测(t 1/2)：根据图5结果，作Ln(残余活力)-时间关系图，并进行线性拟合，所得斜率即为酶在该温度下的一级失活常数（k d）。酶在50ºC和60ºC下的半衰期（t 1/2）由公式 t 1/2 = Ln2/k d求出（表2）。
表2突变体与野生酶的酶学性质比较
Figure 572201DEST_PATH_IMAGE003
序列表
<110> 安徽医学高等专科学校
<120> 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 2
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Pro Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Val Asn Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Leu Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 3
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Pro Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Val Asn Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
Tyr Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 4
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Val Asn Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Asp Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
Tyr Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330

Claims (6)

1.热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型谷氨酰胺转胺酶进行以下定点突变而得：
S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L；
S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y；或
S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y。
2.一种谷氨酰胺转胺酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体。
3.包含权利要求2所述谷氨酰胺转胺酶基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述谷氨酰胺转胺酶基因的重组细胞。
5.权利要求1所述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体作为蛋白质交联剂的应用。
6.一种制备热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建包含权利要求2所述谷氨酰胺转胺酶基因的重组载体；
将所述重组载体导入宿主细胞中，诱导表达，分离纯化获得所述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶。
CN202010817256.7A 2020-08-14 2020-08-14 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用 Expired - Fee Related CN111944778B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010817256.7A CN111944778B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010817256.7A CN111944778B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111944778A CN111944778A (zh) 2020-11-17
CN111944778B true CN111944778B (zh) 2022-06-21

Family

ID=73343131

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010817256.7A Expired - Fee Related CN111944778B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111944778B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112553176B (zh) * 2020-12-29 2022-04-29 江南大学 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
CN112553177B (zh) * 2020-12-29 2022-04-01 江南大学 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
EP4414454A4 (en) * 2021-10-07 2025-10-01 Amano Enzyme Inc MODIFIED TRANSGLUTAMINASE

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006931A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Novo Nordisk A/S Microbial transglutaminases, their production and use
CN1377413A (zh) * 1999-09-30 2002-10-30 味之素株式会社 转谷氨酰胺酶的制备方法
CN101126097A (zh) * 2007-07-09 2008-02-20 江南大学 一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达
CN101679503A (zh) * 2007-02-22 2010-03-24 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 特异性提高的转谷氨酰胺酶变体
CN107739734A (zh) * 2017-10-26 2018-02-27 江南大学 一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体
CN109943546A (zh) * 2019-04-12 2019-06-28 天津科技大学 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7101695B2 (en) * 2002-03-01 2006-09-05 Szu-Yi Chou Method of producing transglutaminase having broad substrate activity

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996006931A1 (en) * 1994-08-26 1996-03-07 Novo Nordisk A/S Microbial transglutaminases, their production and use
CN1377413A (zh) * 1999-09-30 2002-10-30 味之素株式会社 转谷氨酰胺酶的制备方法
CN101679503A (zh) * 2007-02-22 2010-03-24 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 特异性提高的转谷氨酰胺酶变体
CN101126097A (zh) * 2007-07-09 2008-02-20 江南大学 一种吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶酶原基因及其表达
CN107739734A (zh) * 2017-10-26 2018-02-27 江南大学 一种酶活提高的谷氨酰胺转氨酶突变体
CN109943546A (zh) * 2019-04-12 2019-06-28 天津科技大学 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Construction, expression, purification, characterization, and structural analysis of microbial transglutaminase variants;Xiaoping Song et al.;《Biotechnol Appl Biochem.》;20211211;第1-10页 *
Improvement of the activity and thermostability of microbial transglutaminase by multiple-site mutagenesis;Dongdong Mu et al.;《Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry》;20181231;第82卷(第1期);第106-109页 *
微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的分子生物学研究进展;叶梦情等;《中国农学通报》;20130825;第29卷(第24期);第138-142页 *
重组谷氨酰胺转胺酶突变体的表达、分离纯化及其催化应用;宋小平 等;《食品与发酵工业》;20211231;第47卷(第23期);第46-51页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111944778A (zh) 2020-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106676086B (zh) 一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因
CN111944778B (zh) 谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用
US10968439B2 (en) Xylanase mutant
CN111434770B (zh) 蛋白质谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌中的表达和自加工
CN108913671B (zh) 一种ω-转氨酶突变体及其应用
CN103343113A (zh) 一种热稳定性改良的木聚糖酶XynAS9-m突变体V81P/G82E及其基因和应用
CN116970067A (zh) 一种提高人血清白蛋白重组表达水平的策略
CN118561987A (zh) 一种可自组装的重组胶原蛋白及其制备方法与应用
CN113151330B (zh) 一种酸性蛋白酶突变体及其制备方法和应用
CN113122526B (zh) 腈水合酶赖氨酸突变体hba-k1、编码基因及应用
CN114736881B (zh) 酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用
CN114107270B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体
US7501262B2 (en) Promoters and gene expression method by using the promoters
CN112824527A (zh) 人工设计的赖氨酰内切酶及编码序列和发酵方法
CN114395543B (zh) 一种海藻糖合酶突变体及其应用
CN104073510A (zh) 一种制备耐热脂肪酶的方法及其专用表达载体
JP2020522999A (ja) グルコースオキシダーゼＣｎＧＯＤＡ及びその遺伝子ならびに使用
CN107653257A (zh) 一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的编码基因、重组表达载体及应用
CN113481183A (zh) 一种海洋微生物脂肪酶嵌合体及其构建方法和应用
CN106754768B (zh) 一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法
CN116970592B (zh) 热稳定性提高的氨肽酶突变体及其应用
CN116200374B (zh) 热稳定性提高的d-氨甲酰水解酶突变体及其在d-氨基酸合成中的应用
CN119552846B (zh) 一种稳定性提高的酸性蛋白酶突变体及其产品和应用
CN111235138B (zh) 木糖异构酶及其编码基因和制备方法、载体和宿主细胞以及他们的应用
CN119776294B (zh) 谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其在催化合成谷胱甘肽中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220621