CN111926057A - 高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法、测定试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法，包括以下步骤：(1)将试样与含有第一表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子的第一试剂混合反应，得第一反应液，以及遮蔽全部脂蛋白胆固醇；(2)将第一反应液与含有第二表面活性剂的第二试剂混合反应，得第二反应液；(3)读取第二反应液在色原化合物相应波长处的吸光度值，计算高密度脂蛋白3胆固醇的含量。利用表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子清除高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇和遮蔽全部的脂蛋白胆固醇，能大大提高测量精度。本发明还公开了一种采用上述方法的测定试剂以及该测定试剂的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，特别是涉及一种高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂及制备方法。
背景技术
高密度脂蛋白(HDL)是血液中脂蛋白的组成成分之一，一般将HDL亚组分中颗粒较小密度较大的HDL称为高密度脂蛋白3(HDL3)，HDL3中的胆固醇(HDL3-C)是检测心血管疾病的重要指标。
目前在临床检测应用中，测定HDL3的方法有电泳法、超速离心法和分级沉淀法等，均具有较高的精度，企业或医院采用对应的方法需采购对应的仪器设备，并配备相关的技术人员。
现有的检测方法需采用昂贵的仪器设备和专门的技术人员，操作步骤繁琐，一般需要长达十几个小时，检测时间长，难以应用于快速临床医学检测。
发明内容
本发明的一个目的在于提出一种能够快速检测的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂。
一种高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：
(1)将试样与含有第一表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子的第一试剂混合反应，得第一反应液，所述第一试剂用于清除所述试样中高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇，以及遮蔽全部脂蛋白胆固醇；
(2)将第一反应液与含有第二表面活性剂的第二试剂混合反应，得第二反应液；
(3)读取第二反应液在546nm和660nm波长处的吸光度值，计算高密度脂蛋白3胆固醇的含量。
本发明的有益效果在于：利用表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子能清除高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇和遮蔽全部的脂蛋白胆固醇，能大大提高测量精度。
本发明的另一个目的在于提出一种高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂；
第二试剂，包括第二缓冲液、过氧化物酶、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂。
在本发明中，将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶组合使用，再配合过氧化物酶和4-氨基安替比林能实现快速检测，同时能确保检测的精度。
另外，根据本发明提供的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，还可以具有如下附加的技术特征：
进一步地，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液均为MOPS缓冲液或MOPSO缓冲液。
进一步地，所述第一稳定剂为抗坏血酸氧化酶、牛血清白蛋白、氯化钠、EDTA中的一种或多种，所述第一防腐剂为Proclin-300，所述第二防腐剂为叠氮钠。
进一步地，所述第一稳定剂由牛血清蛋白、氯化钠和EDTA组成，含量分别为2～5g/L、25～55mmol/L和0.1～2mmol/L，所述第二稳定剂为牛血清蛋白，含量为0.2～5g/L，所述遮蔽剂包括硫酸葡聚糖、肝素和聚乙二醇，含量分别为0.5％～1.0％、300U/L～2000U/L和0.5％～3.0％，所述第一防腐剂和所述第二防腐剂的浓度分别为0.01～0.5％和0.1～0.3％。
进一步地，所述遮蔽剂还包括皂素，浓度为0.1g/L～2g/L。
进一步地，所述二价金属离子的浓度为2～20mmol/L，所述第一表面活性剂的浓度为0.1％～0.5％，所述胆固醇酯酶的含量为0.5～5KU/L，所述胆固醇氧化酶的含量为1～3.5KU/L，所述过氧化氢酶的含量为1～10MU/L，所述第一缓冲液的浓度为35～50mmol/L，所述过氧化物酶的含量为2～10KU/L，所述4-氨基安替比林的浓度为0.4～40mmol/L。
本发明的另一个目的在于提出一种高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂混合搅拌，调节pH至6.0～7.5，再加入所述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶，得所述第一试剂；
(2)将所述第二缓冲液、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂混合搅拌，调节pH至6.0～7.5，再加入所述过氧化物酶，得所述第二试剂。
进一步地，所述步骤(1)中混合搅拌的步骤包括：
先将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂混合搅拌，得第一混合液；
再将所述遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂混合搅拌，得第二混合液；
将所述第二混合液滴入所述第一混合液中，搅拌均匀，使温度保持在30℃以下，再加入所述第一稳定剂搅拌均匀。
进一步地，所述步骤(2)中混合搅拌的步骤包括：
将所述第二缓冲液、第二表面活性剂和4-氨基安替比林混合，加水溶解得第三混合液；
将所述第二稳定剂和第二防腐剂加入所述第三混合液中，搅拌，溶解保持在20-30℃下静置1～2小时。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例1的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图2是本发明实施例2的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图3是本发明实施例3的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图4是本发明实施例4的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图5是本发明实施例5的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图6是本发明对照例1的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图；
图7是本发明对照例2的测定试剂与沉淀法的检测结果的相关图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
实施例1
一种高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，包括以下步骤：
(1)将试样与含有第一表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子的第一试剂混合反应，得第一反应液，所述第一试剂用于清除所述试样中高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇，以及遮蔽全部脂蛋白胆固醇；
(2)将第一反应液与含有第二表面活性剂的第二试剂混合反应，得第二反应液；
(3)读取第二反应液在546nm和660nm波长处的吸光度值，计算高密度脂蛋白3胆固醇的含量。
需要说明的是，本实施例的第二反应液的波长为色原化合物相应的波长，在其他实施例中，可以为不同的值。
上述测定方法所使用的仪器是本领域常规的仪器，可以为日立7180全自动生化分析仪或贝克曼系列全自动生化分析仪。
本实施例的定量方法利用表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子能清除高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇和遮蔽全部的脂蛋白胆固醇，能大大提高测量精度。
上述方法中采用的试剂为一种高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂；
第二试剂，包括第二缓冲液、过氧化物酶、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂。
在本实施例中，色原化合物为3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠(TOOS)，浓度为2mmol/L，第一表面活性剂为Emulgen A-90，第二表面活性剂为Tergitol15-S-9，所述第一缓冲液为MOPS缓冲液，所述第二缓冲液均为MOPSO缓冲液，二价金属离子为镁离子。
在其他实施例中，第一缓冲液液可以采用磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液等。
本发明的优势在于，将胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶组合使用，再配合过氧化物酶和4-氨基安替比林能实现快速检测，同时能确保检测的精度。
具体的，所述第一防腐剂为Proclin-300，所述第二防腐剂为叠氮钠。
进一步地，所述第一稳定剂由牛血清蛋白、氯化钠和EDTA组成，含量分别为2～5g/L、25～55mmol/L和0.1～2mmol/L，所述第二稳定剂为牛血清蛋白，含量为0.2～5g/L，所述遮蔽剂包括硫酸葡聚糖、肝素和聚乙二醇，含量分别为0.5％～1.0％、300U/L～2000U/L和0.5％～3.0％，所述第一防腐剂和所述第二防腐剂的浓度分别为0.01～0.5％和0.1～0.3％。
优选的，所述遮蔽剂还包括皂素，浓度为0.1g/L～2g/L。
进一步地，所述二价金属离子的浓度为2～20mmol/L，所述第一表面活性剂的浓度为0.1％～0.5％，所述胆固醇酯酶的含量为0.5～5KU/L，所述胆固醇氧化酶的含量为1～3.5KU/L，所述过氧化氢酶的含量为1～10MU/L，所述第一缓冲液的浓度为35～50mmol/L，所述过氧化物酶的含量为2～10KU/L，所述4-氨基安替比林的浓度为0.4～40mmol/L。
具体的，本实施例的第一试剂采用如下组分：
50mM MOPS缓冲液，
6.25mM硫酸镁，
1.0g/L皂角苷，
0.25％Emulgen A-90，
0.01％Tergitol 15-S-9，
28g/L聚乙二醇2000，
2.0KU/L胆固醇酯酶，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
2MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.02％Proclin-300，
0.2mM EDTA，和
5.0g/L牛血清蛋白，以上百分比为质量百分比。
第二试剂的组分如下：
在本实施例中，皂素为皂角苷。
上述高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂混合搅拌，调节pH至6.5，再加入所述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶，得所述第一试剂；
(2)将所述第二缓冲液、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂混合搅拌，调节pH至6.5，再加入所述过氧化物酶，得所述第二试剂。
进一步地，所述步骤(1)中混合搅拌的步骤包括：
先将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂混合搅拌，得第一混合液；
再将所述遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂混合搅拌，得第二混合液；
将所述第二混合液滴入所述第一混合液中，搅拌均匀，使温度保持在30℃以下，再加入所述第一稳定剂搅拌均匀。
进一步地，所述步骤(2)中混合搅拌的步骤包括：
将所述第二缓冲液、第二表面活性剂和4-氨基安替比林混合，加水溶解得第三混合液；
将所述第二稳定剂和第二防腐剂加入所述第三混合液中，搅拌溶解保持在30℃下静置1.5h。
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点14～34点。并与沉淀法对照，如图1所示，本实施例的方法与沉淀法显示出良好的相关性。
在本实施例中，仅需10分钟即可获得检测结果，且无需专业设备。
实施例2
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
第一试剂的组分为：
35mM MOPS缓冲液，
20mM硫酸镁，
0.05％Tergitol NP-9.5，
0.5g/L人参皂甙
13g/L硫酸葡聚糖钠盐50
2.0KU/L胆固醇酯酶，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
2MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.2mM EDTA，和
5.0g/L牛血清蛋白。
在本实施例中，皂素为人参皂甙。
第二试剂的组分为：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点14～34点。结果与沉淀法对照，如图2所示，本实施例的方法与沉淀法显示出良好的相关性。
实施例3
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
第一试剂的组分为：
80mM MOPS缓冲液，
10.0mM硫酸镁，
2000U/L肝素钠，
0.5g/L毛地黄皂甙
0.10％Tergitol NP-13，
2.0KU/L胆固醇酯酶，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
4MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300，
0.2mM EDTA，和
5.0g/L牛血清蛋白。
在本实施例中，皂素为毛地黄皂甙，二价金属离子为镁离子和肝素，其中，镁离子和肝素能同时遮蔽LDL和HDL2。
第二试剂的组分：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点16～34点。结果与沉淀法对照，实施例3测定的相关系数为0.938。如图3所示，本实施例的方法与沉淀法显示出良好的相关性。
实施例4
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
第一试剂的组分为：
35mM MOPS缓冲液，
6.25mM硫酸镁，
25g/L聚乙二醇6000，
2.0g/L皂角苷，
0.010％Tergitol 15-S-12，
2.0KU/L胆固醇酯酶，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
3MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300
0.2mM EDTA，和
5.0g/L牛血清蛋白。
第二试剂的组分为：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点16～34点。如图4所示，本实施例的方法与沉淀法显示出良好的相关性。
实施例5
本实施例与实施例1基本一致，不同之处在于：
第一试剂的组分为：
40mM MOPS缓冲液，
2.5mM硫酸镁，
20g/L聚乙二醇4000，
0.20％Tergitol NP-10，
1.0％Pluronic F88，
0.02g番茄素，
2.0KU/L胆固醇酯酶，
3.5KU/L胆固醇氧化酶，
4MU/L过氧化氢酶，
51mM氯化钠，
0.03％Proclin-300
0.2mM EDTA，和
5.0g/L牛血清蛋白。
在本实施例中，遮蔽剂未采用皂素，将皂素替换为番茄素，番茄素的浓度为0.1g/L～0.5g/L。
第二试剂的组分为：
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点16～34点。如图5所示，本实施例的方法与市售试剂盒显示出良好的相关性。
对照例1
本对照例1与实施例1基本一致，不同之处在于：
本对照例1未采用皂素。
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点16～34点。如图6所示。
对照例2
本对照例2与实施例1基本一致，不同之处在于：
本对照例2未采用4-氨基安替比林。
在日立7180全自动生化分析仪上，150μL上述第一试剂与2.0μL临床人血清试样反应5分钟，然后加入50μL第二试剂，在主/副546nm/660nm波长处采用两点终点法，读点16～34点。如图7所示。
上述实施例和对照例的相关系数见表1。
表1
| 分组 | 相关系数R |
| 实施例1 | 0.9547 |
| 实施例2 | 0.9349 |
| 实施例3 | 0.9376 |
| 实施例4 | 0.9153 |
| 实施例5 | 0.9088 |
| 对照例1 | 0.8747 |
| 对照例2 | 0.8566 |
从表1及图1-图7可以看出，实施例1取得了最佳的效果，其检测结果更接近于沉淀法结果，而对照例1和对照例2的效果明显低于本发明的实施例。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法，用于非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将试样与含有第一表面活性剂、脂蛋白胆固醇遮蔽剂和二价金属离子的第一试剂混合反应，得第一反应液，所述第一试剂用于清除所述试样中高密度脂蛋白3胆固醇以外的脂蛋白胆固醇，以及遮蔽全部脂蛋白胆固醇；
(2)将第一反应液与含有第二表面活性剂的第二试剂混合反应，得第二反应液；
(3)读取第二反应液在色原化合物相应波长处的吸光度值，计算高密度脂蛋白3胆固醇的含量。
2.一种高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，应用于权利要求1的定量方法，其特征在于，包括以下组分：
第一试剂，包括色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂；
第二试剂，包括第二缓冲液、过氧化物酶、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂。
3.根据权利要求2所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，其特征在于，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液均为MOPS缓冲液或MOPSO缓冲液。
4.根据权利要求2所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，其特征在于，所述第一稳定剂为抗坏血酸氧化酶、牛血清白蛋白、氯化钠、EDTA中的一种或多种，所述第一防腐剂为Proclin-300，所述第二防腐剂为叠氮钠。
5.根据权利要求4所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，其特征在于，所述第一稳定剂由牛血清蛋白、氯化钠和EDTA组成，含量分别为2～5g/L、25～55mmol/L和0.1～2mmol/L，所述第二稳定剂为牛血清蛋白，含量为0.2～5g/L，所述遮蔽剂包括硫酸葡聚糖、肝素和聚乙二醇，含量分别为0.5％～1.0％、300U/L～2000U/L和0.5％～3.0％，所述第一防腐剂和所述第二防腐剂的浓度分别为0.01～0.5％和0.1～0.3％。
6.根据权利要求5所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，其特征在于，所述遮蔽剂还包括皂素，浓度为0.1g/L～2g/L。
7.根据权利要求2所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂，其特征在于，所述二价金属离子的浓度为2～20mmol/L，所述第一表面活性剂的浓度为0.1％～0.5％，所述胆固醇酯酶的含量为0.5～5KU/L，所述胆固醇氧化酶的含量为1～3.5KU/L，所述过氧化氢酶的含量为1～10MU/L，所述第一缓冲液的浓度为35～50mmol/L，所述过氧化物酶的含量为2～10KU/L，所述4-氨基安替比林的浓度为0.4～40mmol/L。
8.根据权利要求2～7任意一项所述的高密度脂蛋白3胆固醇的测定试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂、遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂和第一稳定剂混合搅拌，调节pH至6.0～7.5，再加入所述胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶，得所述第一试剂；
(2)将所述第二缓冲液、4-氨基安替比林、第二稳定剂、第二防腐剂和第二表面活性剂混合搅拌，调节pH至6.0～7.5，再加入所述过氧化物酶，得所述第二试剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合搅拌的步骤包括：
先将所述色原化合物、二价金属离子、第一表面活性剂混合搅拌，得第一混合液；
再将所述遮蔽剂、第一缓冲液、第一防腐剂混合搅拌，得第二混合液；
将所述第二混合液滴入所述第一混合液中，搅拌均匀，使温度保持在20～30℃以下，再加入所述第一稳定剂搅拌均匀。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合搅拌的步骤包括：
将所述第二缓冲液、第二表面活性剂和4-氨基安替比林混合，加水溶解得第三混合液；
将所述第二稳定剂和第二防腐剂加入所述第三混合液中，搅拌溶解保持在30℃下静置1～2h。
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