[go: up one dir, main page]

CN111909271B - 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111909271B
CN111909271B CN202010806805.0A CN202010806805A CN111909271B CN 111909271 B CN111909271 B CN 111909271B CN 202010806805 A CN202010806805 A CN 202010806805A CN 111909271 B CN111909271 B CN 111909271B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
bcma
antigen receptor
chimeric antigen
single domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010806805.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111909271A (zh
Inventor
姜舒
王冰
彭方理
张芸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Wingor Bio Technology Co ltd
Priority to CN202010806805.0A priority Critical patent/CN111909271B/zh
Publication of CN111909271A publication Critical patent/CN111909271A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111909271B publication Critical patent/CN111909271B/zh
Priority to PCT/CN2021/086417 priority patent/WO2022033057A1/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体，所述的BCMA嵌合抗原受体的BCMA抗原结合结构域包含抗BCMA单域抗体，所述的抗BCMA单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3。其中，CDR1为SEQ ID NO：15‑17中的一种或与SEQ ID NO：15‑17有80％同一性的序列，CDR2为SEQ ID NO：18‑20中的一种或与SEQ ID NO：18‑20有80％同一性的序列，CDR3为SEQ ID NO：21‑23中的一种或与SEQ ID NO：21‑23有80％同一性的序列。本发明较传统抗体来源的BCMA CAR与靶细胞结合力更强、杀伤效果更好、体内持续时间更久。

Description

一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是浆细胞恶性增殖性疾病，骨髓中克隆性浆细胞异常增生，并分泌单克隆免疫球蛋白或其片段(M蛋白)，并导致相关器官或组织损伤(ROTI)。常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染等。统计显示，每年将有近86000名患者被诊断为骨髓瘤，而每年有约63000名患者死于疾病相关的并发症。近年新药蛋白酶体抑制剂硼替佐米、免疫调节药沙利度胺和来那度胺等的应用尽管改善了MM患者的缓解率和无病生存时间，但总生存时间与传统治疗无明显差异。并且MM应用化疗取得缓解后，大多数病人终将复发，且对原来敏感的药物产生耐药，加大剂量并不能使患者再次获得缓解，反而容易产生骨髓抑制、继发感染、肝功能损害等副作用。解决复发/耐药性多发性骨髓瘤患者目前临床上无有效治疗手段。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor modified T cells，CAR-T)是通过基因修饰的手段，将一个人工合成的CAR分子(Chimeric Antigen Receptor)表达在T细胞膜上，使T细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。CAR分子包括胞外结合区域、铰链区、跨膜区和胞内的信号段，其中胞外结合区域为能特异性识别靶抗原的单克隆抗体来源的单链抗体(scFv)。这一技术有几个优势，例如，CAR分子对肿瘤表面的TAA(肿瘤相关抗原，tumor associated antigen)的识别是以一种MHC(major histocompatibilitycomplex)-非依赖性的方式进行的，因而CAR-T细胞可以克服肿瘤细胞通过下调MHC分子逃脱免疫攻击，并且CAR识别肿瘤抗原没有MHC限制性，同一种CAR可以应用于不同的患者。另外，CAR分子可以识别细胞表面的任何类型的抗原，包括蛋白、糖类、糖脂，这样，相对于TCR(T cell receptor)只能识别MHC-肽段，CAR使T细胞能识别的肿瘤表面标志物的范围大大增加。与抗原-抗体反应一样，CAR-T的scFv段与抗原结合也受结合域的亲和力、抗原表位的结构、肿瘤细胞表面抗原的数量、pH值、温度、离子强度等因素的影响。
中国专利201580050638.9公开了一种嵌合抗原受体，其包含：胞外结构域；跨膜结构域；一个或多个胞内共刺激信号转导结构域；以及初级信号转导结构域，所述胞外结构域包含能结合人BCMA(B细胞成熟抗原)多肽的一个或多个表位的人源化的抗BCMA抗体或其抗原结合片段。利用基因工程技术获得编码基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种嵌合抗原受体T细胞能够用于B细胞相关的恶性肿瘤的治疗。
单域抗体(sdAb)也称为纳米抗体(Nb)，由于具有单个单体抗体可变域而不同于传统的4链抗体。骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的sdAb，其被称为仅重链抗体(HcAb)。骆驼科动物仅重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域(VHH)，这种抗体只包含一个重链可变区VHH和两个常规的CH2和CH3恒定结构域区，分子量只有传统抗体的一半。VHH可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力，是最小的功能性抗原结合片段之一，分子量为大约15kD。VHH由3个抗原互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)和4个框架区域(frame region，FR)组成，一般从N-末端至C-末端排列结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。3个CDR是sdAb与抗原的结合区域，而传统抗体需要6个CDR来维持与抗原的结合。此外，sdAb的CDR1和CDR3的氨基酸序列更长，在一定程度上弥补了由于轻链缺失而导致抗原结合能力的损失。在接受抗原刺激后，sdAb的产生主要依赖于体细胞超突变，因此更长的CDR序列也可产生更多的抗体多样性。抗体晶体学研究表明，更长的CDR3区域赋予sdAb更强的抗原结合能力，从而能够结合传统抗体无法到达的抗原表位。因此，相比于单克隆抗体，Nb展示出相当甚至更强的抗原结合能力。
Nb另外一个优点是，通过序列比对发现，Nb与人源免疫球蛋白IgG的VH结构域高度同源，仅FR2和CDR3区域存在显著差异。有研究表明，Nb反复给药并不会引起体液和细胞免疫反应，但长期重复使用Nb药物是否引起其产生对机体的免疫原性仍有待研究。
中国专利201810972053.8公开了一种嵌合抗原受体，所述CAR包含：BCMA抗原结合结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、以及胞内信号传导结构域；其中所述BCMA抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。包含所述的嵌合抗原受体的免疫细胞(如CAR-T细胞)对相关肿瘤杀伤力强、特异性强。但是，根据所述嵌合抗原受体制备的BCMA CAR-T细胞中，CAR表达效率较低，有待进一步提升。
发明内容
本发明通过筛选特异性的针对BCMA抗原的单域抗体，并将其VHH通过基因重组的方法，构建一个针对BCMA抗原的嵌合抗原受体，使用慢病毒通过基因转导的方式将该重组基因插入人T淋巴细胞的基因组，使其细胞膜表面表达特异性的针对BCMA抗原的嵌合抗原受体(BCMA CAR-T)，通过体外扩增BCMA CAR-T后回输患者体内，达到特异性的针对表达BCMA抗原的肿瘤细胞(骨髓瘤细胞)的免疫细胞疗法，同时，避免来源于小鼠抗体的scFv的小鼠源性BCMA CAR-T细胞的容易产生抗小鼠抗体导致治疗失败的缺点。
术语：
BCMA(抗原)：B细胞成熟抗原；
CAR：嵌合抗原受体；
CAR-T细胞：嵌合抗原受体T淋巴细胞。
一方面，本发明提供了一种抗BCMA单域抗体。
所述的抗BCMA单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3。
所述的CDR1为SEQ ID NO：15-17中的一种或与SEQ ID NO：15-17有80％同一性的序列；所述的CDR2为SEQ ID NO：18-20中的一种或与SEQ ID NO：18-20有80％同一性的序列；所述的CDR3为SEQ ID NO：21-23中的一种或与SEQ ID NO：21-23有80％同一性的序列。
所述的抗BCMA单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体。
所述的嵌合抗原受体包含前述抗BCMA单域抗体。
所述的嵌合抗原受体还包含跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、以及胞内信号传导结构域。
所述的嵌合抗原受体的结构基因包含所述的抗BCMA单域抗体的编码基因，所述的抗BCMA单域抗体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的序列。
所述的嵌合抗原受体的结构基因包含SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
所述的嵌合抗原受体的结构基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列。
再一方面，本发明提供了一种生物材料。
所述的生物材料为重组载体、重组细胞或以治疗或预防为目的生物制品。
所述的生物材料包含前述抗BCMA单域抗体或编码所述抗BCMA单域抗体的基因。
所述的生物材料包含前述嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的基因。
进一步地，所述的生物材料为重组载体，所述的载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体和逆转录病毒载体。
优选地，所述的病毒载体为慢病毒载体。
在一些实施例中，所述的病毒载体为pCDH-EF1a-BCMA CAR病毒载体；所述的病毒载体为包括SEQ ID NO：12-14所示的任一种核苷酸序列的慢病毒载体pCDH-EF1a。
进一步地，所述的生物材料为免疫细胞，所述的免疫细胞包括但不限于：T细胞、NK细胞、外周血单核细胞(PBMC)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞，优选为人外周血T细胞。
优选地，所述的细胞中每单个细胞所携带的嵌合抗原受体分子为3-4个。
又一方面，本发明提供了一种用于治疗骨髓瘤的医用配制品。
所述的医用配制品包含前述抗BCMA单域抗体或编码所述抗BCMA单域抗体的基因。
所述的医用配制品包含前述嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的基因。
所述的医用配制品包含前述生物材料。
优选地，所述的医用配制品包括表达BCMA嵌合抗原受体的T细胞。
进一步地，所述的表达BCMA嵌合抗原受体的T细胞在医用配制品中的细胞浓度为：1×108个阳性BCMA CAR-T/100mL。
所述的医用配制品的施用量为2×106个阳性BCMA CAR-T/kg体重。
所述的医用配制品剂型包括但不限于输液剂、注射剂。
所述的医用配制品的施用方式包括但不限于：静脉注射，腹腔注射。
又一方面，本发明提供了前述抗BCMA单域抗体、嵌合抗原受体或生物材料在制备具有治疗骨髓瘤的药物中的用途。
优选地，所述的骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
本发明旨在解决复发/耐药性多发性骨髓瘤患者目前临床上无有效治疗手段，应用BCMA CART技术特异性杀死骨髓中的骨髓瘤细胞，从而达到治疗复发/耐药性多发性骨髓瘤患者的目的。
本发明采用了与现有技术不同的，由BCMA单域抗体基因和2代CAR结构基因序列串联组成。本发明使用和已知BCMA抗体不同的序列，使用的抗体为单域抗体，较传统抗体来源的CAR与靶细胞结合力更强、杀伤效果更好、体内持续时间更久。
附图说明
图1为流式细胞术检测BCMA VHH重组抗体与高表达BCMA的重组细胞株CHO-BCMA的结合能力结果图。
图2为流式细胞术检测人源化抗体与BCMA的结合力的部分检测结果。
图3为抗体亲和力检测结果。其中A代表筛选的抗BCMA单域抗体B-6-14；B、C分别代表人源化后的抗体NW2-1222-6-14-1、NW2-1222-6-14-2。
图4为CAR-T细胞膜表面标志物的流式细胞术检测结果，其中A为CD8阳性率，B为CD4阳性率，C为BCMA阴性对照，D为B-6-14BCMA CAR-T的CAR阳性率，E为NW2-1222-6-14-1BCMA CAR-T的CAR阳性率，F为NW2-1222-6-14-2BCMA CAR-T的CAR阳性率。
图5为RT-PCR的方法检测BCMA CAR-T细胞上CAR的拷贝数结果。其中A为标准曲线，B为CAR的拷贝数。
图6为重组Nalm6-BCMA-GFP-LUC细胞株流式细胞术检测BCMA阳性率，其中A为FSC-SSC散点图，B为Nalm6阴性对照，C为重组Nalm6-BCMA-GFP-LUC细胞BCMA阳性率(BCMA-GFP双阳)。该图中数据可以对结果进行判定。
图7为BCMA CAR-T细胞体外功能评价实验结果。其中A为对Nalm6-BCMA-GFP-LUC细胞的杀伤作用，B为IFN-γ释放检测结果。
图8为BCMA CAR-T细胞体内功能评价中小鼠活体成像结果，小鼠活体图像中彩色信号越强(颜色越暗)表示小鼠体内肿瘤细胞数量较多。
图9为BCMA CAR-T细胞体内功能评价中小鼠体重变化结果。
图10为BCMA CAR-T细胞体内功能评价中小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗BCMA单域抗体VHH基因获取
1、抗BCMA单域抗体文库构建：利用自制的BCMA抗原蛋白对成年健康的羊驼在颈背部皮下多点注射免疫。免疫时，将抗原和等体积Gerbu佐剂充分混匀后，多点注射羊驼皮下，共进行5次免疫，每次免疫时间间隔为14天；第三次免疫结束，通过颈静脉采集部分外周血分离血清后测定抗原免疫效价，结果见下表：
Figure BDA0002629434940000061
抗体效价>1：160000。
2、第5次免疫结束后采外周血150mL，分离PBMC后，提取总RNA，并反转录成cDNA，通过两轮PCR扩增羊驼重链抗体的可变区片段VHH。将VHH片段及抗体展示载体分别通过SfiI进行酶切后，采用T4 DNA连接酶将VHH片段克隆至展示载体中，然后通过电转化的方法将连接产物电转入毕赤酵母细胞中，并进行筛选，获得单域抗体酵母展示库。
3、向获得的VHH酵母展示库培养基中，加入终浓度为0.5％的甲醇，诱导酵母展示单域抗体至酵母细胞壁上，加入生物素标记的BCMA重组蛋白，对酵母库中阳性的酵母克隆进行标记，采用Streptividin标记的磁珠分离酵母展示库中能够与目标蛋白BCMA结合的克隆，重复上述富集筛选流程2-3次，将能够与BCMA重组蛋白结合的克隆涂布到固体平板上，挑选单克隆后进行克隆鉴定。
4、将上述挑选的单克隆酵母菌扩增后，培养基中加入终浓度为0.5％的甲醇，进行诱导VHH表达，采用流式细胞术检测展示的VHH片段能否与BCMA蛋白结合，从流式细胞术验证为阳性的克隆中抽提基因组DNA、PCR扩增VHH片段、并进行Sanger测序，获得VHH抗体序列。
5、将VHH抗体序列分别进行基因合成，克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，大提质粒。
6、取一个6孔板接种293T后，用Lenti-VHH-hIgG1-Fc表达载体瞬时转染，3天后收集培养基上清，离心后将上清通过0.45μm的滤膜，收集得到BCMA VHH重组抗体。
7、使用流式细胞术检测BCMA VHH重组抗体与高表达BCMA的重组细胞株CHO-BCMA的结合能力：将对照细胞CHO和CHO-BCMA细胞各分为若干份，每份细胞的数量为5×105个细胞；将100μL BCMA VHH重组抗体分别与靶细胞和对照细胞混匀后，4度孵育1小时；PBS洗涤细胞3次后加入100μL PBS重悬细胞后加入1μL PE标记的抗人IgG抗体，充分混匀后，4度避光孵育30分钟；PBS洗涤细胞3次后上机检测，结果见图1，其中A-D为CHO-BCMA细胞，E-H为CHO细胞。
8、BCMA VHH人源化设计
本申请筛选了多种抗BCMA单域抗体，在这些抗BCMA单域抗体中，CDR1区氨基酸序列选自SEQ ID NO：15-17，CDR2区氨基酸序列选自SEQ ID NO：18-20，CDR3区氨基酸序列选自SEQ ID NO：21-23。
本实施例以所筛选的抗BCMA单域抗体B-6-14为示例，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
根据SEQ ID NO：1，采用表面氨基酸替换的设计进行人源化设计，人源化抗体序列如SEQ ID NO：2-7。
将上述6条人源化抗体片段合成、克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，大提质粒。
9、同步骤6-7，瞬转293T后，取上清分别与CHO和CHO-BCMA细胞孵育后流式细胞术检测人源化抗体与BCMA的结合力，图2展示部分结果(NW2-1222-6-14-1、NW2-1222-6-14-2)。
10、结果显示，人源化序列均为为高亲和力BCMA VHH抗体序列，本实施例中，选择了NW2-1222-6-14-1、NW2-1222-6-14-2继续进行后续实验。
11、人源化抗体亲和力检测：将BCMA重组蛋白使用10mM Acetate缓冲液固定在CM5芯片上，分别以上述人源化抗体NW2-1222-6-14-1、NW2-1222-6-14-2及原始序列抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白BCMA的结合能力，结果见图3，结果显示：抗体B-6-14的亲和力KD＝1.985×10-10M；人源化抗体B-6-14-1的KD＝＝1.818×10-10M；人源化抗体B-6-14-2的KD＝1.760×10-10M。
实施例2嵌合抗原受体基因载体构建
由华大基因公司合成2段基因，一段为SEQ ID NO：1-7所示的任一条氨基酸序列对应的核苷酸序列，本实施例选择了其中三条进行合成，如SEQ ID NO：8-10所示。另外一段为设计的2代CAR结构基因，包括CD8a铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域+CD3ζ胞内信号传导结构域，编码包含这些结构域的2代CAR结构基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
分别得到两段合成基因后，进行BCMA-CAR的载体构建，首先通过PCR、酶切、酶连得到SEQ ID NO：12-14。
将慢病毒载体pCDH-EF1a和SEQ ID NO：12-14，分别双酶切、T4 DNA连接酶连接后，转化感受态细胞、挑单克隆，菌液测序无误后，大提质粒，分别得到序列正确的三个慢病毒载体pCDH-EF1a-BCMA 1#，2#，3#，其中1#为抗BCMA单域抗体原始序列，2#，3#为两个人源化抗BCMA单域抗体序列。
实施例3 BCMA CAR慢病毒制备
慢病毒包装质粒混合物(包括PSPAX2和VSVG)分别与pCDH-EF1a-BCMA1#，2#，3#按预优化的比例混合后，加入助转染试剂，室温下孵育15分钟。然后将转染混合物逐滴加入293T细胞。1-3天后收集培养基上清得到慢病毒粗液。在4℃下500g离心10min后收集上清液。然后超离心以进行慢病毒浓缩。在超离心结束后，小心弃去上清液，并用预冷的DPBS小心重悬慢病毒颗粒。将病毒分装后储存在-80℃下。基于RT-PCR方法和流式细胞术测定慢病毒的物理滴度和感染滴度。
实施例4 BCMA CAR-T细胞的制备
1、PBMC制备：将人静脉血30mL在800g，20℃离心30分钟，离心结束后，将上层血浆转移入另外一个离心管。在50mL离心管中加入15mL人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物)，用电动移液枪将离心后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液上方，250g，20℃，离心10分钟。弃掉上层液体，用10ml PBS重悬计数，用于T细胞纯化。
2、T细胞纯化：根据以下所述的制造商的方案，使用Miltenyi Pan T细胞分离试剂盒(目录号130-096-535)从PBMC纯化人T细胞。PBMC计数后，300g，20℃，离心10分钟。倒掉上清液，将细胞沉淀按每107/40μL缓冲液重悬于缓冲液中后，加入10μL/107Pan T细胞生物素-抗体混合物，充分混匀后4℃孵育5分钟。然后加入30μL缓冲液，和20μL Pan T细胞微珠粒混合物。充分混匀后在4℃孵育10分钟。孵育结束后用1mL缓冲液，洗涤PBMC，250g，4℃离心10分钟。离心后细胞用500μL的缓冲液重悬，通过LS柱，细胞悬液随重力流出，收集流出物(即T细胞组分)，继续通过缓冲剂洗涤LS柱并收集流出液。然后离心富集T细胞并重悬于淋巴细胞培养基+1000IU/mL IL-2中。
3、CAR-T制备：用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi#130-091-441)预活化所制备的T细胞24-96小时后，进行慢病毒感染。
B-6-14BCMA CAR-T细胞：pCDH-EF1a-BCMA 1#慢病毒感染；
B-6-14-2BCMA CAR-T细胞：pCDH-EF1a-BCMA 2#慢病毒感染；
B-6-14-3BCMA CAR-T细胞：pCDH-EF1a-BCMA 3#慢病毒感染。
在活化后的T细胞悬液中加入10μg/mL聚凝胺后，按MOI＝10加入慢病毒，1200g，32℃，离心1小时。离心结束后将转导的T细胞放入细胞培养箱，每天补加适量T细胞培养基。
感染7天后，将BCMA Fc蛋白与BCMA CAR-T孵育后，用流式细胞仪检测T细胞膜表面CAR的表达率。
检测结果见图4。图4的结果显示，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞中，三种序列的CAR表达效率均在90％以上。同时将三种BCMA CAR-T提取DNA后用RT-PCR的方法检测BCMACAR-T细胞上CAR的拷贝数，结果见图5，相关数据如下：
Figure BDA0002629434940000101
图5的结果显示，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞中，每个BCMA CAR-T细胞上均带3-4个CAR分子。
实施例5 BCMA CAR-T细胞功能评价
对实施例4制备的BCMA CAR-T细胞进行功能评价实验如下：
1、体外功能评价
重组Nalm6-BCMA-GFP-LUC细胞株(自爱康得生物医学技术(苏州)有限公司获赠)流式细胞术检测BCMA阳性率，结果见图6。结果显示，BCMA分子在Nalm6-BCMA-LUC重组细胞株中高效表达，在Nalm6细胞(购自广州赛库生物技术有限公司)中不表达，可分别作为CAR-T杀伤实验的靶细胞和对照细胞。
将实施例4制备的BCMA CAR-T细胞和Nalm6-BCMA-GFP-LUC或Nalm6细胞按照效靶比10:1、5:1、2.5:1,1.25:1设置四个梯度，共培养20小时后，使用发光荧光素酶测定试剂盒(Promega#E6110)，检测孔中的剩余荧光素酶活性。用下列公式计算特异性细胞毒性：特异性细胞毒性％＝100％×(1-(RLU样品-RLU最小)/(RLU最大-RLU最小))。同时，取上清用IFN-γELISA试剂盒(达科为)检测IFN-γ，结果见图7，其中对Nalm6-BCMA-LUC细胞的杀伤作用参见图7中的A；IFN-γ释放见图7中的B。结果说明，实施例4制备的BCMA CAR-T细胞可以特异高效地杀伤BCMA阳性的细胞，两个人源化BCMA CAR-T细胞杀伤活性不低于甚至略高于原始BCMA单域抗体序列CAR-T细胞。
2、体内功能评价
通过小鼠尾静脉输注肿瘤细胞Nalm6-BCMA-Luciferase细胞1×106/200μL，建立小鼠肿瘤模型，将小鼠随机分为4组，分别于建模后5天，11天，17天以及25天进行活体成像观察，并于建模后第5天分别通过尾静脉输注对照T细胞(分离纯化自同一外周血PBMC样本)及两个人源化单域抗体序列BCMA CAR-T细胞(B-6-14-1BCMA CAR-T，B-6-14-2BCMA CAR-T)，并用小鼠源性BCMA CAR-T作为阳性对照，各细胞注射用量如下：
B-6-14-1BCMA CAR-T细胞：1×107个；
B-6-14-2BCMA CAR-T细胞：1×107个；
对照T细胞：1×107个；
小鼠源性BCMA CAR-T：1×107个。
结果见图8-10，结果显示，与T细胞对照组相比，人源化BCMA CAR-T细胞、小鼠源性BCMA CAR-T细胞对肿瘤细胞均有显著地杀伤效果，肿瘤细胞注射第25天，小鼠源性BCMACAR-T组的肿瘤细胞开始出现复发，而人源化B-6-14-1/B-6-14-2BCMA CAR-T仍具有显著的杀伤效果(图8)。输注对照T细胞的小鼠从第20天开始体重持续下降，而输注CAR-T细胞的小鼠体重维持，并有轻微上升，表明CAR-T细胞抑制了小鼠体内的肿瘤细胞增殖(图9)。小鼠生存分析显示对照组小鼠从建模后第25天左右开始有死亡小鼠，而CAR-T处理组小鼠状态正常，进行持续观察至60+天，小鼠源性BCMA CAR-T注射小鼠全部死亡，而人源化单域抗体序列BCMA CAR-T注射小鼠大部分存活，表明单域抗体序列BCMA CAR-T体内持续时间更久，效果更好(图10)。
序列表
<110> 深圳茵冠生物科技有限公司
<120> 一种基于单域抗体的BCMA嵌合抗原受体及其应用
<130> 20200804
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly
115 120 125
<210> 2
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala
65 70 75 80
Gly Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp Gly Ile Thr Tyr
50 55 60
Tyr Gly Val Ser Val Lys Gly Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 8
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttagtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggacg catgttcagt actggtgccg tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtcaatt tgtagcagct attacccgga gtgatattcg cgagaatgat 180
ggtataacat actatggagt ctccgtgaag ggccgattca ccatctcccg agacagcgcc 240
ggcaacacgg tgtatctgca aatgaacagc ctgaaacctg aggacacggc cgtttattac 300
tgtgcagcag acgctaagct cgtatttacg cctacacctc agtactgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctccggc 378
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggccg gatgttttct actggtgccg tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggaaaag gcctgcagtt cgtggccgcc atcaccagaa gcgacatcag agagaacgac 180
ggcatcacct actacggcgt gtccgtgaag ggcagattca ccatcagcag agacagcgcc 240
ggcaacaccg tgtacctgca gatgaacagc ctgaagcctg aggacaccgc cgtgtattac 300
tgtgccgccg atgccaagct ggtgttcacc cctacacctc agtattgggg ccagggcaca 360
ctggtcacag tgtctagt 378
<210> 10
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggccg gatgttttct actggtgctg tcggctgggt ccgacaggct 120
cctggaaaag gactgcagtt cgtggccgcc atcaccagaa gcgacatcag agagaacgac 180
ggcatcacct actacggcgt gtccgtgaag ggcagattca ccatcagcag agacagcgcc 240
ggcaacaccg tgtacctgca gatgaacagc ctgaagcctg aggacaccgc cgtgtattac 300
tgtgccgccg atgccaagct ggtgttcacc cctacacctc agtattgggg ccagggcaca 360
ctggtcacag tgtctagt 378
<210> 11
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaagcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 180
ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 240
aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 300
ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 360
gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 420
gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 480
cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 540
gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 600
taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 660
ccgcctcgg 669
<210> 12
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagga ttagtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctggacg catgttcagt actggtgccg tgggctggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtcaatt tgtagcagct attacccgga gtgatattcg cgagaatgat 180
ggtataacat actatggagt ctccgtgaag ggccgattca ccatctcccg agacagcgcc 240
ggcaacacgg tgtatctgca aatgaacagc ctgaaacctg aggacacggc cgtttattac 300
tgtgcagcag acgctaagct cgtatttacg cctacacctc agtactgggg ccaggggacc 360
caggtcaccg tctccggcac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 420
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 480
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 540
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 600
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 660
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 720
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 780
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 840
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 900
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 960
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1020
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1047
<210> 13
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggccg gatgttttct actggtgccg tcggctggtt cagacaggcc 120
cctggaaaag gcctgcagtt cgtggccgcc atcaccagaa gcgacatcag agagaacgac 180
ggcatcacct actacggcgt gtccgtgaag ggcagattca ccatcagcag agacagcgcc 240
ggcaacaccg tgtacctgca gatgaacagc ctgaagcctg aggacaccgc cgtgtattac 300
tgtgccgccg atgccaagct ggtgttcacc cctacacctc agtattgggg ccagggcaca 360
ctggtcacag tgtctagtac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 420
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 480
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 540
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 600
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 660
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 720
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 780
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 840
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 900
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 960
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1020
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1047
<210> 14
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggccg gatgttttct actggtgctg tcggctgggt ccgacaggct 120
cctggaaaag gactgcagtt cgtggccgcc atcaccagaa gcgacatcag agagaacgac 180
ggcatcacct actacggcgt gtccgtgaag ggcagattca ccatcagcag agacagcgcc 240
ggcaacaccg tgtacctgca gatgaacagc ctgaagcctg aggacaccgc cgtgtattac 300
tgtgccgccg atgccaagct ggtgttcacc cctacacctc agtattgggg ccagggcaca 360
ctggtcacag tgtctagtac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 420
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaagcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 480
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 540
acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 600
aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 660
gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 720
ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 780
ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 840
gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 900
aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 960
aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1020
cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1047
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
Gly Arg Met Phe Ser Thr Gly Ala
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Gly Arg Ala Phe Ser Tyr Gly Ala
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
Gly Arg Met Gly Asn Thr Gly Ala
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
Ile Thr Arg Ser Asp Ile Arg Glu Asn Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
Ile Thr Arg Thr Asp Ile Arg Val Asn Asp
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
Ile Gly Arg Ser Asp Asn Arg Glu Asn Asp
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr Pro Gln
1 5 10 15
Tyr
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Ala Lys Asn Val Phe Thr Pro Thr Pro Gln
1 5 10 15
Tyr
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
Cys Tyr Gln Ala Ala Asp Ala Lys Leu Val Phe Thr Pro Thr Asn Gln
1 5 10 15
Tyr

Claims (10)

1.一种抗BCMA单域抗体，其特征在于，所述的抗BCMA单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3；所述的CDR1为SEQ ID NO：15所示的序列；所述的CDR2为SEQ ID NO：18所示的序列；所述的CDR3为SEQ ID NO：21所示的序列。
2.根据权利要求1所述的抗BCMA单域抗体，其特征在于，所述的抗BCMA单域抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包含权利要求1或2所述的抗BCMA单域抗体。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体还包含跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、以及胞内信号传导结构域。
5.根据权利要求3或4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，嵌合抗原受体的结构基因包含所述的抗BCMA单域抗体的编码基因，所述的抗BCMA单域抗体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的序列。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的结构基因包含SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的结构基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的序列。
8.一种生物材料，其特征在于，所述的生物材料为重组载体、重组细胞或以治疗或预防为目的生物制品；所述的生物材料包含权利要求1或2所述的抗BCMA单域抗体或编码所述抗BCMA单域抗体的基因，或所述的生物材料包含权利要求3-7任意一项所述的嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的基因。
9.一种用于治疗多发性骨髓瘤的医用配制品，其特征在于，所述的医用配制品包含权利要求1或2所述的抗BCMA单域抗体或编码所述抗BCMA单域抗体的基因、或权利要求3-7任意一项所述的嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的基因、或权利要求8所述的生物材料。
10.权利要求1或2所述的抗BCMA单域抗体、权利要求3-7任意一项所述的嵌合抗原受体或权利要求8所述的生物材料在制备治疗骨髓瘤的药物中的用途。
CN202010806805.0A 2020-08-12 2020-08-12 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用 Active CN111909271B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010806805.0A CN111909271B (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
PCT/CN2021/086417 WO2022033057A1 (zh) 2020-08-12 2021-04-12 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010806805.0A CN111909271B (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111909271A CN111909271A (zh) 2020-11-10
CN111909271B true CN111909271B (zh) 2021-03-23

Family

ID=73283932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010806805.0A Active CN111909271B (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN111909271B (zh)
WO (1) WO2022033057A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111909271B (zh) * 2020-08-12 2021-03-23 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
CN112028996B (zh) * 2020-10-30 2021-01-22 南京北恒生物科技有限公司 靶向bcma的单域抗体及其用途
CN114195896B (zh) * 2021-12-06 2022-07-05 东莞清实生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
CN117384287A (zh) * 2023-10-12 2024-01-12 浙江康佰裕生物科技有限公司 抗bcma单域抗体及其制备方法与应用
WO2025098446A1 (zh) * 2023-11-07 2025-05-15 赛斯尔擎生物技术（上海）有限公司 抗bcma单域抗体及其应用
CN117534763B (zh) * 2023-12-28 2024-03-26 康维众和(中山)生物药业有限公司 抗bcma的纳米抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3230321B1 (en) * 2014-12-12 2019-08-28 Bluebird Bio, Inc. Bcma chimeric antigen receptors
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
IL315737A (en) * 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
CN108103105A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用
US11492409B2 (en) * 2018-06-01 2022-11-08 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
CN109134665B (zh) * 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
CN111542343B (zh) * 2018-08-24 2023-08-18 上海先博生物科技有限公司 抗bcma的单域抗体及其应用
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN109678961A (zh) * 2019-01-15 2019-04-26 深圳市南科生物工程有限公司 一种基于bmca纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用
CN109694413A (zh) * 2019-01-17 2019-04-30 深圳市前海精准生物科技有限公司 一种基于bmca纳米抗体序列的嵌合抗原受体及其应用
CN111454358A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN109942709B (zh) * 2019-04-22 2019-12-27 广州百暨基因科技有限公司 一种抗bcma的单域抗体及其应用
CN110041433B (zh) * 2019-04-26 2020-12-22 上海科棋药业科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN111333729B (zh) * 2020-03-17 2022-12-06 深圳市南科生物工程有限公司 抗b细胞成熟抗原的纳米抗体及应用
CN111909271B (zh) * 2020-08-12 2021-03-23 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022033057A1 (zh) 2022-02-17
CN111909271A (zh) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111909271B (zh) 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
CN109134665B (zh) 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
CN114929751B (zh) Ror1特异性嵌合抗原受体及其治疗应用
CN116082523B (zh) 一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用
KR102316091B1 (ko) Bcma를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CN114667294B (zh) 特异性结合b细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN111925451B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
CN116120465B (zh) 一种靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体及其应用
CN110204619B (zh) 包含FcγRⅠ的嵌合抗原受体及其应用
CN120005019A (zh) 一种靶向gprc5d的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN116396385A (zh) 一种抗bcma的纳米抗体及其制备方法和应用
CN116199781B (zh) 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN116396389B (zh) 一种靶向bcma的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
WO2024017362A1 (zh) 靶向gprc5d和/或bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN116655794A (zh) 一种靶向t细胞淋巴瘤细胞的免疫细胞及其制备方法和应用
CN112457416B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
EP4372088A1 (en) Anti-egfrviii antibody, polypeptide, cell capable of expressing said polypeptide, pharmaceutical composition containing said cell, method for producing said cell, and polynucleotide or vector comprising nucleotide sequence encoding said polypeptide
CN116284389A (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
CN117343177A (zh) 一种驼源重链抗体或抗原结合片段及应用
CN116410331B (zh) 靶向cs1的嵌合抗原受体、靶向bcma/cs1的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP4620974A1 (en) Anti-afp/hla02 tcr-like antibody and use thereof
US20240034790A1 (en) Antibody specific for cd47 and uses thereof
CN120025438A (zh) 一种靶向cd7的人源化抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN120988140A (zh) 双靶点嵌合抗原受体、免疫效应细胞及应用
CN113321743A (zh) 一种靶向赖氨酰氧化酶1的嵌合抗原受体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant