CN111920814B - 依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用，依匹哌唑，化学名称：7‑[4‑(苯并[B]噻吩‑4‑1‑哌嗪)丁氧基]‑2（1H）‑喹啉酮，CAS号为913611‑97‑9，分子式为C₂₅H₂₇N₃O₂S，分子量为433.57。所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。本申请通过实验证实依匹哌唑用于食管鳞状细胞癌细胞（KYSE150细胞、KYSE450细胞）或胃癌细胞（HGC27细胞、AGS细胞）时，能够起到抑制食管鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞生长和转化的作用，且依匹哌唑能够抑制食管鳞状细胞癌细胞或胃癌细胞增殖和转化的适宜浓度为2.5μM~10μM。

Description

依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症的定义特征之一是异常细胞迅速产生，其生长超过正常界限，并因此而能够侵袭体内的临近部位并向其他器官蔓延。早期胃癌症状无特异性，中晚期胃癌常有典型的临床表现，内镜诊断不难，但 5 年生存率显著低于早期胃癌。鉴于食管癌、胃癌的发生、发展是从慢性炎症-异型增生-肿瘤的多步骤过程，时间较长，化学预防对肿瘤的发生有直接影响。

癌症是由环境、饮食以及生活方式与遗传因素协同作用的结果，由致癌物作用结合细胞遗传因素导致细胞遗传基因突变而逐渐发展为癌。癌症的早期临床症状不明显，当临床症状较为突出时，患者的病情已处于中期或者晚期。因此，选择有效的预防和治疗癌症的药物和方法对于改善患者的预后及生活质量都具有重要意义。

依匹哌唑是一种具有多靶点的抗精神疾病的药物是一种有效的人5-羟色胺(5-HT) 5-HT1A 和多巴胺 D2L受体激动剂，且是 5-HT2A 受体拮抗剂。目前还未有研究涉及依匹哌唑对癌症，尤其是对食管癌、胃癌及其他肿瘤的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是其用作食管癌、胃癌和其它肿瘤的预防、治疗药物在临床治疗中的应用。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案

依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用，依匹哌唑，化学名称：7-[4-(苯并[B]噻吩-4-1-哌嗪)丁氧基]-2（1H）-喹啉酮，CAS号为913611-97-9，分子式为C₂₅H₂₇N₃O₂S，分子量为433.57。所述抗肿瘤药物为治疗食管癌或胃癌的药物。

具体的，依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用，“抗肿瘤药物”可应用于预防肿瘤发生、治疗肿瘤、预防肿瘤复发。

所述的抗肿瘤药物制成药用剂型，所述剂型包括糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、散剂、酒剂、配剂、滴剂、注射液、粉针剂、乳膏剂、缓释剂、靶向剂等，用作预防、治疗和预防复发的癌症药物。

所述抗肿瘤药物的给药方式包括口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。

所述抗肿瘤药物并不局限于对人的肿瘤的治疗、预防和术后复发的预防，还可以用于动物的肿瘤的治疗、预防和术后复发的预防。

依匹哌唑对人的剂量范围为0.004 mg/kg/天-1 mg/kg/天，相应的动物剂量范围可根据相应公式进行换算得到。

本发明通过实验证实依匹哌唑用于食管鳞状细胞癌细胞（KYSE150细胞、KYSE450细胞）时，能够起到抑制食管鳞状细胞癌细胞生长和转化的作用。本发明中依匹哌唑在10 μM时对食管鳞状细胞KYSE150细胞和KYSE450细胞有毒性作用，在2.5 μM时能抑制食管鳞状细胞KYSE150细胞和KYSE450细胞的生长和转化，因此，依匹哌唑能够抑制食管鳞癌细胞的增殖和转化的适宜浓度为2.5μM~10μM时。

本发明通过实验证实依匹哌唑用于胃癌细胞（HGC27细胞、AGS细胞）时，能够起到抑制胃癌细胞生长和转化的作用。本发明中依匹哌唑在10 μM时对胃癌HGC-27细胞和AGS细胞有毒性作用，在2.5 μM时能抑制胃癌HGC-27和AGS细胞的生长和转化，因此，依匹哌唑能够抑制胃癌细胞增殖和转化的适宜浓度为2.5μM~10μM时。

本发明通过实验证实人5-羟色胺(5-HT) 5-HT1A 和多巴胺 D2L受体激动剂-依匹哌唑在食管癌和胃癌的抑制增值和转化能力，实验发现：适当浓度的依匹哌唑对于食管癌病变和胃癌病变的预防具有较好地效果，为食管癌和胃癌的化学预防提供了新的思路和参考借鉴的可能性。

本发明使用的模型是利用癌症患者的癌组织在免疫缺陷小鼠身上建立的皮下移植瘤模型，依靠小鼠提供的微环境进行生长。该模型生物学稳定，保持了原代肿瘤的特点,异种移植的模型可能是最接近目前人类癌症特点。模型减少了体外处理过程,能更好地保持患者临床肿瘤组织的原有生物学特性和组织学特征，并且模型取材于不同的患者，可以保留患者肿瘤的异质性，不仅可以检测治疗功效，也是符合癌症生物学治疗基本原则的一种工具和手段，还可以帮助测试新的抗肿瘤药物的疗效，同时也为肿瘤发生发展的机制研究提供了新的方法，为一对一的个体化抗癌治疗提供了可能。本发明通过依匹哌唑处理食管癌模型小鼠，发现与对照组相比，依匹哌唑处理过的小鼠肿瘤明显减小。本发明中，依匹哌唑在小鼠的体内肿瘤治疗浓度为1.3mg/kg—5.2mg/kg，也可以0.0167mg/kg—0.0667mg/kg的剂量供患者服用。通过给患者服用依匹哌唑，在临床上可预防和治疗食管癌、胃癌及除胶质瘤、胰腺癌、肺癌外的其他肿瘤，对食管癌、胃癌及除胶质瘤、胰腺癌、肺癌外的其他肿瘤的术后复发有预防作用。

附图说明

图1为依匹哌唑对KYSE150细胞增殖及转化能力的影响结果，其中A为通过DAPI染色检测依匹哌唑对KYSE150细胞毒性的实验结果， B为依匹哌唑对KYSE150细胞生长抑制作用结果，C为依匹哌唑对KYSE150 细胞转化能力的影响结果；

图2为依匹哌唑对KYSE450细胞增殖及转化能力的影响结果，其中A为通过DAPI染色检测依匹哌唑对KYSE450细胞毒性的实验结果， B为依匹哌唑对KYSE450细胞生长抑制作用结果C为依匹哌唑对KYSE450 细胞转化能力的影响结果；

图3为依匹哌唑对HGC27细胞增殖能力的影响结果，其中A为通过DAPI染色检测依匹哌唑对HGC27细胞毒性的实验结果， B为依匹哌唑对HGC27细胞生长抑制作用结果；

图4为依匹哌唑对AGS细胞增殖能力的影响结果，其中A为通过DAPI染色检测依匹哌唑对AGS细胞毒性的实验结果；B为依匹哌唑对AGS细胞生长抑制作用结果；

图5为依匹哌唑在食管癌编号EG20小鼠模型上的肿瘤生长治疗效果，图5A为给药期间小鼠体重变化趋势图，图5B为给药期间小鼠肿瘤体积变化趋势图，图5C为实验结束后，处死小鼠，称量出肿瘤的重量，图5D为对照组与给药组的肿瘤图片；

图1至5中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例：

材料与方法

1. 材料

食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450以及胃癌细胞HGC27、AGS来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室

1.1 细胞株：KYSE150 细胞株，细胞株采用含10%FBS的1640培养基，37℃恒温、5%CO₂条件下培养、备用。

KYSE450细胞株，细胞株采用含10%FBS的DMEM培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

HGC27细胞株，细胞株采用含10%FBS的1640培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

AGS细胞株，细胞株采用含10%FBS的F12K培养基，37℃恒温、5% CO₂条件下培养、备用。

培养方法：在直径10cm的培养皿，8ml-10ml培养基培养，2-3天换一次培养基。

1.2 肿瘤组织

本发明使用了1例人食管癌组织标本，编号为EG20。患者来源于河南省肿瘤医院，男性，46岁，病例分期T2N0M0II，中分化。

1.3 实验动物

本实施例中SCID CB-17小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号为：SCXK(京)2012—0001。SPF级，SCID小鼠为5—6周龄，体重16g—18g，雌鼠。小鼠饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。许可证号为SCXK(京)2014—0010。

1.4 试剂

RPMI-1640培养基、DMEM培养基500ml一瓶（Biological Industries）；F12K（Gibco）；FBS（Biological Industries）；Trypsin-EDTA胰酶消化液（上海碧云天生物技术有限公司）；PBS（北京索莱宝科技有限公司）；细胞培养皿；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）：称量戊巴比妥钠溶解于无菌蒸馏水中过滤；双抗：青霉素和链霉素购自华北制药股份有限公司，两者浓度均为500U/ml；生理盐水500ml/瓶（辰欣药业股份有限公司）；依匹哌唑（杭州宇昊化工）

仪器与器材

海尔医用保温冰箱；电子天平；Thermo超净工作台；电子天平；细胞培养箱，眼科剪，手术镊，无菌培养皿，手术刀，溶药针，注射器。

2方法

细胞悬液的制备：显微镜下观察细胞生长状态，当细胞状态良好，且细胞数量符合实验要求时，抽掉原来的培养基，用1×PBS洗2次，尽量洗去残留的完全培养基以免影响消化，每个10 cm 培养板中加入1 mL 0.25%胰酶，轻轻晃动使胰酶均匀铺满整个培养板，放入培养箱进行消化，消化结束后，显微镜下观察细胞，当细胞变圆时，轻轻拍打培养板边缘使细胞脱落，加入5 mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞呈单细胞状态，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心3 min，抽去上清，向细胞沉淀中加入12 mL完全培养基，轻轻吹打使细胞分散均匀；

细胞计数：取干净的计数杯，加入19.5 mL计数液，抽取0.5 mL细胞悬液加入其中，轻轻吹打使细胞分散均匀，计数仪计数。重复计3次，求平均值，因计数前细胞悬液被稀释了40倍，故平均值乘以40即为细胞浓度；

细胞毒性实验

实验过程为：将KYSE150细胞（8000个/每孔）；KYSE450（12000个/每孔）；HGC27（6000个/每孔）；AGS（8000个/每孔）细胞接种于96孔板进行培养（KYSE150细胞：10%FBS/RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM；HGC27细胞：10%FBS/ RPMI-1640；AGS细胞：10%FBS/F12K，37℃，5% CO₂），16小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度依匹哌唑（将依匹哌唑溶于DMSO，配成原液，溶度为50mM。加药时取原液稀释于培养基中，使依匹哌唑在培养基中的终浓度分别为0 μM、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM，0μM即为DMSO（二甲基亚砜）溶剂对照），培养24 h、48 h后取出，用100 μl的1×PBS洗两次，100 μl的4%多聚甲醛室温固定30min后，100 μl的1×PBS洗两次，加入100 μl的DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）溶液，37℃孵育30min后，用In Cell Analyzer 6000机器拍板，统计细胞数，计算细胞存活率。

细胞增殖实验

实验过程为：将KYSE150细胞（3000个/每孔）；KYSE450（5000个/每孔）；HGC27（3000个/每孔）；AGS（3000个/每孔）细胞接种于96孔板进行培养（KYSE150细胞：10%FBS/ RPMI-1640；KYSE450细胞：10%FBS/DMEM；HGC27细胞：10%FBS/ RPMI-1640；AGS细胞：10%FBS/F12K，37℃，5% CO₂），16小时后，更换新鲜培养基并加入不同浓度依匹哌唑（依匹哌唑在培养基中的终浓度分别为0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM），加入含药培养基培养0 h、24 h、48 h、72h、96 h后取出，用100 μl的1×PBS洗两次，100 μl的4%多聚甲醛室温固定30min后，100 μl的1×PBS洗两次，加入100 μl的DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）溶液，37℃孵育30min后，用In Cell Analyzer 6000机器拍板，统计细胞数。

锚定非依赖性生长实验

实验过程为：将BME培养基（含10% FBS和 0.5%琼脂）铺于6孔板，3ml/每孔，待培养基凝固后，铺入混悬有KYSE150细胞（8000个/每孔）或KYSE450细胞的（8000个/每孔）上层胶（1ml的含药培养基，培养基为BME培养基，培养基中含10%FBS和0.33%的琼脂，培养基中的药物终浓度分别为0μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM），37℃、5%CO₂培养7天，待克隆形成后取出，利用IN Cell Analyzer 3000进行克隆计数。

人食管癌免疫缺陷鼠种植瘤模型的建立

将新鲜肿瘤组织取出坏死组织，剪成体积为3立方毫米左右，进行组织接种前，用含有青霉素链霉素的PBS（PBS:双抗 50:1）冲洗后置于冰上，等待接种。塞入6周龄、18g左右的雌性小鼠的背部皮下。将小鼠放入小鼠IVC系统饲养。等待肿瘤形成约15mm左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成3立方毫米小块，移植于另外小鼠。颈椎脱臼处死小鼠，肿瘤周围皮肤用酒精消毒，用溶药针扎开一个小口，用镊子撑开后取出肿瘤放到小鼠皮下。

实验动物的治疗研究

接种后一周或者两周后，小鼠背部肿瘤结节长到15立方毫米左右时开始分组，即按照肿瘤体积大小均匀分配小鼠至每组，每组分8只。3组小鼠分别按照以下剂量自由饮水。当对照组小鼠肿瘤长到1000立方毫米左右时，终止实验（约35天），取下背部皮下肿瘤并称重。每周两次记录小鼠体重以及肿瘤体积。分组如下所示

（1）饮用无菌蒸馏水（对照组），

（2）每天以1.3mg/kg灌胃依匹哌唑（依匹哌唑低剂量组，溶剂为10v%DMSO的生理盐水），

（3）每天以5.2mg/kg灌胃依匹哌唑（依匹哌唑高剂量组，溶剂为10v%DMSO的生理盐水）。

实验结果

1.1 如图1和图2所示。从图1A和图2A可以看出，通过机器对染色细胞拍照，进行数据统计分析，可以发现依匹哌唑在浓度为0～5 μM时，对KYSE150细胞、KYSE450细胞的影响较小，6 μM依匹哌唑细胞的存活率在80%左右，但依匹哌唑在浓度为10 μM时表现出一定的细胞毒性，因此在后续的实验中采用依匹哌唑10 μM为实验最高剂量；从图1B和图2B可以看出，依匹哌唑在浓度为1 μM、2.5 μM，对KYSE150细胞、KYSE450细胞处理24 h、48 h、72 h、96h时对KYSE150细胞和KYSE450细胞的生长没有抑制作用，依匹哌唑在浓度为5 μM、10 μM时对KYSE150细胞和KYSE450细胞的生长有抑制作用，并呈现出剂量依赖性和时间依赖性；从图1C和2C可以看出，与DMSO（二甲基亚砜）溶剂对照组相比，依匹哌唑在5 μM、10 μM时对KYSE150的克隆形成具有抑制作用，并且随着依匹哌唑浓度的升高，克隆数量逐渐下降，说明在低毒性浓度的情况下，依匹哌唑能够抑制KYSE150细胞克隆形成能力。

1.2 如图3和图4所示。从图3A和图4A可以看出，通过机器对染色细胞拍照，进行数据统计分析，可以发现依匹哌唑在浓度为0～5 μM时，对HGC27细胞、AGS细胞的影响较小，3μM依匹哌唑细胞的存活率在80%左右，但依匹哌唑在浓度为10 μM时表现出一定的细胞毒性，因此在后续的实验中采用依匹哌唑10 μM为实验最高剂量；从图3B和4B可以看出，依匹哌唑在浓度为2.5 μM时，对HGC27细胞和AGS细胞处理24 h、48 h时对HGC27细胞和AGS细胞的生长抑制作用不显著，在培养72h、96h后对HGC27细胞和AGS细胞的生长抑制作用显著，依匹哌唑在浓度为5 μM时培养48h后对HGC27细胞和AGS细胞的生长抑制作用显著，在浓度为10 μM时培养24h后对HGC27细胞和AGS细胞的生长抑制作用显著。

1.3 如图5所示。从图5A可以看出低剂量和高剂量的依匹哌唑处理不会影响小鼠的体重，即无毒副作用；从5B、5C、5D可以看出，与对照组相比，依匹哌唑1.3mg/kg、5.2mg/kg处理后可以显著抑制肿瘤生长，且低剂量组在肿瘤体积和肿瘤重量上显著优于高剂量组。

上述细胞研究中，以KYSE150细胞、KYSE450细胞、HGC27细胞和AGS细胞为研究对象，选用依匹哌唑浓度为0 μM、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM进行毒性实验，筛选出安全的药物浓度，确定药物浓度为0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM。通过进一步的增值实验，发现依匹哌唑浓度 为5 μM、10 μM时对KYSE150细胞，KYSE450细胞、HGC27细胞、AGS细胞具有增值抑制作用。最后通过锚定非依赖实验检测依匹哌唑对KYSE150细胞，KYSE450细胞、HGC27细胞、AGS细胞转化的抑制能力，观察到依匹哌唑在低毒性的条件下具有抑制试管鳞状细胞癌和胃癌细胞的增值和转化的能力。根据动物实验可以看出依匹哌唑可以有效的抑制肿瘤的生长。

根据以上细胞毒性、细胞增殖结论，可以认定，10 μM以下浓度的依匹哌唑对食管鳞状细胞癌癌细胞和胃癌癌细胞的毒性是在可接受范围的，而且在此浓度范围内，依匹哌唑对食管鳞状细胞癌癌细胞和胃癌癌细胞具有增殖抑制作用；而且，根据锚定实验的结论，可初步认定，依匹哌唑在低浓度条件下具有抑制试管鳞状细胞癌癌细胞和胃癌癌细胞转化的作用，或者说，在安全的依匹哌唑药物浓度范围基础上（10 μM以下时），可以有效的抑制试管鳞状细胞癌癌细胞和胃癌癌细胞的增殖和恶性转化；同时，动物实验可以看出，依匹哌唑可以有效抑制肿瘤生长。

综上所述，依匹哌唑能够抑制肿瘤 （尤其是食管癌和胃癌）的生长，可用于临床上食管癌、胃癌及其他肿瘤种癌症的预防、治疗和术后预发的预防。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims (3)

1.依匹哌唑在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管鳞癌或胃癌的药物，其中的治疗食管鳞癌的药物是制备抑制食管鳞癌或胃癌细胞生长和转化的药物，依匹哌唑在浓度为2.5μM~10μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖和转化，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞，依匹哌唑在浓度为2.5μM~10μM时能够抑制胃癌细胞的增殖和转化，所述胃癌细胞为HGC27细胞和/或AGS细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，依匹哌唑在制备抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤生长药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，依匹哌唑在剂量1.3mg/kg—5.2mg/kg时能抑制食管癌或胃癌人源化移植瘤模型肿瘤的生长。

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