CN111939250B

CN111939250B - 一种预防covid-19的疫苗及其制备方法

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Publication number: CN111939250B
Application number: CN202010827992.0A
Authority: CN
Inventors: 程振国; 王尧河
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111939250A

Abstract

一种预防COVID‑19的疫苗，所述的新型疫苗的抗原的核苷酸序列为SEQ NO:1，氨基酸序列为SEQ NO:2，本发明的疫苗的抗原包含两个功能部分：可诱导特异性中和抗体的S蛋白受体结合结构域和可诱导激活效应T细胞的T细胞相关N蛋白截短肽段；本发明的疫苗具有以下特征：T细胞相关N蛋白截短肽段诱导N蛋白抗体的产生能力弱，能够使用N抗体鉴别疫苗接种者和新冠感染患者，疫苗抗原不诱导N蛋白抗体的产生，能够减少肺损伤，更加安全；本发明的细胞疫苗造价低，且能够诱导产生病毒特性中和抗体和T细胞免疫反应。

Description

一种预防COVID-19的疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种预防COVID-19的疫苗及其制备方法。

背景技术

SARS-CoV2也称为2019-nCoV，是一种新型的冠状病毒科Sarbecovirus亚属的RNA病毒，导致了2019新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的全球流行。截至8月10日，全球病毒感染人数已超过1986万人，死亡人数超过73万。目前有139种候选疫苗在临床前评估，25种候选疫苗正在临床评估或临床试验中，其中部分疫苗如重组腺病毒载体疫苗、灭活疫苗已进入II期临床试验并显示出令人鼓舞的结果，然而当前各类疫苗的抗原设计仍存在一些不足，需进一步优化。例如部分人群体内存在较高5型腺病毒（Ad5）的中和抗体，抑制了基于Ad5新冠疫苗的疗效；灭火疫苗可诱导机体产生大量非中和抗体，存在潜在安全风险，同时疫苗刺激机体产生的N蛋白抗体会对感染患者的血清学诊断造成干扰。

刺突蛋白（S蛋白）是SARS-CoV2表面的关键蛋白，主要由S1和S2两部分组成。其中S1中的受体结合结构域（RBD）能够与宿主细胞表面受体-血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，触发S蛋白同源三聚体的构象变化及病毒-宿主细胞膜间的融合，使病毒进入宿主细胞并复制增殖，因此S蛋白是当前疫苗设计和抗病毒治疗的主要靶标。然而，最近的血清学检测结果显示，COVID-19患者的血清中含有高滴度的S1特异性抗体，而针对S蛋白RBD的抗体却很低。同时部分SARS-CoV-2感染者无法产生长久的S蛋白的抗体，提示单独针对S蛋白的疫苗可能存在脱效风险，疫苗设计仍需改进。抗体依赖性感染增强（ADE）是指一些病毒特异性抗体（通常为非中和抗体）与病毒结合后，通过抗体Fc片段与表达FcR（Fc受体）的特定细胞结合，进而增强病毒感染的现象，它与抗病毒疫苗的安全性密切相关。研究表明SARS-CoV2的受体结合结构域（RBD）可引发有效的中和反应，而无明显的ADE现象，提示受体结合结构域是开发基于S蛋白疫苗的理想候选区域。

体液免疫（特别是中和抗体的产生）和T细胞免疫是机体控制和清除感染性病原微生物的主要防御反应。COVID-19临床数据表明，康复期患者的PBMC中存在大量针对SARS-CoV2抗原的特异性T细胞，表明增强特异性抗病毒T细胞反应将有助于预防SARS-CoV2感染。核衣壳蛋白（N）是SARS-CoV2感染后表达最为丰富的蛋白之一，与SARS-CoV N蛋白高度同源。研究发现，SARS-CoV 感染者体内存在大量针对病毒N蛋白的记忆性T细胞，这些T细胞可以在体内长期存在，并能够与SARS-CoV2 的N蛋白发生交叉反应。SARS相关研究也表明，接种N蛋白疫苗可诱导机体产生特异性抗病毒抗体和T细胞免疫反应，抑制病毒感染，提示N蛋白可诱导机体产生较强免疫反应，可作为潜在疫苗靶点。然而，动物实验发现，使用SARS-CoV全长N蛋白作为疫苗时，可诱导机体产生大量N蛋白抗体，导致小鼠肺损伤加剧，提示基于N蛋白的疫苗需克服N抗体产生问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种预防COVID-19的疫苗及其制备方法。

本发明主要提供了一种针对COVID-19嵌合疫苗及其制备方法，为新型冠状病毒或高度同源变异体的预防提供一种新的有效选择。

一种预防COVID-19的疫苗，所述的疫苗的抗原的核苷酸序列为SEQ NO:1，氨基酸序列为SEQ NO: 2。

所述的疫苗抗原主要由三部分组成，编码SARS-CoV2 的受体结合结构域的核苷酸序列 SEQ NO:3、编码自切割肽T2A的核苷酸序列SEQ NO:4，以及编码N蛋白T细胞反应肽段的核苷酸序列SEQ NO:5。

所述的编码SARS-CoV2 的受体结合结构域的多核苷酸进行密码子优化，氨基酸序列为 SEQ NO:6；自切割肽T2A氨基酸序列为SEQ NO:7；N蛋白T细胞反应肽段氨基酸序列为SEQ NO:8。

所述的编码SARS-CoV2 的受体结合结构域为RBD，编码N蛋白T细胞反应肽段为Ntap。

一种如上所述的预防COVID-19的疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）首先构建能分泌表达GP96-hFc的慢病毒载体，感染并筛选出能稳定分泌表达GP96-hFc的HEK293T的细胞系，核苷酸序列见序列SEQ NO:9，蛋白序列见SEQ NO:10；

（2）构建能嵌合表达SARS-CoV2 的S蛋白受体结合结构域和截短的N蛋白T细胞相关肽段的慢病毒载体，并在步骤1）的基础上筛选出能分泌表达GP96-hFc同时嵌合表达SARS-CoV2 的结合结构域和截短的N蛋白T细胞相关肽段的HEK293T的细胞系；

（3）在无菌的条件下收集步骤2）所得的细胞，并用无菌的生理盐水或PBS清洗，调整细胞浓度为1×10⁶~1×10⁷/100μL，得到预防COVID-19的疫苗。

所述的步骤（3）中的预防COVID-19的疫苗为活细胞、丝裂霉素B或放射线处理细胞及细胞裂解液。

所述的HEK293T的细胞系可替换为满足抗原表达的同源或异源细胞。

一种如上所述的预防COVID-19的疫苗的免疫接种方法，给个体皮下或肌肉注射含预防COVID-19的疫苗抗原的细胞疫苗，给药一次或多次，所述的预防COVID-19的疫苗注射前应保存于-80℃或液氮中备用。

一种如上所述的疫苗在制备预防SARS-CoV2病毒的药物。

本发明的一种针对SARS-CoV2的免疫接种方法，其包括给个体皮下（或肌肉）注射含本发明抗原的细胞疫苗，进一步的，可以给药一次，也可以多次，具体实施情况可根据具体实际情况改变或调整免疫次数或免疫时间点。

本发明所构建的融合抗原可以被进一步加工为DNA疫苗、RNA疫苗、蛋白疫苗或重组病毒疫苗。

本发明所含的核衣壳蛋白T细胞反应肽段保守性高，与SARS-CoV病毒高度同源，同时该肽段能够诱导机体产生T细胞免疫反应，抗体诱导能力弱。

本发明所含的核衣壳蛋白T细胞反应肽段抗体诱导能力弱，可以用于疫苗接种者与SARS-CoV2感染的鉴别诊断。

本发明还提供了一种有效的新型细胞疫苗在预防新型冠状病SARS-CoV2病毒的用途。该细胞中表达融合型的疫苗抗原，同使用分泌型GP96-hFc（GP96与人IgG1 Fc片段的融合蛋白）作为免疫增加剂。

本发明的有益效果是：本发明的疫苗的抗原包含两个功能部分：可诱导特异性中和抗体的S蛋白受体结合结构域和可诱导激活效应T细胞的T细胞相关N蛋白截短肽段；本发明的疫苗具有以下特征：T细胞相关N蛋白截段肽段诱导N蛋白抗体的产生能力弱，能够使用N抗体鉴别疫苗接种者和新冠感染患者，疫苗抗原不诱导N蛋白抗体的产生，能够减少肺损伤，更加安全；本发明的细胞疫苗造价低，且能够诱导产生病毒特异性中和抗体和T细胞免疫反应。

附图说明

图1为SARS-CoV2的S蛋白的生物信息学分析，其中（A）显示了S蛋白的主要功能结构域；（B）基于SARS-CoV2 RBD 3D结构预测的潜在B细胞抗原表位分布；（C）SARS-CoV2 S全长蛋白潜在线性B细胞表位分布；（D）左图显示SARS-CoV（蓝色）与SARS-CoV2 （绿色）潜在B细胞抗原在3D结构中的位置（SARS-CoV抗原标记为紫色，SARS-CoV2抗原标记为红色），右图为SARS-CoV2受体结合结构域和ACE2受体之间相互作用模型，黄色部分为RBD区与受体ACE2结合的关键位点。

图2为SARS-CoV2与SARS-CoV的比较，（A）SARS-CoV2和SARS-nCoV 刺突蛋白的S1和S2功能域的同源性分析；（B）SARS-CoV2和SARS-nCoV刺突蛋白不同位点的分布。（C）基于SARS-CoV RBD 3D结构预测的潜在B细胞抗原表位分布；（D）SARS-CoV S全长蛋白潜在线性B细胞表位分布。

图3（A）具有SARS-CoV2野生序列的刺突蛋白和核衣壳蛋白的质粒在人HEK-293T中的表达；（B）SARS-CoV2刺突蛋白野生型序列及经密码子优化（opt）后序列的表达。

图4 SARS-CoV2和SARS-nCoV核衣壳蛋白的同源性分析。

图5 SARS-CoV2核衣壳蛋白（N）表位分析，其中（A）N蛋白潜在B细胞表位；（B）N蛋白的潜在MHCI结合肽分布；（C）SARS-CoV N蛋白的功能域及其抗体表位图。

图6 嵌合体疫苗抗原的表达与抗体识别特征，其中（A）为SARS-CoV2的嵌合疫苗的骨架模式图；（B）使用SARS-CoV2恢复患者抗血清、抗SARS-CoV2 RBD商业化多克隆抗体及抗SARS-CoV2核衣壳的商业抗体分析不同抗体对SARS-CoV2衍生蛋白和嵌合疫苗抗原的识别特征。

图7为，不同COVID-19患者恢复期血清（5例）针对SARS-COV2衍生蛋白和嵌合疫苗抗原的识别特征。

图8 使用T2细胞验证Ntap区域3种多肽与人源HLA- A * 0201分子的结合。

图9 基于细胞的新型融合疫苗抗原表达的验证，其中（A）使用免疫细胞化学实验检测嵌合细胞疫苗（C-Vac）中gp96-Fc蛋白的表达；（B）使用Western-Blot检测不同抗体对嵌合细胞疫苗（C-Vac）抗原的识别特征。

图10使用金黄仓鼠评价嵌合疫苗（C-Vac）有效性和安全性。使用不同处理的HEK293T细胞疫苗（未处理的活细胞，丝裂霉素C处理的细胞和冻融细胞裂解液）对叙利亚仓鼠进行免疫接种，通过假病毒感染试验评估免疫后第7天（A）和第21天（第14天进行第二次免疫）（B）中和抗体表达；（C）苏木素-伊红（HE）检测初次免疫第7天仓鼠肺改变;（D）使用表达融合抗原的仓鼠源肾脏细胞BHK21的成瘤大小评估病毒特异性T细胞反应。

具体实施方式

（1）首先构建能分泌表达GP96-hFc的慢病毒载体，感染并筛选出能稳定分泌表达GP96-hFc的HEK293T的细胞系，所述GP96-hFc的核苷酸序列如SEQ NO:9所示，蛋白序列如SEQ NO:10所示；

（2）构建能嵌合表达SARS-CoV2 的受体结合结构域和截短的N蛋白T细胞相关肽段的慢病毒载体，并在步骤1）的基础上筛选出能分泌表达GP96-hFc同时嵌合表达SARS-CoV2的受体结合结构域和截短的N蛋白T细胞相关肽段的HEK293T的细胞系；

实施例1：SARS-CoV2的S蛋白的生物信息学分析

通过参考SARS-CoV相关研究及UniProt公共数据可将SARS-CoV2的S蛋白分为多个功能结构域；可见S蛋白主要由S1和S2亚基组成（图1A），其中S1中的受体结合结构域（RBD）能够与血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合触发同源三聚体的构象变化，而S2亚基可进一步形成六螺旋束，促进病毒与宿主细胞膜的融合。使用Discospe软件分析SARS-CoV2 S蛋白受体结合结构域的潜在基于3D 结构的B细胞抗原（图1B），用IEDB数据库分析SARS-CoV2全S蛋白的潜在线性B细胞表位（图1C），可见基于结构的B 抗原较少，而线性B细胞抗原较为丰富。将来自SARS-CoV2（PDB：6LZG）和SARS-CoV（PDB：2GHW）的RBD域的结构使用3D-Match（http :www.softberry.commberry.phtml）进行比较，并使用Discovery Studio进行显示可发现位于受体结合结构域中潜在3D B细胞抗原（SARSCoV2：红色，SARS-CoV：紫色）主要位于受体结合结构域与ACE2受体相互作用的区域（图1D）。

通过使用MegAlign软件分析显示SARS-CoV和SARS-CoV-2之间的S1亚基同源性低于S2亚基（67.1％对90％）（图2A），进一步对差异氨基酸进行标记（红色）（图2B）可见SARS-CoV和SARS-CoV-2的残基差异很大，提示单纯基于S蛋白的疫苗会随着因RBD区位点的突变造成疫苗保护作用减弱。图2C为Discospe软件分析SARS-CoV S蛋白受体结合结构域的潜在基于3D 结构的B细胞抗原，图2D为使用IEDB数据库分析SARS-CoV全S蛋白的潜在线性B细胞表位，可发现SARS-CoV2的RBD的免疫原性比SARS-CoV的RBD弱，这可能是SARS-CoV2如此广泛传播的原因。

实施例2：SARS-CoV2 刺突蛋白与核衣壳蛋白表达的验证

由Sangon Biotech按照NCBI数据库公布序列（（MN908947.3）合成SARS-COV的S蛋白基因（SEQ NO:11）及SARS-COV2的核衣壳蛋白（SEQ NO：12），并构建至pcDNA3.1-his标签（hygro）载体中。密码子优化的SARS-CoV2质粒购自Sino Biological。使用下述引物分别构建PCDNA3.1-his-optS，PCDNA3.1-his-optS1、PCDNA3.1-his-optNRBD（从N末端到RBD结构域）表达。

Spike-optF（密码子优化）：ACTTAATTAAGCCACCATGTTTGTGTTCCTGGTGCTGCT，

Spike-opt-R：TAACCGGTGGTGTAGTGCAGTTTCACTCCTTTCA；

Spike-optS1-R：TAACCGGTGCTGTTGGTCTGGGTCTGGTAGG；

Spike-optNRBD-R：TAACCGGTTCCATTGAAGTTGAAGTTCACACACTT；

使用PEI将相应表达质粒转染至HEK-293T细胞中，使用Western Blot 方法检测相应基因的表达。Western Blot步骤如下:

在冰上用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，并用含1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris•HCl，pH 7.4，0.1％SDS，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA）在冰上溶解细胞10分钟，在4°C以13000 rpm离心30分钟来澄清细胞裂解液，然后通过10％SDS-PAGE分离25 ug总蛋白，并转移至PVDF膜（Millipore）。将膜用5％脱脂奶封闭，并按照抗体制造商的说明孵育一抗，TBST洗涤3次，然后在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1：5000，ZSBIO）孵育1小时后，将膜用TBST洗涤3次，并通过增强化学发光（ECL）系统（Thermopierce，美国）进行检测。所用抗体包括，小鼠抗组氨酸标签mAb（Abmart，M20001S），HRP山羊抗小鼠IgG（ZSBIO，ZB -5305）。

图3A为SARS-CoV2野生序列质粒的表达（Vector: pcDNA3.1-his载体、Spike：S蛋白、N：N蛋白），图3B为不同Spike及其衍生序列质粒的表达（Spike-WT：野生型S蛋白、Spike-OPT：密码子优化后的S表达质粒、S1-OPT：密码子优化后的S1表达质粒、NRBD-OPT：spike起始N端至RBD区的优化密码子后表达质粒）。结果显示使用S基因的原始序列在人293T细胞中几乎无法检测到S蛋白的表达，而优化密码子后则S蛋白的表达显著升高，表明密码子优化的S基因对于设计SARS-COV-2疫苗十分重要。

实施例3：SARS-CoV2的N蛋白的生物信息学分析

使用MegAlign对SARS-CoV2和SARS-nCoV之间的核衣壳蛋白（N蛋白）进行同源性分析。显示N蛋白在SARS-CoV-2和SARS-CoV氨基酸的同源性为91.2％（图4），这一结果支持了SARS-CoV的恢复期血清与新感染SARS-CoV-2的病人血清具有高交叉反应性的结果，提示基于N蛋白的疫苗可能具有交叉保护作用。

通过IEDB数据库预测N蛋白的潜在B细胞表位（图5A）和N蛋白的潜在MHCI结合肽（图5B），结果显示， N蛋白中有两个区域具有较少的B细胞表位，但具有丰富的组织相容性复合物1（MHC I）结合T细胞表位。图5C为SARS-CoV N蛋白的功能域及其抗体表位图，可见SARS患者中针对N蛋白多肽212-341位氨基酸（第二区域）的抗体减少，这一结果与图4中的分析结果一致。

实施例4：嵌合体疫苗抗原的构建与抗原表达验证

依据上述分析数据设计SARS-CoV2的嵌合疫苗的骨架（图6A），RBD：S蛋白受体结合结构域（316-541aa），Ntap：N蛋白的T细胞相关肽（211-339aa）。该疫苗由诱导特异性中和抗体的S蛋白的受体结合结构域和N蛋白T细胞反应肽段（Ntap）组成。

合成了具有密码子优化的RBD结构域（包含信号肽），T2A裂解肽和截短的N蛋白T细胞相关肽段（Sangon Biotech合成），并将其插入修饰的pLenti6-puromycin载体中，构建重组慢病毒载体。使用SARS-CoV2恢复患者抗血清和针对SARS-CoV2 RBD或核衣壳的商业抗体验证SARS-CoV2衍生的蛋白和C-Vac抗原的抗体识别表征（图6B），方法参照实施例3。结果表明嵌合疫苗抗原能够较好表达，且SARS-CoV2 RBD蛋白与全长N蛋白能够诱导机体产生抗体，而商品化多克隆抗体对Ntap识别不佳，证实Ntap抗体诱导能力弱。

此外，使用另外五名COVID-19患者的恢复期血清患者进行Western Blot检测时发现，COVID-19患者的恢复期血清具有针对完整N蛋白的高反应性抗体，而未见对S蛋白和T细胞相关Ntap有显著识别（图7），所有患者血清均由郑州大学第一附属医院提供，并通过郑州大学伦理委员会批准。

所用抗体明细如下：兔抗RBD PAb（多克隆抗体）（Sino Biological，＃40592-T62），兔抗Nucleocapsid PAb（Sino Biological，＃40588-T62），HRP山羊抗兔IgG（ZSBIO，ZB-5301），HRP山羊抗人IgG（ZSBIO，ZB-2304）。

实施例5：流式细胞术验证Ntap来源多肽与人MHC I结合能力的验证

使用不表达HLA DR且II类主要组织相容性（MHC）分子阴性的T2细胞作为工具细胞，评估HLA-A * 0201与肽之间的亲和力。分别合成源自Ntap的HLA-A*0201三种潜在结合多肽（LALLLLDRLNQL，RLNQLESKM，GMSRIGMEV），一种来自HER2的阳性结合肽（KIFGSLAFL）和一种来自MUC1的阴性结合肽（SAPDTRPAP）（所有肽均有吉尔生化有限公司合成），并按下述方法进行验证。

方法如下：将100μL 1×10⁵ T2细胞（无FBS的IMEM培养基重悬）接种到圆底96孔板中，随后加入最大浓度为100 µM的倍比稀释多肽并共同孵育4 小时；然后将细胞用预冷PBS洗涤两次，加入小鼠抗人HLA-A2-FITC抗体（Abcam）冰上染色30分钟；预冷PBS洗涤两次之后，使用BD FACSAria（BD Biosciences Immunocytometry Systems）分析细胞的荧光强度。

结果显示来源于Ntap的两个表位肽（LLLDRLNQL和GMSRIGMEV）及源于HER2的阳性肽（KIFGSLAFL）均能够与T2细胞结合，而RLNQESKM肽与源自MUC1的阴性肽（SAPDTRPAP）不与T2细胞结合（图8）。序列比对结果还表明，与SARS-CoV（RLNQESKV）相比（已有文献证实可与HLA-A * 0201结合），源自SARS-CoV2的肽RLNQESKM有一个位点发生变异，该位点的变异可能影响肽与HLA-A * 0201分子的结合。

实施例6：COVID-19新型细胞疫苗的构建

（1）合成构建能分泌表达GP96-hFc表达质粒3.1-GP96-hFc（SEQ NO:9），用Higene（Applygen，China）转染质粒，并用200μg/ml潮霉素B（Invitrogen）进行选择，构建293T-GP96-hFc过表达细胞系，随后用HRP山羊抗人IgG（ZSBIO，ZB-2304）及DAB显色试剂盒（福州迈新）及免疫细胞化学方法检测融合蛋白的表达（图9A）。

（2）合成构建表达疫苗抗原（SEQ NO:1）的慢病毒质粒，并按照下述步骤包被表达疫苗抗原的慢病毒：将2×10⁶ HEK293T细胞接种到10 cm细胞培养皿中，并将质粒混合物（包括25μg目标质粒，8μg psPAX2、4μg pMD2.G和40μL 2mg/ml PEI）共转染；6小时后更换新鲜培养基，48小时后收集含有慢病毒的上清，0.22μm滤膜（Millipore）过滤后等分保存在-80℃。将步骤1）构建的293T-GP96-hFc细胞接种到24孔板中，然后加入1 ml含有疫苗抗原慢病毒上清液和5μg/ml polybrene（Sigma），12小时后更换新鲜培养基，并在感染后72小时加入5μg/ ml嘌呤霉素（Selleck）以筛选稳定的细胞系。使用Western Blot方法检测疫苗抗原的表达情况（图9B），可见嵌合HEK293T细胞疫苗（C-Vac）能够稳定表达疫苗融合抗原。

实施例7：COVID-19新型细胞疫苗的疗效评价

已有多篇文章报道叙利亚仓鼠（也称为金黄仓鼠）能够支持SARS-CoV2的感染与复制，是较为理想的动物模型。36只12周龄的雌性叙利亚仓鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并随机分为4组（n = 9）。第1-4组分别接种1×10⁷ 293T-GP96-hFc对照细胞，活的293T-C-Vac细胞，经5μg/ml丝裂霉素（MCE）处理4h的293T-C-Vac细胞，及293T-C-Vac疫苗细胞冻融裂解液。在免疫后第7天，取每组三只仓鼠处死，收集动物血清样品并储存在-80℃，同时将肺组织固定在10％中性缓冲福尔马林中，并制作成石蜡标本。剩余动物在第14天以与初免相同的方案进行加强免疫，并在第21天（加强免疫后第7天）收获血清。剩余仓鼠于第45天用5×10⁶表达RBD-Ntap（C-Vac抗原）的仓鼠细胞BHK21细胞（构建方法同实施例5）进行荷瘤实验，并测量同种异体移植物的体积，评估疫苗特异性细胞毒性T细胞作用。在这项研究中使用的所有动物均在郑州大学实验动物中心SPF级条件下饲养，并按照动物实验伦理规定进行处理。

（1）SARS-CoV2假病毒的包被与仓鼠血清中和抗体测定

将2×10⁶ HEK293T细胞接种到10 cm细胞培养皿中，并使用20μg lenti-Luc（表达萤光素酶的慢病毒质粒），10μg psPAX和10μg 3.1-optS-d18（表达缺失S蛋白末端18个氨基酸残基）共转染，并参照慢病毒方法收集SARS-CoV2假病毒。将疫苗免疫组和对照组的仓鼠血清在56℃下热灭活30分钟，并从1：25开始进行倍比稀释。随后将固定量的假病毒（50μL）与50μL稀释的血清在37℃细胞培养箱中孵育1小时，并感染1×10⁴表达人hACE2的仓鼠BHK21中。感染后72小时，用萤光素酶测定系统（Promega）和GloMax Discover检测仪（Promega）测量细胞的相对萤光素酶活性。与对照细胞相比，使用50％RLU信号来计算血清中和效价（ID50）。如图10所示，所有表达融合抗原的疫苗接种组在单次免疫的第7天（图10A）和二次增强免疫后第7天（首次免疫后第21天）（图10B）均可有效诱导特异性中和抗体。

（2）苏木素伊红染色评价疫苗对金黄仓鼠肺脏的影响

将仓鼠的肺组织石蜡标本切成6 µm的切片，按照标准苏木素-伊红染色步骤进行操作，中性树脂封片后拍照分析肺脏组织变化。结果显示所有动物中均未观察到显著肺脏改变，提示该新型COVID-19细胞疫苗具有较高安全性（图10C）。

（3）同种荷瘤实验分析疫苗接种后病毒特异性T细胞反应

初次免疫后第45天，向剩余仓鼠中皮下注射5×10⁶表达融合疫苗抗原的仓鼠BHK-21（构建方法同实施例6），并在第70天对瘤体积进行测量。如图10D所述活细胞疫苗及裂解细胞疫苗免疫后叙利亚仓鼠显著减小了同种异体细胞成瘤体积，表明本发明的嵌合疫苗可以刺激机体产生病毒抗原特异性T细胞免疫反应。

目前在临床前研究和临床试验中正在开发针对SARS-CoV2的许多疫苗，但大多数疫苗仅针对刺突蛋白。在本发明中，我们开发了一种全新的嵌合疫苗（C-Vac），以S蛋白的受体结合结构域（RBD）和可诱导T细胞激活的核衣壳蛋白（N）截短肽段为靶标。该疫苗可以有效诱导针对病毒蛋白的特异性中和抗体和特异性T细胞效应，且具有较低的诱导抗体依赖性感染增强作用和N蛋白抗体介导免疫毒性的风险,具有较高安全性。本发明的C-Vac含有高保守的Ntap，有望为机体提供针对新型冠状病毒长期免疫保护，并将为SARS-CoV2及其突变体提供一定保护。同时本发明的疫苗所含的Ntap肽段诱导N蛋白抗体的产生能力弱，能够使用N蛋白抗体鉴别疫苗接种者和新冠感染患者。本发明的细胞疫苗造价低，且能够有效诱导产生病毒特性性中和抗体和T细胞免疫反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 一种预防COVID-19的新型疫苗及其制备方法

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 核苷酸序列SEQ NO：1

<400> 1

atggacatga gggtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgcc 60

aggtgcgtcc aaccaacaga gagcattgtg aggtttccaa acatcaccaa cctgtgtcca 120

tttggagagg tgttcaatgc caccaggttt gcctctgtct atgcctggaa caggaagagg 180

attagcaact gtgtggctga ctactctgtg ctctacaact ctgcctcctt cagcaccttc 240

aagtgttatg gagtgagccc aaccaaactg aatgacctgt gtttcaccaa tgtctatgct 300

gactcctttg tgattagggg agatgaggtg agacagattg cccctggaca aacaggcaag 360

attgctgact acaactacaa actgcctgat gacttcacag gctgtgtgat tgcctggaac 420

agcaacaacc tggacagcaa ggtgggaggc aactacaact acctctacag actgttcagg 480

aagagcaacc tgaaaccatt tgagagggac atcagcacag agatttacca ggctggcagc 540

acaccatgta atggagtgga gggcttcaac tgttactttc cactccaatc ctatggcttc 600

caatcaacca atggagtggg ctaccaacca tacagggtgg tggtgctgtc ctttgaactg 660

ctccatgccc ctgccacagt gtgtggacca aagaagagca ccaacctggt gaagaacaag 720

tgtgtgaact tcaacttcaa tggacgtagg aagcgaggat caggcgaggg cagaggaagt 780

cttctaacat gcggtgacgt gcaggagaat cccggccctg gcaatggcgg tgatgctgct 840

cttgctttgc tgctgcttga cagattgaac cagcttgaga gcaaaatgtc tggtaaaggc 900

caacaacaac aaggccaaac tgtcactaag aaatctgctg ctgaggcttc taagaagcct 960

cggcaaaaac gtactgccac taaagcatac aatgtaacac aagctttcgg cagacgtggt 1020

ccagaacaaa cccaaggaaa ttttggggac caggaactaa tcagacaagg aactgattac 1080

aaacattggc cgcaaattgc acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt cggaatgtcg 1140

cgcattggca tggaagtcac accttcggga acgtggttga cctacacagg tgccatcaaa 1200

ttgtaa 1206

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 氨基酸序列SEQ NO:2

<400> 2

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe

20 25 30

Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr

35 40 45

Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys

50 55 60

Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe

65 70 75 80

Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr

85 90 95

Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln

100 105 110

Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu

115 120 125

Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu

130 135 140

Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg

145 150 155 160

Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr

165 170 175

Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr

180 185 190

Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Ser Thr Asn Gly Val Gly Tyr

195 200 205

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro

210 215 220

Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

225 230 235 240

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Glu

245 250 255

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Gln Glu Asn Pro Gly

260 265 270

Pro Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg

275 280 285

Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln

290 295 300

Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro

305 310 315 320

Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe

325 330 335

Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu

340 345 350

Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln

355 360 365

Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met

370 375 380

Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys

385 390 395 400

Leu

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> 密码子优化RBD合成序列SEQ NO:3

<400> 3

atggacatga gggtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgcc 60

aggtgcgtcc aaccaacaga gagcattgtg aggtttccaa acatcaccaa cctgtgtcca 120

tttggagagg tgttcaatgc caccaggttt gcctctgtct atgcctggaa caggaagagg 180

attagcaact gtgtggctga ctactctgtg ctctacaact ctgcctcctt cagcaccttc 240

aagtgttatg gagtgagccc aaccaaactg aatgacctgt gtttcaccaa tgtctatgct 300

gactcctttg tgattagggg agatgaggtg agacagattg cccctggaca aacaggcaag 360

attgctgact acaactacaa actgcctgat gacttcacag gctgtgtgat tgcctggaac 420

agcaacaacc tggacagcaa ggtgggaggc aactacaact acctctacag actgttcagg 480

aagagcaacc tgaaaccatt tgagagggac atcagcacag agatttacca ggctggcagc 540

acaccatgta atggagtgga gggcttcaac tgttactttc cactccaatc ctatggcttc 600

caatcaacca atggagtggg ctaccaacca tacagggtgg tggtgctgtc ctttgaactg 660

ctccatgccc ctgccacagt gtgtggacca aagaagagca ccaacctggt gaagaacaag 720

tgtgtgaact tcaacttcaa tgga 744

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> T2A合成序列SEQ NO:4

<400> 4

cgtaggaagc gaggatcagg cgagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtgcag 60

gagaatcccg gccct 75

<210> 5

<211> 387

<212> DNA

<213> N蛋白T反应肽段合成序列 SEQ NO:5

<400> 5

ggcaatggcg gtgatgctgc tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag 60

agcaaaatgt ctggtaaagg ccaacaacaa caaggccaaa ctgtcactaa gaaatctgct 120

gctgaggctt ctaagaagcc tcggcaaaaa cgtactgcca ctaaagcata caatgtaaca 180

caagctttcg gcagacgtgg tccagaacaa acccaaggaa attttgggga ccaggaacta 240

atcagacaag gaactgatta caaacattgg ccgcaaattg cacaatttgc ccccagcgct 300

tcagcgttct tcggaatgtc gcgcattggc atggaagtca caccttcggg aacgtggttg 360

acctacacag gtgccatcaa attgtaa 387

<210> 6

<211> 250

<212> PRT

<213> RBD 氨基酸序列SEQ NO:6

<400> 6

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Leu Glu Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

20 25 30

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

35 40 45

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

50 55 60

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

65 70 75 80

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

85 90 95

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

100 105 110

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

115 120 125

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

130 135 140

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

145 150 155 160

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

165 170 175

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

180 185 190

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Ser Thr Asn Gly Val

195 200 205

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

210 215 220

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

225 230 235 240

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

245 250

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> T2A 氨基酸序列SEQ NO:7

<400> 7

Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys

1 5 10 15

Gly Asp Val Gln Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 8

<211> 128

<212> PRT

<213> N蛋白T反应肽段氨基酸序列SEQ NO:8

<400> 8

Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu

1 5 10 15

Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly

20 25 30

Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg

35 40 45

Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly

50 55 60

Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu

65 70 75 80

Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe

85 90 95

Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu

100 105 110

Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu

115 120 125

<210> 9

<211> 3102

<212> DNA

<213> GP96-hFc核苷酸序列 SEQ NO:9

<400> 9

atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60

gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaagct 2400

agcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 2460

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2520

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2580

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2640

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2700

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2760

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 2820

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 2880

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2940

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 3000

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggg tctgcacaac 3060

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 3102

<210> 10

<211> 1033

<212> PRT

<213> GP96-hFc氨基酸序列 SEQ NO:10

<400> 10

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val

35 40 45

Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser

50 55 60

Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala

65 70 75 80

Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn

85 90 95

Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu

100 105 110

Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly

115 120 125

Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu

130 135 140

Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val

145 150 155 160

Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn

165 170 175

Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile

180 185 190

Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys

195 200 205

Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu

210 215 220

Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr

225 230 235 240

Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser

245 250 255

Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser

260 265 270

Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr

275 280 285

Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu

290 295 300

Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met

325 330 335

Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu

340 345 350

Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp

355 360 365

Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys

370 375 380

Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val

405 410 415

Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe

420 425 430

Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu

450 455 460

Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

465 470 475 480

Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val

485 490 495

Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe

500 505 510

Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val

515 520 525

Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser

530 535 540

Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys

545 550 555 560

Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys

565 570 575

Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala

580 585 590

Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg

595 600 605

Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp

610 615 620

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu

625 630 635 640

Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly

645 650 655

Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp

660 665 670

Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn

675 680 685

Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp

690 695 700

Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr

705 710 715 720

Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly

725 730 735

Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp

740 745 750

Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu

755 760 765

Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val

770 775 780

Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Ala

785 790 795 800

Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

805 810 815

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

820 825 830

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

835 840 845

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

850 855 860

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

865 870 875 880

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

885 890 895

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

900 905 910

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

915 920 925

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

930 935 940

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

945 950 955 960

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

965 970 975

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

980 985 990

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

995 1000 1005

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr

1010 1015 1020

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

1025 1030

Claims

1.一种预防COVID-19的疫苗，其特征在于：所述的疫苗的抗原的核苷酸序列为SEQIDNO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。

2.根据权利要求1所述的一种预防COVID-19的疫苗，其特征在于：所述的疫苗抗原由三部分组成，编码SARS-CoV2 的受体结合结构域的核苷酸序列 SEQ ID NO:3、编码自切割肽T2A的核苷酸序列SEQ ID NO:4，以及编码N蛋白T细胞反应肽段的核苷酸序列SEQ ID NO:5。

3.根据权利要求2所述的一种预防COVID-19的疫苗，其特征在于：所述的编码SARS-CoV2 的受体结合结构域的多核苷酸进行密码子优化，氨基酸序列为 SEQ ID NO:6；自切割肽T2A氨基酸序列为SEQ ID NO:7； N蛋白T细胞反应肽段氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

4.根据权利要求2或3所述的一种预防COVID-19的疫苗，其特征在于：所述的编码SARS-CoV2 的受体结合结构域为RBD，所述的编码N蛋白T细胞反应肽段为Ntap。

5.一种如权利要求1或2所述的预防COVID-19的疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）首先构建能分泌表达GP96-hFc的慢病毒载体，感染并筛选出能稳定分泌表达GP96-hFc的HEK293T的细胞系，所述GP96-hFc的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，蛋白序列如SEQID NO:10所示；

（2）构建能嵌合表达SARS-CoV2 的受体结合结构域和N蛋白T细胞反应肽段的慢病毒载体，并在步骤1）的基础上筛选出能分泌表达GP96-hFc同时嵌合表达SARS-CoV2 的受体结合结构域和N蛋白T细胞反应肽段的HEK293T的细胞系；

6.根据权利要求5所述的一种预防COVID-19的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）中的预防COVID-19的疫苗为活细胞、丝裂霉素B或放射线处理细胞及细胞裂解液。

7.根据权利要求5所述的一种预防COVID-19的疫苗的制备方法，其特征在于：所述的HEK293T的细胞系为满足抗原表达的同源或异源细胞。

8.一种如权利要求1所述的疫苗在制备预防SARS-CoV2病毒的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的疫苗在制备预防SARS-CoV2病毒的药物中的用途，其特征在于：所述的疫苗进一步加工为DNA疫苗、RNA疫苗、蛋白疫苗或重组病毒疫苗。