CN111902196A

CN111902196A - 用于解决具有挑战性的分离问题的自动化双柱循环色谱方法

Info

Publication number: CN111902196A
Application number: CN201980023679.7A
Authority: CN
Inventors: F·格里蒂; T·S·麦唐纳; M·利尔
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-11-06
Also published as: US20190302067A1; EP3773968A1; EP3773968B1; WO2019186469A1

Abstract

本技术涉及一种循环色谱方法。将样品注入液相色谱系统的移动相流动流中，从而产生组合流动流。该液相色谱系统包括：至少两个柱，该至少两个柱串联定位；阀，该阀与该至少两个柱流体连通；和检测池，该检测池定位在该至少两个柱之间。使该组合流动流流过该至少两个柱并且由该检测池监视该样品的色谱峰。该检测池被配置为测量该色谱峰的分辨率和宽度，并且当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将该阀从第一位置切换到第二位置。

Description

用于解决具有挑战性的分离问题的自动化双柱循环色谱方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月29日提交的美国临时专利申请号62/649,803的权益和优先权，该美国临时专利申请的全部内容据此以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及用于解决具有挑战性的分离问题的自动化双柱循环色谱方法和系统。具体地，本公开涉及一种检测池，该检测池可测量色谱峰的分辨率和宽度，并且当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将阀从第一位置切换到第二位置。

背景技术

当使用填充有标准尺寸的颗粒（例如，约3.5µm）并且在标准压降（例如，小于约400巴）下操作的标准高效液相色谱(HPLC)柱时，选择性因子小于1.05的化合物的完全基线分离是极具挑战性的或者甚至是不可能的。可实现的最高效率是以无限小的流速运行的无限长的柱的效率。该效率极限由最大允许系统压力、柱渗透性、洗脱液的粘度和化合物沿着柱的纵向扩散系数的强度固定。该极限仅在关于无限长的柱和洗脱时间的不实际实验条件下才能观察到。

另选地，双柱循环分离工艺(TCRSP)可通过将分离区从一个柱转移到另一个相同的柱直至该区的空间宽度达到一个柱长度来减轻该分辨率极限。计算预测出，TCRSP可以克服传统单柱分批工艺的经典速度分辨率障碍。TCRSP的性能可能会受到分析物的保留因子对沿着柱的局部压力的依赖性的负面或正面影响。

双柱循环分离工艺的一个问题是，用户必须手动控制阀的切换，该阀的切换将分离区从第一柱转移到第二柱。这需要用户不断参与双柱循环分离工艺，使得该工艺是劳动密集型的。此外，需要切换两个柱的时间对操作条件（诸如温度、流速、保留力和柱效率）的意外变化敏感。此外，这些变量中的每个变量可随时间推移而改变，从而导致手动阀切换时效率和/或分辨率的损失。

发明内容

本技术通过提供用于解决具有挑战性的分离问题的自动化双柱循环色谱方法来解决现有技术的问题。具体地，本公开涉及一种检测池，该检测池可测量色谱峰的分辨率和宽度，并且当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将阀从第一位置切换到第二位置。这可通过结合到检测池中的反馈回路来完成。反馈回路可定位在检测器与阀之间。检测池可包括检测器和反馈回路。

本技术提供了一种自动控制阀切换的方法和装置，该阀切换基于所测量的峰数据（例如，峰分辨率和峰宽）而不是基于何时应切换阀的理论和计算来将分离区从第一柱转移到第二柱。本技术可准确考虑峰分辨率和峰宽如何由于操作条件（例如，温度、流速、保留力和柱效率）的意外变化而随时间推移改变，该操作条件的意外变化无法使用现有技术的方法和装置来有效考虑。

本公开涉及一种循环色谱方法。该方法包括将样品注入液相色谱系统的移动相流动流中以产生组合流动流。液相色谱系统包括：至少两个色谱柱，该至少两个色谱柱串联定位；阀，该阀与至少两个色谱柱流体连通；和检测池，该检测池定位在至少两个色谱柱之间。该方法还包括使组合流动流流过至少两个色谱柱，以及通过检测池监视样品的色谱峰。该检测池被配置为测量色谱峰的分辨率和宽度，并且当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将该阀从第一位置切换到第二位置。

该方法可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。检测池可被配置为计算切换时间并且在所计算的切换时间自动地将阀从第一位置切换到第二位置。在一些实施方案中，检测池继续监视样品的色谱峰并且将阀从第一位置切换到第二位置或从第二位置切换到第一位置，直到a)所测量的分辨率大于期望的分辨率；b)所测量的组合峰宽大于或等于最大组合峰宽；或者c)切换计数大于或等于预定的最大切换数。

该方法还可包括检测组合流动流。在一些实施方案中，该方法包括计算每个峰的洗脱时间。

检测池可为低分散性检测池。

在一些实施方案中，至少两个色谱柱是相同的。

阀为六通阀或八通阀。在一些实施方案中，阀为十通阀。阀可为低分散性阀，相对于标准商业阀该低分散性阀可为循环色谱方法提供两倍的最终峰分辨率增益。

本技术提供了一种色谱系统。该系统包括注射器，该注射器用于将样品注入移动相流动流中以产生组合流动流。该系统还包括：至少两个色谱柱，该至少两个色谱柱串联定位并且在注射器的下游；和阀，该阀与该至少两个色谱柱流体连通。检测池定位在该至少两个色谱柱之间。检测池被配置为：监视样品的色谱峰；测量色谱峰的分辨率和宽度；以及当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将阀从第一位置切换到第二位置。该系统还包括检测器，该检测器在至少两个色谱柱的下游。

该系统可包括本文所述的实施方案中的一个或多个。检测池还可被配置为计算切换时间并且在所计算的切换时间自动地将阀从第一位置切换到第二位置。在一些实施方案中，检测池为低分散性检测池。

至少两个色谱柱可为相同的。至少两个色谱柱可为液相色谱柱。

在一些实施方案中，阀为六通阀。阀可为八通阀或十通阀。

本公开的实施方案通过如下方式提供优于现有技术的优点：基于所测量的峰数据而不是依赖于基于所计算的峰分辨率和峰宽的预定切换时间自动地控制将分离区从第一柱转移到第二柱的阀切换。预先计算的切换时间无法考虑操作条件的变化。本技术可基于所测量的实时峰数据而不是基于理论和计算的预定切换时间来实时地准确考虑操作条件的任何波动。

本技术使得用户能够解决利用标准HPLC柱时在等度条件（选择性因子α<1.05）下的异常难的分离问题，标准HPLC柱不能单独实现完全分离。手性化合物、来自API的杂质、异构体、同位素和单克隆抗体以及它们的聚集体可被分离并且是本技术的直接应用。本技术的益处在于，用户不必手动控制切换阀定时，该切换阀定时对可实时变化的操作条件（诸如温度、流速、保留力和柱效率）的意外变化敏感。

附图说明

通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：

图1A是根据本技术的例示性实施方案的在位置A使用外部十通阀的双柱循环色谱系统的示意图。

图1B是根据本技术的例示性实施方案的在位置B使用外部十通阀的双柱循环色谱系统的示意图。

图2是根据本技术的例示性实施方案的由结合到检测池中的反馈回路使用的逻辑的流程图。

具体实施方式

本技术基于将在色谱系统（例如，液相色谱或气相色谱）中使用的新仪器和方法的设计。该系统包括注射器、两个相同或几乎相同的色谱柱、具有6、8或10个端口的阀以及检测器（例如，低分散性检测器）。通过在阀将样品区从一个柱切换到第二柱（反之亦然）时进行转移来通过虚拟的半无限长柱分离化合物，直到分离区的宽度变得等于一个柱长。

双柱循环系统和工艺包括阀开关，该阀开关允许阀的自动切换和工艺的自动终止。这通过由串联放置在两个色谱柱之间的检测池（例如，低分散性检测池）所提供的反馈答案来控制。本技术允许解决在利用标准HPLC柱时在等度条件（选择性因子α<1.05）下异常难的分离问题。手性化合物、来自活性药物成分(API)的杂质、异构体、同位素和单克隆抗体以及它们的聚集体可被分离并且是本技术的直接应用。本技术的益处在于，用户不必手动控制切换阀定时，该切换阀定时对可实时变化的操作条件（诸如温度、流速、保留力和柱效率）的意外变化敏感。此外，本技术可提供比可在柱出口处提供的检测下限更低的检测下限。

图1A是在位置A使用外部十通阀的双柱循环色谱系统100的示意图。图1B是在位置B使用外部十通阀的双柱循环色谱系统100的示意图。该系统包括注射器（未示出），该注射器将样品注入移动相流动流中，从而产生组合流动流。该系统还包括阀105。阀105可具有6个端口、8个端口或10个端口。

该系统还可包括至少两个色谱柱，例如第一柱110和第二柱120。第一柱110和第二柱120可为相同的。在一些实施方案中，第一柱110和第二柱120几乎相同。两个色谱柱110、120串联定位。第一柱110和第二柱120可为液相色谱柱或气相色谱柱。两个柱110、120可为高效色谱柱。两个柱110、120可为不锈钢。在一些实施方案中，使用多于两个柱，例如三个柱或四个柱。可基于特定样品和正执行的分离来选择柱长、内径、填料和流速。类似地，可基于特定样品和正执行的分离来选择柱效率、保留因子和选择性因子。本领域的普通技术人员理解如何基于待分离的样品来选择这些柱参数。

通过使部件（例如，柱、阀、检测器、管材）之间的距离最小化，可将样品分散或带扩展保持为最小。例如，部件之间的距离可介于约10cm至约20cm之间。在一些实施方案中，部件之间的距离可为约15cm。在一些实施方案中，阀与柱入口之间的距离为约14cm、13cm、12cm、11cm或10cm。例如，阀与柱入口和柱出口之间的距离可为约15cm。这允许使用75µm×25cm长的低分散性面密封件，该面密封件将具有小于约0.1µL²的最小样品分散性的管件连接。可使用可从美国马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司（Waters Corporation, Milford,MA）商购获得的ZenFit^®连接技术作为连接管。通过将每个部件之间的距离保持最小，也可使柱外部发生的带扩展最小化。

检测器/检测池115定位在第一柱110与第二柱120之间。检测池115可为低分散性检测池，以使由检测池引起的任何柱外带加宽保持为小。检测池可为例如UV检测池或荧光检测器。

参见图1A，样品和移动相组合的流动流在位置A流过阀105并且流入第一柱110，在该第一柱处样品的至少一部分被分离。基于待实现的特定分离、正分离的特定样品和/或色谱柱是液相色谱柱还是气相色谱柱来选择移动相组成。

然后，部分分离的组合流动流从第一柱110流出并且通过阀105流到检测器115。当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，检测器115基于所检测的/所测量的峰分辨率和峰宽自动地确定，并且将阀105从位置A切换到位置B。检测器115所使用的方法在图2中示出，并且可通过使用反馈回路而结合到检测池115中。在一些实施方案中，反馈回路并不结合到检测池中，而是结合到定位在检测池之后和阀之前的电子部件中。

仍然参见图1A，部分分离的组合流动流离开检测器115，流过阀105并且流入第二柱120中，在该第二柱中样品被进一步分离。进一步分离的组合流动流离开第二柱120并且流过阀105。如果检测器115基于在第一柱110中发生的分离已确定（即，通过反馈回路）所测量的分辨率大于期望的分辨率、所测量的宽度大于或等于最大组合峰宽或者切换计数大于或等于预定的最大切换数，则阀105保持在位置A并且组合流动流从阀105流出到废液中。在一些实施方案中，组合流动流没有流到废液中，而是流到另外的检测器（未示出），该另外的检测器在至少两个色谱柱下游。可由附加检测器对分离的样品执行进一步检测和分析。检测器可为例如UV检测池或荧光检测器。

然而，如果结合到检测器115中的反馈回路已基于所检测的/所测量的峰分辨率和峰宽确定所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数，则检测器将通过自控反馈回路自动地将阀105从图1A中的位置A切换到图1B中的位置B。在组合流动流离开第二柱120之后进入阀105之前，切换阀105。

当阀切换到图1B中的位置B时，样品和移动相离开第二柱120，进入阀105并且流到检测器115。流离开检测器115，流入阀105，然后流入第一柱110。如果结合到检测器115中的反馈回路基于在第二柱120中发生的分离确定所测量的分辨率大于期望的分辨率、所测量的宽度大于或等于最大组合峰宽或者切换计数大于预定的最大切换数，则阀105保持在位置B并且组合流动流从阀105流出到废液中。如上所述，在一些实施方案中，组合流动流没有流到废液中，而是流到检测器以便进一步分析样品。

然而，如果结合到检测器115中的反馈回路基于所检测的/所测量的峰分辨率和峰宽确定所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数，则检测器将通过反馈回路自动地将阀105从图1B中的位置B切换到图1A中的位置A。在样品和移动相在离开第一柱110之后进入阀105之前切换阀。

当阀从图1B中的位置B切换到图1A中的位置A时，样品和移动相从第一柱110流出，流入阀105并且流到检测器115。如先前针对在阀105处于位置A的情况下的样品和流动相的流动所描述的，流动继续进行。组合流动流的流动以这种方式继续，直到检测器115确定所测量的分辨率大于期望的分辨率、所测量的宽度大于或等于最大组合峰宽或者切换计数大于预定的最大切换数，此时检测器自动停止切换阀115，并且样品和移动相流动流流到废液中。

每次样品和移动相流过第一柱110和第二柱120时，样品被进一步分离。这样，通过两个柱对样品进行的连续分离模拟了无限长的柱。

图2示出了由结合到检测池中的反馈回路使用来确定检测池是否应自动切换阀（例如，图1A至图1B的阀115）的位置的逻辑的流程图200。该过程开始于将样品注入色谱系统（例如，液相色谱或气相色谱系统）的移动相流动流中，从而形成组合流动流（步骤205）。如果阀（如图1A和图1B中所述）尚未处于位置A，则将阀切换到位置A。随着组合流动流流过色谱柱和检测池，检测池例如通过UV检测连续监视峰（步骤210）。检测池实时拟合峰（步骤215）并且测量分离样品的分辨率(R_s)和峰宽(w)（步骤220）。

然后，结合到检测池中的反馈回路基于检测器的测量和计算来做出第一确定。第一确定是所测量的分辨率(R_s)是否大于期望的分辨率(r_D)（步骤225）。期望的分辨率(r_D)是用户已预先确定为足以分离样品的分辨率的分辨率值。如果确定所测量的分辨率(R_s)大于期望的分辨率(r_D)（步骤225），则已实现足够的分辨率，并且检测池可计算已与样品分离的每个峰的洗脱时间（步骤230）。经编程的馏分收集器可单独地收集每个峰（步骤235）并且该方法已完成。然后可注入新样品（步骤240）并且可再次开始该过程。在一些实施方案中，该方法包括通过定位在至少两个色谱柱下游的检测器检测组合流动流。检测器可为例如UV检测池或荧光检测器。

如果所测量的分辨率(R_s)小于期望的分辨率(r_D)（步骤225），则结合到检测池中的反馈回路确定所测量的组合峰宽(w)是否大于或等于最大组合峰宽(w_max)（步骤245）。最大组合峰宽是基于正分离的特定样品的预定最大值。换句话讲，检测器记录分离区从第一柱完全洗脱时的时间，并且向阀发送在该时刻致动的命令。重复相同的反馈控制，并且在样品区的前部离开一个柱而样品区的后部仍在从另一柱洗脱时结束该反馈控制。

如果所测量的组合峰宽(w)大于或等于最大组合峰宽(w_max)（步骤245），则不再可能分辨峰并且峰的体积太大而无法继续（步骤250）。可结合到检测器中的反馈回路中的数据处理器确定是否可收集峰的部分分离（步骤255）。如果可收集峰的部分分离（步骤255），则经编程的馏分收集可收集每个部分分离的峰（步骤235），可注入新样品（步骤240）并且可再次开始该过程。如果无法收集峰的部分分离（步骤255），则将样品倾倒至废液中（步骤260），可注入新样品（步骤240）并且可再次开始该过程。

如果所测量的分辨率(R_s)小于期望的分辨率(r_D)（步骤225）并且所测量的组合峰宽(w)小于最大组合峰宽(w_max)（步骤245），则结合到检测池（例如，图1A和图1B的检测池115）中的反馈回路确定切换计数(s)是否大于或等于预定的最大切换数(s_max)（步骤265）。预定的最大切换数基于待分离的特定样品来确定。如果切换计数(s)大于或等于预定的最大切换数(s_max)（步骤265），则不再可能分辨峰，并且峰的体积太大而无法继续（步骤250）。可结合到检测器中的反馈回路中的数据处理器确定是否可收集峰的部分分离（步骤255）。如果可收集峰的部分分离（步骤255），则经编程的馏分收集可收集每个部分分离的峰（步骤235），可注入新样品（步骤240）并且可再次开始该过程。如果无法收集峰的部分分离（步骤255），则将样品倾倒至废液中（步骤260），可注入新样品（步骤240）并且可再次开始该过程。

如果结合到检测池（例如，图1A和图1B的检测器单元115）中的反馈回路确定(1)所测量的分辨率(R_s)小于期望的分辨率(r_D)（步骤225）；(2)所测量的组合峰宽(w)小于最大组合峰宽(w_max)（步骤245）；以及(3)切换计数(s)小于预定的最大切换数(s_max)（步骤265），则计算切换时间（步骤270）。切换时间是检测池将阀从位置A切换到位置B或反之亦然的时间（参见例如图1A和图1B）。然后，检测池将通过将阀从位置A切换到位置B或从位置B切换到位置A来在所计算的时间执行切换（步骤275）。然后将初始化为零的切换计数(s)增加一(s＝s+1)（步骤280）。然后，该过程重复进行以下步骤：连续监视峰（步骤210）、实时拟合峰（步骤215）以及测量分辨率和峰宽（步骤220）以确定分离结果是否足够（步骤230）、不再可能分辨（步骤250）或者该过程是否需要再次重复（步骤270、275、280）。

应当指出的是，过程200的步骤的特定编号并非旨在暗示该过程串行地或以任何特定顺序发生。例如，反馈回路可同时确定以下各项：(1)所测量的分辨率(R_s)是否小于期望的分辨率(r_D)（步骤225）；(2)所测量的组合峰宽(w)是否小于最大组合峰宽(w_max)（步骤245）；以及(3)切换计数(s)是否小于预定的最大切换数(s_max)（步骤265）。在一些实施方案中，可同时执行两个步骤，然后可执行第三步骤。另外，可以任何顺序执行这些步骤，例如，可首先执行步骤245，然后执行步骤225，然后执行步骤265。另选地，可首先执行步骤265，然后执行步骤245，然后执行步骤225。在一些实施方案中，算法仅包括三个步骤中的两个步骤，例如，算法可包括步骤225和245、或步骤245和265、或步骤225和265。

反馈回路可与控制阀的位置的控制器通信。控制器可定位在检测池中，或者控制器可与反馈回路的电路（例如，微处理器）一起定位，该反馈回路容纳在与检测器单元分开的部件中（例如，容纳在定位在检测池与阀之间的部件中）。控制器可与反馈回路、阀和/或检测池通信。

在一些实施方案中，计算机耦接到检测池的输出端。计算机可具有执行其的代码，该代码在被执行时使得计算机执行本文所述的循环色谱方法，例如，监视如由检测池所输出的样品的色谱峰、测量色谱峰的分辨率和宽度，以及当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，使得控制器自动地将阀从第一位置切换到第二位置。在一些实施方案中，计算机可将数据存储在存储器中。

在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质可包括存储在其上用于执行本文所述的循环色谱方法的代码。

本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验便能确定本文所述具体程序的许多等同形式。此类等同形式被认为是在本技术的范围内并由以下权利要求书所涵盖。本申请通篇引用的所有参考文献、发布专利和公布的专利申请的内容据此以引用方式并入。

Claims

1.一种循环色谱方法，所述循环色谱方法包括以下步骤：

将样品注入液相色谱系统的移动相流动流中以产生组合流动流；所述液相色谱系统包括：

至少两个色谱柱，所述至少两个色谱柱串联定位；

阀，所述阀与所述至少两个色谱柱流体连通；和

检测池，所述检测池定位在所述至少两个色谱柱之间；

使所述组合流动流流过所述至少两个色谱柱；以及

由所述检测池监视所述样品的色谱峰，所述检测池被配置为测量所述色谱峰的分辨率和宽度，并且当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将所述阀从第一位置切换到第二位置。

2.根据权利要求1所述的循环色谱方法，其中所述检测池被配置为计算切换时间并且在所述计算的切换时间自动地将所述阀从所述第一位置切换到所述第二位置。

3.根据权利要求1所述的循环色谱方法，其中所述检测池继续监视所述样品的所述色谱峰，并且将所述阀从所述第一位置切换到所述第二位置或从所述第二位置切换到所述第一位置，直到

a)所测量的分辨率大于所述期望的分辨率；

b)所测量的组合峰宽大于或等于所述最大组合峰宽；或

c)所述切换计数大于或等于所述预定的最大切换数。

4.根据权利要求3所述的循环色谱方法，还包括检测所述组合流动流。

5.根据权利要求3所述的循环色谱方法，还包括计算每个峰的洗脱时间。

6.根据权利要求1所述的循环色谱方法，其中所述检测池为低分散性检测池。

7.根据权利要求1所述的循环色谱方法，其中所述至少两个色谱柱是相同的。

8.根据权利要求1所述的循环色谱方法，其中所述阀为六通阀或八通阀。

9.一种色谱系统，所述色谱系统包括：

注射器，所述注射器用于将样品注入移动相流动流中，从而产生组合流动流；

至少两个色谱柱，所述至少两个色谱柱串联定位并且在所述注射器的下游；

阀，所述阀与所述至少两个色谱柱流体连通；

检测池，所述检测池定位在所述至少两个色谱柱之间，所述检测池被配置为：

监视所述样品的色谱峰；

测量所述色谱峰的分辨率和宽度；以及

当所测量的分辨率小于期望的分辨率、所测量的宽度小于最大组合峰宽并且切换计数小于预定的最大切换数时，自动地将所述阀从第一位置切换到第二位置；和

检测器，所述检测器在所述至少两个色谱柱的下游。

10.根据权利要求9所述的色谱系统，其中所述检测池还被配置为计算切换时间并且在所计算的切换时间自动地将所述阀从所述第一位置切换到所述第二位置。

11.根据权利要求9所述的色谱系统，其中所述检测池为低分散性检测池。

12.根据权利要求9所述的色谱系统，其中所述至少两个色谱柱是相同的。

13.根据权利要求9所述的色谱系统，其中所述阀为六通阀或八通阀。

14.根据权利要求9所述的色谱系统，其中所述至少两个色谱柱为液相色谱柱。