CN111918962A

CN111918962A - 从人脐带中分离干细胞的方法

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Publication number: CN111918962A
Application number: CN201980023108.3A
Authority: CN
Inventors: 赵显哲; 李我英
Original assignee: Akerso Stem Cell Antibiotic Therapy Co ltd
Current assignee: Akerso Stem Cell Antibiotic Therapy Co ltd
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-11-10
Also published as: US20210009944A1; EP3778873A4; WO2019190246A1; EP3778873A1; JP7064254B2; JP2021514680A; US12391917B2; KR102015502B1

Abstract

本发明涉及一种分离源自脐带的干细胞的方法，更具体地，涉及一种分离源自脐带的干细胞的方法，通过该方法可以从具有一定尺寸的脐带中分离大量干细胞。本发明的分离方法无需酶处理便可从脐带组织中分离干细胞，因此在显著抑制施加至细胞的胁迫压力方面具有巨大优势。此外，与通过常规分离方法分离的干细胞相比，通过本发明的分离方法分离的干细胞具有优异的细胞增殖潜力。

Description

从人脐带中分离干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种分离源自脐带的干细胞的方法，更具体地，涉及一种从具有特定大小的脐带中分离大量间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是可以分化为构成生物组织的多种细胞的细胞。干细胞统指可从胚胎组织、胎儿组织和成年人组织中获得的未分化的细胞。就其分化能力而言，干细胞可分为多能干细胞、专能干细胞和单能干细胞。多能干细胞具有分化为所有类型细胞的潜能，其包括胚胎干细胞(ES细胞)和诱导的多能干细胞(iPS细胞)。专能干细胞和/或单能干细胞可以是例如成年干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。

干细胞的利用被认为是治疗不治之症的新选择(韩国专利公开第2015-0016117号)。迄今为止，已经提出了器官移植和基因疗法来治疗不治之症，但是由于免疫排斥，器官不足或缺乏关于载体发展和疾病基因的知识，有效的实际应用仍然受到限制。

在这种情况下，人们对干细胞的研究兴趣越来越高，并且提出了利用干细胞再生器官并治疗帕金森病、糖尿病和脊髓损伤的各种可能性。

存在几种获得干细胞源的方法。最近提出了在不涉及道德问题的情况下通过iPS细胞获得成体干细胞的新可能性，但它们仍处于研究的早期阶段，并需要科学验证实际选择方案。

作为解决上述问题的方案，已经出现了利用例如骨髓和脂肪的成体干细胞源的技术。然而，干细胞难以在一定程度上分化，特别是骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞的连续传代会导致干细胞迅速老化。此外，老化的骨髓干细胞本身难以传代培养。换句话说，老年人或患有慢性疾病的患者的干细胞质量下降。

具体而言，发现从老年供体获得的干细胞形成集落的能力差、增殖率低且分化潜能差，从患有例如骨关节炎的慢性疾病的患者获得的干细胞与从正常群体获得的干细胞相比，其增殖能力和分化潜能下降。

患者抱怨在获取他们的干细胞时感到不适，并且由于干细胞的质量低下，大多数干细胞也无法使用。针对同种异体间充质干细胞的移植或治疗，迫切需要提供足够量的高质量干细胞，以确保快速使用干细胞并确定干细胞移植的适合性，例如，通过测试移植所必需的传染性标志物。即，常规技术在提供足够量的干细胞方面受到限制，因为它们在分离和培养干细胞中具有局限性。

分娩后丢弃的生物学废物由最年轻的细胞组成，其是成体干细胞的来源。这样的生物学废物组织包括脐带血、脐带、胎盘和羊膜。特别地，脐带血已被认为是用于治疗应用的造血干细胞的来源。但是，由于源自脐带血的间充质干细胞的分离成功率非常低，因此在保存后未从脐带血中分离间充质干细胞时可能引起许多问题。Hows等人和Wexler等人报道了不能从脐带血中分离间充质干细胞(Hows，1992；Wexler，2003；Pojda，2005；Bieback，2004)。因此，从脐带血中分离间充质干细胞的成功率不是非常高。

脐带组织已成为细胞治疗的新来源。脐带是胎儿组织，因此是可以从中获取除胚胎外的干细胞的最年轻的组织。因此，使用脐带基本上可以防止干细胞的质量由于年龄和各种疾病而变差，因此其根本的优点是可以避免胚胎干细胞和成体干细胞的缺点。特别地，报道了源自脐带的干细胞形成了大量的CFU-F、具有更快的增殖速度、且可以比骨髓来源的干细胞传代更多次(Karahuseyinoglu，2007；Lund，2007；Baksh，2007；Lu，2006)。

因此，需要开发一种从脐带中分离大量干细胞，同时尽可能保持其活性的技术。

提供背景技术的描述仅是为了更好地理解本发明的背景，而不应被认为对应于本领域技术人员已知的现有技术。

发明内容

本发明解决的问题

本发明人认真且深入地进行了研究，以开发一种从脐带组织制备大量干细胞的方法。结果，本发明人设计了用于分离具有高增殖能力的大量干细胞的策略，并且基于该策略发现当移植和培养脐带组织时可以大规模制备干细胞。基于该发现已经完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种分离源自脐带的干细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供通过该方法获得的源自脐带的干细胞。

本发明的另一个目的是提供一种细胞治疗剂，其包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞。

本发明的又一个目的是提供一种药物组合物，其包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞。

通过以下详细的描述、权利要求和附图，本发明的其他目的和优点将变得更加明显。

用于解决问题的手段

本发明的一个方面提供了一种分离源自脐带的干细胞的方法，所述方法包括(a)将分离的脐带组织破碎为宽度为2mm至4mm，长度为2mm至4mm的外植体，和(b)在培养基中培养外植体。

培养基可以以每克脐带组织0.5ml至3.0ml的量添加。

培养基可以选自Dulbecco最低限度必需培养基(DMEM)、RPMI、Ham's F-10、Ham'sF-12、α最低限度必需培养基(α-MEM)、Glasgow最低限度必需培养基(GMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)及其组合。

可将外植体培养至每单位面积(cm²)0.0007g至0.0068g。

步骤(b)可以进行60分钟至120分钟。

本发明的另一个方面提供了通过该方法获得的源自脐带的干细胞。

本发明的另一个方面提供了一种细胞治疗剂，其包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞。

分化的细胞可以选自源自中胚层的细胞、源自内胚层的细胞、源自外胚层的细胞及其组合。

分化的细胞可以选自神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞/韧带细胞、肌细胞及其组合。

细胞治疗剂还可以包含一种或多于一种选自蛋白质和肽制剂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子和基因治疗剂的成分。

细胞治疗剂还可以包含一种或多于一种选自抗炎药、干细胞募集因子和血管生长因子的成分。

可以以包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞的可注射制剂的形式提供细胞治疗剂，或者可以将其负载到载体上。

本发明的又一个方面提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞。

药物组合物可用于预防或治疗骨、软骨、肌肉、腱或韧带疾病。

药物组合物可用于预防或治疗骨代谢疾病。

骨代谢疾病可能是骨质疏松症、佩吉特病、牙周病、骨转移癌或类风湿关节炎。

发明效果

本发明的特征和优点概括如下：

(i)本发明的方法可有效地从脐带分离干细胞。

(ii)与使用常规方法相比，本发明的方法可用于从相同尺寸的脐带中分离大量的干细胞。

(iii)本发明方法的巨大优势在于，因为无需酶处理便可从脐带组织中分离干细胞，因此可以显著抑制施加至细胞的胁迫压力(stress)。此外，与通过常规分离方法获得的干细胞相比，通过本发明的方法获得的干细胞具有优异的增殖能力。

换句话说，本发明的方法通过移植能够简单有效地从具有指定大小的脐带中分离大量的干细胞，因此适用于需要大量干细胞的应用或用于治疗应用。

附图说明

图1A显示了在实施例1至5中制备的组织外植体的数量随切碎时间的变化，图1B显示了在实施例1至5中制备的不同大小的外植体分离的细胞数，图1C显示了在培养实施例1至5中制备的不同大小的外植体后形成的集落的大小。

图2A显示了通过在含有不同量的培养基(0ml/g、0.5ml/g和1ml/g)的培养皿中移植脐带组织而获得的全部破碎组织，图2B显示了通过在含有不同量的培养基(0ml/g、0.3ml/g、0.5ml/g、1ml/g、2ml/g、3ml/g、4ml/g和5ml/g)的培养皿中移植脐带组织而分离的细胞总数。

图3A显示了从不同重量的外植体分离的源自脐带的干细胞中的CFU-F数量，其中CFU-F数量是通过结晶紫染色确定的，下图显示了CFU-F的数量和大小，图3B显示了从不同重量的外植体分离的源自脐带的干细胞的数量。

图4A显示了实施例8中分离的源自脐带的干细胞的数量，图4B显示了实施例8中制备的源自脐带的干细胞的CFU-F数量，其中CFU-F数量是通过结晶紫染色确定的，下图显示了CFU-F的数量和大小。

图5A显示了光学显微镜图像，其显示了实施例9中制备的源自脐带的干细胞的形态，图5B显示了在对比例1中通过酶促法制备的源自脐带的干细胞和由实施例9制备的源自脐带的干细胞的CPDL的取决于培养时间的变化，图5C显示了在对比例1中通过酶促法制备的源自脐带的干细胞和在实施例9中制备的源自脐带的干细胞的群体倍增时间(PDT)值。

图6显示了在实施例9中分离的源自脐带的干细胞的免疫分型特征，使用流式细胞仪对其进行了分析。

图7A至图7D显示了在实施例9中分离的源自脐带的干细胞对于脂肪形成(图7A)、成骨作用(图7B)、软骨形成(图7C)和肌腱形成(图7D)的分化潜能。

具体实施方式

本发明的一个方面提供了一种分离源自脐带的干细胞的方法。

胚胎干细胞具有伦理问题。诱导的多能干细胞提供了新的可能性，但仍处于研究的早期阶段。因此，诱导的多能干细胞需要进行科学验证以用于实际的选择方案。骨髓和脂肪干细胞目前作为成体干细胞备受关注，但是它们具有其频率、增殖能力和分化潜能随年龄的增长而降低的问题。骨髓和脂肪干细胞的另一个问题是需要进行侵入性治疗才能获得分离出干细胞的组织。

作为克服这些局限性和问题的研究结果，本发明人发现可以从来自脐带的具有指定大小的外植体以高产率获得具有提高的体外增殖能力和显著的分化潜能的干细胞而无需进行酶促或额外处理。基于该发现已经完成了本发明。

如本文所使用的，术语“脐带”指将胎盘与胎儿连接的带。

如本文所使用的，术语“源自脐带的干细胞”指从脐带及其相关组织分离的干细胞，优选从脐带血、脐带静脉内皮下膜、脐带血管周围基质、脐带Wharton胶质、脐带羊膜下缘和羊膜、羊水、胎盘和绒毛膜分离的干细胞。源自脐带的干细胞更优选是从脐带血、脐带静脉血管内皮下膜、脐带血管周围基质、脐带Wharton胶质或脐带羊膜下缘分离的细胞。

特别地，与其他器官和组织不同，因为在分娩后将脐带丢弃，所以在分娩过程中无需进行特殊操作或进行医学处理即可容易地获得脐带。已知脐带含有大量的干细胞。由脐带体外培养干细胞需要满足各种要求。即使在培养时，也仅收集到非常少量的干细胞，从而限制了它们在治疗剂开发中的用途。

具体地，方法包括(a)将分离的脐带组织破碎为宽度为2mm至4mm，长度为2mm至4mm的外植体，和(b)在培养基中培养外植体。

根据本发明的优选实施方案，方法还包括(c)在培养后收集源自脐带的干细胞。

脐带是可以从中获得干细胞的代表性组织。由于可以在不进行特殊操作或药物治疗的情况下取出脐带，并且在分娩时没有副作用，因此在分离和培养干细胞的组织的需求和供应方面没有问题。另外，脐带不太可能被异源细胞污染，因此有利于干细胞的分离和培养以制备用于不治之症的治疗剂。

然而，如上所述，源自脐带的干细胞非常麻烦并且难以体外培养。即使进行培养，由于源自脐带的干细胞的产量相当低，只能收集到非常少量的源自脐带的干细胞，或者源自脐带的干细胞的分化潜能非常低。

因此，本发明的方法旨在收集大量干细胞并分离具有增强的分化潜能的干细胞。

首先，将分离的脐带组织破碎为宽度为2mm至4mm，长度为2mm至4mm的外植体(步骤(a))。来自分离的脐带组织的30％或大于30％，优选50％或大于50％，更优选70％或大于70％的破碎外植体的宽度为2mm至4mm，长度为2mm至4mm。最优选地，50％至70％的外植体具有2mm至4mm的宽度和2mm至4mm的长度。可以将组织切成六面体外植体，其宽度为2mm至4mm，长度为2mm至4mm，高度为2mm至4mm。外植体的均匀大小导致从外植体分离的细胞数量显著增加。这可以从以下实验实施例中看出。为了分离源自脐带的干细胞，步骤(a)可以包括将脐带组织引入培养基中，并将脐带组织切成宽度为2mm至4mm且长度为2mm至4mm的外植体。这种引入有利于制备均匀大小的外植体，并且能够用最少的剪切将少量组织切成均匀的外植体，这减少了污染的可能性，因此使得在后续步骤中易于分离和培养干细胞。

以每克脐带组织0ml至10ml，优选0ml至5.0ml，更优选0.5ml至3.0ml的量添加培养基。如果每克脐带组织的培养基的量超过10.0ml，则可能分离出数量减少的细胞。

然后，将外植体在培养基中培养(步骤(b))。培养外植体以达到每单位培养皿面积(cm²)0.0001g至0.05g，优选0.0006g至0.03g，更优选0.0006g至0.0135g，最优选0.0007g至0.0068g。小于每单位培养皿面积(cm²)0.0001g或超过每单位培养皿面积(cm²)0.05g的量的外植体可以显著地减少待分离的细胞数。

步骤(b)优选进行1分钟至600分钟，优选10分钟至180分钟，更优选30分钟至120分钟，最优选60分钟至120分钟。外植体培养少于1分钟或超过600分钟可能会显著地减少待分离的细胞数。

当满足所有上述培养条件时，可以从1g外植体中分离1×10⁶个至5×10⁶个，优选1.5×10⁶个至2×10⁶个细胞。这证明了本发明的方法优于常规方法，如表1所示。

表1

分离方法	从1g外植体中分离的细胞数
		满足所有条件的本发明的方法	1,820,000±44,000
Hua，2014<sup>1)</sup>	67,000±
		Montanucci2011<sup>2)</sup>	300,000±
Kim，2013<sup>3)</sup>	130,000±20,000
		Yan,2013<sup>4)</sup>	150,000±
Chatzistamatiou，2014<sup>5)</sup>	302,000±66,000
		Yoon，2013<sup>6)</sup>	489,000±320000
Jo2008<sup>7)</sup>	399,000±522000

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培养基可以指可以在体外维持源自脐带的干细胞的活性或者可以诱导源自脐带的干细胞的增殖的媒介。培养基可以是通常用于培养哺乳动物细胞的任何培养基。用于培养基的可商购获得的产品的实例包括Dulbecco最低限度必需培养基(DMEM)、RPMI、Ham'sF-10、Ham's F-12、α最低限度必需培养基(α-MEM)、Glasgow最低限度必需培养基(GMEM)和Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)及其组合。

培养基还可以包含血清(即动物包括人的血清)和/或一种或多于一种可促进源自脐带的干细胞增殖的生长因子。这些生长因子的实例包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、富血小板血浆(PRP)、血小板裂解物(PL)和干细胞因子(SCF)。

生长培养基可以包含一种或多于一种抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。

培养基可以由DMEM：Ham's F12(1:1)、胎牛血清、EGF、bFGF、IGF和庆大霉素组成。更具体地，培养基可以由70％至95％(体积％)的DMEM：Ham's F12(1:1)、5％至15％(体积％)的胎牛血清、5ng/ml至50ng/ml的EGF、0.5ng/ml至10ng/ml的bFGF、5ng/ml至50ng/ml的IGF和5mg/ml至50mg/ml的庆大霉素组成。

培养后，收集源自脐带的干细胞。可以将收集的源自脐带的干细胞扩增。对扩增方法没有特别限制，但是优选通过单层培养进行扩增。将收集的源自脐带的干细胞接种在培养皿中。此后，当将干细胞培养至覆盖培养皿表面积的60％至90％时，通过用胰蛋白酶-EDTA处理将它们从培养皿中分离，然后再次接种到新的培养皿中。可以重复该传代以扩增细胞，从而为治疗剂量提供所需数量的细胞。

本发明的方法使得能够从少量的脐带无限次地重复培养源自脐带的干细胞，从而可以在不对脐带组织重复取样的情况下尽可能多地分离干细胞以治疗不治之症。

源自脐带的干细胞是间充质干细胞，其可以分化为内胚层、中胚层、外胚层以及由此获得的组织和组织细胞。

根据本发明的优选实施方案，源自中胚层的细胞选自成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞及其组合。

根据本发明的一个实施方案，源自脐带的干细胞具有成脂、成骨、成软骨和形成腱/韧带的分化潜能。

源自脐带的干细胞的倍增时间为30小时至50小时，这表明它们具有优异的体外生长能力。倍增时间指一个细胞分裂为两个细胞所需的时间。源自脐带的干细胞具有比通过常规培养方法获得的倍增时间为60小时的间充质干细胞更好的体外生长能力。因此，本发明的方法可以确保获得在短时间内治疗不治之症所需的有效剂量的干细胞。

源自脐带的干细胞可以是可分化为各种细胞类型的间充质干细胞。这种细胞类型的实例包括但不限于神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞/韧带细胞和肌细胞。

源自脐带的干细胞可以自发分化成为的细胞类型没有特别限制，但是优选为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞/韧带细胞和肌细胞。

本发明的另一个方面提供了一种细胞治疗剂，其包含作为活性成分的由本方法获得的源自脐带的干细胞或其分化的细胞。

细胞治疗剂可以直接使用源自脐带的干细胞，而无需涉及特殊的分化过程。或者，细胞治疗剂可以使用将源自脐带的干细胞分化成的细胞用于靶向细胞治疗。

对细胞治疗剂中使用的分化细胞没有特别限制，例如可以选自神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞、施万细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞/韧带细胞、肌细胞及其组合。

根据本发明优选的实施方案，细胞治疗剂还可以包含一种或多于一种选自蛋白质和肽制剂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子和基因治疗剂的成分。

除了干细胞分化为内胚层、中胚层和外胚层所产生的影响外，本发明的细胞治疗剂还可得益于源自MSC的细胞外囊泡的旁分泌作用，所述源自MSC的细胞外囊泡包括干细胞分泌的含miRNA的外排体和微泡以及基质。干细胞的旁分泌作用在本领域中是众所周知的(韩国专利公开第2017-0103697号(肝纤维化的治疗)、美国专利公开第2015-0190429号(抗炎和免疫抑制作用)、欧洲专利公开第3145493号(肺部疾病的治疗)和中国专利公开第101854941号(急性肾衰竭的治疗)。

源自脐带的干细胞或其分化的细胞在细胞治疗剂中的使用是没有特别限制的。源自脐带的干细胞或其分化的细胞可以通过本领域已知的任何合适的方法来使用。源自脐带的干细胞优选负载在载体上。

载体可以是不会对宿主引起任何实质性有害反应的载体，并且是任选可生物降解的，或可以从生物系统中自然除去和/或可以化学引入到生物系统中。载体不限于特定种类，但优选为含有纤维蛋白、血小板裂解物、富血小板血浆(PRP)或天然或合成聚合物的凝胶或水凝胶形式。

源自脐带的干细胞可以与水凝胶混合使用。水凝胶材料没有特别限制，但是天然聚合物，优选胶原蛋白水凝胶。胶原蛋白水凝胶的体内降解速率可以通过改变胶原蛋白浓度来控制。水凝胶的使用可以防止细胞在注射时通过血液流失，并可以减少损伤部位的炎症细胞和酶对细胞的损害。

抗炎药可保护用水凝胶移植的源自脐带的干细胞免于过度的炎症反应。干细胞募集因子和血管生长因子分别用于诱导周围神经中的干细胞募集和血管生长，从而实现增强的细胞再生。

抗炎药的实例包括但不限于COX抑制剂、ACE抑制剂、水杨酸盐、类固醇和合成代谢类固醇，包括地塞米松和睾酮及其前体。

干细胞募集因子的实例包括但不特别限于IGF、bFGF、PDGF和EGF。

血管生长因子包括但不特别限于EGF、PDGF、VEGF、ECGF和血管生成素。

根据本发明优选的实施方案，细胞治疗剂可以与一种或多于一种选自蛋白质和肽制剂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子和基因治疗剂的成分组合使用。

可以以包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞的可注射制剂的形式提供本发明的细胞治疗剂，或者可以将其负载到支撑体或载体上。

本发明的药物组合物得益于干细胞再生组织的能力，其基于组织再生能力而对疾病具有预防或治疗作用，并表现出由干细胞的旁分泌作用引起的抗炎和免疫调节作用。

基于其再生组织的能力及其对疾病的预防或治疗作用，本发明的药物组合物可用于预防或治疗各种疾病，包括但不限于1)心脏、血液和血管的损害，以及由此在循环系统中引起的疾病，2)皮肤、头发、脂肪和指甲的损害，以及由此在外皮系统中引起的疾病，3)骨、软骨、腱、韧带和肌肉的损害，以及由此在骨骼系统中引起的疾病，4)生殖器例如卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精液和前列腺的损害，以及由此在生殖系统中引起疾病，5)对唾液腺、食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肠、直肠和肛门的损害，以及由此在消化系统中引起的疾病，6)体液、电解质平衡、肾、输尿管、膀胱和尿道的损害，以及由此在泌尿系统中引起的疾病，7)气管、咽、喉、支气管、肺和横隔膜的损害，以及由此在呼吸系统中引起的疾病，8)下丘脑、脑垂体、松果体或松果腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺和内分泌腺的损害，以及由此在内分泌系统中引起的疾病，9)免疫系统的损害以及由此引起的疾病，10)淋巴结和血管的损害以及在淋巴系统中引起的疾病，11)骨骼肌、平滑肌和心肌的损害，以及由此在肌肉系统中引起的疾病，和12)脑、脊髓、植物神经和周围神经的损害，以及由此在神经系统中引起的疾病。

基于其抗炎和免疫调节作用，本发明的药物组合物可用于治疗各种疾病，包括但不限于1)关节疾病，包括关节炎、白塞病(Behcet’s disease)和痛风，以及各种器官和组织中的炎性疾病，2)自身免疫性疾病，包括狼疮、特应性和类风湿性关节炎，3)肿瘤，包括癌症，4)传染病和休克，5)移植后的不良反应和GVHD。

根据本发明的优选实施方案，药物组合物用于预防或治疗骨、软骨、肌肉、腱或韧带疾病。

本发明的药物组合物可用于预防或治疗骨代谢疾病。优选地，本发明的药物组合物用于预防或治疗骨质疏松症、佩吉特病(Paget’s disease)、牙周病、骨转移癌或类风湿性关节炎的目的。

本发明的方法能够在60分钟至120分钟内培养大量的源自脐带的干细胞。另外，根据本发明的方法，有效量的源自脐带的干细胞的PDT为30小时至50小时，这表明其优异的体外生长能力，并且适用于可以在短时间内获得的细胞治疗剂。

根据本发明的源自脐带的干细胞的优异的体外增殖能力和多潜能性使药物组合物受益于再生组织的能力，其基于组织再生能力而具有对疾病的预防或治疗作用，和/或显示出抗炎和免疫调节作用。

本发明的药物组合物包含一种或多于一种通常用于配制的药学上可接受的载体。这些药学上可接受的载体的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。本发明的药物组合物还可以包含选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂的至少一种添加剂。合适的药学上可接受的载体和制剂的详细说明可见于Remington’sPharmaceutical Sciences(第19版，1995年)中。

本发明的药物组合物可以口服施用或肠胃外施用，优选肠胃外施用。例如，本发明的药物组合物可以静脉内注射、局部注射或腹膜内注射。

根据本发明的药物组合物的合适剂量可以根据各种因素而变化，例如根据配制方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别和病理状况、饮食、施用时间和途径、排泄率以及响应能力而变化。具有本领域普通技术的医师可以容易地确定并开出所需治疗或预防有效量的药物组合物。

本发明的药物组合物可以以单位剂型制备或与药学上可接受的载体和/或赋形剂通过本领域普通技术人员可以容易实施的合适方法一起分配在多剂量容器中。可以以包含作为活性成分的源自脐带的干细胞或其分化的细胞的可注射制剂的形式提供本发明的药物组合物，或者可以将其负载到载体上。本发明的药物组合物可以任选地与一种或多于一种选自蛋白质和肽制剂、糖胺聚糖、蛋白聚糖、生长因子和基因治疗剂的其他物质组合使用。

本发明的实施方式

会参考以下实施例更具体地说明本发明。对于本领域技术人员明显的是，本发明的范围不受根据本发明的主旨的这些实施例的限制。

实验方法

1.成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)测定

在培养的第14天，将培养皿用DPBS洗涤两次，并将细胞在4％的多聚甲醛中固定20分钟，并用0.1％结晶紫溶液(Merck，Darmstadt，德国)染色10分钟。将由≥50个染色细胞组成的细胞聚集体定义为CFU-F。测量CFU-F的数量和面积。

2.干细胞增殖能力的测定(生长动力学测定)

通过测量干细胞的累积群体倍增水平(CPDL)和群体倍增时间(PDT)来分析干细胞的增殖能力。干细胞传代9次，共60天的总培养期，包括分离干细胞所需的时间。通过将源自脐带的干细胞以3333个细胞/cm²的密度接种到培养皿中，并通过锥虫蓝排除法测量每次传代的细胞数，从而测量累积群体倍增水平。通过PD＝Log(Nf/Ni)/Log2和PDT＝CT/PD(其中Ni是初始细胞数，Nf是最终细胞数)计算群体倍增时间(PDT)。每个实验重复三次。

3.免疫分型

在第三次传代(P3)后，通过流式细胞术使用细胞分析细胞表面抗原的免疫分型。用DPBS洗涤细胞，以2×10⁵个的密度铺板，离心，并向其中添加冷染色缓冲液(DPBS，0.1％的叠氮化钠和2％的胎牛血清)。

使与异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)缀合的共八种抗体在暗室中于4℃下反应30分钟。抗体是HLA-DR、CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90(其均可从BectonDickinson，圣何塞，加利福尼亚州，美国获得)和CD105(可从Abcam，剑桥，英国获得)。然后，用DPBS洗涤细胞并在1％的多聚甲醛中固定细胞。IgG1-FITC、IgG1-PE和IgG2a-FITC(其均可从Becton Dickinson，圣何塞，加利福尼亚州，美国获得)用作同型对照。使用BectonDickinson FACSAria和FACSDiva软件(Becton Dickinson，圣何塞，加利福尼亚州，美国)分析数据。共获得了10000个事件。

4.定量实时聚合酶链反应

通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检查脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和腱细胞特异性基因的表达。首先，使用HiYield Total RNA Mini试剂盒(Real BiotechCorporation，台湾)从细胞中提取总RNA。使用分光光度计(NanoDrop，威明顿，特拉华州)在260nm和280nm处测量吸光度后，对外植体中的总RNA进行定量。将1μg的每种总RNA与50μM寡核苷酸(oligo)(dT)和10mM dNTP混合，并将蒸馏水添加到混合物中，直至最终体积为10μl。使反应在65℃下进行5分钟。之后，将反应溶液与10X RT缓冲液、25mM MgCl₂、0.1M DTT、40U/ml RNaseOut和200U/mL Superscript II反转录酶(Superscript II反转录试剂盒(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州))的混合溶液混合。使混合物在50℃下反应50分钟并在85℃下反应5分钟。将所得溶液冷却至4℃，并向其中添加2U/ml核糖核酸酶H(RNaseH)溶液。使反应在37℃下进行20分钟以合成cDNA。Taq-Man基因表达测定法(AppliedBiosystems，福斯特城，加利福尼亚州)用于实时定量以下基因的表达：aP2(测定ID：Hs01086177_m1)、OPN(测定ID：Hs00959010_m1)、聚集蛋白聚糖(测定ID：Hs00153936_m1)、SCX A/B(测定ID：Hs03054634_g1)和GAPDH(测定ID：Hs99999905_m1)。在LightCycler 480(Roche Applied Science，曼海姆，德国)上进行聚合酶链反应。聚合酶链反应由60个变性(95℃/10分钟)和退火(95℃/10秒，60/1分钟，72℃/4秒)的循环组成。聚合在72℃下进行7分钟，并且观察结果。将基因表达与作为对照的GAPDH的表达水平进行量化比较。

实施例

<实施例1-5>源自脐带的干细胞的培养

剖宫产术或阴道分娩后，在征得同意的情况下从一名正常孕妇收集脐带。用补充有抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B(抗生素-抗霉菌溶液；Welgene，大邱，韩国))的不含Ca²⁺、Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gibco)洗涤脐带2至3次，以从外表面上除去残留的血液，然后测量其长度和重量。用剪刀将大量的脐带均匀地切成块，使得每块的宽度为约5cm，长度为约5cm，高度为约5cm。将脐带组织切成不同大小的外植体：宽度、长度和高度均≤1mm(实施例1)、1mm至2mm(实施例2)、2mm至4mm(实施例3)、>4mm(实施例4)、≤10mm(实施例5)。将外植体对齐并接种到含有无菌DMEM培养基的培养皿中。在外植体完全黏附于培养皿之后，将培养基添加至培养皿中。

当细胞在培养皿中生长至约60％至80％的汇合度时，通过用DPBS洗涤两次并用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05％的胰蛋白酶和0.53mM的乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA；Welgene，大邱，韩国)处理3分钟来分离贴壁细胞。然后用锥虫蓝排除法进行细胞染色，计数，并以3333个细胞/cm²的密度连续培养。

<实施例6>使用或不使用用于移植的培养基培养源自脐带的干细胞

剖宫产术或阴道分娩后，在征得同意的情况下从一名正常孕妇中收集脐带。用补充有抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B(抗生素-抗霉菌溶液；Welgene，大邱，韩国))的不含Ca²⁺、Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gibco)洗涤脐带2至3次，以从外表面上除去残留的血液，然后测量其长度和重量。

由于收集的脐带大而黏稠，因此需要大量时间用剪刀切端脐带。为了在短时间内分离大量细胞，向每克收集的脐带组织添加0ml至5ml培养基，然后将脐带组织以宽度2mm至4mm，长度2mm至4mm，高度2至4mm移植。将外植体对齐并接种到培养皿中。在外植体完全附着于培养皿之后，将培养基添加至培养皿中。

<实施例7>在接种不同初始量的脐带后培养源自脐带组织的干细胞

脐带组织被以宽度2mm至4mm，长度2mm至4mm，高度2mm至4mm移植。将外植体对齐并接种到培养皿中。以每单位面积(cm²)培养皿0mg至13.5mg的量添加外植体。在外植体完全黏附于培养皿之后，将培养基小心地添加至培养皿中。

<实施例8>对于不同黏附时间的源自脐带组织的干细胞的培养

将脐带组织以宽度2mm至4mm，长度2mm至4mm，高度2mm至4mm移植。使外植体黏附至培养皿上，并在37℃下的5％CO₂培养箱中放置不同的时间(10分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟)。

<实施例9>满足所有条件时的源自脐带的干细胞的分离

向每克收集的脐带组织添加0ml至2ml的培养基。然后，将脐带组织以宽度2mm至4mm，长度2mm至4mm，高度2mm至4mm移植。将外植体对齐并接种到培养皿中。以每单位面积(cm²)培养皿0.7至6.8mg的量添加外植体。使外植体在5％CO₂培养箱中在37℃下静置60分钟。

<对比实施例1>源自脐带组织的干细胞的培养

剖宫产术或阴道分娩后，在征得同意的情况下从一名正常孕妇中收集脐带。用补充有抗生素(100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml的两性霉素B(抗生素-抗霉菌溶液；Welgene，大邱，韩国))的不含Ca²⁺、Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gibco)洗涤脐带2至3次，以从外表面上除去残留的血液，然后测量其长度和重量。将大的脐带切其约5cm的块，用剪刀均匀切开。

用剪刀和刀将脐带切为具有1mm至2mm的宽度，1mm至2mm的长度和1mm至2mm的高度的外植体。然后，将外植体在补充有0.1％的1型胶原酶(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)和抗生素的低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(LG DMEM；Welgene，大邱，韩国)中在37℃下温和搅拌2小时。在添加相同量的培养基(LG DMEM，10％的胎牛血清(FBS；Welgene，大邱，韩国)和抗生素-抗真菌溶液)后，使用100μm细胞过滤器除去未消化的组织。通过在500g和20℃下离心15分钟收集细胞，并用培养基洗涤两次。通过锥虫蓝排除法对分离的细胞进行计数，以1×10⁴个细胞/cm²的密度在150mm培养皿中铺板，并在5％CO₂培养箱中在37℃下培养。培养3天后，用新培养基替换培养基以除去不黏附在培养皿底部的细胞，并每周2至3次用新培养液替换培养液。

实验实施例1：在实施例1至5和对比实施例1中分离的源自脐带的干细胞的数量的测量

对实施例1至4和对比实施例1中收集的细胞进行计数。结果如图1和表2所示。

在图1中，(A)显示了在实施例1至4中随通过剪刀切碎的时间变化的源自脐带的干细胞的数量变化，(B)显示了由实施例1至5中制备的不同大小的外植体分离的源自脐带的干细胞数量，和(C)显示了在用实施例1至5中制备的不同大小的外植体培养后由源自脐带的干细胞形成的集落的大小。

如图1所示，在实施例3中分离的源自脐带的干细胞的数量为1.86±0.49×10⁶/g。从CFU-F染色的结果也获得了相同的结果。即，实施例3中分离的细胞数量大于对比实施例1和实施例1、2、4和5中的细胞数量。还证实了1分钟的剪切最适合于制备实施例3的外植体，其大小对于有效的细胞分离是理想的。

1分钟的剪切结果是宽度为2mm至4mm、长度为2mm至4mm、高度为2mm至4mm的外植体占所有外植体的≥50％。由实施例3的外植体分离的源自脐带的干细胞非常容易增殖，这通过以下实验实施例得到证实。

表2

外植体的大小	每克外植体中分离的细胞数	每克外植体的CFU-F面积(cm<sup>2</sup>)
			10mm(实施例5)	148,720±122,661	1.0±0.2
5mm(实施例4)	264,138±144,990	1.2±0.5
			2-4mm(实施例3)	1,855,818±490,340	9.0±0.4
1-2mm(实施例2)	320,000±208,046	4.2±1.2
			＜1mm(实施例1)	123,333±61,283	0.8±0.3
对比实施例1	432,830±258,225	4.5±0.0

实验实施例2：实施例6中分离的细胞数的测量

图2中，(A)显示了通过在含有不同量的培养基(0ml/g、0.5ml/g和1ml/g)的培养皿中移植脐带组织而获得的全部破碎组织，(B)显示了通过在含有不同量的培养基(0ml/g、0.3ml/g、0.5ml/g、1ml/g、2ml/g、3ml/g、4ml/g和5ml/g)的培养皿中移植脐带组织分离的细胞总数。

表3

培养基的量	外植体的数目(个)
		0ml/g	19.5±3.5
0.5ml/g	24.0±4.1
		1.0ml/g	27.5±2.6

表4

培养基的量	每克外植体中分离的细胞数(个)
		0.5ml/g	2，190,000±189,934
1.0ml/g	1,990,000±328,976
		2.0ml/g	2,233,333±267,815
3.0ml/g	1,510,000±442,691
		4.0ml/g	1,446,667±285,832
5.0ml/g	1,503,333±311,328

从图2以及表3和表4的结果可以看出，在培养基中脐带组织被切为更大数量的小块。将不同量(0ml、0.3ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml)的培养基添加至1克的脐带组织中，将脐带切开，并在达到80％的汇合度时对细胞进行计数。将脐带组织切为小的外植体，分离的细胞数随培养基的量增加而减少。

发现每克脐带组织的培养基量为0ml至5.0ml，优选0.5ml至3ml。具体地，与没有培养基的情况相比，在有培养基的情况下切碎脐带组织时，外植体的数量增加1.4倍。

与使用其他尺寸的外植体时相比，当使用实施例3的源自脐带的干细胞时，获得了显著更大的CFU-F面积。特别是，实施例3的外植体的CFU-F总面积为9.0±0.4cm²，其中对于每克外植体，2mm至4mm大小的外植体占所有外植体的≥50％，实施例2的外植体的CFU-F总面积为4.2±1.2cm²，对比实施例1的外植体的CFU-F总面积为4.5±0.0cm²。

实验实施例3：从不同量的外植体中分离的细胞数的测量

将外植体转移至150mm培养皿中，并研究从不同重量(g)的外植体中分离的细胞数的变化。在150mm培养皿中排列0.1g、0.5g、1.0g和2.0g的2mm至4mm的外植体，然后培养2周。当达到80％的汇合度时，测量分离的细胞数并测量CFU-F的数目。

图3中，(A)显示了实施例7的从不同重量的外植体分离的源自脐带的干细胞中的CFU-F数量，其中CFU-F数量是通过结晶紫染色确定的，下图显示了CFU-F的数量和大小，(B)显示了从不同重量的外植体分离的源自脐带的干细胞的数量。

表5

接种的脐带的量	每克外植体的CFU-F面积(cm<sup>2</sup>)
		0.1g	2.2±0.2
0.5g	4.8±5.7
		1.0g	21.5±1.6
2.0g	21.2±4.9

如图3和表5所示，从不同重量的外植体中分离的细胞数没有显著差异，但集落的数量随外植体重量的增加而增加。特别地，从0.1g、0.5g、和1.0g或2.0g中分离的源自脐带的干细胞的集落数存在显著差异，但是从1.0g和2.0g中分离的源自脐带的干细胞的集落数无差异。

此外，当考虑每单位面积的培养皿的外植体重量(0.0007g/cm²至0.0135g/cm²)时，从培养皿中2.0g外植体中分离的源自脐带的干细胞的数量减少。即，脐带组织的过大重量(实施例5)导致从不同重量的外植体中分离的源自脐带的成体干细胞的数量减少。这些结果表明，当将外植体培养至0.0007g/cm²至0.0068g/cm²时，可以获得最大数量的源自脐带的干细胞。

实验实施例4：不同黏附时间培养后分离的源自脐带的干细胞数量的分析

使实施例8中制备的源自脐带的干细胞黏附至CO₂培养箱，然后培养10分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟。测量黏附在培养箱中的细胞数量，并测量CFU-F的数量以评估黏附时间的影响。

图4中，(A)显示了实施例8中分离的源自脐带的干细胞的数量，(B)显示了实施例8中制备的源自脐带的干细胞的CFU-F数量，其中CFU-F数量是通过结晶紫染色确定的，下图显示了CFU-F的数量和大小。

表6

如图4和表6所示，随着外植体的黏附时间增加，分离的细胞数量逐渐增加。当外植体黏附60分钟时，观察到分离的细胞的最大数量。

但是，当黏附时间超过120分钟时，分离的细胞数量开始逐渐减少。当测量CFU-F的数量时，也观察到相同的趋势。具体地，黏附时间为60分钟时达到CFU-F的最大面积(45.7±6.9cm²)，黏附时间为120分钟和180分钟时CFU-F的面积与黏附时间为60分钟的CFU-F的面积没有显著差异。

综上所述，最优选的是，脐带组织的外植体的宽度、长度和高度各为2mm至4mm，并在培养箱中排列并培养60分钟。

实验实施例5：生长特性

在该实施例中，测量了从培养基中收集的源自脐带的干细胞的群体倍增时间(PDT)。为此，将实施例9中制备的细胞接种并在48孔培养皿中培养。通过PDT＝[(指数期的天数)/((logN2-logN1)/log2)]来计算PDT，其中N1是指数生长期的初始阶段的细胞数，N2是指数生长期结束时的细胞数。

在图5中，(A)显示了光学显微镜图像，其显示了实施例9中制备的源自脐带的干细胞的形态，(B)显示了在对比例1中通过酶促法制备的源自脐带的干细胞的CPDL的取决于培养时间的变化，和(C)显示了在对比例1中通过酶促法制备的源自脐带的干细胞和在实施例9中制备的源自脐带的干细胞的群体倍增时间(PDT)值。

表7

如图5的(A)所示，通过本发明的方法获得的源自脐带的干细胞具有纺锤形，甚至在传代培养后也保持其特征性的成纤维细胞样形状。

如图5的(B)和(C)所示，在培养60天和88天后，实施例9中制备的源自脐带的干细胞的CPDL值分别为35.5±2.36和55.8±1.96，这显著地高于对比实施例1和先前报道的方法所制备的源自脐带的干细胞的CPDL值。

如图5和表7所示，与对比实施例1中分离的源自脐带的干细胞相比，实施例9中制备的源自脐带的干细胞在阶段P2、P5、P7和P9中显示出显著更低的PDT值。即使当传代培养的数目增加时，也没有观察到在实施例9中制备的源自脐带的干细胞的PDT变化。

实验实施例6：免疫分型

如上所述进行免疫分型。通常已知间充质干细胞对CD73、CD90和CD105呈阳性，而对CD11b(或CD14)、CD19(或CD79α)、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性。在通过本发明的方法分离的源自脐带的干细胞显示出这种倾向的假设下，进行该分析。

图6显示了在实施例9中分离的源自脐带的干细胞的免疫分型特征，使用流式细胞仪对其进行分析。结果汇总于表8中。在实施例9中分离的源自脐带的干细胞对CD73、CD90和CD105呈强阳性(＞95％)，但对HLA-DR、CD11b、CD19、CD34和CD45呈阴性(<1.5％)。

表8

标志物	阳性率
		CD73	97.2±4.2
CD90	99.0±1.8
		CD105	95.8±3.9
CD11b	1.4±0.5
		CD19	0.1±0.2
CD34	0.4±0.3
		CD45	0.8±0.3
HLA-DR	1.2±0.9

实验实施例7：源自脐带的干细胞的多潜能性

1)分化为脂肪细胞的能力

评估实施例9中制备的源自脐带的干细胞分化为脂肪细胞的能力。为此，首先，将细胞以8000个细胞/cm²的密度放入培养皿中。达到约60％至80％的汇合度后，将细胞在补充有10％胎牛血清、1％抗生素溶液、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma)、1μM地塞米松、5μg/ml胰岛素(Gibco)和60μM消炎痛(Sigma)的脂肪细胞分化培养基(LG-DMEM)中培养21天。通过油红O(Oil Red O)染色和脂肪细胞标志物的基因表达来测量细胞的分化程度。对于油红O染色，用蒸馏水洗涤培养的细胞一次，在室温下于4％的多聚甲醛中固定1小时，洗涤3次，然后在室温下与0.18％油红O溶液(Sigma)反应10分钟，用蒸馏水洗涤，观察到分化为脂肪细胞。

图7显示了实施例9中分离的源自脐带的干细胞在脂肪形成(A)、骨形成(B)、软骨形成(C)和腱形成(D)中的分化潜能。

如图7的(A)所示，诱导了源自脐带的干细胞向脂肪细胞的分化，然后观察到中性脂质累积(PPARγ2)。中性脂质以红色表示。观察到脂蛋白脂肪酶(LPL)和脂肪细胞蛋白2(aP2)的表达显著增加。具体地，发现脂肪细胞分化标志物aP2在分化细胞中的表达比在未分化的细胞中的表达高355±31.94倍。

2)分化为骨细胞的能力

评估实施例9中分离的源自脐带的干细胞分化为骨细胞的能力。为此，首先，将细胞以8000个细胞/cm²的密度放入培养皿中。在达到约60至80％的汇合度后，将细胞在补充有10％胎牛血清、1％抗生素溶液、100nM地塞米松(Sigma，圣路易斯，密西西比州，美国)、10mMβ-甘油磷酸酯(Sigma)和0.2mM抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)的骨细胞分化培养基(LG-DMEM)中培养21天。通过Von Kossa染色和骨细胞标志物的基因表达来测量细胞的分化程度。对于Von Kossa染色，用蒸馏水洗涤培养的细胞一次，在室温下于4％的多聚甲醛中固定1小时，洗涤3次，然后在60W的灯下与5％的硝酸银溶液(Sigma)反应1小时，用蒸馏水洗涤3次，用5％的硫代硫酸钠处理5分钟，与0.1％核固红溶液反应5分钟，观察到分化为骨细胞。

如图7的(B)所示，证实了细胞外钙的存在，并且分化的细胞中Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)的表达水平显著地高于未分化的细胞中的Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)的表达水平。通过实时PCR测量表达水平。具体地，发现骨细胞分化标志物OPN在分化细胞中的表达比在未分化的细胞中的表达高5.9±1.94倍。这些结果得出结论：本发明的源自脐带的干细胞可以分化为成骨细胞。

3)分化为软骨细胞的能力

评估实施例9中制备的源自脐带的干细胞分化为软骨细胞的能力。为此，将2×10⁵个源自脐带的干细胞悬浮在不含胎牛血清的HG-DMEM培养基中，置于15ml聚丙烯管中，并离心以获得用于三维培养的沉淀物。将沉淀物在补充有50μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯、100nM地塞米松、100μg/ml丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸、10ng/ml转化生长因子-β1和1X胰岛素-转铁蛋白-Serenite(ITS；Gibco)的分化培养基(DMEM-HG)中培养21天。通过番红O(Safranin O)染色和软骨细胞标志物的基因表达来测量细胞向软骨细胞的分化程度。对于番红O染色，将沉淀物在4％的多聚甲醛溶液中固定24小时，然后制备5μm样品。样品用0.2％番红O溶液染色10分钟，用蒸馏水洗涤，与0.04％的固绿溶液反应15秒钟，观察到分化为软骨细胞。

如图7的(C)所示，在分化的源自脐带的干细胞中发现了番红O染色的聚集蛋白聚糖，这表明与未分化的细胞相比，分化的细胞有效地分化为软骨细胞。发现腱细胞分化标志物Aggreca在分化细胞中的表达比在未分化的细胞中的表达高5.1±1.65倍。这些结果得出结论：本发明的源自脐带的干细胞可以分化为软骨细胞。

4)分化为腱细胞的能力

评估实施例9中制备的源自脐带的干细胞分化为腱细胞的能力。为此，首先将SYLGARD(Dow Corning，米德兰，密歇根州，美国)倒入35mm培养皿中，并用1至2周覆盖培养皿。然后，将5mm的缝合丝线植入SYLGARD中。将培养皿和缝合线在干净的工作台中用100％乙醇和UV灭菌，并干燥2小时。然后，将DMEM在37℃的CO₂培养箱中预浸泡1小时。将2×10⁵个细胞与凝血酶混合物(补充有10％胎牛血清、1％抗生素溶液、1U/ml凝血酶(MerckChemicals，英国)、200μM氨基己酸(Sigma-Aldrich)和10mg/ml抑肽酶(Roche，英国)的DMEM)混合，并向其中添加10mg/ml纤维蛋白原溶液(Sigma-Aldrich)。将混合溶液迅速铺展在SYLGARD涂覆的培养皿的表面，并在37℃下静置1小时。然后，将细胞在DMEM-HG中的包含250μM抗坏血酸和50μM L-脯氨酸的腱细胞分化培养溶液中培养14天。细胞的分化程度通过苏木精和伊红(H&E)染色、天狼猩红染色和免疫组化染色进行测量。还通过腱细胞标志物的基因表达来测量细胞的分化程度。将细胞在4％的多聚甲醛溶液中固定24小时，包埋在石蜡中以制备10μm切片样品，然后进行H&E染色和天狼猩红染色。为了进行免疫组织化学染色，将细胞与预先以1∶200稀释的抗Col I(Abcam)在室温下反应2小时，并在室温下与HRP缀合的二抗反应30分钟，观察到分化为腱细胞。

图7的(D)证实了沿长轴排列的纤维蛋白结构的存在。具体地，H&E染色显示了存在类似于健康的腱基质的浅红色染色的基质和纺锤状细胞。腱基质为1型胶原蛋白，通过天狼猩红染色呈黄色。用1型胶原蛋白抗体进行的免疫组织化学染色证实了基质为1型胶原蛋白。

在实施例9中制备的源自脐带的干细胞分化的细胞中，Scleraxis(SCX)和Mohawk(MKX)的表达水平显著地高于未分化的细胞。通过实时PCR确定表达水平。具体地，SCX在分化的细胞中的表达水平是未分化的细胞中的表达水平的57.4±1.97倍，证明了本发明的源自脐带的干细胞分化为腱细胞的能力。

尽管已经详细描述了本发明的细节，但是对于本领域技术人员而言明显的是，这些细节仅是优选的实施方案，并且不旨在限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种分离源自脐带的干细胞的方法，所述方法包括(a)将分离的脐带组织破碎为宽度为2mm至4mm、长度为2mm至4mm的外植体，和(b)在培养基中培养外植体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括将脐带组织引入培养基中并将脐带组织切成宽度为2mm至4mm、长度为2mm至4mm的外植体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中以每克脐带组织0.5ml至3.0ml的量添加培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中培养基选自Dulbecco最低限度必需培养基(DMEM)、RPMI、Ham's F-10、Ham's F-12、α最低限度必需培养基(α-MEM)、Glasgow最低限度必需培养基(GMEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)及其组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其中培养外植体以达到每单位面积(cm²)0.0007g至0.0068g。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)进行60分钟至120分钟。