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CN111939151A - 一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111939151A
CN111939151A CN202010634393.7A CN202010634393A CN111939151A CN 111939151 A CN111939151 A CN 111939151A CN 202010634393 A CN202010634393 A CN 202010634393A CN 111939151 A CN111939151 A CN 111939151A
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唐岚
张冉
何峥
单伟光
张振海
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Zhejiang University of Technology ZJUT
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Abstract

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒(VES‑DOX‑BSANPs)及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。本发明提供的VES‑DOX‑BSANPs是以牛血清白蛋白(BSA)作为载体材料，再通过包裹药物阿霉素(DOX)和维生素E琥珀酸酯(VES)，采用高压均质法制备得到VES‑DOX‑BSANPs。所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒具有大小均匀、粒径合适、分散性较好、理化性质稳定的优势。在体内外药效实验中，VES‑DOX‑BSANPs具有增效减毒和逆转肿瘤多药耐药的作用。

Description

一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
癌症长久以来一直是困扰人类健康问题的疾病，其复杂性、多变性和难治愈性，一直是药学研究、临床研究的难点和热点。在过去的几十年里，癌症治疗取得了巨大的进展。在众多的治疗方法中，化疗因药物对癌细胞的高细胞毒性成为大多数癌症治疗的主要策略，然而传统的化疗药物如阿霉素(Doxorubicin，DOX)总是表现出固有的局限性，如非特异性分布、毒性大、生物利用度差、血液清除快和在生理环境中溶解度差等。
DOX属于一种蒽环类抗肿瘤抗生素，由链霉菌青灰亚种衍生而成，是一类具有广泛活性的化学治疗药物。DOX与快速分裂的细胞作斗争，并阻碍肿瘤细胞的生长，这些特性使其作为一种非常重要的化疗药物而享有盛誉，尽管DOX已被标准化为抗癌一线药物，其耐药性和毒副作用仍然是其临床应用的重要限制因素，其潜在的心脏毒性，包括危及生命的心肌疾病、充血性心力衰竭以及剂量限制性的骨髓抑制作用是必须考虑的副作用。
纳米粒(Nanoparticles，NPs)通常被定义为1～1000nm之间的胶体聚合物粒子，是药物的良好载体，与微球类载体的主要区别是其具有超微小体积，它能穿透组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管，因而作为新的药物载运系统被广泛研究，特别是在靶向和定位给药、粘膜吸收给药、基因治疗和蛋白多肽类药物控释等领域，纳米粒独具优越性。
白蛋白是一种简单蛋白质，其分子中氨基酸以肽键相连接，并且扭曲成团状，具有无数的网状空隙，为镶嵌携带药物创造了有利的空间条件。动物病理学研究表明，牛血清白蛋白BSA可作为安全无毒的载体，静脉注射白蛋白微球广泛地用于诊断，未见有毒性地相关报道。白蛋白还具有生物可降解性，当药物与白蛋白结合后，可阻止药物从注射部位释放，使药物在有效部位缓慢释放。以白蛋白作为载体的纳米粒无毒、生物相容性较好，它能够利用天然白蛋白的途径，比如gp60和小窝蛋白介导的跨细胞转运和肿瘤SPARC蛋白之间的相互作用来达到药物的肿瘤靶向。综上所述，牛血清白蛋白属于一种理想的药物载体。
白蛋白纳米粒给药系统包括主动靶向和被动靶向。未经表面修饰的纳米粒通过静脉给药进入机体后，主要被网状内皮细胞丰富的脏器所摄取。纳米给药系统进入机体后的分布主要受纳米粒的表面性质及粒径的影响。表面带正电的纳米粒一般具有肺组织靶向性，表面带负电荷的纳米粒具有肝组织靶向性。白蛋白纳米粒主动靶向系统有纳米粒表面修饰、磁性白蛋白纳米粒和通过抗原-抗体相结合的白蛋白纳米粒。纳米粒表面修饰，是通过共价偶联作用，改变纳米粒的表面性质，从而可以避免被肝脏、脾脏等巨噬细胞吞噬，而具有靶向性；磁性白蛋白纳米粒，即用白蛋白将药物及磁性物质(如四氧化三铁、三氧化二铁等)包载后制备纳米粒，给药后通过外界磁场的控制使磁性白蛋白纳米粒移至靶组织或靶器官。
白蛋白纳米粒的制备方法主要可以分为乳化固化法、去溶剂化法、NabTM技术及其他方法。
维生素E琥珀酸酯(Vitamin E succinate，VES)抗肿瘤作用广泛，同时对正常人体细胞及组织没有毒副作用，目前众多研究验证了VES对胃癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌等均有较好抑制效果。VES能够通过活氧簇ROS来诱导细胞凋亡，由于肿瘤细胞内pH比正常细胞低，使得VES可以选择性的抑制肿瘤细胞而对正常组织无不良作用。
VES抗肿瘤作用机制在于以下两个方面：(1)抑制肿瘤细胞增殖，肿瘤细胞因细胞周期紊乱而造成无限制增殖，VES抑制肿瘤细胞增殖主要通过抑制DNA的合成、阻滞细胞周期、调节细胞周期调控蛋白等机制来实现；(2)诱导肿瘤细胞凋亡，VES诱导肿瘤细胞凋亡主要通过内源性通路和外源性通路实现。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题的不足，提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒(VES-DOX-BSANPs)及其制备方法和其在抗肿瘤方面的应用。为降低DOX的毒副作用，增强疗效，逆转肿瘤的多药耐药性，本发明选择同时具有抗肿瘤和抗耐药作用的VES和阿霉素制备一种复合型纳米粒并用于癌症的治疗。通过将DOX和VES联合用药，制备合适粒径的纳米粒，起到较好的肿瘤靶向作用，降低阿霉素的毒副作用并增强抗肿瘤作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的目的之一是提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs，所述纳米粒是由脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES溶于有机溶剂中作为有机相，含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相，在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳，经高压均质后去除有机溶剂获得。
本发明的另一目的是提供一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取一定量的脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES溶于有机溶剂中作为有机相，以含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相；
(2)在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳；
(3)将初乳置于高压均质机中，在一定的均质压力下多次循环后得到包裹DOX和VES的纳米粒混悬液，除去有机溶剂，即得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs混悬水溶液。
优选的，所述方法步骤在避光下进行。
优选的，所述脱盐阿霉素DOX的制备方法为，精密称取适量DOX·HCl，加入一定量的纯化水，超声10min使其充分溶解，加入氢氧化钠水溶液调节pH值为8～8.5，用氯仿萃取，取氯仿层，用饱和食盐水萃取，除去未游离出的DOX·HCl，氯仿溶液加入过量无水硫酸钠除去水分，35℃减压浓缩除去氯仿，得到脱盐DOX。
优选的，所述步骤(1)中脱盐DOX和VES的投料摩尔比为1：1-3，更优选的投料摩尔比为1:1。
优选的，所述步骤(1)中，有机相中脱盐阿霉素DOX的投料量为5-10mg/mL有机相，更优选的投料量为10mg/mL。
优选的，所述步骤(1)中，水相中的牛血清白蛋白BSA含量为3-10mg/mL水相，更优选的含量为5mg/mL。
优选的，所述步骤(1)中有机溶剂为氯仿；水相的水溶液为纯化水、1％氯化钠水溶液、2％氯化钠水溶液或3％氯化钠水溶液，更优选的水溶液为纯化水。
优选的，所述步骤(1)中有机相与水相体积比为1:40。
优选的，所述步骤(2)中在高剪切乳化机的剪切条件下将有机相加入水相。
优选的，所述步骤(2)中有机相加入水相后继续剪切5min形成初乳。
优选的，所述步骤(2)中有机相和水相形成初乳后过100目筛网。
优选的，所述步骤(3)中均质压力为900-1300bar，循环次数为7-9次；更优选的均质压力为1100bar，循环次数为7次。
优选的，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液于低温冰箱中预冻后取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥，得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs冻干粉
优选的，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液放入-80℃低温冰箱中预冻12h，随后将预冻样品取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥24h后，得到VES-DOX-BSANPs冻干粉。
本发明的另一目的是提供一种所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs在抗肿瘤方面的应用。
本发明与现有技术相比，其有益效果主要体现在：
(1)本发明所述的VES-DOX-BSANPs以BSA为载体，采用了高压均质法制备白蛋白纳米粒，高压均质法与传统制备方法相比，不需添加表面活性剂或任何聚合物，药理活性物质以非晶体、无定型状态存在，可以得到分散均匀且粒径合适的纳米粒。
(2)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在体外毒性试验中，表明VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR有较强的细胞生长抑制作用，其毒性强于DOX原料药。计算耐药指数和逆转耐药因子，证明VES不仅有很强的抗肿瘤作用，还有对MCF-7/ADR的抗耐阿霉素药的良好作用。DOX和VES的协同实现了对耐药株的抑制，更能有效的杀死耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)。
(3)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在荷瘤鼠体内的药效学试验研究结果显示，与其它给药组相比，VES-DOX-BSANPs组体内抑瘤效果最强。
(4)本发明所述的VES-DOX-BSANPs在荷瘤鼠体内，能更好地靶向肿瘤组织，起到增强疗效，降低毒副作用的效果。
因此，本发明所述的复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs具有避免了有毒有机溶剂的残留、逆转肿瘤对DOX的多药耐药性、更好的肿瘤靶向性的作用，从而能够增强疗效，降低DOX的毒副作用。
附图说明
图1 VES-DOX-BSANPs的TEM图；
图2 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对MCF-7细胞的生长抑制效果图(n＝5)；
图3 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR细胞的生长抑制效果图；
图4 DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对4T1细胞的生长抑制效果图；
图5为各组小鼠肿瘤体积在给药期间的变化图；
图6为各组小鼠肿瘤解剖图；
图7为各组荷瘤鼠瘤重图；
图8为给药期间各组荷瘤鼠的相对体重变化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1：VES-DOX-BSANPs的制备
(1)脱盐DOX的制备
精密称取77mgDOX·HCl于锡纸包好的小烧杯中，加入10mL的纯化水，超声10min使其充分溶解，加入0.5％的氢氧化钠水溶液，调节其pH值为8～8.5，用氯仿萃取5次，收集水层再次调pH值为8～8.5，用氯仿萃取2次，合并所有氯仿层，用饱和食盐水萃取氯仿层，除去未游离出的DOX·HCl，氯仿溶液加入过量无水硫酸钠除去水分，35℃减压浓缩除去氯仿，得到脱盐DOX。
(2)VES-DOX-BSANPs的制备
采用高压均质法制备VES-DOX-BSANPs。按占有机相10mg/mL的量，称取20mg的脱盐DOX和19.53mg的VES(DOX和VES摩尔比1:1)溶于2mL氯仿中作为有机相。按占水相5mg/mL的量，称取0.4g的BSA溶解于80mL纯化水中作为水相。在高剪切乳化机剪切条件下，将有机相缓慢匀速逐滴加入水相，用高剪切乳化机剪切5min后形成初乳，过100目筛网后，将初乳置于高压均质机中，在1100bar均质压力下7次循环后得到包裹DOX和VES的纳米粒混悬液，将纳米粒混悬液转移至包有锡纸的圆底烧瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，即得到VES-DOX-BSANPs混悬水溶液，整个实验过程做好避光措施。利用马尔文激光粒度仪测定VES-DOX-BSANPs粒径(121.9±0.98)nm，电位(-21.4±0.44)mv。
将制备好的VES-DOX-BSANPs混悬水溶液放入-80℃低温冰箱中预冻12h，随后将预冻样品取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥24h后，得到VES-DOX-BSANPs冻干粉。取适量VES-DOX-BSANPs冻干粉溶解在纯化水中，均匀溶解后用毛细管滴加在铜网上，红外灯下静置几分钟使其干燥，用TEM观察其形态并拍摄照片。TEM观察纳米粒的形态如图1所示，VES-DOX-BSANPs外观呈球形，表面光滑，分散性较好，粒径大小与马尔文粒径仪所测结果相近。
实施例2：制备VES-DOX-BSANPs时，脱盐阿霉素DOX的投料量为5mg/mL有机相；脱盐DOX和VES摩尔比1:3；均质压力为900bar。其余操作同实施例1。利用马尔文激光粒度仪测定VES-DOX-BSANPs粒径(102.2±1.06)nm，电位(-18.1±0.36)mv。
实施例3：制备VES-DOX-BSANPs时，脱盐阿霉素DOX的投料量为7.5mg/mL有机相，均质压力为1300bar；循环次数为9次，其余操作同实施例1。利用马尔文激光粒度仪测定VES-DOX-BSANPs粒径(106.7±0.62)nm，电位(-17.4±0.36)mv。
实施例4：制备VES-DOX-BSANPs时，水相的牛血清白蛋白BSA含量为3mg/mL水相；水相溶剂为2％氯化钠水溶液；有机相氯仿为1.5mL。其余操作同实施例1。利用马尔文激光粒度仪测定VES-DOX-BSANPs粒径(131.9±0.77)nm，电位(-25.4±0.51)mv。
实施例5：制备VES-DOX-BSANPs时，水相的牛血清白蛋白BSA含量为10mg/mL水相；水相溶剂为3％氯化钠水溶液；有机相氯仿为3mL。其余操作同实施例1。利用马尔文激光粒度仪测定VES-DOX-BSANPs粒径(98.6±0.39)nm，电位(-19.5±0.58)mv。
对比例1：DOX-BSANPs的制备
采用高压均质法制备DOX-BSANPs。称取20mg的脱盐DOX溶于2mL氯仿中作为有机相，称取0.4mg的BSA溶解于80mL纯化水中作为水相。在高剪切乳化机剪切条件下，将有机相缓慢匀速逐滴加入水相，剪切5min后形成初乳，过100目筛网后，将初乳置于高压均质机中，在1100bar均质压力下7次循环后得到包裹DOX的纳米粒混悬液，将纳米粒混悬液转移至包有锡纸的圆底烧瓶中旋转蒸发除去有机溶剂，即得到DOX-BSANPs混悬水溶液，整个实验过程做好避光措施。将制备好的DOX-BSANPs混悬水溶液放入-80℃低温冰箱中预冻12h，随后将预冻样品取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥24h后，得到DOX-BSANPs冻干粉。
试验例1：VES-DOX-BSANPs体外抗肿瘤活性研究
为了考察VES-DOX-BSANPs的体外抗肿瘤作用，本申请以人乳腺癌细胞(MCF-7)、耐DOX乳腺癌细胞(MCF-7/ADR)、以及鼠乳腺癌细胞(4T1)为细胞模型，通过MTT方法考察DOX、实施例1VES-DOX-BSANPs和对比例1DOX-BSANPs对这三种细胞增殖的影响以及实施例1VES-DOX-BSANPs的抗耐药性。
细胞的培养：4T1、MCF-7、MCF-7/ADR分散于25cm2的培养瓶中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养，培养过程中，每隔一天更换新鲜培养液培养。
(1)细胞接种
取对数生长期的细胞用胰酶消化直至细胞变圆，加入含10％胎牛血清的培养液终止消化。用枪头吹打细胞使之完全脱落转移至离心管中，以1000rpm离心5min，弃去上清液，加入适量新鲜完全培养液，吹打使其成为分散均匀的细胞悬液。吸取少量细胞悬液置于血球细胞计数板计数，用含胎牛血清的RPMI 1640完全培养液稀释至密度为5×104个/mL的细胞混悬液，分散均匀后用移液枪接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，为减少实验误差，96孔板外围一圈加入100μL的PBS，置于培养箱中培养过夜使其贴壁。每个浓度梯度设定5个重复孔，同时设定5个空白孔以及5个对照孔，将96孔板置于培养箱中孵育24h使细胞贴壁。
(2)不同制剂药液的配制
精密称取DOX原料药、DOX-BSANPs、VES-DOX-BSANPs冻干粉用RPMI-1640培养液溶解后配制成0.5mg/mL(以DOX含量计算)的母液，用0.22μm微孔滤膜过滤，然后用RPMI-1640培养液稀释至含DOX浓度为50、25、5、1、0.2、0.04μg/mL，用于MCF-7细胞以及4T1细胞的毒性试验。用RPMI-1640培养液稀释上述DOX制剂，使得含DOX浓度为100、50、10、2，0.4、0.08μg/mL用于MCF-7/ADR细胞的毒性试验。
(3)MTT实验检测细胞毒作用
细胞贴壁后，按照(2)中设定浓度每孔加入100μL的含药培养液，对照组则补加100μL培养液，空白组只加200μL无细胞的培养液。培养48h后，取出孔板，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，置于培养箱中继续培养4h后吸走上清液，并将孔板倒扣于滤纸上小心地吸干残留溶剂。每孔再加入100μL DMSO并于水平震荡器中震荡十分钟，使紫色结晶物完全溶解。用酶标仪在570nm波长下测定吸光度，计算细胞抑制率，计算细胞的存活率。
Figure BDA0002569922900000081
(4)细胞耐药实验
GraphPad Prism5.0软件计算各物质的IC50值，并通过耐药指数(ResistantIndex,RI)来评价所制备制剂以及药物的多药耐药性。通过逆转耐药因子(Reversalfactor,RF)来评价制剂逆转肿瘤细胞多药耐药的程度。RI及RF的计算公式如下：
RI＝IC50(MCF-7/ADR)/IC50(MCF-7)
RF＝IC50(DOX)/IC50(VES-DOX-BSANPs)
考察了DOX、DOX-BSANPs、VES-DOX-BSANPs与MCF-7、MCF-7/ADR、以及4T1细胞孵育48h后对细胞的生长抑制作用。MTT试验结果显示这三种药物对这三种细胞都具有一定的细胞毒性。从整体图中我们可以看出随着药物浓度增高，细胞存活率降低，药物对细胞的抑制作用存在着浓度依赖性。DOX、DOX-BSANPs和VES-DOX-BSANPs在不同浓度下与MCF-7、MCF-7/ADR以及4T1细胞孵育48h后的细胞存活率如图2、图3、图4，各组的IC50值如表1所示。
表1DOX、DOX-BSANPs及VES-DOX-BSANPs对MCF-7、MCF-7/ADR和4T1细胞的IC50
Figure BDA0002569922900000091
图2、4可以看出，在浓度为0.04～50μg/mL(以DOX含量计算)范围内，DOX比两种纳米制剂对MCF-7有更高的毒性，对于4T1细胞而言，在浓度为0.04～5μg/mL时，DOX仍然比两种纳米制剂对MCF-7有更高的毒性，在浓度为25～50μg/mL时，VES-DOX-BSANPs表现出比原料药高的细胞毒性，表明在较高浓度下，VES和DOX联合给药对4T1细胞的毒性增大，有更好的抗肿瘤作用。
对于耐药株MCF-7/ADR而言，其对DOX的耐受程度很明显，DOX原药浓度高达100μg/mL时，细胞存活率仍接近20％，在DOX浓度同为50％时，MCF-7/ADR的存活率为25.2％，而MCF-7的存活率为仅为6.8％。在浓度为0.4～100μg/mL范围内，对MCF-7/ADR，VES-DOX-BSANPs药物表现出比原药和DOX-BSANPs更好的细胞毒性。VES和DOX复合的纳米粒，VES的抗耐药性使MCF-7/ADR变敏感，增强了DOX单独给药的毒性，VES的抗肿瘤作用和抗耐药性使得对MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用明显，药效进一步增强。
单一药物DOX对MCF-7和4T1细胞均有较高的细胞毒性，IC50分别为0.06±0.006μg/mL，0.16±0.003μg/mL，不论是在MCF-7细胞还是在4T1细胞中，VES-DOX-BSANPs的细胞存活率均低于DOX-BSANPs，且在MCF-7和4T1细胞中，DOX-BSANPs与VES-DOX-BSANPs的IC50比值分别为1.6和4，说明纳米粒制剂中VES的加入显著提高了同浓度DOX制剂对乳腺癌细胞的毒性。
表2VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR细胞的耐药指数和逆转耐药因子
Figure BDA0002569922900000092
VES-DOX-BSANPs对耐药株MCF-7/ADR逆转肿瘤细胞多药耐药性结果如表2所示。MCF-7/ADR对DOX的耐受程度很明显，耐药指数远远大于对VES-DOX-BSANPs制剂。与DOX进行比较，VES-DOX-BSANPs对MCF-7/ADR的逆转耐药因子为1.71，说明该纳米制剂有较好的逆转肿瘤多药耐药的作用。
试验例2：VES-DOX-BSANPs体内药效研究
本试验例将实施例1、对比例1制备的两种纳米制剂，用于以下药效学试验：
(1)荷瘤鼠肿瘤模型的建立
取对数生长期的乳腺癌细胞4T1，PBS清洗两遍，用胰酶消化后，加入培养液吹打使细胞脱落下来，置于低速离心机上离心(1000r/min，5min)，离心后，收集下层细胞，加入PBS并用移液枪吹打使其成细胞悬液，配制细胞悬液浓度为5×107个/mL。将其皮下注射到健康的小鼠左前肢腋下，每只小鼠注射细胞混悬液量为0.15mL，每次注射前重悬细胞，避免因沉降作用细胞浓度不均。注射后隔天观察肿瘤生长情况，并用游标卡尺测量肿瘤的长径、短径，计算肿瘤的体积。当肿瘤体积长至150～200mm3时，即可认为造模成功。
(2)给药方案
待肿瘤体积生长至150～200mm3，对荷瘤小鼠进行定期给药。将荷瘤小鼠随机分成3组，分别为生理盐水组、DOX组、DOX-BSANPs、VES-DOX-BSANPs组，每组5只。以药物浓度DOX5mg/kg，每隔三天给一次药，连续给药四次，给药方式为尾静脉注射，给药体积为0.2mL/只。
(3)体内药效学考察与毒副作用评价
体内药效学考察纳米粒制剂对肿瘤的生长抑制作用。给药后，每天称量体重并使用游标卡尺测量肿瘤的最长直径(A)和最短直径(B)。绘制出小鼠肿瘤体积-时间和体重-时间变化曲线。肿瘤体积的计算公式如下：
Figure BDA0002569922900000101
V：肿瘤体积
A：肿瘤最大直径
B：肿瘤最小直径
待荷瘤小鼠模型组与给药组间的肿瘤体积存在明显差异后，停止给药。采用颈椎脱臼法处死小鼠，剥离皮下完整的肿瘤，称量瘤重，计算抑瘤率，公式如下：
Figure BDA0002569922900000111
给药14天内，观察对照组和给药组小鼠的体型及体重情况，定期称重，并观察小鼠的生存状态、毛色及活动行为，并观察其排泄物情况。
通过每天测量肿瘤最长径和最短径，计算出肿瘤的体积，以此作为考察VES-DOX-BSANPs抑制小鼠肿瘤生长指标之一。从图5可以看出，生理盐水Saline组的小鼠肿瘤体积变化最为明显，肿瘤生长速度不受影响。DOX-BSANPs组小鼠肿瘤的生长速度较慢，VES-DOX-BSANPs组肿瘤体积变化最小，其抑制肿瘤生长效果最强。实验最后一次给药结束后，将各组小鼠处死，然后取出肿瘤组织并称重，计算DOX组、DOX-BSANPs、VES-DOX-BSANPs组的抑瘤率，各组的抑瘤率分别为40.3％、49.1％、71.9％。从图6中可以直观的看出生理盐水组肿瘤体积最大，VES-DOX-BSANPs组的肿瘤体积最小，抑制效果最为明显。处死小鼠后，VES-DOX-BSANPs组瘤重分别为生理盐水组的27.5％(p<0.0001)，为DOX组的47.1％(p<0.05)，DOX-BSANPs组的55.2％(p<0.05)。DOX组，DOX-BSANPs组、VES-DOX-BSANPs组的肿瘤生长受到不同程度的抑制，分别为生理盐水组的59.7％(p<0.01)、50.9％(p<0.001)、27.6％(p<0.0001)，说明VES-DOX-BSANPs组对小鼠肿瘤的生长抑制效果最为明显，是因为VES和DOX复合形成的白蛋白纳米粒，VES作为P-gp抑制剂，增加了肿瘤部位DOX的药物浓度，而VES具有良好的抗肿瘤作用同时又具有较好的抗耐药性，双重作用使得两种药物在肿瘤部位更多的聚积，从而保证了VES-DOX-BSANPs较强的抗肿瘤作用。
空白对照组与各个给药组小鼠在给药期间的体重变化情况如图8所示。生理盐水组小鼠体重变化最为明显，呈上升趋势，而VES-DOX-BSANPs组体重在前7天内先增加后成缓慢下降趋势，总体体重变化不明显。同样，DOX-BSANPs组在给药期间体重呈波动状态，总体呈缓慢上升趋势。DOX组的荷瘤鼠体重下降明显，且在给药期间小鼠的毛色无光泽并有小鼠死亡。以上结果均表明原料药阿霉素具有极大的毒副作用，而制备成VES-DOX-BSANPs能减小阿霉素的毒副作用。
给药期间每天观察小鼠健康状态，生理盐水组小鼠体型正常，肥硕且皮肤饱满有光泽，VES-DOX-BSANPs小鼠状态良好。相比之下，DOX组小鼠体型偏瘦，且小鼠皮肤颜色略微发黑，在给药期间，DOX组出现了程度不同的腹泻。
试验例3：VES-DOX-BSANPs体内组织分布的研究
本试验例将实施例1、对比例1制备的两种纳米制剂，用于以下小动物活体试验：
(1)荷瘤鼠肿瘤模型的建立
参照试验例2。
(2)小动物活体成像
本实验利用DOX自带荧光特性，可以用于实时观察药物在裸鼠体内的迁移和分布。采用小动物活体成像技术来证明VES-DOX-BSANPs的靶向性，即将造模成功的荷MCF-7瘤裸鼠分为3组，即DOX组、DOX-BSANPs组，VES-DOX-BSANPs组。各组分别通过尾静脉注射200μL含DOX浓度均为5mg/kg的溶液，并且分别于1、3、6、9、24h这5个时间点进行活体成像。在成像前3分钟，用异氟烷将小鼠快速麻醉然后上机检测。
活体成像结果显示，对于DOX组，在给药3h后，DOX组药物出现全身分布的情况，给药9h时，肿瘤部位可观察到DOX的荧光，到24h DOX在全身的分布变窄，肿瘤部位还可观察到荧光，但荧光强度并未出现增强的现象，荧光强度随给药时间呈现无规则变化，这一现象说明药物在肿瘤部位的作用时间并不长且聚集的量不多，随着血液循环，又分散于其他组织或者被代谢排出体外，这也证实了DOX溶液的组织分布较差。
对于DOX-BSANPs和VES-DOX-BSANPs组，在给药1h后，药物呈现全身分布，然而肿瘤部位都可观察到DOX的荧光，随着时间的延长，VES-DOX-BSANPs组肿瘤部位荧光强度持续增强，而DOX-BSANPs组裸鼠肿瘤部位的荧光强度先增强后减弱，在给药9h时，VES-DOX-BSANPs组肿瘤部位DOX荧光强度达到最高。以上结果说明VES-DOX-BSANPs在裸鼠体内靶向性更强，药物能更有效的聚集于肿瘤部位，VES抑制了DOX在肿瘤部位的外排，增加了药物在肿瘤部位的浓度。
活体成像24h结束后，将两组的裸鼠脱颈椎处死，并快速在超净台上进行解剖，取出心、肝、脾、肺、肾组织以及肿瘤，将这些组织器官和肿瘤用生理盐水洗净后，放置于滤纸上吸干水分，按顺序摆放于黑色塑料板上，上机成像并拍照记录。组织荧光成像结果显示，DOX组在肝脏部位中荧光较强，肿瘤部位检测到微弱荧光。DOX-BSANPs组肝脏部位荧光弱于DOX组，而在肿瘤部位荧光变强，其他器官未见荧光信号，说明DOX-BSANPs组对肝脏也具有微弱毒副作用。在VES-DOX-BSANPs组中，荧光大量聚集在肿瘤部位，荧光强度明显强于DOX-BSANPs组。组织分布试验证实了VES-DOX-BSANPs可以高效靶向于肿瘤部位，靶向作用强于不含VES的DOX-BSANPs，从而有更强的抗肿瘤效果。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒，其特征在于，所述纳米粒是由脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯溶于有机溶剂中作为有机相，含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相，在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳，经高压均质后去除有机溶剂获得。
2.一种权利要求1所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取一定量的脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯溶于有机溶剂中作为有机相，以含有牛血清白蛋白BSA的水溶液作为水相；
(2)在剪切条件下将有机相逐滴加入水相形成初乳；
(3)将初乳置于高压均质机中，在一定的均质压力下多次循环后得到包裹阿霉素和维生素E琥珀酸酯的纳米粒混悬液，除去有机溶剂，即得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒混悬水溶液。
3.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述脱盐阿霉素的制备方法为，盐酸阿霉素加入纯化水中超声溶解，用氢氧化钠水溶液调节pH值为8～8.5，用氯仿萃取后减压浓缩除去氯仿，得到脱盐阿霉素。
4.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱盐阿霉素的投料量为5-10mg/mL有机相，脱盐阿霉素和维生素E琥珀酸酯的投料摩尔比为1：1-3，有机溶剂为氯仿。
5.根据权利要求4所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中水相中的牛血清白蛋白BSA含量为3-10mg/mL水相；所述步骤(1)中水相的水溶液为纯化水或氯化钠水溶液；水相与有机相体积比为40:1。
6.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中在高剪切乳化机的剪切条件下将有机相加入水相后，继续剪切5min形成初乳并过100目筛网。
7.根据权利要求6所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中均质压力为900-1300bar，循环次数为7-9次。
8.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中脱盐阿霉素DOX的投料量为10mg/mL有机相，脱盐阿霉素DOX和维生素E琥珀酸酯VES的投料摩尔比为1︰1，有机溶剂为氯仿，水相的水溶液为纯化水，水相与有机相的体积比为40︰1，水相的牛血清白蛋白BSA含量为5mg/mL水相；所述步骤(3)中均质压力为1100bar，循环次数为7次。
9.根据权利要求2所述一种复合型阿霉素白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的纳米粒混悬水溶液于低温冰箱中预冻后取出，置于冷冻干燥器内冷冻干燥，得到复合型阿霉素白蛋白纳米粒VES-DOX-BSANPs冻干粉。
10.一种权利要求1所述复合型阿霉素白蛋白纳米粒在抗肿瘤方面的应用。
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