[go: up one dir, main page]

CN111918673A - 控制体内的药物动态的组合物 - Google Patents

控制体内的药物动态的组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN111918673A
CN111918673A CN201980018952.7A CN201980018952A CN111918673A CN 111918673 A CN111918673 A CN 111918673A CN 201980018952 A CN201980018952 A CN 201980018952A CN 111918673 A CN111918673 A CN 111918673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
blood
administered
hours
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201980018952.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111918673B (zh
Inventor
片冈一则
大泽重仁
内田智士
林光太朗
安佳那余路·迪丽萨拉
藤加珠子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kawasaki City
Original Assignee
Kawasaki City
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kawasaki City filed Critical Kawasaki City
Publication of CN111918673A publication Critical patent/CN111918673A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111918673B publication Critical patent/CN111918673B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/25—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids with polyoxyalkylated alcohols, e.g. esters of polyethylene glycol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供控制药物动态的组合物。具体而言，本发明提供含有多价阳离子作为有效成分的用于控制药物动态的组合物、以及使用多价阳离子的控制药物动态的方法。

Description

控制体内的药物动态的组合物
技术领域
本发明涉及控制体内的药物动态的组合物(例如，用于改变药物的分布、抑制药物的代谢或抑制药物的排泄的组合物)，特别涉及基于肝脏的血窦内皮细胞的药剂(例如药物活性成分、药剂递送用的载体)从血中的清除的抑制剂。另外，本发明涉及基于肾脏的药物从血中的清除的抑制剂。另外，本发明涉及用于向脾脏增加药物递送量的组合物。
背景技术
体内的药物动态在药品开发中具有重要的意义。例如，血药浓度对于发挥药品的效果而言很重要，这一点无需赘言。血药浓度由药物的吸收、分布、代谢、排泄这4个过程来决定。特别地，药物的代谢及药物的排泄(清除)为血药浓度的重要决定因素。
作为提高质粒DNA的血中稳定性的技术，开发了由亲水性嵌段-温度响应性嵌段-聚阳离子性嵌段构成的三元共聚物(非专利文献1)。其为如下技术：该三元共聚物与质粒DNA在低温下混合而形成胶束。该胶束中，质粒DNA与上述三元共聚物的聚阳离子性嵌段形成复合体。然后，升高温度时，温度响应性嵌段从亲水性变为疏水性，由此形成包覆质粒DNA的疏水性的中间层，将其作为DNA的保护层使用。但是，大幅改善mRNA的血中稳定性的胶束制剂技术仍属未知。另外，公开了将亲水性片段与阳离子性片段的共聚物和核酸形成复合体以中和电荷的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2013/162041
非专利文献
非专利文献1：Osawa S.et al.,Biomacromolecule,17(1):354-361,2016
发明内容
本发明提供用于控制药物动态的组合物(例如用于改变药物的分布、抑制药物的代谢或抑制药物的排泄的组合物)，特别提供基于肝脏的血窦内皮细胞的药剂(例如药物活性成分、药剂递送用的载体)的排泄能力的抑制剂。另外，本发明提供基于肾脏的从血中排泄药物的能力的抑制剂。
本发明人发现，多价阳离子(特别是为了提高生物相容性而用聚乙二醇修饰的多价阳离子)定位于肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面及肾脏的血管内皮的血管内表面、并且使从血中排泄药物的能力降低。另外，本发明人还发现，多价阳离子使向包括脾脏在内的各种内脏或组织的药物递送量增加。
本发明基于这样的见解。
即，根据本发明，可提供以下的发明。
(1A)一种用于控制体内的药物动态的组合物，其含有多价阳离子作为有效成分{在此，多价阳离子可以为阳离子性聚合物}。
(2A)根据上述(1A)所述的组合物，其中，多价阳离子为与亲水性聚合物嵌段的结合体的形态。
(3A)根据上述(1A)所述的组合物，其中，多价阳离子为具有两条以上的亲水性聚合物链的阳离子性聚合物。
(4A)根据上述(2A)所述的组合物，其中，多价阳离子为阳离子性聚合物嵌段与支链聚乙二醇的嵌段共聚物。
(5A)根据上述(1A)～(4A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为从血中的清除的控制。
(6A)根据上述(1A)～(5A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肝脏的血窦内皮细胞从血中排泄药物的能力的降低。
(7A)根据上述(1A)～(5A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肾脏从血中排泄药物的能力的降低。
(8A)根据上述(1A)～(6A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为向靶内脏或靶组织的递送量的增加。
(9A)根据上述(1A)～(6A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为向脾脏的递送量的增加。
(10A)根据上述(1A)～(4A)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为药物的血中滞留性的增大。
(11A)根据上述(1A)～(10A)中任一项所述的组合物，其早于要控制动态的药物给药。
(12A)根据上述(1A)～(10A)中任一项所述的组合物，其与要控制动态的药物同时给药。
(13A)根据上述(1A)～(10A)中任一项所述的组合物，其晚于要控制动态的药物给药{但是，以在上述药物滞留在血中的期间内进行上述给药为条件}。
(14A)根据上述(1A)～(13A)中任一项所述的组合物，其中，多价阳离子为游离形态或以游离形态被给药。
(15A)根据上述(1A)～(14A)中任一项所述的组合物，其中，要控制动态的药物为包封于药物递送用载体的药物。
(16A)一种药物动态的控制方法，其特征在于，使用(1A)～(15A)中任一项所述的组合物。
另外，根据本发明，可提供以下的发明。
(1B)一种用于控制体内的药物动态的组合物，其含有阳离子性聚合物作为有效成分。
(2B)根据上述(1B)所述的组合物，其中，阳离子性聚合物为与亲水性聚合物嵌段的结合体(例如共聚物)的形态。
(3B)根据上述(1B)所述的组合物，其中，阳离子性聚合物为具有两条以上的亲水性聚合物链的阳离子性聚合物。
(4B)根据上述(2B)所述的组合物，其中，阳离子性聚合物为阳离子性聚合物嵌段与支链聚乙二醇的嵌段共聚物。
(5B)根据上述(1B)～(4B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为从血中的清除的控制。
(6B)根据上述(1B)～(5B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肝脏的血窦内皮细胞从血中排泄药物的能力的降低。
(7B)根据上述(1B)～(5B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肾脏从血中排泄药物的能力的降低。
(8B)根据上述(1B)～(6B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为向靶内脏或靶组织的递送量的增加。
(9B)根据上述(1B)～(6B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为向脾脏的递送量的增加。
(10B)根据上述(1B)～(4B)中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为药物的血中滞留性的增大。
(11B)根据上述(1B)～(10B)中任一项所述的组合物，其早于要控制动态的药物给药。
(12B)根据上述(1B)～(10B)中任一项所述的组合物，其与要控制动态的药物同时给药。
(13B)根据上述(1B)～(10B)中任一项所述的组合物，其晚于要控制动态的药物给药{但是，以在上述药物滞留在血中的期间内进行上述给药为条件}。
(14B)根据上述(1B)～(13B)中任一项所述的组合物，其中，阳离子性聚合物为游离形态或以游离形态被给药。
(15B)根据上述(1B)～(14B)中任一项所述的组合物，其中，要控制动态的药物为包封于药物递送用载体的药物。
(16B)一种药物动态的控制方法，其特征在于，使用(1B)～(15B)中任一项所述的组合物。
附图说明
图1为示出阳离子性聚合物对肝脏及肾脏中的载体蓄积(离子复合物)的效果的图。
图2为示出多价阳离子对脑中的药物蓄积的效果的图。
图2A示出在肝脏、肾脏以外的内脏中mRNA的蓄积增加的图。
图3为示出多价阳离子对肝脏(上图)及肾脏(下图)中的载体蓄积(脂质复合物)的效果的图。
图3A为示出在肝脏、肾脏以外的内脏中mRNA的蓄积增加的图。
图4为示出多价阳离子向肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面蓄积的图。特别示出多价阳离子被覆着血窦内皮细胞的内表面的情况。
图5为示出多价阳离子向末梢(耳)的血管内皮细胞的血管内表面蓄积的图。对于末梢的血管内皮细胞，未观察到实质性的多价阳离子的被覆、蓄积。
图6为示出多价阳离子对核酸包封载体的血中滞留性的效果的图。
图7为示出多价阳离子对核酸包封载体向肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面蓄积的效果的图。
图8为示出本发明的多价阳离子与白蛋白实质上不发生相互作用的图。
图9为示出多价阳离子对mRNA的脂质复合物在脾脏中聚集的效果的图。
图10为示出bPEG-PLL、PEG-PLL及bPEG的血中滞留性的图。
图11为示出bPEG-PLL在肝脏血窦内皮细胞的管腔侧内壁的存在量的经时变化的图。
图12为示出多价阳离子对病毒粒子在各内脏中的蓄积性的影响的图。
图13为示出多价阳离子对病毒粒子在各内脏中的蓄积性的影响的图。
具体实施方式
本说明书中，“对象”是指包括人在内的哺乳动物。对象可以为健康的对象，也可以为罹患了某些疾病的对象。对象可以为哺乳动物、例如人，特别地，可以为本发明的胶束的给药有益处的哺乳动物、例如人。
本说明书中，“药剂递送用的”是指：为生物相容性且可以将药剂包封于载体中。本说明书中，“药剂递送用的”是指：使药剂的血中残存时间与裸药剂的血中残存时间相比延长的用途、或提高药剂向规定组织的递送量的用途。
本说明书中，“载体”是指：可以包封物质的微粒或中空微粒。载体优选具有生物相容性的外壳或修饰。作为载体，没有特别限定，可列举例如脂质体及胶束，可特别列举由磷脂等构成的脂质体。
本说明书中，“胶束”是指：高分子等分子缔合而形成的载体。作为胶束，可列举由表面活性剂等两亲性分子形成的胶束、及由聚离子复合物形成的胶束(PIC胶束)。从改善生物利用度的观点出发，胶束优选其外表面被不带电荷的亲水性链修饰。
本说明书中，“平均分子量”在无特别声明时是指数均分子量。
本说明书中，“聚合度”是指聚合物中的单体单元的数量，“平均聚合度”在没有特别声明时表示数均聚合度。
本说明书中，“阳离子性嵌段”及“阳离子性聚合物”分别是指使含有阳离子性的单体的单体单元聚合而得到、整体上为阳离子性的聚合物嵌段及聚合物。作为阳离子性聚合物，可列举均聚阳离子性聚合物、均聚阳离子性聚合物与不带电荷的亲水性链连接而成的聚合物等。在阳离子性聚合物与其它聚合物形成嵌段共聚物时，阳离子性聚合物部分有时被称为阳离子性嵌段。本说明书中，阳离子性聚合物为药学上可接受的阳离子性聚合物。本说明书中，“多价阳离子”是指：在为阳离子性的分子中在分子内具有多个显示阳离子性质的基团的分子。本说明书中，“多价阳离子”在血液环境中以分子整体可具有阳离子性。作为多价阳离子，可列举阳离子性聚合物、阳离子性树枝状聚合物等在血液环境中为阳离子性的分子。多价阳离子为具有生物相容性的多价阳离子。本说明书中，“树枝状聚合物”是指在成为核的1个原子上具有多阶段的支链的分子。
本说明书中，“亲水性嵌段”是指相对于水性介质显示溶解性的聚合物链，有时称为亲水性聚合物嵌段。本发明中，不带电荷的亲水性链为药学上可接受的不带电荷的亲水性链。作为这类亲水性链，可列举聚乙二醇(PEG)、聚(2-乙基-2-
Figure BDA0002676186260000071
唑啉)。不带电荷的亲水性链只要在局部或整体上电荷被中和，则也可以具有极性原子。亲水性嵌段可以含有支链，也可以不含支链。在亲水性嵌段具有分支点的情况下，分支点的数量可以为1个或1个以上。
本说明书中，“温度响应性嵌段”及“温度响应性聚合物”分别是指可以依赖于温度而从亲水性变为疏水性的聚合物嵌段及聚合物。依赖于温度而从亲水性变为疏水性的物质已知有各种，可列举例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000072
唑啉)、聚(2-异丙基-2-
Figure BDA0002676186260000073
唑啉)。温度响应性的聚合物具有低临界溶解温度(LCST)，低于LCST时为亲水性，在LCST以上时为疏水性。温度响应性聚合物含有温度响应性嵌段。某种方式中，温度响应性聚合物含有温度响应性嵌段和亲水性嵌段。某种方式中，温度响应性聚合物不具有阳离子性嵌段。温度响应性聚合物可以是实质上由温度响应性嵌段构成的聚合物，也可以是由温度响应性嵌段构成的聚合物。低临界溶解温度(LCST)可优选为4℃以上且40℃以下，特别地可以设为低于人等对象的体温。
本说明书中，“三元共聚物”或“三嵌段共聚物”是指含有3种不同的聚合物嵌段的嵌段共聚物。各嵌段可以介由接头、间隔基而连接。在三元共聚物依次含有3种不同的嵌段A、B及C时，可以记作“A-B-C”。符号“-”可以为键、或接头或者间隔基。三元共聚物只要含有3种不同的聚合物嵌段则也可以含有其他不同的聚合物嵌段。三元共聚物可以实质上由3种不同的聚合物嵌段“A-B-C”构成或由“A-B-C”构成。
本说明书中，“外壳”是指包覆RNA的保护层。外壳未必意味着存在于最外壳。本说明书中，“保护层”与无保护层时相比，可以保护RNA免受RNase等降解酶的降解。
本说明书中，“含有”(comprise)以包括“由…构成”(consist of)及“实质上由…构成”(essentially consist of)的意思来使用。“含有”是指：可以含有成为对象的构成要素以外的构成要素，“由…构成”是指不含成为对象的构成要素以外的构成要素。本说明书中，“实质上由…构成”是指：在发挥特别的功能的方式(完全丧失了发明的效果的方式等)中不含成为对象的构成要素以外的构成要素。
本说明书中，“分开给药A和B”或其类似表述以包括在时间上分开给药A和B、以及将A和B不混合而将二者同时给药的意思来使用。
本说明书中，“清除”是指药物的代谢及药物的排泄。例如，清除可以为药物由于代谢而减少、或药物从血中排泄出去而减少。已知清除会使药物的血中滞留性降低。
本说明书中，“靶内脏或靶组织”是指：意欲使所给药的药物送达的内脏或组织。靶内脏或靶组织根据所给药的药物的种类、给药对象的患者的种类而不同。“靶内脏或靶组织”这一术语不是意味着将药物仅递送至该内脏或组织的术语，只要药物被递送至靶内脏或靶组织，则药物也可以被递送至该内脏或组织以外的内脏或组织。优选地，药物向“靶内脏或靶组织”的递送优选对该靶内脏或靶组织具有选择性。这里，“具有选择性”是指：药物在该靶内脏或靶组织中的聚集比在其以外的内脏或组织中的聚集更多。
如后述的实施例所示，若将多价阳离子给药于血中，则多价阳离子在肝脏的血窦内皮细胞、肾脏的血管内皮细胞的管腔侧内壁聚集，被覆血管内壁。另外，作为其结果，多价阳离子使肝脏的血窦内皮细胞和肾脏的血管内皮细胞所进行的药物的清除降低，提高药物的血中滞留性。因此，根据本发明，阳离子性聚合物所代表的多价阳离子能够用于控制体内的药物动态。
另外，根据本发明，阳离子性聚合物可用于控制体内的药物动态。
在此，药物动态的控制是指药物动态的改善或改变。作为药物动态的控制，可列举清除的控制。更具体地，药物动态的控制可列举基于肝脏的血窦内皮细胞的从血中排泄药物的能力的降低。作为药物动态的控制，另外可列举基于肾脏的从血中排泄药物的能力的降低。作为药物动态的控制，进一步可列举向靶内脏的递送量的增加。作为药物动态的控制，进一步还可列举药物向脾脏的递送量的增加。作为药物动态的控制，进一步还可列举药物的血中滞留性的增大。
这样，本发明中，通过使用阳离子性聚合物等多价阳离子，可以抑制基于肝脏的血窦内皮细胞的血药代谢或基于该途径的排泄、基于肾脏的代谢或排泄，提高药物的血中滞留性，和/或提高药物向靶内脏或者组织(例如脑、肺、心脏及脾脏等内脏或组织、以及肿瘤等)的递送量。即，根据本发明，阳离子性聚合物等多价阳离子为控制同时或分开给药的其它药物有效成分(药物)的体内动态的物质。因此，根据本发明，阳离子性聚合物等多价阳离子不必为药物有效成分。另外，阳离子性聚合物等多价阳离子不必与药物有效成分形成复合体(即，可以为游离形态)。
从提高该阳离子本身的生物利用度的观点出发，多价阳离子可以受到亲水性聚合物的修饰。
从提高该聚合物本身的生物利用度的观点出发，阳离子性聚合物例如可以为阳离子性嵌段与亲水性聚合物嵌段的共聚物的形态。
由此，阳离子性聚合物的生物利用度提高，可以期待提升基于肝脏的血窦内皮细胞的从血中排泄药物的能力的降低效果、或基于肾脏的从血中排泄药物的能力的降低效果。
亲水性聚合物嵌段可以使用例如不带电荷的亲水性聚合物嵌段。不带电荷的亲水性聚合物嵌段为药学上可接受的聚合物。作为这样的聚合物，没有特别限定，可列举例如聚亚烷基二醇、聚(2-
Figure BDA0002676186260000101
唑啉)、多聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)。作为不带电荷的亲水性聚合物，优选使用聚亚烷基二醇、聚(2-
Figure BDA0002676186260000102
唑啉)，可特别优选使用聚亚烷基二醇。作为聚亚烷基二醇，可优选使用聚乙二醇(PEG)。
含有上述阳离子性聚合物部分和PEG部分的共聚物中，PEG部分的平均分子量可以设为例如10kD以上、15kD以上、20kD以上、30kD以上或40kD以上(例如，可以为80kD以下、70kD以下、60kD以下或50kD以下)，优选为20kD以上，更优选为30kD以上。含有上述阳离子性聚合物部分和PEG部分的共聚物中，阳离子性聚合物的平均聚合度可以为15以上、20以上、30以上或40以上(例如，可以为80以下、70以下、60以下或50以下)。从增大PEG部分的体积的观点出发，PEG部分可以设为平均分子量大的、例如40kD以上、50kD以上、60kD以上或70kD以上(例如，可以为80kD以下、70kD以下、60kD以下或50kD以下)的单链PEG，也可以设为具有多条10kD以上、15kD以上、20kD以上、30kD以上或40kD以上(例如，可以为80kD以下、70kD以下、60kD以下或50kD以下)的PEG链的支链PEG。从增大PEG部分的体积的观点出发，可优选使用支链PEG。
某种方式中，含有阳离子性聚合物部分和PEG部分的共聚物的PEG部分为具有多条10kD以上、15kD以上、20kD以上、30kD以上或40kD以上的PEG链的支链PEG，阳离子性聚合物部分的平均聚合度可以为15以上、20以上、30以上或40以上。该特定方式中，含有阳离子性聚合物和PEG的共聚物中，PEG部分为具有多条20kD以上、30kD以上或40kD以上的PEG链的支链PEG，阳离子性聚合物部分的平均聚合度可以为20以上、30以上或40以上。
某种方式中，含有阳离子性聚合物部分和PEG部分的共聚物中，PEG部分为40kD以上的单链PEG，阳离子性聚合物部分的平均聚合度可以为15以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上或70以上(例如，可以为80以下、70以下、60以下或50以下。特别是在单链PEG的情况下，平均分子量越大则血中滞留性的改善效果越大)。
某种特定方式中，阳离子性聚合物嵌段的平均聚合度为15～30，阳离子性聚合物嵌段与支链PEG相连，支链PEG的PEG部分的总平均分子量可以为40kD～100kD、50kD～90kD或60kD～80kD。另外，例如支链PEG具有1处分支，由该分支伸出的各PEG链的平均分子量独立地可为例如20kD～60kD、25kD～50kD或30kD～40kD。根据本发明，可以将这样的支链PEG与阳离子性聚合物的共聚物作为本发明的多价阳离子来进行给药。
另一特定方式中，阳离子性聚合物嵌段的平均聚合度为15～30，阳离子性聚合物嵌段与支链PEG相连，支链PEG具有1处分支，从该分支伸出的各PEG链的平均分子量独立地可为例如20kD～60kD、25kD～50kD或30kD～40kD，根据本发明，可以将这样的支链PEG与阳离子性聚合物的共聚物作为本发明的多价阳离子来进行给药。
本发明中，作为阳离子性聚合物或阳离子性聚合物部分，可列举例如阳离子性天然氨基酸及阳离子性非天然氨基酸、例如组氨酸、色氨酸、鸟氨酸、精氨酸及赖氨酸等阳离子性天然氨基酸和/或具有-(NH-(CH2)2)p-NH2所示的基团{在此，p为1～5的整数。}作为侧链的聚合物嵌段、例如具有上述阳离子性的侧链的阳离子性非天然氨基酸的聚合物嵌段、例如具有上述阳离子性的侧链的天冬氨酸或谷氨酸等阳离子性非天然氨基酸的聚合物嵌段。本发明的某种方式中，聚阳离子嵌段为具有-(NH-(CH2)2)p-NH2所示的基团{在此，p为1～5的整数。}作为侧链的聚合物嵌段。在此，作为阳离子性天然氨基酸，优选列举组氨酸、色氨酸、鸟氨酸、精氨酸及赖氨酸，更优选列举精氨酸、鸟氨酸及赖氨酸，进一步优选列举鸟氨酸及赖氨酸，进一步更优选列举赖氨酸。本发明的某种方式中，阳离子性聚合物或阳离子性聚合物部分可以设为聚赖氨酸或聚鸟氨酸。
聚阳离子嵌段中可以混杂有阳离子性氨基酸及具有阳离子性的侧链的氨基酸。即，本发明的某种方式中，聚阳离子嵌段为阳离子性天然氨基酸、阳离子性非天然氨基酸、或含有阳离子性天然氨基酸及阳离子性非天然氨基酸的单体单元的聚合物。本发明的某种方式中，聚阳离子嵌段中的单体单元间的键为肽键。本发明的优选方式中，阳离子性非天然氨基酸为具有-(NH-(CH2)2)p-NH2所示的基团{在此，p为1～5的整数}作为侧链的氨基酸。另外，本发明的某种方式中，聚阳离子嵌段可以设为阳离子性天然氨基酸以及被-(NH-(CH2)2)p-NH2所示的基团{在此，p为1～5的整数。}修饰的天冬氨酸及谷氨酸以任意的顺序聚合而成的聚阳离子嵌段。本发明的某种方式中，聚合物中的单体单元的40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％具有-(NH-(CH2)2)p-NH2所示的基团{在此，p为1～5的整数。}作为侧链。
例如，作为本发明的阳离子性聚合物的一个方式，可列举：具有支链PEG的聚赖氨酸或聚鸟氨酸，其中，PEG部分为含有两条具有20～50kD的平均分子量的PEG的支链PEG，聚赖氨酸或聚鸟氨酸的平均聚合度为20～70或30～60。优选的某种方式中，PEG或支链PEG可连接在阳离子性聚合物的末端。作为另一方式，可以为以赖氨酸及鸟氨酸等阳离子性单体作为主骨架的聚合物，其单体单元的侧链的5％～80％或20％～50％被PEG或支链PEG等亲水性聚合物修饰的聚合物(即，接枝共聚物)。
本发明的多价阳离子可通过被覆肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面、肾脏的血管内皮细胞的血管内表面来降低内皮细胞本身的清除功能。因此，本发明的多价阳离子可以在各种药物的给药前、给药的同时或给药后进行给药。任一情况下，当分开给药多价阳离子和药物的情况下，在二者同时存在于血中时能够控制药物动态{在药物给药之前给药多价阳离子的情况下，在阳离子性聚合物滞留在血中的期间或残存在肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面的期间或残存在肾脏的内皮细胞的血管内表面的期间内给药上述药物；在药物给药之后给药多价阳离子的情况下，在上述药物滞留在血中的期间内给药多价阳离子}。某种方式中，例如可以在即将给药药物之前给药多价阳离子，例如可以在给药药物之前30秒以上时给药多价阳离子，可以在给药药物之前1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、4分钟以上或5分钟以上给药多价阳离子。某种方式中，例如可以在给药药物之前60分钟以内、50分钟以内、40分钟以内、30分钟以内、20分钟以内或10分钟以内给药多价阳离子。某种方式中，可以在给药多价阳离子10分钟之前、5分钟之前、4分钟之前、3分钟之前、2分钟之前、1分钟之前、30秒之前、或即将给药前给药药物，优选从给药药物至给药多价阳离子的间隔短。在同时给药的情况下，例如可以在输液袋中混入药物和多价阳离子来给药。
本发明的阳离子性聚合物可通过被覆肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面、肾脏的血管内皮细胞的血管内表面来降低内皮细胞本身的清除功能。因此，本发明的阳离子性聚合物可以在各种药物给药前、给药的同时或给药后进行给药。任一情况下，当分开给药阳离子性聚合物和药物的情况下，在二者同时存在于血中时能够控制药物动态{在药物给药之前给药阳离子性聚合物的情况下，在阳离子性聚合物滞留在血中的期间或残存在肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面的期间或残存在肾脏的内皮细胞的血管内表面的期间内给药上述药物；在药物给药之后给药阳离子性聚合物的情况下，在上述药物滞留在血中的期间内给药阳离子性聚合物}。某种方式中，例如可以在即将给药药物之前给药阳离子性聚合物，例如可以在给药药物之前30秒以上时给药阳离子性聚合物，可以在给药药物之前1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、4分钟以上或5分钟以上给药阳离子性聚合物。某种方式中，例如可以在给药药物之前60分钟以内、50分钟以内、40分钟以内、30分钟以内、20分钟以内或10分钟以内给药阳离子性聚合物。某种方式中，可以在给药阳离子性聚合物10分钟之前、5分钟之前、4分钟之前、3分钟之前、2分钟之前、1分钟之前、30秒之前、或即将给药前给药药物，优选从给药药物至给药阳离子性聚合物的间隔短。在同时给药的情况下，例如可以在输液袋中混入药物和阳离子性聚合物来给药。
本发明的某种方式中，可以根据药物的给药时间(或根据其前后)来确定本发明的多价阳离子的给药量及给药次数，以使得给药药物的清除以所需的时间减少。本发明的某种方式中，可以根据药物的给药时间(或根据其前后)来单次给药或多次给药本发明的多价阳离子，以使得给药药物的清除以所需的时间减少。本发明的某种方式中，可以根据目的将给药设为推注给药或输注给药。
根据本发明，利用多价阳离子来降低包封有核酸的药物递送用载体(胶束、脂质体)在肝脏的血窦内皮细胞中的蓄积、在肾脏的内皮细胞中的蓄积。因此，本发明的多价阳离子可特别用于控制包封有核酸的药物递送用载体的药物动态。
根据本发明，利用阳离子性聚合物可降低包封有核酸的药物递送用载体(胶束、脂质体)在肝脏的血窦内皮细胞中的蓄积、在肾脏的内皮细胞中的蓄积。因此，本发明的阳离子性聚合物可特别用于控制包封有核酸的药物递送用载体的药物动态。
作为核酸，可列举例如：脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、以及锁核酸(LNA)及桥接核酸(BNA)等修饰核酸、或这些的杂交体。作为DNA，没有特别限定，可列举直链状双链DNA、直链状单链DNA、环状双链DNA及环状单链DNA。作为RNA，没有特别限定，可列举例如siRNA、shRNA、微小RNA、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、非编码RNA(ncRNA)及双链RNA、以及这些RNA的衍生物。
在与包封有核酸的药物递送用载体(胶束、脂质体)一起给药时，多价阳离子可以以游离形态存在。即，已知多价阳离子可与核酸直接形成复合体，但本发明中，多价阳离子是被覆肝脏、肾脏的血管内皮细胞的物质，因此优选多价阳离子以游离形态(即，不与核酸形成复合体的状态)存在。包封有核酸的药物递送用载体可以不是离子复合物、而是脂质复合物等脂质复合体。
在与包封有核酸的药物递送用载体(胶束、脂质体)一起给药时，阳离子性聚合物可以以游离形态存在。即，虽然已知阳离子性聚合物可与核酸直接形成复合体，但本发明中，认为阳离子性聚合物是被覆肝脏、肾脏的血管内皮细胞的物质，因此阳离子性聚合物可以以游离形态(即，不与核酸形成复合体的状态)存在。作为阳离子性聚合物，可以使用与制造包封有核酸的药物递送用载体时所用的阳离子性聚合物不同的阳离子性聚合物。包封有核酸的药物递送用载体可以不是离子复合物、而是脂质复合物等脂质复合体。
本发明的某种方式中，可以使用病毒作为用于提高对细胞的核酸导入效率的载体。作为用于提高对细胞的核酸导入效率的载体，可使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及AAV10等)、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、痘苗病毒载体、疱疹病毒载体等病毒载体。这些载体可具有例如使细胞内表达所递送的核酸的表达单元(例如使核酸可操作地连接于启动子或增强子而成的表达单元)。
本发明的某一方面提供一种向对象给药药物的方法，其包括向对象给药多价阳离子的步骤和向对象给药药物的步骤。本发明的某种方式中，多价阳离子和RNA分开进行给药。本发明的某种方式中，多价阳离子可与药物同时给药于对象、或者早于或晚于药物给药于对象。多价阳离子具有生物相容性，但可以以不产生剂量限制性毒性(DLT)的用量来给药。
本发明的某一方面提供向对象给药药物的方法，其包括向对象给药阳离子性聚合物的步骤和向对象给药药物的步骤。本发明的某种方式中，阳离子性聚合物和RNA分开进行给药。本发明的某种方式中，阳离子性聚合物可与药物同时给药于对象、或者早于或晚于药物给药于对象。阳离子性聚合物具有生物相容性，但可以以不产生剂量限制性毒性(DLT)的用量来给药。
本发明的某一方面提供向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的方法，其包括向对象给药多价阳离子的步骤和向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的步骤。本发明的某一方面提供向对象的组织递送核酸的方法，其包括向对象给药多价阳离子的步骤和向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的步骤。本发明的某种方式中，多价阳离子可与包封有核酸的药物递送用载体同时给药于对象、或者早于或晚于药物给药于对象。
本发明的某一方面提供向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的方法，其包括向对象给药阳离子性聚合物的步骤和向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的步骤。本发明的某一方面提供向对象的组织递送核酸的方法，其包括向对象给药阳离子性聚合物的步骤和向对象给药包封有核酸的药物递送用载体的步骤。本发明的某种方式中，阳离子性聚合物可以与包封有核酸的药物递送用载体同时给药于对象、或者早于或晚于药物给药于对象。
本发明人另外发现，由含有亲水性嵌段、温度响应性嵌段和阳离子性嵌段的三元共聚物形成的胶束使核酸的血中稳定性急剧提高，例如可以将核酸大量地递送到脑组织。因此，根据本发明，例如提供一种用于向内脏或组织(特别是脑)递送核酸的组合物，其包含胶束，所述胶束包含核酸以及含有亲水性嵌段、温度响应性嵌段和阳离子性嵌段的三元共聚物，且表面被葡萄糖修饰。
这样的胶束可以通过以下的步骤来制备。即，将含有亲水性嵌段、温度响应性嵌段和阳离子性嵌段的三元共聚物以及RNA以能够形成胶束的方式在温度低于LCST的水溶液中混合。得到胶束后，使水溶液的温度升高至LCST以上，使温度响应性嵌段从亲水性变为疏水性。可认为，如此得到的胶束呈现内部包封有核酸、具有疏水性的保护层作为其外壳的状态，可以使所包封的核酸在血中维持稳定。即，该胶束中，核酸被由变为疏水性的温度响应性嵌段形成的外壳覆盖。
考虑到血液的温度在人的情况下为36℃～37℃左右这一点，三元共聚物的LCST优选为35℃以下。通过如此设定，在给药后可在血中维持胶束的状态。另外，考虑到在0℃～4℃左右进行mRNA的制备这一点，LCST优选为5℃以上。需要说明的是，对于LCST而言，优选考虑此外的各种状况而设定合适的LCST。例如，LCST可以设为5℃～35℃，可以设为10℃～32℃、或可以设为25℃～32℃。一般来说，水溶性聚合物具有LCST。本发明中，若为在上述温度范围内具有LCST的聚合物，则可以适宜地作为温度响应性嵌段来使用。
本发明的某种方式中，三元共聚物的亲水性嵌段可以为聚乙二醇或聚(2-乙基-2-
Figure BDA0002676186260000181
唑啉)。亲水性嵌段的平均分子量可以设为例如10kD以上、15kD以上、20kD以上、30kD以上或40kD以上。另外，亲水性嵌段可以设为例如20kD以下、30kD以下、40kD以下或50kD以下的平均分子量。
本发明的某种方式中，三元共聚物的温度响应性嵌段可以为聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000182
唑啉)或聚(2-异丙基-2-
Figure BDA0002676186260000183
唑啉)。温度响应性嵌段的平均分子量可以为例如3kD以上、5kD以上、7kD以上或10kD以上。另外，温度响应性嵌段的平均分子量可以为例如10kD以下、15kD以下或20kD以下。
本发明的某种方式中，三元共聚物的聚阳离子性嵌段可以为含有天然或非天然的阳离子性氨基酸作为单体单元的肽。三元共聚物的聚阳离子性嵌段可以为例如含有赖氨酸及鸟氨酸等天然的阳离子性氨基酸作为单体单元的肽，例如聚赖氨酸或聚鸟氨酸。本发明的某种方式中，三元共聚物的聚阳离子性嵌段可以为例如含有用二亚乙基三胺或三亚乙基四胺修饰了羧基的天冬氨酸、谷氨酸作为单体单元的肽、例如均聚聚合物。聚阳离子性嵌段的平均聚合度可以为例如30以上、40以上、50以上、60以上或70以上。另外，聚阳离子性嵌段的平均聚合度可以为70以下、80以下、90以下或100以下。
本发明的某种方式中，三元共聚物的亲水性嵌段为聚乙二醇或聚(2-乙基-2-
Figure BDA0002676186260000184
唑啉)、温度响应性嵌段为聚(2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000185
唑啉)、聚阳离子性嵌段为聚赖氨酸或聚鸟氨酸。本发明的某种方式中，三元共聚物的亲水性嵌段为聚乙二醇、温度响应性嵌段为聚(2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000186
唑啉)、聚阳离子性嵌段为聚赖氨酸。
本发明中，作为包封有核酸的药物递送用载体，可以使用上述由三元共聚物等形成的、使被疏水性保护层包封的核酸稳定的胶束。另外，本发明中，作为包封有核酸的药物递送用载体，可以使用泡囊，例如脂质基泡囊、例如脂质体、例如Invivofectamine(商标)等脂质基泡囊(例如脂质复合物)。这些泡囊优选在其表面具有亲水性聚合物的被覆层。
本发明中，作为将核酸递送至脑时使用的药物递送用载体，可以使用利用葡萄糖等的GLUT1配体被覆外表面而成的载体(详细的原理请参照WO2015/075942A1)。若按照以下的给药方案来给药该载体，则在脑中的蓄积提高。即，给药方案包括对断食或诱导了低血糖的对象给药该组合物的步骤、以及在该对象中诱导血糖值上升的步骤。
本发明中，作为递送至脾脏的核酸，没有特别限定，可列举例如编码提高脾脏功能(例如免疫功能)的因子的核酸。作为编码提高免疫功能的因子的核酸，可列举编码成为免疫细胞的抗原的肽、蛋白质的核酸。由此可提高对特定的抗原的免疫功能，可得到对感染或癌症等的预防效果或治疗效果。作为编码成为免疫细胞的抗原的肽、蛋白质的核酸，可列举例如编码肽疫苗、特别是作为肿瘤特异性肽疫苗使用的肽(例如HLA限制性肽，例如HLA-A24、HLA-A2限制性肽，例如HLA-A2:01、HLA-A24:01限制性肽)的核酸。这种肽已经开发出多种，正在进行临床研究的也很多，本领域技术人员可以适宜选择并用于本发明。脾脏中存在树突状细胞，通过在这些树突状细胞中表达肽，由此使该肽被呈递到免疫细胞。免疫细胞在脾脏中对该肽呈响应性，对该肽的免疫功能提高、并且可攻击在细胞表面表达该肽的癌细胞。由此，最终可期待抗肿瘤效果提高。根据本发明，提供AAV8的用于向脾脏递送核酸中的应用。根据本发明，提供AAV8在制造用于向脾脏递送核酸的药物中的应用。根据本发明，提供AAV8与多价阳离子的组合的用于向脾脏递送核酸的应用。根据本发明，提供AAV8与多价阳离子的组合在制造用于向脾脏递送核酸的药物中的应用。根据本发明，提供多价阳离子的用于向脾脏递送AAV8的应用。根据本发明，提供多价阳离子在制造用于向脾脏递送AAV8的药物中的应用。根据本发明，提供用于向脾脏递送AAV8的药物，其含有多价阳离子。
本发明中，成为治疗对象的心脏疾病或障碍可列举例如心肌梗塞，但不限于这些。根据本发明，提供在有需求的对象中处置这些心脏疾病或障碍的方法，其包括给药与本发明的多价阳离子组合使用的AAV的步骤。这里，作为AAV，可以使用例如AAV9。AAV9例如可具有编码血管内皮生长因子(VEGF)等具有心脏再生作用的因子的基因。根据本发明，提供AAV9的用于向心脏递送核酸的应用。根据本发明，提供AAV9与多价阳离子的组合在制造用于向心脏递送核酸的药物中的应用。根据本发明，提供AAV9的用于向心脏递送核酸的应用。根据本发明，提供AAV9与多价阳离子的组合在制造用于向心脏递送核酸的药物中的应用。根据本发明，提供多价阳离子的用于向心脏递送AAV9的应用。根据本发明，提供多价阳离子在制造用于向心脏递送AAV9的药物中的应用。根据本发明，提供用于向心脏递送AAV9的药物，其含有多价阳离子。
本说明书中，“GLUT1配体”是指与GLUT1特异性结合的物质。作为GLUT1配体，已知有各种配体，没有特别限定，可列举例如葡萄糖及己糖等分子，在本发明中，GLUT1配体均可以代替葡萄糖而用于载体或缀合物的制备。GLUT1配体优选相对于GLUT1具有与葡萄糖同等或其以上的亲和性。已知2-N-4-(1-叠氮基-2,2,2-三氟乙基)苯甲酰基-1,3-双(D-甘露糖-4-基氧基)-2-丙胺(ATB-BMPA)、6-(N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(6-NBDG)、4,6-O-亚乙基-α-D-葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖及3-O-甲基葡萄糖也与GLUT1结合，本发明中也可以使用这些分子作为GLUT1配体。
本说明书中，“诱导低血糖”是指：与在对象中不进行该处置时应显示的血糖相比，血糖值降低。作为诱导低血糖的方法，可列举糖尿病药的给药等。例如，在诱导低血糖时，只要达到诱导低血糖的目的，也允许例如摄取其它药剂或饮用水等饮料。诱导低血糖的处置中也可以伴有不会对血糖造成实质影响的其它处置。
本说明书中，“断食”是指：使对象断食，例如断食3小时以上、4小时以上、5小时以上、6小时以上、7小时以上、8小时以上、9小时以上、10小时以上、11小时以上、12小时以上、13小时以上、14小时以上、15小时以上、16小时以上、17小时以上、18小时以上、19小时以上、20小时以上、21小时以上、22小时以上、23小时以上、24小时以上、25小时以上、26小时以上、27小时以上、28小时以上、29小时以上、30小时以上、31小时以上、32小时以上、33小时以上、34小时以上、35小时以上、36小时以上、37小时以上、38小时以上、39小时以上、40小时以上、41小时以上、42小时以上、43小时以上、44小时以上、45小时以上、46小时以上、47小时以上或48小时以上。通过断食，会引起对象的低血糖。断食时间由医生等参考对象的健康状态来决定，例如优选设为使对象达到空腹血糖的时间以上的时间。断食时间可以设为例如脑血管内皮细胞的血管内表面处的GLUT1的表达增加或达到平台期的时间以上的时间。断食时间可以设为例如12小时以上、24小时以上或36小时以上的上述时间。另外，断食可以伴随有不会对血糖值、GLUT1在血管内表面的表达造成实质影响的其它处置。
本说明书中，“诱导血糖值上升”是指：在诱导了低血糖的对象或维持低血糖状态的对象中，使血糖值上升。血糖值可以通过本领域技术人员熟知的各种方法来上升，例如可以给药诱导血糖值上升的物质，例如，可以通过给予葡萄糖、果糖(Fructose)、半乳糖等诱导血糖值上升的单糖、给予麦芽糖等诱导血糖值上升的多糖、或者摄取或食用淀粉等诱导血糖值上升的碳水化物来使其上升。
本说明书中，“血糖操作”是指：对对象诱导低血糖，之后使血糖值上升。在对对象诱导低血糖后，可以使对象的血糖值维持为低血糖。使对象的血糖值维持为低血糖的时间可以设为例如0小时以上、1小时以上、2小时以上、3小时以上、4小时以上、5小时以上、6小时以上、7小时以上、8小时以上、9小时以上、10小时以上、11小时以上、12小时以上、13小时以上、14小时以上、15小时以上、16小时以上、17小时以上、18小时以上、19小时以上、20小时以上、21小时以上、22小时以上、23小时以上、24小时以上、25小时以上、26小时以上、27小时以上、28小时以上、29小时以上、30小时以上、31小时以上、32小时以上、33小时以上、34小时以上、35小时以上、36小时以上、37小时以上、38小时以上、39小时以上、40小时以上、41小时以上、42小时以上、43小时以上、44小时以上、45小时以上、46小时以上、47小时以上、48小时以上。之后，可以使血糖值上升。本说明书中，“维持血糖”只要达到使对象维持低血糖的目的则也允许例如摄取其它药剂或饮用水等饮料。诱导低血糖的处置也可以伴有不会对血糖造成实质影响的其它处置。
在根据本发明的给药方案中，可以与诱导该对象的血糖值上升同时地连续或逐次向该对象给药该组合物。给药方案中，向该对象给药组合物与诱导该对象的血糖值上升之间可以具有间隔，也可以不具有间隔。在诱导该对象的血糖值上升的同时给药该组合物的情况下，可以以与引起血糖值上升的诱导的药剂混合的方式向该对象给药该组合物，也可以以与引起该对象的血糖值上升的诱导的药剂分开的方式来给药该组合物。另外，在与诱导该对象的血糖值上升连续或逐次地向该对象给药该组合物的情况下，可以在诱导该对象的血糖值上升之前向该对象给药该组合物，也可以在诱导该对象的血糖值上升之后给药该组合物，优选地，可以在诱导该对象的血糖值上升之前向该对象给药该组合物。在向该对象给药该组合物之前在该对象中诱导血糖值上升的情况下，优选在该对象中诱导血糖值上升后1小时以内、45分钟以内、30分钟以内、15分钟以内或10分钟以内向该对象给药该组合物。另外，在向该对象给药该组合物后在该对象中诱导血糖值上升的情况下，优选在向该对象给药该组合物后6小时以内、4小时以内、2小时以内、1小时以内、45分钟以内、30分钟以内、15分钟以内或10分钟以内在该对象中诱导血糖值上升。关于上述给药方案的循环，可以进行2次以上。葡萄糖给药和样品给药的先后关系可根据通过血脑屏障的时机来决定。
本发明的由上述三元共聚物等形成的、使被疏水性保护层包封的核酸稳定的胶束可以用于向脑血管内皮细胞进行递送。另外，本发明中的葡萄糖的作用在血液神经屏障、血液视网膜屏障及血液脑脊液屏障中也相同。特别是在血液神经屏障、血液视网膜屏障及血液脑脊液屏障中，也是在低血糖时的血管内皮细胞中表达GLUT1。因此，本发明的上述由三元共聚物等形成的、使被疏水性保护层包封的核酸稳定的胶束可以用于使其通过血液神经屏障、血液视网膜屏障及血液脑脊液屏障。另外，本发明的上述由三元共聚物等形成的、使被疏水性保护层包封的核酸稳定的胶束还可以用于向存在于血液神经屏障、血液视网膜屏障及血液脑脊液屏障的血管内皮细胞进行递送。
实施例
实施例1：给药多价阳离子对药剂递送用胶束在肝脏中的蓄积的效果
[材料]
作为药剂递送用胶束，使用在PEG(分子量11k)-b-PnPrOx(分子量8k)-b-PLys(聚合度43)的三嵌段聚合物胶束的表面具有葡萄糖修饰的胶束。表面的葡萄糖修饰为用于容易将胶束向脑递送的修饰，根据WO2015075942A1的公开，若对断食状态的对象给药经葡萄糖修饰的胶束、并且在其前后使对象的血糖值上升，则该胶束随着血糖值上升而被显著地摄入脑中。
在PEG侧末端具有葡萄糖衍生物DIG的聚合物(DIG-PEG)的合成按照WO2015075942A1中的记载来进行。另外，DIG-PEG与PnPrOx、PLys的共聚物通过将按照European Polymer Journal,2017,88,553-561的记载合成的PnPrOx-b-PLys和Glc-PEG连接而得到。三嵌段共聚物的合成路线如以下路线1～4所示。
路线1
Figure BDA0002676186260000241
路线2
Figure BDA0002676186260000242
路线3
Figure BDA0002676186260000243
路线4
Figure BDA0002676186260000251
具体而言，如下所述地合成了由作为温度响应性链的聚(2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000252
唑啉)(PnPrOx)和阳离子性链聚(L-赖氨酸)(PLys)构成且具有炔末端的嵌段共聚物alkyne-PnPrOx-b-Plys。
首先，将聚合引发剂对甲苯磺酸炔丙酯(61mg,0.29mmol)溶解于7mL乙腈中，加入2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000253
唑啉(2.5g,22mmol)。使反应溶液在42℃下反应6天后，加入叠氮化钠(380mg,5.8mmol)，在70℃下搅拌1小时而使聚合反应停止。上述工艺均在Ar气氛下进行。这里使用的对甲苯磺酸炔丙酯购自东京化成，用购自Wako公司的五氧化二磷作为脱水剂进行蒸馏纯化后使用。2-正丙基-2-
Figure BDA0002676186260000254
唑啉购自东京化成，用购自Sigma-Aldrich公司的氢化钙作为脱水剂进行蒸馏纯化后使用。反应溶剂乙腈购自wako公司，用氢化钙作为脱水剂进行蒸馏纯化后使用。叠氮化钠购自Wako公司，直接使用。聚合反应后，将反应溶液相对于水进行5次透析，冷冻干燥，由此得到具有叠氮化物末端的alkyne-PnPrOx-N3。由利用MALDI-TOFMS(UltraFlextreme,Bruker公司)和1H-NMR(ESC400,JEOL)的分析获知，所得到的PnPrOx的分子量为8.3k。
接着，通过施陶丁格反应将alkyne-PnPrOx-N3的叠氮化物末端转化为胺末端。将alkyne-PnPrOx-N3(830mg,0.10mmol)溶解于20mL甲醇中，加入三苯基膦(530mg,2.0mmol)，在40℃下搅拌3小时。接着，加入纯水20mL，用冰冷却，通过过滤除去未反应的三苯基膦等。将得到的溶液相对于纯水进行3次透析后，通过冷冻干燥进行回收。使用以购自GE-healthcare公司的CM-Sephadex C50作为柱填料的开放柱对得到的alkyne-PnPrOx-NH2进行进一步纯化。这里使用的甲醇、三苯基膦分别购自Sigma-Aldrich公司、东京化成。
由上述步骤中纯化、回收的alkyne-PnPrOx-NH2将Lys(TFA)-NCA聚合，之后通过利用碱的TFA基的脱保护得到alkyne-PnPrOx-b-PLys。使用二氧杂环己烷将alkyne-PnPrOx-NH2(330mg,0.040mmol)冷冻干燥。将其溶解于以1M的浓度溶解有硫脲的DMF(DMF(1M TU))2mL中，作为引发剂溶液。另行在Ar背景中量取Lys(TFA)-NCA(480mg,1.8mmol)至烧瓶中，溶解于6mL的DMF(1M TU)中。将制备的Lys(TFA)-NCA溶液在Ar气氛下加入到引发剂溶液中，在25℃下搅拌3天而进行聚合反应。将反应溶液相对于水透析5次后进行冷冻干燥，由此得到PnPrOx-b-Poly(L-Lysine)(TFA)(PLys(TFA))。接着，量取500mg所得的alkyne-PnPrOx-b-PLys(TFA)，溶解于25mL的甲醇中。向其中加入7.5mL的1M NaOH溶液，在35℃下反应12小时。反应后，相对于0.01M HCl进行3次透析，然后相对于水进行3次透析，通过冷冻干燥回收PnPrOx-b-PLys。对于回收物，通过使用GE health care公司的色谱柱Superdex 200的SEC(AKTAexplorer,GE Helthcere)确认到具有单峰性的分子量分布。另外，由利用1H-NMR(ESC400,JEOL)的分析获知，得到的聚合物的Lys为43。这里，基于非专利文献(J.Polym.Sci.Part A Polym.Chem.2003,41 1167-1187)通过Fuchs-Farthing法合成Lys(TFA)-NCA。二氧杂环己烷使用购自Wako公司的二氧杂环己烷。在购自关东化学的脱水溶剂中溶解购自Sigma-Aldrich公司的硫脲而制备DMF(1M TU)。将购自Nacalai公司的5M NaOH溶液用纯水稀释而准备1M NaOH溶液。将购自犬印公司的浓盐酸用纯水稀释而准备0.01MHCl。
另外，按照文献Bioconjugate,2007,18,2191-2196将DIG-PEG-OH的OH末端转化为叠氮基。首先，对DIG-PEG-OH(550mg,0.050mmol)进行苯冷冻干燥。将其溶于20mL的THF中，加入三乙胺(25μL,0.20mmol)而制成PEG溶液。量取甲烷磺酰氯(16μL,0.20mmol)至另一烧瓶中，用THF 5mL进行稀释。在水冷下向该甲烷磺酰氯稀释液中加入上述中制备的PEG溶液，反应一晚。反应在Ar气氛下进行。利用乙醚500mL进行再沉淀而回收反应物。由利用1H-NMR(ESC400,JEOL)的分析可知，回收的样品为末端被甲磺酰基化的DIG-PEG-Ms。将得到的DIG-PEG-Ms(440mg,0.044mmol)溶解于20mL的DMF中，加入叠氮化钠(286mg,4.4mmol)，在50℃下搅拌三天。THF及DMF使用购自关东化学的超脱水溶剂。三乙胺购自Wako公司，用氢化钙作为脱水剂进行蒸馏纯化后使用。甲磺酰氯购自Nacalai公司，使用利用五氧化二磷作为脱水剂进行蒸馏后的产物。叠氮化钠直接使用购自Wako公司的产品。
接着，利用点击化学(Click Chemistry)将Alkyne-PnPrOx-PLys和DIG-PEG-N3偶联。将Alkyne-PnPrOx-PLys(31mg,0.0020mmol)溶解于水2mL中，加入1M的CuSO4溶液和1M的抗坏血酸钠溶液各20μL，搅拌。另行将DIG-PEG-N3(110mg,0.01mmol)溶解于水2mL中，加入到Alkyne-PnPrOx-PLys溶液中。将其在-20℃下静置一晚，在4℃下用2小时进行融化。对于生成物，将反应溶液相对于水透析5次，通过冷冻干燥而回收。这里的回收物除了含有三嵌段共聚物以外还含有为了使Alkyne-PnPrOx-Plys全部反应而过量添加的Glc-PEG-N3及未反应的Alkyne-PnPrOx-PLys。着眼于这些未反应物与作为生成物的三嵌段共聚物的分子量差异，利用SEC进行纯化操作。最后，按照WO2015075942A1的记载，使用TFA将DIG转化为葡萄糖，制成Glc-PEG-b-PnPrOx-b-PLys。
在偶联的进行的确认和利用SEC的纯化操作中，使用利用GE health care公司的色谱柱Superdex 200的SEC(AKTAexplorer,GE Helthcere)。
该三嵌段共聚物的低临界溶解温度(LCST)为约30℃。
然后，作为多价阳离子，合成将亲水性嵌段连接而提高了生物相容性的阳离子性聚合物。具体而言，合成了作为具有支链PEG(分子量37000×2)的嵌段阳离子聚合物的支链聚(乙二醇)-b-聚(L-赖氨酸)(聚合度20)(以下也称为“bPEG-b-PLL”、“PEGasus-PLL”、或“PEGasus-PLL(37×2-20)”)。
将购自日油的末端具有伯胺结构的支链聚乙二醇(bPEG)(分子量37000×2)作为引发剂，使基于非专利文献(J.Polym.Sci.Part A Polym.Chem.2003,41 1167-1187)通过Fuchs-Farthing法合成的Lysine(TFA)-NCA聚合后，用碱进行处理，由此得到。
具体而言，在bPEG-PLL的合成中，首先利用购自Nacalai公司的苯将具有伯胺的bPEG(740mg,0.010mmol)冷冻干燥。接着，作为反应溶剂，准备将购自Sigma-Aldrich公司的硫脲(TU)溶解于购自关东化学公司的脱水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中而制备为1M的浓度的DMF(1M TU)。使冷冻干燥后的bPEG溶解于10mL的DMF(1M TU)中。接着，在Ar背景中量取Lys(TFA)-NCA 59mg(0.22mmol)至烧瓶中，溶解于DMF 2mL中。将制备的Lys(TFA)-NCA溶液在Ar气氛下加入到bPEG溶液中，在25℃下搅拌3天。将反应溶液相对于甲醇(Sigma-Aldrich公司)与乙醚(SHOWA-ETHER公司)的1:9混合溶液300mL进行滴定，使共聚物bPEG-PLL(TFA)再沉淀。通过过滤回收所得到的bPEG-PLL(TFA)，真空干燥。量取得到的bPEG-PLL(TFA)500mg，溶解于25mL的甲醇中。接着，向该bPEG-PLL(TFA)溶液中加入1M NaOH 7.5mL，在35℃下搅拌12小时而进行TFA基的脱保护。反应后，相对于0.01M HCl进行3次透析，然后相对于水进行3次透析，通过冷冻干燥回收bPEG-PLL。通过使用GE health care公司的色谱柱superdex200的SEC(LC2000 system,日本分光公司)、1H-NMR(ESC400,JEOL)对得到的bPEG-PLL进行分析。
由得到的三嵌段聚合物和mRNA形成多聚体胶束。具体而言，在4℃下与mRNA以电荷比为2的方式混合，之后在37℃下静置，由此以在三嵌段聚合物中包入mRNA的方式形成疏水性层，得到具有疏水性层作为mRNA的保护层的多聚体胶束。
使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒(Ambion公司)对模板DNA进行体外转录，另外使用poly(A)tail试剂盒(Ambion公司)实施poly(A)修饰，由此制备mRNA。另外，作为模板DNA，使用购自New England Biolabs公司的pCMV-Gluc control plasmid。
pDNA使用由RIKEN BioResource Center提供的编码荧光素酶且具有CAG启动子的pCAG-Luc2。
(1)由多价阳离子引起的多聚体胶束的体内动态的变化
[实验]
实验中，在对断食小鼠单独给药上述葡萄糖修饰多聚体胶束的情况(胶束单独给药组)与除了等量的上述葡萄糖修饰多聚体胶束以外还给药阳离子性聚合物(PEGasus-PLL)的情况(多价阳离子给药组)之间比较mRNA的体内动态。该实验中使用的mRNA预先用Label IT Tracker Cy5试剂盒(Mirus Bio公司)进行荧光标记。
具体而言，使小鼠断食一晩而呈饥饿状态。对该小鼠i.p.给药20％葡萄糖溶液。30分钟后，对于胶束单独给药组，给药向调整成200ng/μL的mRNA浓度的多聚体胶束溶液200μL中加入100μL的HEPES缓冲液而得到的300μL，对于多价阳离子给药组，除了给药调整成200ng/μL的mRNA浓度的多聚体胶束溶液200μL以外，还给药按照电荷比相对于所给药的mRNA为3的方式调整了浓度的PEGasus-PLL溶液100μL(计300μL)。在给药30分钟后回收全血，用PBS灌注后解剖小鼠，摘出内脏(肝脏、肾脏及脑)。将回收的内脏整体用裂解缓冲液(promega公司)和多珠振荡器(安井器械公司)磨碎，用酶标仪(Infinite M100 Pro,TECAN公司)测定该悬浮液的Cy5荧光量，评价胶束的内脏分布。将总给药量设为100％而求出内脏中蓄积的量(％)。结果如图1及2所示。
如图1所示表明，在胶束单独给药组中，肝脏中的mRNA的蓄积量为小于30％，与此相对地，在多价阳离子给药组中，蓄积量为大于10％左右，肝脏中的蓄积量降低至一半以下。另外，如图1所示表明，在胶束单独给药组中，肾脏中的mRNA的蓄积量为约7％，与此相对地，在多价阳离子给药组中，肾脏中的mRNA的蓄积量为约5％左右，肾脏中的蓄积量降低至七成左右。
然后，通过脑组织中的mRNA的蓄积量评价了mRNA向脑中的递送量，结果如图2所示，在胶束单独给药的情况下也确认到达到0.05％的大量的mRNA蓄积在脑组织中。这意味着多聚体胶束本身使mRNA极显著地稳定化(需要说明的是，mRNA在血中不稳定，数秒即达到检测限以下)。另外，与此相对地，在多价阳离子给药组中，mRNA向脑中的递送量进一步提高了5倍以上。
进一步评价了mRNA在脾脏、心脏等其它内脏中的蓄积量，结果如图2A所示，在多价阳离子给药组中，mRNA在脾脏中的蓄积量、mRNA在心脏中的蓄积量均显著增加。
另外，认为肝脏、肾脏中的mRNA的蓄积量的降低与肝脏、肾脏中的从血中排泄mRNA的排泄能力有关。由此明确了：多价阳离子具有降低肝脏和肾脏中的从血中排泄mRNA的能力、由此增加mRNA即药物在肝脏和肾脏以外的内脏中的分布的作用。在上述实施例中，在向脑的递送实验中，为了促进在脑中的选择性蓄积而进行了血糖操作(断食及葡萄糖给药)及利用葡萄糖的胶束被覆。因此，在这种目标为mRNA的选择性递送的体系中，mRNA的排泄能力的降低和血中滞留性的增加会增强mRNA向脑中的选择性蓄积。另一方面，上述实施例中，对于脾脏、心脏，未进行用于向这些内脏中的选择性蓄积的特别操作。但是，即便如此mRNA在脾脏、心脏等内脏中的蓄积量也提高，因此认为阳离子性聚合物具有如下效果：通过提高mRNA的血中滞留性的效果，来促进药物在肝脏、肾脏以外的内脏中的蓄积。
(2)由多价阳离子引起的脂质基mRNA复合体的体内动态的变化
作为向肝脏递送RNA的试剂，有Invitrogen公司销售的Invivofectamine(商标)。Invivofectamine(商标)为用于全身给药脂质基mRNA的试剂，特别适合于向肝脏递送mRNA。
这里，按照制造商的规程将Invivofectamine(商标)和mRNA混合，形成脂质基mRNA复合体。该实验中使用的mRNA预先用Label IT Tracker Cy5试剂盒(Mirus Bio公司)进行了荧光标记。
对于小鼠，静脉给药调整到12.5mg/mL的浓度的PEGasus-PLL溶液100μL。5分钟后，i.v.给药上述所制备的invivofectamine溶液200μL。30分钟后回收全血，用PBS灌注后，将小鼠解剖并摘出内脏(肝脏及肾脏)。作为观察聚合物添加效果的阴性对照组，对小鼠不进行聚合物添加剂的先行给药，与静脉给药上述所制备的溶液200μL的组进行比较。将回收的内脏用裂解缓冲液(promega公司)和多珠振荡器(安井器械公司)磨碎，用酶标仪(InfiniteM100 Pro,TECAN公司)测定该悬浮液的Cy5荧光量，评价胶束的内脏分布。
结果如图3所示。如图3的上图所示，复合体单独给药的情况下，肝脏中的mRNA的蓄积量大于7％，与此相对地，在事先给药多价阳离子的情况下，蓄积量为0.5％以下。由此明确了：通过事先给药多价阳离子，使mRNA复合体在肝脏中的蓄积急剧减少。
另外，如图3的下图所示，在单独给药的情况下，肾脏中的mRNA的蓄积量小于8％，与此相对地，在事先给药多价阳离子的情况下，蓄积量小于4％。由此明确了：多价阳离子使mRNA复合体在肾脏中的蓄积也减少。
另外，对于脂质复合物，也评价了脾脏、心脏等其它内脏中的mRNA的蓄积量，结果如图3A所示，在多价阳离子给药组中，mRNA在脾脏中的蓄积量、mRNA在肺中的蓄积量、mRNA在心脏中的蓄积量均显著增加。由此表明，通过降低从血中排泄mRNA的能力而促进了mRNA、即药物向各种内脏中的递送。
实施例2：多价阳离子的体内动态
本实施例中，为了探究发挥上述功能的原因而对多价阳离子的体内动态进行阐明。
对于小鼠，静脉注射用购自Thermo Fisher scientific公司的Alexa Fluor594NHS Ester进行了荧光标记的浓度为12.5mg/mL的PEGasus-PLL(37×2-20)100μL。之后，用活体共聚焦显微镜观察肝脏的血管。可以通过荧光来评价血管内的聚合物蓄积。
结果如图4所示。如图4所示，从给药多价阳离子1分钟后起，观察到吸附、蓄积于血窦内皮细胞的血管内表面的样子。
然后，作为末梢血管的一例，对耳的血管进行观察。结果如图5所示，可以确认多价阳离子在血管内流动，但是未观察到在耳的血管内皮细胞的血管内表面的蓄积。
这样，多价阳离子在肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面蓄积，另一方面，未观察到在末梢血管的血管内表面的蓄积。
已知肝脏、肾脏在药物代谢动力学中为对从血中排泄药物的能力产生较大影响的内脏。可知，多价阳离子通过吸附在血窦内皮细胞的表面而物理性地被覆血管内表面，由此降低基于肝脏的血窦内皮细胞、肾脏的从血中排泄的能力，具有降低从血中排泄药物的能力的作用。另外，该被覆相对于肝脏的血窦内皮细胞、肾脏的血管内皮细胞是特异性的。
实施例3：由多价阳离子带来的、提高胶束的血中滞留性的效果
上述实施例中明确了多价阳离子具有基于肝脏的血窦内皮细胞和肾脏的从血中排泄药物的能力的降低作用。
本实施例中，确认这些排泄能力的降低是否有助于药剂的血中滞留性的提高。
对于小鼠，静脉给药作为多价阳离子的调整为浓度12.5mg/mL的PEGasus-PLL溶液100μL。5分钟后，给药通过Biomaterial,2017,126,31-38的方法制作的包封有质粒DNA(pDNA)的高分子胶束溶液200μL。该实验中使用的pDNA预先用Label IT Tracker Cy5试剂盒(Mirus Bio公司)进行了荧光标记。之后确认pDNA的血中滞留性。将荧光强度的最大值设为100％，通过随着时间经过的荧光强度变化来评价pDNA的血中滞留性。作为对照组，对未向小鼠进行多价阳离子的先行给药、而是静脉给药上述所制备的溶液200μL的组进行观察。
结果如图6所示。如图6所示，明确了：在未先行给药多价阳离子的组中，pDNA的血中残存量迅速降低，与此相对地，在先行给药多价阳离子的组中，其血中滞留性显著增大。
另外，在使用单链PEG的实验中，PEG部分的平均分子量大则血中滞留性提高(例如，与50kD相比，60kD、70kD时血中滞留性提高)。
然后，用活体共聚焦显微镜观察胶束在肝脏中的蓄积。如图7的上图所示，在未进行多价阳离子的先行给药的组中，可确认到pDNA在肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面蓄积的样子。与此相对地，如图7的下图所示，在进行了多价阳离子的先行给药的组中，pDNA在肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面的蓄积显著降低。
根据这些结果，认为实施例1、2中观察到的从血中排泄药物的能力降低的原因在于，通过多价阳离子被覆肝脏的血窦内皮细胞的血管内表面而抑制药物在血窦内皮细胞的聚集，以及通过阳离子性聚合物被覆肾脏的血管内皮细胞的血管内表面而抑制药物经由肾小球的排泄。这样，即使单独(即，以游离形态)给药多价阳离子也具有降低从血中排泄药剂的能力、提高其血中滞留性的效果，由此可以改善向靶内脏的药物递送量。
然后，确认多价阳离子与白蛋白的相互作用。具体而言，使用马尔文等温滴定型量热仪Microcal PEAQ-ITC测定将白蛋白和PEGasus-PLL混合时产生的热量。作为样品池侧样品，准备在PBS中以33.3μM的浓度溶解白蛋白而成的白蛋白溶液200μL，作为注射侧样品，准备在PBS中以313μM的浓度溶解PEGasus-PLL而成的PEGasus-PLL溶液。在750rpm的搅拌速度下，向白蛋白溶液中滴加37μL的PEGasus-PLL溶液并观察热变化。作为对照实验，观察向PBS中滴加PEGasus-PLL时的热变化。在将过滤期设为5秒、将反馈模式设为高的装置条件下进行。结果如图8所示。
如图8所示，在白蛋白存在下及不存在下热变化几乎同等，未观察到显著差异。该结果表明，PEGasus-PLL与白蛋白之间没有相互作用，即，PEGasus-PLL不与白蛋白结合。可认为，PEGasus-PLL不是通过基于白蛋白的药物清除效果、而是通过基于被覆肝脏的血窦内皮细胞带来的清除降低作用来提高药物的血中滞留性。
实施例4：由多价阳离子带来的、脂质复合物在脾脏中的基因表达性提高
作为向肝脏递送RNA的试剂，有Invitrogen公司销售的Invivofectamine(商标)。Invivofectamine(商标)为用于全身给药脂质基mRNA的试剂，据称特别适合于向肝脏递送mRNA。
这里，按照制造商的规程将Invivofectamine(商标)和mRNA混合而形成脂质基mRNA复合体(脂质复合物)。
对于小鼠，静脉给药作为多价阳离子的调整为浓度12.5mg/mL的PEGasus-PLL溶液100μL。5分钟后，i.v.给药上述所制备的invivofectamine溶液200μL。24小时后摘出内脏(肝脏及脾脏)。作为观察聚合物添加效果的阴性对照组，与对小鼠不进行多价阳离子的先行给药、而是静脉给药上述所制备的溶液200μL的组进行比较。将回收的内脏用裂解缓冲液(promega公司)和多珠振荡器(安井器械公司)磨碎。使用购自promega公司的荧光素酶测定试剂盒，按照制造商的规程并用光度计(Lumat LB9507,Berthold公司)对该悬浮液测定荧光素酶的发光量，评价肝脏和脾脏中的基因表达量。结果如图9所示。
如图9所示，通过添加多价阳离子，可以使脂质复合物在脾脏中的基因表达提高100倍以上。从而证实，多价阳离子的添加抑制基于肝脏的血窦内皮细胞、肾脏的内皮细胞的药剂摄入，提高药剂的血中滞留性，由此提高药物在肝脏、肾脏以外的内脏中的蓄积。图9与图3A的不同之处在于，图3A中评价了Cy5的荧光量，与此相对地，图9中评价了所给药的mRNA的表达量。通过这些实施例可明确，给药多价阳离子对提高脾脏中的mRNA的表达量有效。
另外，根据本实施例，可以向脾脏中有效地递送mRNA。脾脏为产生免疫细胞的内脏，mRNA向脾脏的递送及表达的实现是关系到RNA疫苗、肽疫苗等疫苗的开发的重大成果。
另外，在进行多价阳离子的添加的情况下，与上述实施例所示同样地，肝脏中的基因表达可见若干减少。认为这是由于，此前提到的PEGasus-b-PLL抑制脂质复合物在肝脏的血窦内皮的聚集。特别是获知：肝脏中的基因表达中的大部分由于PEGasus-b-PLL而受到抑制，因此脂质复合物主要在肝脏的血窦内皮细胞中蓄积。另一方面，由于两者在肝脏中的基因表达量及其差不特别大，因此表明，即使脂质复合物在肝脏的血窦内皮聚集，也不会相应地得到肝脏中的高基因表达。另外，根据这些结果可认为，核酸在肝脏血窦内皮的聚集有助于从血中除去核酸载体，并且还与核酸的失活有关。
实施例5：bPEG-PLL从体内排出的特性
本实施例中，对多价阳离子从体内的排出进行调查。
具体而言，使用购自Thermofisher公司的Alexa Fluor 594NHS ester对bPEG、以及如上所述使Lys(TFA)-NCA聚合而合成的bPEG(分子量40k×2)-PLL(TFA)(聚合度20)和PEG(分子量80k)-PLL(TFA)(聚合度20)进行荧光标记。将bPEG-PLL(TFA)和PEG-PLL(TFA)按照上述那样用碱脱除TFA保护基，制成荧光标记的bPEG-PLL、PEG-PLL。将调节为12.5mg/mL的浓度的这些溶液100μL尾静脉给药于小鼠，用活体共聚焦显微镜观察其血中滞留性。结果如图10所示。
另外，对于bPEG-PLL，用活体共聚焦显微镜观察肝脏的血窦内皮细胞的管腔侧内壁。结果如图11所示。
如图10所示，键合有作为多价阳离子的聚合度20的赖氨酸的bPEG-PLL和PEG-PLL与不具有阳离子性嵌段的bPEG相比，血中滞留性更低，特别是bPEG-PLL，在10小时后几乎都从血中排出(图10)。由此暗示了，阳离子性嵌段具有降低bPEG的血中滞留性的作用。
另外，如图11所示，经时观察被覆着血窦内皮细胞的管腔侧内壁的bPEG-PLL的存在量的结果是，给药后可以持续被覆内壁至少1小时以上，但是在给药6小时后几乎从内壁完全消失(图11)。
由此认为，通过以游离形态单独给药bPEG-PLL，在足以进行药物递送的时间内被覆内皮细胞的管腔侧内壁、降低药物的清除，另一方面能够在药物递送后消失。另外，由使用bPEG-PLL的实验暗示了，可根据药物的给药时间(或根据其前后)来进行本发明的多价阳离子的单次给药或多次给药，以使得给药药物的清除以所需的时间减少。进一步地，由使用bPEG-PLL的实验暗示了，本发明的多价阳离子能够实现以在递送药物后从体内排出的方式来给药的给药方式(给药频率及给药量等)。
实施例6：使用病毒粒子的递送实验
本实施例中，对给药多价阳离子对利用病毒粒子的基因递送带来的影响进行调查。
作为多价阳离子，使用PEGasus-b-PLL。另外，作为病毒粒子，使用腺伴随病毒(AAV8)。作为AAV8，从Vector Biolabs公司购买了在CMV启动子下重组有编码萤火虫荧光素酶的基因的AAV8(Catalog#:VB1473)。从小鼠(Balb/c、雌性、6周龄)的尾静脉给药AAV8(1×1010病毒基因组/小鼠)。在给药21天后处死小鼠，采集内脏(肝脏、胰脏、四头肌、大腿)的组织，在被动溶解缓冲液1mL中，将100mg组织制成匀浆。将匀浆以18000g在4℃下离心10分钟，对于20μL上清，检测荧光素酶的发光。为了确定蛋白质浓度，进行BCA检测。以相对于蛋白质含量进行标准化而得到的相对光学单位(RLU)来表示荧光素酶活性。结果如图12所示。
如图12所示，多价阳离子降低利用AAV8向肝脏导入荧光素酶的效率，增强胰脏、四头肌、大腿的组织中的荧光素酶表达。预测会减少向肝脏的蓄积性、增加向多个内脏的聚集性。由此确认，本申请发明的聚阳离子对病毒粒子也发挥改变所给药的药物的动态、减少清除的效果。
然后，使用可以向心肌运送基因的AAV9代替AAV8，除此以外同样地进行上述实验。作为AAV9，从SignaGen Laboratories公司购买了在CMV启动子下重组有编码萤火虫荧光素酶的基因的AAV9(Catalog#:SL101494)。其中，将用量设为5×1010病毒基因组/小鼠，给药2天后处死小鼠。其结果如图13所示，多价阳离子减少了AAV9在肝脏中的蓄积性、降低了向肝脏的基因导入效率，另一方面增加了在心脏中的聚集性、提高了对心脏的基因导入效率。
从而明确了：虽然病毒的组织特异性根据病毒的种类、血清型而存在差异，但是，根据本发明，阳离子性聚合物(聚阳离子)通过封闭肝脏的血窦内皮细胞的表面，不仅降低胶束、还降低病毒粒子等粒子状物在肝脏中的清除，并且作为结果或同时增强病毒自身所具有的内脏或组织特异性。

Claims (15)

1.一种用于控制体内的药物动态的组合物，其含有多价阳离子作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，多价阳离子为与亲水性聚合物嵌段的结合体的形态。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，多价阳离子为具有两条以上的亲水性聚合物链的阳离子性聚合物。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中，多价阳离子为阳离子性聚合物嵌段与支链聚乙二醇的嵌段共聚物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为从血中的清除的控制。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肝脏的血窦内皮细胞从血中排泄药物的能力的降低。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为基于肾脏从血中排泄药物的能力的降低。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为向靶内脏或靶组织的递送量的增加。
9.根据权利要求1～6所述的组合物，其中，药物动态的控制为向脾脏的递送量的增加。
10.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，药物动态的控制为药物的血中滞留性的增大。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其早于要控制动态的药物给药。
12.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其与要控制动态的药物同时给药。
13.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其晚于要控制动态的药物给药，但是，以在所述药物滞留在血中的期间内进行所述给药为条件。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的组合物，其中，多价阳离子为游离形态或以游离形态被给药。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的组合物，其中，要控制动态的药物为包封于药物递送用载体的药物。
CN201980018952.7A 2017-10-05 2019-03-12 控制体内的药物动态的组合物 Active CN111918673B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017195061 2017-10-05
JP2018043880A JP2019069933A (ja) 2017-10-05 2018-03-12 体内における薬物動態を制御する組成物
JP2018-043880 2018-03-12
PCT/JP2019/009919 WO2019176916A1 (ja) 2017-10-05 2019-03-12 体内における薬物動態を制御する組成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111918673A true CN111918673A (zh) 2020-11-10
CN111918673B CN111918673B (zh) 2024-09-06

Family

ID=66441009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980018952.7A Active CN111918673B (zh) 2017-10-05 2019-03-12 控制体内的药物动态的组合物

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11957708B2 (zh)
EP (1) EP3766519A4 (zh)
JP (2) JP2019069933A (zh)
CN (1) CN111918673B (zh)
WO (1) WO2019176916A1 (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727907A (zh) * 2011-04-13 2012-10-17 苏州瑞博生物技术有限公司 一种小干扰rna药物的给药系统和制剂
CN102971002A (zh) * 2010-07-09 2013-03-13 国立大学法人东京大学 核酸递送用组合物及载体组合物、使用其的药物组合物以及核酸递送方法
EP2842546A1 (en) * 2012-04-27 2015-03-04 The University of Tokyo Unit structure-type pharmaceutical composition for nucleic acid delivery
CN105899192A (zh) * 2013-11-22 2016-08-24 国立大学法人东京大学 药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法
WO2018038155A1 (ja) * 2016-08-23 2018-03-01 国立大学法人東京大学 ミセル及びその使用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008201673A (ja) * 2005-05-16 2008-09-04 Kyushu Univ Ｒｎａ含有組成物
ES2937113T3 (es) * 2006-01-20 2023-03-24 Starpharma Pty Ltd Macromolécula modificada
JP5277439B2 (ja) * 2006-03-01 2013-08-28 国立大学法人 東京大学 核酸内包高分子ミセル複合体
JP5271715B2 (ja) * 2006-11-22 2013-08-21 国立大学法人 東京大学 ジスルフィド架橋高分子ミセルを用いた環境応答性ｓｉＲＮＡキャリア
EP2272897B1 (en) * 2008-03-10 2016-12-28 The University of Tokyo Copolymer including uncharged hydrophilic block and cationic polyamino acid block having lateral chain to which hydrophobic radical is partially introduced, and use of copolymer
WO2010106700A1 (ja) * 2009-03-17 2010-09-23 国立大学法人東京大学 タンパク質の電荷調節剤、及びタンパク質内包高分子ミセル複合体
JP5463531B2 (ja) * 2009-07-22 2014-04-09 国立大学法人 東京大学 Ｐｈｄ２発現抑制物質搭載ポリイオンコンプレックス
CN105188905B (zh) * 2013-03-01 2019-01-15 国立研究开发法人科学技术振兴机构 物质包封微囊及其制备方法
WO2015121924A1 (ja) * 2014-02-12 2015-08-20 一般社団法人医療産業イノベーション機構 ｍＲＮＡ送達用組成物
EP3292871B1 (en) * 2015-05-07 2021-06-23 The University of Tokyo Nanoreactor using polyion complex polymersomes, and method for producing same
WO2016186204A1 (ja) * 2015-05-21 2016-11-24 国立大学法人 東京大学 温度感受性重合体を用いた核酸の送達用ミセル組成物およびその製造方法
US11066665B2 (en) * 2015-11-19 2021-07-20 Public University Corporation Nagoya City University Antitumor drug delivery formulation

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102971002A (zh) * 2010-07-09 2013-03-13 国立大学法人东京大学 核酸递送用组合物及载体组合物、使用其的药物组合物以及核酸递送方法
CN102727907A (zh) * 2011-04-13 2012-10-17 苏州瑞博生物技术有限公司 一种小干扰rna药物的给药系统和制剂
EP2842546A1 (en) * 2012-04-27 2015-03-04 The University of Tokyo Unit structure-type pharmaceutical composition for nucleic acid delivery
CN105899192A (zh) * 2013-11-22 2016-08-24 国立大学法人东京大学 药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法
US20160287714A1 (en) * 2013-11-22 2016-10-06 The University Of Tokyo Carrier for use in delivering drug, conjugate, composition comprising same, and method for administrating same
WO2018038155A1 (ja) * 2016-08-23 2018-03-01 国立大学法人東京大学 ミセル及びその使用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3766519A4 (en) 2021-12-01
US11957708B2 (en) 2024-04-16
JP2019069933A (ja) 2019-05-09
US20210038634A1 (en) 2021-02-11
WO2019176916A1 (ja) 2019-09-19
US20240207306A1 (en) 2024-06-27
CN111918673B (zh) 2024-09-06
JPWO2019176916A1 (ja) 2021-02-25
EP3766519A1 (en) 2021-01-20
JP7434145B2 (ja) 2024-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miyata et al. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses
Maruyama et al. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D, L-lactic acid)
CN102920649B (zh) 载药纳米胶束及其制备方法和应用
Han et al. In vivo distribution and antitumor activity of heparin-stabilized doxorubicin-loaded liposomes
CN102824647B (zh) 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法
JP5271715B2 (ja) ジスルフィド架橋高分子ミセルを用いた環境応答性ｓｉＲＮＡキャリア
Ji et al. Development of self-assembled multi-arm polyrotaxanes nanocarriers for systemic plasmid delivery in vivo
Li et al. pH-Sensitive nanoparticles as smart carriers for selective intracellular drug delivery to tumor
CN108542885A (zh) 抗肿瘤药物及其制备方法
LI et al. Stealth polycyanoacrylate nanoparticles as tumor necrosis factor-α carriers: pharmacokinetics and anti-tumor effects
CN111632153B (zh) 一种化学基因药物共载的靶向纳米递药系统及其制备方法
CN111214461B (zh) 糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用
CN103800915B (zh) 一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法
CN115708809A (zh) 一种递送核酸药物的新型脂质纳米粒以及制备方法
CN108126210B (zh) 一种单靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
Grill et al. A review of select recent patents on novel nanocarriers
Garcia-Guerra et al. A modular RNA delivery system comprising spherical nucleic acids built on endosome-escaping polymeric nanoparticles
CN115151278A (zh) 用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
CN105168130B (zh) 一种肿瘤靶向聚合物胶束及其制备方法
US9579394B2 (en) Polyanion nanocomplexes for therapeutic applications
CN111743861B (zh) 靶向三阴性乳腺癌的低氧响应手性药物胶束及其制备方法
JP2022075622A (ja) 薬物送達キャリア及びそれを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤
CN107998081A (zh) 一种靶向还原响应囊泡纳米药物在制备脑肿瘤治疗药物中的应用
US20240207306A1 (en) Composition controlling pharmacokinetics in the body
WO2018038155A1 (ja) ミセル及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant