CN111902157B

CN111902157B - 促进局部肌肉增长、减缓或防止局部肌肉萎缩的组合物及其用途

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Publication number: CN111902157B
Application number: CN201880090991.3A
Authority: CN
Inventors: 詹勋锦
Original assignee: Songyang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Songyang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: JP7183291B2; WO2019178759A1; EP3769779C0; JP2021516252A; EP3769779A4; CN111902157A; EP3769779A1; US11672845B2; EP3769779B1; US20210008165A1

Abstract

一种促进局部肌肉增长或减缓或防止局部肌肉萎缩的组合物，其包含金黄色葡萄球菌肠毒素C2区域的多肽，以及肌生成抑制素多肽。通过所述的组合物，克服现有技术仅能全身性肌肉增长的缺陷，以达成促进局部肌肉增长、减缓或防止局部肌肉萎缩的效果。

Description

促进局部肌肉增长、减缓或防止局部肌肉萎缩的组合物及其用途

技术领域

本发明是关于一种组合物，特别是指一种促进局部肌肉增长的组合物；本发明另提供一种组合物的用途，特别是指一种用于制造促进局部肌肉增长的药物的用途。本发明另关于一种组合物，特别是指一种减缓或防止局部肌肉萎缩的组合物；本发明另提供一种组合物的用途，特别是指一种用于制造减缓或防止局部肌肉萎缩的药物的用途。

背景技术

肌生成抑制素(myostatin)就其序列而言，与转化生长因子(transforminggrowth factorβ，TGF-β)家族其他成员高度相似。肌生成抑制素的基因结构包括有三部分：(1)作为蛋白质分泌释放信号的N端疏水结构域；(2)高度保守的蛋白质切割位置RXRR；以及(3)富含半胱氨酸(cysteine)的C端活性结构域。许多研究报告指出，脊椎动物中肌生成抑制素的氨基酸序列在C端活性结构域具有高度的保守性。现有研究提出对肌生成抑制素具有高特异性的单株抗体JA16(Whittemore et al.,2003,Biochemical and BiophysicalResearch Communications300:965-971)，通过分析肌生成抑制素的结合位置，发现结合位置位在小鼠肌生成抑制素C端15个氨基酸DFGLDCDEHSTESRC，从而可知C端结构域为抗原片段(antigenic fragment)。

然而，目前施予肌生成抑制素的抗体皆会产生全身性的反应，如Camporez等人于2016年的文献指出，局部注射抗肌生成抑制素抗体后，使年老的小鼠全身性的肌肉增长，进而使全身重量增加。此外，针对肌生成抑制剂ACE-031(myostatin inhibitor)于2010年的临床试验结果显示虽可用于增加全身肌肉及加强肌肉力量，但受试者分别出现自发性出血(spontaneous bleeding)、流鼻血(nosebleeds)、皮肤微血管扩张(small expansion ofblood vesselsin skins)或头痛(headaches)等副作用，因此该临床试验不得不因负面现象(negative phenomena)而于2011年中止试验；尤其抗体会引起受体免疫系统的全身性作用，诸如过敏反应、寒颤、腹泻、恶心呕吐、皮肤瘙痒等症状。此外，如H.N.Peiris于2012年的文献[Placenta 33(2012 902-907)]指出，在“双重肌肉”基因型(double-muscling)的牛种中，产犊(calving)和生育(fertility)都存在困难；然而在myostatin基因缺乏的小鼠(Mstn^-/-)却是可生育的(fertile)；由此推测，肌肉生长抑制素可能与妊娠期促成胎盘及其功能有关。

中国台湾发明专利I540968揭露含有肌肉倍增片段(myostatin)与绿脓杆菌外毒素区域Ia片段融合形成多肽片段或抗体，其中绿脓杆菌外毒素片段的目的在于有效增强诱导免疫反应；然而，就所属领域技术人员所知，绿脓杆菌在细菌生产过程中可能会产生内涵体(inclusion body)，因此萃取片段或抗体时需要额外添加尿素(urea)去破坏细胞而导致尿素残留，以及重新折叠(refolding)片段而可能影响蛋白质功能；更重要的是，该篇专利所揭露的效果仍是全身性的反应，因此，现有技术的肌生成抑制素抗体仍有改善的空间。

另外，目前研究显示，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的肠外蛋白(enterotoxin)可被分为A、B、C1、C2、D、E和F等几种类型，其中金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin)SEA、SEB、SEC1及SEC2)的肠毒素蛋白分子量都相近似且在结构上有较高的类似性，故皆会引起全身性的免疫反应并具有相同的临床症状，如发烧、血压升高等较大的副作用。

有鉴于此，如何发展出只影响局部肌肉而不引起全身性反应的药剂，实为各相关业者积极研究开发的目标。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种组合物，以达成局部肌肉增长的效果。

在一个态样中，本发明是关于一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的组合物，其包含：第一多肽，其是如SEQ ID NO：8所示具有相似度至少90％以上的序列；以及第二多肽，其包含如SEQ ID NO：14所示序列1至10个重复单元(repeatunits)。

较佳的，所述的第二多肽为纵列重复单元(tandem repeated units)的线性排列重复抗原(linear array epitope，LAE)，其中所述第二多肽为如SEQ ID NO：14所示序列1至10个重复单元。

更佳的，所述的第二多肽为纵列重复单元的线性排列重复抗原，其中所述第二多肽包含如SEQ ID NO：14所示序列6个重复单元。

较佳的，所述的第一多肽在SEQ ID NO：8对应于位点7具有T或L、位点9具有G或E、位点13具有Y或V及位点105具有H或Y。

较佳的，所述的第一多肽选自由如SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11及12所组成的群组。

较佳的，所述的组合物，其还包含：连接子，其是介于所述第一多肽以及第二多肽之间；其中所述组合物的序列如SEQ ID NO：17所示。

在一个较佳的制备例中，所述第一多肽与第二多肽可选自以下例示：

在另一个态样中，本发明是关于一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的组合物，其包含：金黄色葡萄球菌肠毒素的多肽；以及肌生成抑制素多肽。

较佳的，所述的金黄色葡萄球菌肠毒素的多肽选自于由金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1、C2、D、E、F、G及H所组成的群组。

SEC2具有27kDa的分子量，含有239个氨基酸。甫经转录的SEC2为266个氨基酸的蛋白质，分子量计为30kDa；于丙氨酸27处切断SEC2多肽可产生成熟毒素，其含有239个氨基酸，分子量计为27kDa。通过N端多肽定序可确定SEC2中的信息多肽切割位置并确认成熟毒素的N端，由此可证明SEC2能够有效地增强所引发的免疫反应。更佳的，所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2序列的多肽序列与SEQ ID NO：8中所示序列具有至少90％以上的序列一致性，举例而言，对应于SEQ ID NO：8所示序列中选自由位点7具有T或L、位点9具有G或E、位点13具有Y或V及位点105具有H或Y所组成的群组。

较佳的，所述的肌生成抑制素多肽包含、但不限于生长分化因子8(growthdifferentiation factor 8，GDF8)、滤泡抑素(follistatin)或第二型活化素受体(activin receptor type-2B，ACTR-IIB)。

更佳的，所述的肌生成抑制素多肽选自由生长分化因子8如SEQ ID NO：13所示序列、滤泡抑素如SEQ ID NO：15所示序列及第二型活化素受体如SEQ ID NO：16所示序列所组成的群组。

较佳的，所述的肌生成抑制素的抗原决定位多肽为纵列重复单元(tandemrepeated units)的线性排列重复抗原(linear array epitope，LAE)。

在另一态样中，本发明是关于一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的医药组成物，其包含如前所述的组合物以及药学上可接受的载剂。

在本文中，所述的“药学上可接受的载剂”包含，但不限于水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellow wax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收增强剂(absorption enhancers)、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizingagents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)、推进剂(propellants)表面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)，及其他类似或适用本发明的载剂。

在本文中，所述的“佐剂”包括，但不限于，明矾沉淀、弗朗氏完全佐剂(Freund’scomplete adjuvant)、弗朗式不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)、及单磷氧基-脂质A/海藻糖dicorynomycolate佐剂。

本发明所述的医药组成物可以多种形式存在。这些形式包括，但不限于液体、半固体及固体药剂形式，其中液体包括，但不限于分散液或悬浮液；半固体及固体包括，但不限于锭剂、丸剂、粉剂、脂质粒及栓剂。较佳的形式取决于预期的投药模式及治疗应用。更佳的，所述的医药组合物呈可口服或可输注溶液形式。

在另一态样中，本发明是关于一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的核酸，其编码由SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列组成的组合物。

在另一态样中，本发明是关于一种如前所述的组合物的用途，其是用于制造促进局部肌肉增长的药物，其是将药物以有效剂量施予受体局部以使局部肌肉达到增长的效果。

在本发明的一个较佳实施例中，使用上述组合物以达成促进哺乳类局部肌肉增长，包括给予肌生成抑制素片段和SEC2的融合蛋白，从而获得抗肌生成抑制素的特异性免疫细胞。本发明的免疫细胞可以由肌生成抑制素片段的抗原决定位引入其他动物中，并经过纯化或通过将免疫细胞或其抗原决定位引入哺乳动物体内，以使哺乳动物身体本身能够增加肌肉生长。本发明的免疫细胞可为多株B淋巴球或T细胞殖株；较佳的是，上述免疫细胞是调节型T细胞。

在另一态样中，本发明是关于一种如前所述的组合物的用途，其是用于制造防止局部肌肉萎缩的药物，其是将药物以有效剂量施予受体局部以减缓或防止使局部肌肉萎缩的效果。在一实施例中，是使一侧腿神经受损后，施予上述组合物于被受损神经一侧的腿部肌肉，以使该侧腿部肌肉可维持肌肉大小避免因神经受损而造成肌肉萎缩的现象。在一实施例中，是使一侧腿神经阻断后，施予上述组合物于被阻断神经一侧的腿部肌肉，以使该侧腿部肌肉可维持肌肉大小避免因神经阻断而造成肌肉萎缩的现象。

上述组合物及用途适用于动物。较佳的是，适用于脊椎动物；更佳的是，人、猪、牛、羊、犬和家禽、水禽等动物的肌生成抑制素已获选殖，且其氨基酸序列具有高度的保守性，因此可假定上述动物的肌生成抑制素具有相同的功能；更佳的是，上述哺乳动物属于人、猪、牛、羊或犬。

本发明所述的组合物适用于各种肌肉萎缩症状，肌肉萎缩可由药物引起，其包括，但不限于由使用糖皮质激素(诸如皮质醇(cortisol)、地塞米松(dexamethasone)、倍皮质醇(betamethasone)、普赖松(prednisone)、甲基培尼皮质醇(methylprednisolone)或去氢皮质醇(prednisolone)治疗引起。肌肉萎缩也可由神经创伤造成去神经化或由退化性、由神经坏死所引起、代谢性或发炎性神经病变，例如格巴二氏症候群(Guillian-Barresyndrome)、周边神经病变，或暴露于环境毒素引起。

此外，肌肉萎缩另可由肌肉疾病所引起，包括，但不限于肌肉强直症(myotonicdystrophy)、先天性肌病(congenital myopathies)、家族周期性麻痹(familial periodicparalysis，FPP)、代谢性肌肉病(metabolic myopathies；诸如由肝糖或脂质储存疾病所致)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、包涵体肌炎(inclusionbody myositis，IBM)、骨化性肌炎(myositis ossificans)或横纹肌溶解症(rhabdomyolysis)所致。

肌肉萎缩也可由以下疾病引起，包括，但不限于成人运动神经元疾病(motorneuron diseases，MND)、脊髓性肌肉萎缩症(spinal muscular atophy，SMA)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、少年型脊髓性肌萎缩症(juvenile spinal muscular atrophy；又称SMA-Ⅲ)、肌无力症(myasthenia Gravis，MG)、因中风或脊髓损伤的瘫痪、因创伤的骨骼固定化、长期卧床、自主不活动、非自主不活动、代谢压力或营养不足、癌症、爱滋病(AIDS)、禁食、甲状腺病症、糖尿病、肌中央轴空病(central core disease，CCD)、烧烫伤、慢性阻塞性肺病、肝病(诸如纤维化、硬化)、败血症、肾衰竭、充血性心脏衰竭、衰老、太空航行或在零重力环境中度过一段时间所引起的肌肉萎缩。

另一方面，在本文中，用语“抗原决定位(epitope)”是指能够引发免疫反应以产生蛋白质抗原中的抗原的片段，其可以通过结构预测或通过选择蛋白片段来观察免疫动物的免疫反应。

另一方面，在本文中，用语“有效剂量”是指在剂量上及对于所需要的时间而言对达成所要促进局部肌肉增长或减缓或防止局部肌肉萎缩有效的量；其如本发明所例示的，有效促进局部肌肉增长的剂量可通过促进局部肌肉增长试验(实施例1)而得知；有效减缓或防止局部肌肉萎缩的剂量可通过减缓或防止局部肌肉萎缩试验(实施例2、3)而得知。

由于所述抗原决定位是小型多肽片段，如果以该小型多肽片段在动物中直接进行免疫，则免疫反应可能未尽理想。较佳的是，建构含有纵列重复单元的线性排列重复抗原(linear array epitope，LAE)，以改善免疫反应。此外，可以使用细菌毒素来帮助抗原的传递，通过使用消除毒素活性的毒素作为运输系统，从而以毒素的性质来加强整体免疫效果。在一态样中，本发明的肌生成抑制素C端的抗原决定位的线性排列重复抗原与金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)融合。

一种宿主细胞包含上述核酸是可被生产的。实施例包括大肠杆菌、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌细胞及哺乳动物细胞。该核酸分子可以用于表达本说明书所述的多肽或融合蛋白，操作上可将该核酸分子连接至合适的载体的多克隆位点(multiple cloning site，MCS)以产生所述的多肽或融合蛋白。

载体实施例包含质粒。该载体较佳的是包括启动子、增强子、多克隆位点等，核酸分子连接至合适的载体的多克隆位点后，该表达载体可以被导入宿主细胞以产生本说明书所述的多肽或融合蛋白。所述宿主细胞包括，但不限于大肠杆菌、百日咳杆菌、芽孢杆菌、非洲绿猴肾脏细胞、嗜血杆菌、真菌或酵母。

本发明的优点在于通过包含金黄色葡萄球菌肠毒素C2序列的多肽以及肌生成抑制素C端的抗原决定位多肽的组合物，以达成促进局部肌肉增长的效果，是突破现有技术的困难且未有前例的。此外，所述的组合物施予上述组合物于神经损伤或神经阻断一侧的腿部肌肉，意外地发现该侧腿部肌肉可维持肌肉大小，将有助于临床上遇到神经损伤或神经阻断时可有效地避免病人局部肌肉萎缩的现象。

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：

图1是本发明低剂量实验组与低剂量对照组对比的肌肉截面积比率折线图。其中，低剂量实验组以标示●的折线表示、低剂量对照组以标示■的折线表示。

图2是本发明中剂量实验组与中剂量对照组对比的肌肉截面积比率折线图。其中，中剂量实验组以标示●的折线表示、中剂量对照组以标示■的折线表示。

图3是本发明高剂量实验组与高剂量对照组对比的肌肉截面积比率折线图。其中，高剂量实验组以标示●的折线表示、高剂量对照组以标示■的折线表示。

图4是本发明小鼠后腿电脑断层纵截面扫描图及横截面扫描图，各横截面扫描图是相应纵截面扫描图的剖面线标示处的横截面；图4中(A)是低剂量对照组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(B)是中剂量对照组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(C)是高剂量对照组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(D)是低剂量对照组的横截面扫描图；图4中(E)是中剂量对照组的横截面扫描图；图4中(F)是高剂量对照组的横截面扫描图；图4中(G)是低剂量实验组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(H)是中剂量实验组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(I)是高剂量实验组的纵截面扫描图，上下虚线之间为肌肉体积计算的区域；图4中(J)是低剂量实验组的横截面扫描图；图4中(K)是中剂量实验组的横截面扫描图；图4中(L)是高剂量实验组的横截面扫描图。

图5是本发明低剂量对照组及低剂量实验组的小鼠后腿体积比率的柱状图；A.U.表示Arbitrary Unit(任意单位)。

图6是本发明中剂量对照组及中剂量实验组的小鼠后腿体积比率的柱状图；A.U.表示Arbitrary Unit(任意单位)。

图7是本发明高剂量对照组及高剂量实验组的小鼠后腿体积比率的柱状图；A.U.表示Arbitrary Unit(任意单位)。

图8是本发明高剂量对照组小鼠后小腿肌丝纤维苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin，H-E)组织组织染色图。

图9是本发明高剂量实验组小鼠后小腿肌丝纤维H-E组织染色图。

图10是本发明小鼠后腿肌丝纤维针对肌生成抑制素的免疫组织染色图；其中图10中(A)至(C)为对照组；图10(D)至(F)分别为50纳克(ng)(低剂量)、500ng(中剂量)与5000ng(高剂量)实验组。

图11是本发明低、中、高剂量实验组小鼠在施予组合物后的体重变化折线图。其中，低剂量实验组以标示●的折线表示、中剂量实验组以标示■的折线表示、高剂量实验组以标示▲的折线表示。

图12是控制组与实验组小鼠局部肌肉历经坐骨神经破坏手术后，实验组施予本发明组合物1000ng后观察肌肉体积比率的柱状图；其中左腿历经坐骨神经破坏手术，右腿没有历经坐骨神经破坏手术。

图13是图12的控制组与实验组各别以左腿肌肉体积比除以右腿肌肉体积比获得的肌肉比率的柱状图。

图14是控制组、实验组A与实验组B小鼠局部肌肉历经坐骨神经截断手术后，实验组A、B分别施予本发明组合物1000ng、5000ng观察肌肉体积比率的柱状图；其中左腿历经坐骨神经破坏手术，右腿没有历经坐骨神经破坏手术。

图15是图14的控制组、实验组A、与实验组B各别以左腿肌肉体积比除以右腿肌肉体积比获得的肌肉比率的柱状图。

具体实施方式

以下配合附图及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。

制备例1、制备含SEC2片段与肌生成抑制素片段的组合物

本实施例所采用的融合蛋白是采用大肠杆菌(E.coli)的pET表达系统表达的载体；较佳的，是选用pET-28a。其中第一多肽“SEC2m”所示是金黄色葡萄球菌肠毒素C2具有点突变(point mutation)，核酸序列如SEQ ID NO：1所示、蛋白质序列如SEQ ID NO：8(突变点于位点7具有L、位点9具有E、位点13具有V及位点105具有Y)；第二多肽“Myo epitope”所示则为肌生成抑制素的抗原决定位，其是肌生成抑制素C端15个氨基酸(如序列SEQ ID NO：14所示；该序列具有高度的保守性，因此多个物种皆具有此序列)具有6个重复片段，其单一片段的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。位于pET载体多克隆位点(multiple cloning site，MCS)内的基因序列从N端依序为“SEC2m”、连接子(linker)与“Myo epitope”，如核酸序列SEQ ID NO：3所示。

建立35L发酵培养程序以在50L发酵罐中培养含有SEQ ID NO：3pET载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。4管5mL菌株在37℃下用LB/氨芐青霉素(Ampicillin)培养基培养过夜，各菌株分别接种到0.2升的LB/氨芐青霉素培养基中，共1升，于37℃持续摇动培养至OD 600为0.3。其后加入至35μL培养基中进行培养，并以每两小时取样测定OD 600为以监测生长曲线的变化，并根据生长曲线进一步选择合适的时间点，加入最终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导大肠杆菌以高度表达融合蛋白，于37℃持续摇动培养3小时，离心回收菌株。通过SDS-PAGE电泳和西方墨点法测定融合蛋白的表达，以确定最佳35L发酵条件。大致上，是将大肠杆菌BL21(DE3)表达的融合多肽在细胞裂解后，进行该融合多肽的萃取与分离，最终获得一组合物(如SEQ ID NO：17所示)；由于所述表达蛋白的萃取与分离属于习知技术，在此不再赘述。

实施例1、促进局部肌肉增长试验

本实施例的动物实验所采用的小鼠为“C57BL/6”品系8周龄(12个月龄)的母鼠，对照组和实验组共9只小鼠，实验时间为6个月。自小鼠成长至12个月龄时，开始采用高脂质饲料，并使用含高果糖浆的饮水饲育。饲料及饮水，每两天更换一次，以避免变质。饲料保存于-20℃，高果糖浆则保存于4℃；每两周量测一次体重。实验动物经6个月的喂食后，开始每周以肌肉内注射该组合物一次。取自制备例1的组合物(以生理食盐水将组合物稀释成不同浓度)分别注射于小鼠左后小腿的肌肉成为不同剂量的实验组，右后小腿则为注射生理食盐水(saline)；其实验分组如下表1所示。

表1、动物实验分组与组合物的施予方式

实验数据的收集，是每周以游标量尺测量一次、量测肌肉的长径(a)及短径(b)和体重，量测位置为注射药物的位置。将所得数值以椭圆面积计算公式︰「a×b×3.14」，算得肌肉概约截面积，计算范围如图4(A)、4(B)、4(C)、4(G)、4(H)、4(I)上下虚线之间为肌肉体积计算的区域，以进行各实验组间的比较。

(1)比较实验组(左后小腿)及对照组(右后小腿)注射组合物后的肌肉截面积

请参阅图1至图3所示，于第19周时将各实验组与其对照组相比，其中注射高剂量组合物的小腿横截面积相较于高剂量对照组增加了8.19％，接受中剂量组合物的小腿横截面积相较于中剂量对照组增加5.5％，而接受低剂量组合物的横截面积相较于低剂量对照组也增加5.67％。

(2)比较实验组(左后小腿)及对照组(右后小腿)注射组合物后的肌肉体积

请参阅图4，小鼠后腿电脑断层纵截面扫描图及横截面扫描图，各横截面扫描图是相应纵截面扫描图的剖面线标示处的横截面。其中图4中(A)、图4中(B)、图4中(C)、图4中(G)、图4中(H)、图4中(I)虚线之间为计算肌肉体积的范围，将各截面积以积分获得肌肉体积。投药至19周，结束实验，将小鼠牺牲并取其两只小腿，以10％福马林固定，进行电脑断层扫描。

请参阅图5至图7所示，肌肉体积中，低剂量实验组相较于低剂量对照组增加4.6％，中剂量实验组相较于中剂量对照组增加8.5％，高剂量实验组相较于高剂量对照组增加19.2％。由于本试验是以同一小鼠的左后小腿的肌肉为实验组，右后小腿则为对照组，因此结果显示，将本发明的组合物注射于左侧小腿只会造成该侧小腿肌肉增长，另一侧(右侧)小腿的肌肉并无增长，故本发明所述的组合物经由局部施予后仅于该局部产生肌肉增长的效果，并无产生全身肌肉变大的反应。

(3)测量实验组(左后小腿)及对照组(右后小腿)的注射组合物后肌丝纤维粗细情形

于第19周牺牲后并经电脑断层扫描后，将实验小鼠的小腿骨取出，肌肉部分则进行石蜡包埋及切片，并以H-E组织染色比较肌丝纤维粗细。请参阅图8及图9所示，图8为高剂量对照组小鼠后小腿肌丝纤维、图9为高剂量实验组小鼠后小腿肌丝纤维，可知高剂量实验组小鼠肌丝纤维较对照组显著增大。

(4)测量实验组(左后小腿)及对照组(右后小腿)的注射组合物后肌生成抑制素含量分布

于第19周牺牲后并经电脑断层扫描后，将实验小鼠的小腿骨取出，肌肉部分则进行石蜡包埋及切片，并以肌生成抑制素抗体进行免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)观察肌生成抑制素含量分布。请参阅图10所示，图10中(A)、图10中(B)、图10中(C)不同剂量的对照组(左后小腿)肌生成抑制素可明显被染色；反观图10中(D)、图10中(E)、图10中(F)，无论是低剂量、中剂量、或高剂量实验组(右后小腿)肌生成抑制素的表达明显被抑制。也就是说，无论低剂量、中剂量或是高剂量，同一只老鼠的右小腿(即对照组)的肌生成抑制素浓度高，右小腿肌肉并无明显变大；但同一只小鼠的左小腿(即实验组)的肌生成抑制素被本发明的组合物所抑制，故肌生成抑制素浓度低，左小腿肌肉变大，即本发明所述的组合物具有能够使局部肌肉变大的效果(不受全身血液循环影响)。

(5)比较注射低剂量、中剂量、或高剂量的组合物后体重变化

于第19周时量测体重，请参阅图11所示，无论是低剂量、中剂量、或高剂量实验组在施予组合物之后，各组间体重并没影显著差异。因此，本试验通过局部施予组合物只会在施予部位的局部增大肌肉，并不会造成全身性肌肉增大。

实施例2、减缓或防止局部肌肉因神经损伤导致萎缩的试验

准备10只ICR小鼠(八周龄，购自于乐斯科生技股份有限公司)以正常饲料喂食1周至2周后，分成2组(每组各5只)，于实验第1天进行坐骨神经破坏手术使各组小鼠的左腿坐骨神经造成神经损伤(各组小鼠的右腿皆不进行坐骨神经破坏手术)，并于第28天牺牲，其中各组分别为：控制组(左腿进行坐骨神经破坏手术，但不给药)，实验组(左腿进行坐骨神经破坏手术，且每只小鼠于第1、3、7、14天以肌肉内注射施予本发明制备例1所述的组合物1000ng，最后观察小鼠肌肉萎缩程度来评估本发明的组合物对于减缓或防止肌肉萎缩的效果。

坐骨神经破坏手术是对小鼠施予麻醉剂(腹腔麻醉)后，剔除小鼠手术侧膝盖至臀部的体毛，固定小鼠腿部并以酒精棉消毒手术部位，找到大腿股骨位置，于靠近臀部处开一道平行股骨的切口，剥离肌肉层后可看见平行于股骨的坐骨神经，将坐骨神经挑起，以特殊工具损伤小鼠的坐骨神经后，将其坐骨神经放回原本位置，缝合皮肤后每日观察小鼠的伤口愈合情况、步态变化及整体状态，其目的为模拟神经损伤的状态。

结果显示，于第28天测量其中一只控制组小鼠的左大腿肌肉体积约为1373立方毫米(mm³)、右大腿肌肉体积约为1595mm³，由于右腿未进行坐骨神经破坏手术，故将右大腿肌肉体积做为基准比率1、左大腿肌肉体积比率则为左大腿肌肉体积除以右大腿肌肉体积(如图12控制组所示)，显示控制组小鼠左腿肌肉相较于右腿肌肉呈现萎缩现象；另测量其中一只实验组小鼠左大腿肌肉体积约为1888mm³、右大腿肌肉体积约为1705mm³，将右大腿肌肉体积做为基准比率1、左大腿肌肉体积比率则为左大腿肌肉体积除以右大腿肌肉体积(如图12实验组所示)，尽管小鼠左腿进行坐骨神经破坏手术但因施予本发明所述的组合物，故显示左腿肌肉并无萎缩现象。

如图13所示，控制组的左大腿/右大腿肌肉体积比率约为0.86(小于1即表示呈现萎缩状态)；实验组的左大腿/右大腿肌肉体积比率约为1.11，故实验组相较于控制组因施予本发明所述的组合物而呈现维持肌肉量体积的现象。由此可见，于神经损伤的情况下，经由施予本发明所述的组合物可减少或舒缓局部肌肉萎缩、甚至维持原本肌肉体积的现象。

实施例3、减缓或防止局部肌肉因神经截断导致萎缩的试验

准备10只ICR小鼠(八周龄，购自于乐斯科生技股份有限公司)以正常饲料喂食1周至2周后，分成2组(每组各5只)，于实验第1天进行坐骨神经截断手术，并于第28天牺牲，其中各组分别为：控制组(左腿进行坐骨神经截断手术，但不给药)，实验组A(左腿进行坐骨神经截断手术，且每只小鼠于第1、3、7、14天以肌肉内注射施予本发明制备例1所述的组合物1000ng，实验组B(左腿进行坐骨神经截断手术，且每只小鼠于第1、3、7、14天以肌肉内注射施予本发明制备例1所述的组合物5000ng，最后观察小鼠肌肉萎缩程度来评估本发明的组合物对于抗肌肉萎缩的效果(以上各组小鼠的右腿皆不进行坐骨神经截断手术)。坐骨神经截断手术方式大略同实施例2，差异在于将坐骨神经挑起后直接截断。

结果显示，于第28天测量控制组小鼠左大腿肌肉体积约为1375mm³、右大腿肌肉体积约为1560mm³，由于右腿未进行坐骨神经破坏手术，故将右大腿肌肉体积做为基准比率1、左大腿肌肉体积比率则为左大腿肌肉体积除以右大腿肌肉体积(如图14控制组所示)，显示控制组小鼠左腿肌肉相较于右腿肌肉呈现萎缩，右腿肌肉也无萎缩现象；实验组A小鼠左大腿肌肉体积约为1289mm³、右大腿肌肉体积约为1394mm³，由于右腿未进行坐骨神经破坏手术，故将右大腿肌肉体积做为基准比率1、左大腿肌肉体积比率则为左大腿肌肉体积除以右大腿肌肉体积(如图14实验组A所示)，在坐骨神经截断手术后，左腿肌肉萎缩现象显著减缓；实验组B小鼠左大腿肌肉体积约为1958mm³、右大腿肌肉体积约为1869mm³，由于右腿未进行坐骨神经破坏手术，故将右大腿肌肉体积做为基准比率1、左大腿肌肉体积比率则为左大腿肌肉体积除以右大腿肌肉体积(如图14实验组B所示)，尽管小鼠左腿历经坐骨神经破坏手术，但因左腿肌肉施予本发明所述的组合物5000ng，并无产生萎缩现象。

如图15所示，控制组的左大腿/右大腿肌肉体积比率约为0.87呈现萎缩状态(小于1即表示呈现萎缩状态)；实验组A的左大腿/右大腿肌肉体积比率约为0.92实验组A相较于控制组呈现减缓肌肉萎缩；实验组B的左大腿/右大腿肌肉体积比率约为1.04，实验组B相较于控制组甚至可以维持肌肉体积。由此可见，于坐骨神经截断的情况下，经由施予本发明所述的组合物，除了如实施例2可减少或舒缓局部肌肉萎缩、本实施例3甚至可维持原本肌肉体积的现象。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 傅惠芳

<120> 促进局部肌肉增长、减缓或防止局部肌肉萎缩的组合物及其用途

<130> cfp0692

<150> PCT/CN2018/079716

<151> 2018-03-21

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 1

tcaagtgagt ttactggtct gatggagaat atgaaagttt tatatgatga tcattatgta 60

tcagcaacta aagttatgtc tgtagataaa tttttggcac atgatttaat ttataacatt 120

agtgataaaa aactaaaaaa ttatgacaaa gtgaaaacag agttattaaa tgaagattta 180

gcaaagaagt acaaagatga agtagttgat gtgtatggat caaattacta tgtaaactgc 240

tatttttcat ccaaagataa tgtaggtaaa gttacaggtg gtaaaacttg tatgtatgga 300

ggaataacaa aatatgaagg aaaccacttt gataatggga acttacaaaa tgtacttata 360

agagtttatg aaaataaaag aaacacaatt tcttttgaag tgcaaactga taagaaaagt 420

gtaacagctc aagaactaga cataaaagct aggaattttt taattaataa aaaaaatttg 480

tatgagttta acagttcacc atatgaaaca ggatatataa aatttattga aaataacggc 540

aatacttttt ggtatgatat gatgcctgca ccaggcgata agtttgacca atctaaatat 600

ttaatgatgt acaacgacaa taaaacggtt gattctaaaa gtgtgaagat agaagtccac 660

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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agtgataaaa aactaaaaaa ttatgacaaa gtgaaaacag agttattaaa tgaagattta 180

gcaaagaagt acaaagatga agtagttgat gtgtatggat caaattacta tgtaaactgc 240

tatttttcat ccaaagataa tgtaggtaaa gttacaggtg gtaaaacttg tatgtatgga 300

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agagtttatg aaaataaaag aaacacaatt tcttttgaag tgcaaactga taagaaaagt 420

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tatgagttta acagttcacc atatgaaaca ggatatataa aatttattga aaataacggc 540

aatacttttt ggtatgatat gatgcctgca ccaggcgata agtttgacca atctaaatat 600

ttaatgatgt acaacgacaa taaaacggtt gattctaaaa gtgtgaagat agaagtccac 660

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Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr

225 230 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys

245 250 255

Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys

260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val

275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr

290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys

305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala

325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr

340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val

355 360 365

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

370 375

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 344

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr

35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile

65 70 75 80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys

115 120 125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135 140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr

145 150 155 160

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185 190

Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly

195 200 205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215 220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225 230 235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295 300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe

325 330 335

Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp

340

<210> 16

<211> 288

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys

35 40 45

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50 55 60

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Lys Cys Ile Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly

210 215 220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280 285

<210> 17

<211> 318

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Ser Ser Glu Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp

1 5 10 15

Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu

20 25 30

Ala His Asp Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Cys Met Tyr Gly Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Gly Asn His Phe Asp Asn

100 105 110

Gly Asn Leu Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile

165 170 175

Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Asn Gly Leu Glu Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu

225 230 235 240

Ser Arg Cys Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser

245 250 255

Arg Cys Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg

260 265 270

Cys Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys

275 280 285

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Asp

290 295 300

Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys

305 310 315

Claims

1.一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的组合物，其包含：

第一多肽；

第二多肽；以及

连接子，其是介于所述第一多肽以及所述第二多肽之间；其中所述组合物包含的多肽序列如SEQ ID NO：17所示。

2. 一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的核酸，其编码由SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。

3.一种促进局部肌肉增长、延缓局部肌肉萎缩或防止局部肌肉萎缩的医药组成物，其包含如权利要求1所述的组合物以及药学上可接受的载剂。

4.一种如权利要求1所述的组合物用于制造促进局部肌肉增长的药物的用途。

5.一种如权利要求1所述的组合物用于制造减缓或防止局部肌肉萎缩的药物的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述组合物是用于制造适用于药物引起的肌肉萎缩、神经创伤引起的肌肉萎缩、神经坏死所引起的肌肉萎缩、自体免疫反应引起的肌肉萎缩、环境毒素引起的肌肉萎缩或外力引起的肌肉萎缩。