CN111939163A - 葛杜宁在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及药物葛杜宁新的用途，具体涉及印度传统药物葛杜宁(Gedunin)在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途。本发明应用细胞免疫荧光化学、免疫印迹和qRT‑PCR，从蛋白水平和mRNA水平分别检测转染突变亨廷顿蛋白的细胞系Neuro‑2a，以及亨廷顿病人成纤维细胞和亨廷顿病人可诱导多潜能干细胞定向分化的神经元中，结果表明，葛杜宁能降解细胞系Neuro2a中转染的突变亨廷顿蛋白，降解亨廷顿病人来源成纤维细胞和可诱导性多能干细胞分化的神经元中内源性的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白，其作用具有剂量依赖性和时间依赖性。进一步可用于制备预防和治疗亨廷顿病的药物。

Description

葛杜宁在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及药物葛杜宁新的用途，具体涉及印度传统药物葛杜宁(Gedunin)在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途。所述的印度传统药物葛杜宁通过降解亨廷顿病人细胞内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白，达到治疗亨廷顿病的作用效果。

背景技术

现有技术公开了亨廷顿病(Huntington's disease,HD)是由4号染色体上的IT15基因发生突变，使CAG重复序列多聚谷氨酰胺(PolyQ)异常扩增导致编码出异常的突变亨廷顿蛋白聚集体的一种单基因显性遗传的神经退行性疾病；目前尚无有效的治疗方法(Kieburtz et al.,2018；MacDonald et al.,1993；Squitieri et al.,2016)。实践显示，所述HD病人常出现无法控制的舞蹈样动作和认知功能减退，以及抑郁、焦虑、痴呆等精神障碍，最终生活不能自理、出现吞咽和呼吸困难，直至死亡(Walker,2007)；据统计，该疾患从发病到死亡病程延续10-25年。研究显示，亨廷顿病人的CAG重复数在37以上，突变蛋白中异常扩增的多聚谷氨酰胺其结构转变为β-折叠，形成缠绕着的纤维样和非纤维样聚集，并且该种错误的折叠会使突变亨廷顿蛋白进入到细胞核内，隔离重要的细胞成分，引起细胞内转录紊乱，导致细胞正常功能的丧失和细胞毒性的增加(Aylward et al.,2011；DiFigliaet al.,1997；Saudou and Humbert,2016)；异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白会选择性的使纹状体中的γ-氨基丁酸(GABA)能神经元死亡，导致相应的神经系统功能紊乱，出现严重的不受控制的运动(Fisher and Hayden,2014)。本发明人的研究发现：小分子药物可降解突变亨廷顿蛋白，减少异常蛋白质累积和细胞毒性，可能将成为效治亨廷顿病的有疗手段。

热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是细胞内含量最丰富的的伴侣分子，与其他伴侣分子结合成分子伴侣复合物，共同参与蛋白质的装配、折叠、运输和降解过程(Massey,2010)。Hsp90与辅助分子伴侣形成复合物，稳定其所结合的下游蛋白，抑制下游蛋白降解，而Hsp90的抑制剂，促进下游蛋白与Hsp90形成蛋白酶体靶向型分子伴侣复合物，使Hsp90下游蛋白通过泛素-蛋白酶体系统途径降解增强(Bagatell et al.,2001)。突变亨廷顿蛋白聚集体和野生型亨廷顿蛋白都是典型的Hsp90下游蛋白，Hsp90的抑制剂NVP-AUY922降解突变亨廷顿蛋白呈剂量依赖性(Baldo et al.,2012)。报道公开了葛杜宁是从印度楝树分离出来的Hsp90天然抑制剂，在印度传统医学中主要用于治疗疟疾(Patwardhanet al.,2013)。

基于现有技术的现状与基础，本申请的发明人拟提供传统药物葛杜宁新的用途，具体涉及印度传统药物葛杜宁(Gedunin)在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途。

与本发明有关的参考文献：

Aylward,E.H.,Nopoulos,P.C.,Ross,C.A.,Langbehn,D.R.,Pierson,R.K.,Mills,J.A.,Johnson,H.J.,Magnotta,V.A.,Juhl,A.R.,and Paulsen,J.S.(2011).Longitudinal change in regional brain volumes in prodromal Huntingtondisease.J Neurol Neurosurg Psychiatry 82,405-410.

Bagatell,R.,Khan,O.,Paine-Murrieta,G.,Taylor,C.W.,Akinaga,S.,andWhitesell,L.(2001).Destabilization of steroid receptors by heat shock protein90-binding drugs:a ligand-independent approach to hormonal therapy of breastcancer.CLIN CANCER RES 7,2076-2084.

Baldo,B.,Weiss,A.,Parker,C.N.,Bibel,M.,Paganetti,P.,and Kaupmann,K.(2012).A screen for enhancers of clearance identifies huntingtin as a heatshock protein 90(Hsp90)client protein.J BIOL CHEM 287,1406-1414.

DiFiglia,M.,Sapp,E.,Chase,K.O.,Davies,S.W.,Bates,G.P.,Vonsattel,J.P.,and Aronin,N.(1997).Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclearinclusions and dystrophic neurites in brain.SCIENCE 277,1990-1993.

Fisher,E.R.,and Hayden,M.R.(2014).Multisource ascertainment ofHuntington disease in Canada:Prevalence and population at risk.MOVEMENTDISORD 29,105-114.Kieburtz,K.,Reilmann,R.,and Olanow,C.W.(2018).Huntington'sdisease:Current and future therapeutic prospects.MOVEMENT DISORD.

MacDonald,M.E.,Ambrose,C.M.,Duyao,M.P.,Myers,R.H.,Lin,C.,Srinidhi,L.,Barnes,G.,Taylor,S.A.,James,M.,and Groot,N.,et al.(1993).A novel genecontaining a trinucleotide repeat that is expanded and unstable onHuntington's disease chromosomes.CELL 72,971-983.

Massey,A.J.(2010).ATPases as drug targets:insights from heat shockproteins 70 and 90.J MED CHEM 53,7280-7286.

Patwardhan,C.A.,Fauq,A.,Peterson,L.B.,Miller,C.,Blagg,B.S.,andChadli,A.(2013).Gedunin inactivates the co-chaperone p23 protein causingcancer cell death by apoptosis.J BIOL CHEM 288,7313-7325.

Saudou,F.,and Humbert,S.(2016).The Biology of Huntingtin.NEURON 89,910-926.Squitieri,F.,Griguoli,A.,Capelli,G.,Porcellini,A.,and D'Alessio,B.(2016).Epidemiology of Huntington disease:first post-HTT gene analysis ofprevalence in Italy.CLIN GENET 89,367-370.

Walker,F.O.(2007).Huntington's disease.LANCET 369,218-228.。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状与基础，提供药物葛杜宁新的用途，具体涉及印度传统药物葛杜宁(Gedunin)在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途。

本发明通过实验证实，葛杜宁降解细胞系Neuro-2a中转染的突变亨廷顿蛋白的药物作用剂量和时间，降解亨廷顿病人细胞内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白的药物作用剂量和时间，及其降解突变亨廷顿蛋白的途径，所述传统药物葛杜宁可用于制备新的预防和治疗亨廷顿病的药物。

本发明的实验表明，所述葛杜宁能够降解神经退行性疾病中的亨廷顿病的病理蛋白——突变亨廷顿蛋白；

本发明中，所述葛杜宁降解亨廷顿病人成纤维细胞内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体的作用剂量为5-15μM和作用时间为12-24h；

本发明中，所述葛杜宁降解亨廷顿病人成纤维细胞进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白的作用剂量为10-20μM和作用时间为12-24h；

本发明中，所述葛杜宁降解亨廷顿病人神经元内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白和的剂量为5-15μM和时间为12-24h，作用效果8-10天后出现，葛杜宁降解神经元中突变亨廷顿蛋白具有长效作用；

本发明中，葛杜宁通过泛素-蛋白酶体系统途径而非自噬-溶酶体系统途径降解亨廷顿病人的突变亨廷顿蛋白。

本发明中，采用如下方法从三种不同种类的细胞分别检测葛杜宁降解突变亨廷顿蛋白的作用：

(一)葛杜宁对小鼠神经母细胞瘤(Neuro2a)细胞转染的EGFP-HDQ74的降解作用

用DMEM和10％FBS培养液培养小鼠神经母细胞瘤(Neuro2a)细胞，待长到80％左右时，用lipofectamine2000将增强型绿色荧光蛋白与含有74个CAG三核苷酸重复的亨廷顿蛋白第一外显子融合基因EGFP-HDQ74转染到神经样Neuro2a细胞，用不同剂量5μM、10μM、15μM、20μM的葛杜宁作用24小时，和相同浓度20μM的葛杜宁分别作用为8小时、16小时、24小时；药物处理以后，进行免疫印迹，细胞免疫荧光染色和qRT-PCR等实验；

(二)葛杜宁对蛋白降解通路的影响

MG132和Bafilomycin A1分别是溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂，为观察葛杜宁降解突变亨廷顿蛋白通过哪条途径降解：在转染后，每组加入20μM葛杜宁作用16小时，低浓度、高浓度的MG132(5μM,10μM)或Bafilomycin A1(0.5μM、1μM)作用6小时后观察突变亨廷顿蛋白表达水平，DMSO和葛杜宁(20μM)分别为空白对照和阳性对照，进行免疫印迹和细胞免疫荧光染色；

(三)葛杜宁对亨廷顿家系来源的成纤维细胞中突变亨廷顿蛋白的降解作用

选择两组正常人和三组不同CAG重复序列的亨廷顿病人，用DMEM和10％FBS培养液培养人来源的成纤维细胞，分别加入5μM和10μM葛杜宁作用24小时，进行细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦进行扫描，检测和统计突变亨廷顿蛋白的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量；

(四)蛋白酶体系统抑制剂MG132可阻止葛杜宁对亨廷顿病人来源的成纤维细胞突变亨廷顿蛋白降解效果；

本发明中，选择一位CAG重复序列为55的亨廷顿病人，采用用DMEM和10％FBS培养液培养该亨廷顿病人的成纤维细胞，加入10μM葛杜宁作用12小时后，再加入10μMMG-132继续孵育12小时，并设置对照组；进行细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦进行扫描，检测和统计突变亨廷顿蛋白的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量；

(五)葛杜宁对亨廷顿病人来源的诱导性多能干细胞(iPSCs)分化的神经元中的突变亨廷顿蛋白的降解作用

采用Matrigel支持的无饲养层细胞的诱导性多能干细胞培养系统，使用E8培养液培养；克隆生长密度达85％时(传代后第5天左右)，使用Dispase消化，离心后用诱导分化培养基(DMEM/F12，100xN2，100xNEAA，100x-Glutmax)进行培养，培养至第40天，消化神经球，贴壁神经元；神经元贴壁第47天加药葛杜宁5-15μM，作用24小时；继续培养至62天；分别在50天，57天和62天固定神经元；进行细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦显微镜进行扫描，检测和统计亨廷顿病人来源的iPSCs分化成的神经元突变亨廷顿蛋白的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量。

本发明的实验的结果表明：

(一)采用免疫印迹实验检测细胞系Neuro2a中转染的突变亨廷顿蛋白后加入葛杜宁20μM能够降解突变亨廷顿蛋白，葛杜宁对突变亨廷顿蛋白的降解有剂量依赖性，作用8小时以后，随着葛杜宁作用时间延长，突变亨廷顿蛋白表达量逐渐减少，葛杜宁作用24小时组与对照组相比有统计意义，与细胞荧光结果一致；采用qRT-PCR检测20μM葛杜宁作用24小时组与对照组突变亨廷顿蛋白的mRNA含量无统计学差异，表明葛杜宁对突变亨廷顿蛋白的降解不是在转录水平，而是在蛋白水平；结果证实20μM葛杜宁作用24小时能够降解外源性转入细胞中的突变亨廷顿蛋白(如图1所示)。

(二)免疫印迹实验检测出在转染的Neuro2a细胞中，蛋白酶体系统抑制剂MG132可挽救葛杜宁对突变亨廷顿蛋白降解效果，但溶酶体抑制剂BafilomycinA1不能挽救葛杜宁对突变亨廷顿蛋白降解效果，与细胞荧光结果一致；结果证实蛋白酶体抑制剂MG132拮抗葛杜宁，即葛杜宁通过促进蛋白酶体水解发挥活性，降解突变亨廷顿蛋白(如图2所示)。

(三)细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦进行扫描，检测和统计正常人成纤维细胞的突变亨廷顿蛋白和亨廷顿病人成纤维细胞中突变亨廷顿蛋白聚集体的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量，分别加入葛杜宁5μM和10μM作用24小时，正常人成纤维细胞中的亨廷顿蛋白面积经统计无明显变化，亨廷顿病人成纤维细胞加入葛杜宁5μM突变亨廷顿蛋白聚集体的面积减小，但细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量无明显变化，加入葛杜宁10μM突变亨廷顿蛋白聚集体的面积减小且细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量减少；结果证实5μM和10μM葛杜宁能够降解突变亨廷顿蛋白聚集体，并具有剂量依赖，且葛杜宁是有针对性的降解亨廷顿病人的内源性突变亨廷顿蛋白，不会影响正常人的亨廷顿蛋白的正常功能(如图3所示)。

(四)细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦显微镜进行扫描，检测和统计亨廷顿病人成纤维细胞中突变亨廷顿蛋白聚集体的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量，10μMMG-132不仅减少葛杜宁降解内源性突变亨廷顿蛋白聚集体，也减少葛杜宁降解进入细胞核内的突变型亨廷顿蛋白；结果证实MG132通过蛋白酶体途径可挽救葛杜宁对内源性突变亨廷顿蛋白降解效果(如图4所示)。

(五)细胞免疫荧光染色后，通过激光共聚焦进行扫描，检测和统计加药后培养至不同天数的亨廷顿病人来源的iPS分化成的神经元中突变亨廷顿蛋白聚集体的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量；结果显示，加入5μM葛杜宁不会影响亨廷顿病人来源的iPSCs分化的神经元的形态；未加药组对照组中，从50天至62天，突变亨廷顿蛋白聚集体的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量逐渐增加；加入5μM葛杜宁组中，第57天突变亨廷顿蛋白聚集体的面积大小和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量减少，第62天出现轻微的回升，但仍少于未加药对照组；结果进一步表明，葛杜宁对降解内源性突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变型亨廷顿蛋白有效(如图5所示)。

本发明提供了印度传统药物葛杜宁(Gedunin)在制备新的预防和治疗亨廷顿病药物中的用途。本发明通过实验证实，葛杜宁降解细胞系Neuro-2a中转染的突变亨廷顿蛋白的药物作用剂量和时间，降解亨廷顿病人细胞内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白的药物作用剂量和时间，及其降解突变亨廷顿蛋白的途径，所述传统药物葛杜宁可用于制备新的预防和治疗亨廷顿病的药物。

附图说明

图1显示了葛杜宁对Neuro2a细胞转染的EGFP-HDQ74的降解作用。

图2显示了葛杜宁对蛋白降解通路的影响。

图3显示了葛杜宁对正常人来源的成纤维细胞的亨廷顿蛋白和亨廷顿病人来源的成纤维细胞中突变亨廷顿蛋白聚集体的降解作用。

图4显示了蛋白酶体系统抑制剂MG132挽救葛杜宁对亨廷顿病人来源的成纤维细胞突变亨廷顿蛋白降解作用。

图5显示了葛杜宁对亨廷顿病人来源的诱导性多能干细胞(iPSCs)分化成的神经细胞中的突变亨廷顿蛋白的降解作用。

具体实施方式

实施例1

(一)葛杜宁对小鼠神经母细胞瘤(Neuro2a)细胞转染的EGFP-HDQ-74的降解作用，具体流程：

1.细胞培养：每次以1:5传代

(1)吸弃培液，用3-10ml 0.01M的PBS洗1遍；

(2)加3-5ml 0.25％胰酶-EDTA消化2-3分钟；

(3)加入3-5ml含10％FBS的DMEM培液中止消化，轻轻吹打分离细胞；

(4)将皿中的细胞悬液吸入15ml离心管中；

(5)离心(1200rpm 2min)，吸弃上清；

(6)加1ml含10％FBS的DMEM培液重悬，吸出200μl到10cm的培养皿中，种两皿，吸出67μl到6cm的培养皿中，放入5％CO2的37℃培养箱中培养。

2.细胞转染：转染前一天铺板，铺两个6孔板和一个24孔板

(1)取细胞长至90％的10cm培养皿，用0.25％胰酶-EDTA消化离心后，细胞用1ml培液重悬，取6孔板，每孔种细胞150μl，培养24小时后，转染74Q；另一块6孔板操作相同；从无水乙醇中取直径13mm清洗干净的圆玻片放入24孔板中，超净台中吹干；取6cm dish，细胞用1ml培液重悬，每个玻片种细胞50μl，2小时后每孔加培液500μl；

(2)6孔板按Lipofectamine2000试剂盒进行转染：①将4ug×6孔的质粒DNA加至250ul的OPTI-MEM培基中，混匀；②将10ul×6孔的Lipofectamine2000加至另外250ul的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟；③将DNA悬液和Lipo2000悬液混合，总体积500ul×6孔，轻轻混匀，室温静置20分钟；④弃旧培养基，每个孔加入DNA和Lipo2000混合液500ul，前后左右晃动孔板混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4-6小时更换10％FBS的DMEM培液，培养至24小时；另一块6孔板操作相同；

(3)24孔板按Lipofectamine2000试剂盒进行转染：①将0.8ug×24孔的质粒DNA加至50ul的OPTI-MEM培基中，混匀；②将2ul×24孔的Lipo2000加至另外50ul×12孔的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟；③将DNA悬液和Lipo2000悬液混合，总体积100ul，轻轻混匀，室温静置20分钟；④弃旧培养基，每个孔加入DNA和Lipo2000混合液100ul，前后左右晃动孔板混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4-6小时更换10％FBS的DMEM培液，培养至24小时。

3.加药：转染后3小时开始药物处理

(1)用培养液将母液为10mM的葛杜宁稀释成不同浓度，如5μM、10μM、15μM、20μM，作用24小时；

(2)用相同浓度(20μM)作用不同时间，分别为8小时、16小时、24小时；

4.6孔板加药细胞提取总蛋白

(1)每孔细胞加500μl 0.01M的PBS；平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去洗液；重复上述操作两次，洗细胞三次，洗去培养液中的血清；

(2)加入500μl 0.01M的PBS，用干净刮棒收集细胞于1.5ml离心管中，4℃，2500g，离心10min；

(3)吸弃上清，估计样品体积，加入含PMSF的细胞裂解液30-60ul，振荡器混匀；4℃静置30分钟；

(4)于4℃下12000g离心10min；

(5)取上清，其中一部分按1uL样品+4μl PBS稀释后取2μl用于测蛋白浓度；准备BCA工作液A液：B液＝50:1，稀释好各个浓度BSA标准品,样品用PBS进行稀释；每孔加样品20ul,标准品也加20ul,再加200ulBCA工作液,混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪560nm波长滤光片读取OD值；用Excel2007分析浓度值；

(6)另一部分加5×loadingbuffer煮沸5分钟后保存。

5.免疫印迹实验检测不同浓度葛杜宁对突变亨廷顿蛋白的清除作用和葛杜宁作用不同时间对突变亨廷顿蛋白的清除作用

(1)配置分离胶和浓缩胶；

(2)蛋白：从-20℃取出加入5×上样缓冲液稀释并在沸水中煮5min的变性蛋白；

(3)加样：每孔加入10～20μl(一般蛋白上样量为10-20ug)样品；

(4)电泳：200V恒压40-50分钟电泳，而在溴酚蓝到达下层胶底部时停止；

(5)转膜：按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵，恒定电压100V下，转膜90min；

(6)封闭：加入5％脱脂奶粉的PBS封闭，常温摇床摇1小时；

(7)加一抗：吸弃封闭液，加入一抗，置于4℃侧摆摇床孵育过夜；

(8)加二抗：回收一抗，TBST洗膜5min，共3次，加入二抗，常温侧摆摇床孵育1小时；吸弃二抗，TBST洗膜10min，共3次；

(9)PVDF膜正面向上放在保鲜膜上，将ECL发光剂滴在膜上，1min后将膜上的发光剂去掉(注意：不可干掉)；

6.细胞免疫荧光染色

(1)固定：将细胞用冰的4％PFA(多聚甲醛)固定15-20分钟，0.01M PBS洗3次，每次5分钟；

(2)破膜：用0.2％Triton-100破膜20分钟，0.01M PBS洗1次；

(3)封闭：用驴血清(10％)封闭1小时；

(4)加DAPI：按工作液浓度(1：1000)加DAPI，室温避光放置15-20分钟；

(5)0.01M PBS洗3次，每次5分钟；

(6)封闭：用水溶性防淬灭封片剂封片。

7.激光共聚焦显微镜扫描并统计荧光表达量

(1)采用3D扫描；

(2)通过Image J软件把Z-轴扫描图片Z-stacked,然后统计绿色荧光的表达量。

8.RT-PCR方法检测葛杜宁对突变亨廷顿蛋白的mRNA表达水平的影响

(1)RNA抽提：为防止RNA污染，整个过程应在超净台中进行，且实验中使用的枪头、离心管均为无RNA酶制品；

①单层培养细胞:0.01MPBS洗一遍，在培养板中加入TRIZOL裂解细胞，6孔板加1ml/孔，12孔板加500ul/孔，24孔板加250ul/孔，用移液器吸打几次。TRIZOL的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数；

②加入1/5体积的氯仿，充分涡旋15秒，室温放置3分钟；

③4℃12000rpm离心15分钟；样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层；

④把水相转移到新管中。用与上清等体积的异丙醇沉淀水相中的RNA；上下颠倒，轻柔混匀，室温放置20分钟；

⑤4℃12000rpm离心15分钟；移去上清；

⑥用1ml 75℅乙醇洗涤RNA沉淀4℃8000rpm离心5分钟，弃上清；

⑦微量分光光度计测RNA浓度及纯度，OD260/280在1.8-2.0范围内。真空抽干RNA沉淀。

(2)逆转录:从-80℃冰箱中取出RNA，解冻，在0.2μl PCR管中配制反应溶液

逆转录反应条件:37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)，4℃降温或短期保存。

(3)RT-PCR配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)，

其中实验中用到的引物序列如表，

。

(4)两步法PCR扩增标准程序：①预变性，95℃，90秒，②PCR反应，40个循环，95℃，5秒；60℃，30秒。

(二)葛杜宁对蛋白降解通路的影响，具体流程为：

1.细胞培养：每次以1:5传代；

2.细胞转染：转染前一天铺板，铺两个6孔板和一个24孔板；

3.加药：转染后3小时开始药物处理；

每组加入20μM葛杜宁作用16小时，低浓度、高浓度的MG132(5μM,10μM)或Bafilomycin A1(0.5μM、1μM)作用6小时后观察突变亨廷顿蛋白表达水平DMSO和葛杜宁(20μM)分别为空白对照和阳性对照；

4.6孔板加药细胞提取总蛋白；

5.免疫印迹实验检测葛杜宁对蛋白降解通路MG132和Bafilomycin A1(Baf A1)的影响；

6.细胞免疫荧光染色；

7.激光共聚焦显微镜扫描并统计荧光表达量。

(三)葛杜宁对正常人来源的成纤维细胞的突变亨廷顿蛋白和亨廷顿病人来源的成纤维细胞中突变亨廷顿蛋白聚集体的降解作用，具体流程为：

1.24孔板铺好玻片，将培养好的亨廷顿病人来源的成纤维细胞密度适中的种在玻片上，放入培养箱培养过夜；

2.用培养液将母液为10mM的葛杜宁稀释成浓度为5μM和10μM，分别加入不同来源的成纤维细胞作用24小时，各组分别取未加药组做对照；

3.细胞免疫荧光染色

(1)固定：将细胞用冰的4％PFA(多聚甲醛)固定15-20分钟，0.01M PBS洗3次，每次5分钟；

(2)破膜：用0.2％Triton-100破膜20分钟，0.01M PBS洗1次；

(3)封闭：10％驴血清(Donkey-serum)封闭60分钟；

(4)加一抗：，抗体3B5H10按每片1：5000的浓度加入0.2％triton-100，5％Donkey-serum和PBS组成的孵育液，每片100μl，4°过夜；

(5)去掉一抗，0.01M PBS洗3次，每次放置5-10分钟；

(6)加二抗：将荧光二抗和DAPI按每片1：1000的浓度加入5％驴血清和PBS组成的孵育液，每片100μl，同时加(1：1000)。室温避光放置60分钟；

(7)去掉Ⅱ抗，0.01M PBS洗3次，每次放置5-10分钟；

(8)封闭：水溶性荧光防淬灭封片剂封片，室温避光放置过夜。

4.激光共聚焦显微镜扫描并统计荧光表达量

(1)在Leica SP8 40倍干镜下寻找细胞均匀的视野，Z-轴确定细胞的厚度采用Z-stack扫描。Leica SP8激光共聚焦显微镜扫描参数为：像素：1024*1024(pixel)，扫描速度:100Hz；线性(liner):2；Z-stack间距:1μm；会有一定的染色背景差异，因此其它参数可以根据需求进行调整；

(2)通过Image J软件把Z-轴扫描图片Z-stacked(maximum intensityprojection),然后统计突变型亨廷顿蛋白聚集体的面积和细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量；

细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞计数利用软件中的细胞计数(cellcounter)菜单计数功能进行计数，具体流程如下：

①首先初始化图片(initialize),进入计数界面；

②选择计数类型按钮(counter type)；

③利用鼠标右键计数细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞；

④计数后把数据存入到excel数据表；

(3)采用SPSS20.0软件进行统计分析。

(四)蛋白酶体系统抑制剂MG132挽救葛杜宁对亨廷顿病人来源的成纤维细胞突变亨廷顿蛋白降解效果，具体流程为：

1.24孔板铺好玻片，将培养好的亨廷顿病人来源的成纤维细胞密度适中的种在玻片上，放入培养箱培养过夜；

2.亨廷顿病人来源的成纤维细胞中分别加入10μM的葛杜宁作用12小时，12小时后对照组更换培养新鲜培养基，另一组加入MG132 10μM，继续培养12小时；

3.细胞免疫荧光染色，一抗使用3B5H10；

4.激光共聚焦显微镜扫描并统计荧光表达量。

(五)葛杜宁对亨廷顿病人来源的诱导性多能干细胞(iPS)分化成的神经细胞中的突变亨廷顿蛋白的降解作用(由于神经元分化方法十分复杂此处简要介绍)

1.贴壁神经元用诱导分化培养基(DMEM/F12，0.5x N2，1xNEAA，1xL-G)培养于玻片上，隔天半换液；

2.第47天加药葛杜宁5μM，作用24小时；继续培养至62天；分别在50天，57天和62天固定神经元；

3.细胞免疫荧光染色，一抗使用3B5H10和Tuj1；

4.激光共聚焦显微镜扫描并统计荧光表达量。

结果表明：

1.葛杜宁降解外源性突变亨廷顿蛋白

细胞系Neuro2a中转染的突变亨廷顿蛋白3小时后加入葛杜宁20μM作24小时能够降解突变亨廷顿蛋白，葛杜宁对外源性转入细胞中突变亨廷顿蛋白的降解有剂量依赖性和有时间依赖性，且葛杜宁对突变亨廷顿蛋白的降解不是在基因水平，而是在蛋白水平；酶体抑制剂MG132能拮抗葛杜宁，即葛杜宁通过促进蛋白酶体水解发挥活性，降解突变亨廷顿蛋白。

2.葛杜宁降解内源性的突变亨廷顿蛋白

正常人成纤维细胞的突变亨廷顿蛋白和亨廷顿病人成纤维细胞中，分别加入葛杜宁5μM和10μM作用24小时，正常人成纤维细胞中的突变亨廷顿蛋白面积经统计无明显变化；亨廷顿病人成纤维细胞加入葛杜宁5μM突变亨廷顿蛋白聚集体的面积减小，但细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量无明显变化；亨廷顿病人成纤维细胞加入葛杜宁10μM突变亨廷顿蛋白聚集体的面积减小，且细胞核内进入突变型亨廷顿蛋白的细胞数量减少；葛杜宁是有针对性的降解亨廷顿病人的内源性突变亨廷顿蛋白，并具有剂量依赖不会影响正常人的亨廷顿蛋白的正常功能；MG132通过蛋白酶体途径可挽救葛杜宁对内源性突变亨廷顿蛋白降解效果；亨廷顿病人来源的iPS分化成的神经元，加药培养至不同天数，加入5μM葛杜宁不会影响亨廷顿病人来源的iPS分化成的神经元的形态；未加药组对照组和加入5μM葛杜宁组进一步证明，葛杜宁对降解内源性突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变型亨廷顿蛋白有效。

Claims (5)

1.葛杜宁在制备预防和治疗亨廷顿病药物中的用途，所述的葛杜宁通过降解细胞内及神经元内异常的突变亨廷顿蛋白(mHTT)聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白起作用，其作用具有剂量依赖性和时间依赖性。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述葛杜宁降解突变亨廷顿蛋白通过泛素-蛋白酶体系统途径。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述葛杜宁降解细胞内异常的突变亨廷顿蛋白(mHTT)聚集体的作用剂量为5-15μM、作用时间为12-24h。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述葛杜宁降解进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白(mHTT)的作用剂量为10-20μM、作用时间为12-24h。

5.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述葛杜宁降解神经元内异常的突变亨廷顿蛋白聚集体和进入细胞核内的突变亨廷顿蛋白的剂量为5-15μM、时间为12-24h。

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