CN111909236B

CN111909236B - 一种二肽修饰的菁染料化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN111909236B
Application number: CN202010690292.1A
Authority: CN
Inventors: 王飞翼; 陶林林; 王天林; 杨桂春; 卢翠芬; 马超; 李峥; 陈祖兴
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: CN111909236A

Abstract

本发明涉及一种二肽修饰的菁染料化合物，所述化合物的结构通式如下：

其中R₁、R₂为引入的取代基，可以调节新化合物（HCHMC‑Leu）的电子效应、发光性能和化合物的水溶性等。本发明提供的新化合物（HCHMC‑Leu）是一种全新的有机化合物。其由半花菁染料衍生物（HCHMC）和二肽（半胱氨酸亮氨酸：Cys‑Leu）通过亲核取代反应制得，同时，该新化合物能够特异性与生物酶LAP进行相互作用，并引起化合物荧光信号发生比值式变化，可用于对LAP进行检测。

Description

一种二肽修饰的菁染料化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于精细化工领域（染料），具体为设计合成了一种二肽修饰的菁染料新化合物：HCHMC-Leu，该化合物由半花菁染料衍生物（HCHMC）和二肽（半胱氨酸亮氨酸：Cys-Leu）通过亲核取代反应制得，并可用于对亮氨酸氨基肽酶（LAP）进行检测。

背景技术

菁染料是一种常见的荧光染料，其具有荧光发射波长较长、荧光量子产率高、摩尔消光系数大、生物相容性较好等优点，广泛应用于精细化工、材料学、生物医学等领域。菁染料的衍生物由于菁染料本身所具有的特性而使其几乎同样具有发射波长较长、生物相容性较好等特性。因而，开发基于菁染料的新型化合物不仅可以丰富荧光染料家族，拓展其在感光材料、荧光标记等方面的应用，而且新型荧光染料化合物的开发与应用也有助于推动有机化学、精细化工、感光材料、生物化工和医学分析等领域的进一步发展。因此，开发（补充）新型荧光染料化合物仍具有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种二肽修饰的菁染料化合物：HCHMC-Leu。

本发明第二个目的是提供一种二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的制备方法。

本发明第三个目的是提供一种二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu用于对亮氨酸氨基肽酶（LAP）进行检测。

本发明提供的技术方案为，一种二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu，其结构通式如下：

其中R₁、R₂为引入的取代基，可以调节化合物HCHMC-Leu的电子效应、发光性能和化合物的水溶性。

优选地，R1为羟基，R2为甲基。

本发明还提供了上述二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的制备方法，所述化合物主要经以下有机合成反应制得：

以半花菁染料衍生物为原料，通过与半胱氨酸亮氨酸进行亲核取代反应得到二肽修饰的菁染料化合物。所述半花菁染料衍生物具有以下所示的结构：

根据本发明所述一种二肽修饰的菁染料化合物：HCHMC-Leu，可特异性与生物酶亮氨酸氨基肽酶（LAP）进行相互作用，并引起化合物荧光信号变化，可用于对LAP进行检测。因此本发明进而提出了所述二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu在对亮氨酸氨基肽酶进行检测中的应用。

更进一步地，本发明所述二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu在制备用于检测亮氨酸氨肽酶的荧光探针中的应用。

本发明提供的二肽修饰的菁染料化合物详细合成方法如下：

根据所述二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu），优选R₁为羟基，R₂为甲基为例进行说明。

以半花菁染料衍生物（HCHMC）为原料，通过与半胱氨酸亮氨酸进行亲核取代反应得到HCHMC-Leu：

在氩气保护下，将HCHMC（80 mg，0.1629 mmol）和二肽（Cys-Leu，100 mg，0.4272mmol）溶于60 mL乙腈-HEPES缓冲液（1：1，v / v，20 mM，pH 7.4）中，并在40 ℃下搅拌4 h。反应结束后，将体系冷却至室温，真空下旋蒸除去溶剂。将残余物通过硅胶柱层析分离提纯（CH₂Cl₂/MeOH），得到目化合物：HCHMC-Leu。

本发明的创造性在于：（1）将半花菁染料的衍生物（HCHMC）与二肽（半胱氨酸亮氨酸：Cys-Leu）进行有机结合，设计合成出了一种二肽修饰的菁染料新型化合物：HCHMC-Leu；（2）通过调节花菁染料R1处的取代基，不仅可以设计合成出具有更多不同光学性能的花菁染料化合物，而且还可以通过调节R1，调节 HCHMC-Leu与亮氨酸氨基肽酶相互作用的光学信号变化，使HCHMC-Leu具有荧光比值式检测LAP的效果，从而增强其作为荧光探针检测LAP时的抗干扰能力；（3）通过选用菁染料作为荧光团，结合二肽作为识别基团，使得该化合物作为荧光探针不仅具有极好的生物相容性，而且荧光发射波长也较长，两项优点都非常有利于生物成像研究。

该二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）作为荧光探针，利用LAP能够特异性剪切二肽中的亮氨酸残基的特点，实现了与LAP的相互作用，引起分子内的S→N转换，并最终引起化合物荧光信号变化，使其具有检测LAP的用途。

术语：

Absorption为吸收值。

Fluoresence (FL) intensity为荧光强度。

有益技术效果：

本发明提供一种二肽修饰的菁染料新化合物：HCHMC-Leu。菁染料是一种具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、发射波长在近红外区和可修饰位点较多等优点的荧光染料，广泛应用于感光材料、生物化工、荧光标记等方面，具有非常重要的应用价值。然而，由于其合成过程复杂、难度较高、产率较低，大规模生产仍然受到限制，并且基于菁染料的新化合物也相对有限。通过对花菁染料母体进行改造和不同的修饰（功能化），可设计合成具有不同光学性能的染料分子，可用于构建新型荧光传感器、制备新型感光材料、荧光材料等，而且新染料化合物的合成与应用在精细化工、材料学、生物医学等领域也都将具有非常重要的意义。因而，开发（补充）新型的基于菁染料的新化合物仍具有非常重要的现实意义。

本发明基于以上需求，提供了一种二肽修饰的菁染料新化合物：HCHMC-Leu，该化合物以半花菁染料衍生物（HCHMC）为原料，通过与半胱氨酸亮氨酸进行亲核取代反应制得。HCHMC-Leu不仅是一种全新的基于菁染料的新化合物，而且在相关性能测试中发现，该化合物还可用于对亮氨酸氨基肽酶（LAP）进行检测。

附图说明

图1是本发明二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）在PBS 缓冲溶液（pH=7.4）中与LAP作用前后的（a）紫外吸收光谱图（b）荧光发射光谱图；

图2是本发明二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）在PBS 缓冲溶液（pH=7.4）中与各种分析物反应前后荧光强度变化示意图。其中：a：无；b：Mg²⁺；c：Ca²⁺；d：Zn²⁺；e：HS^-；f：GSH；g：Cys；h：葡萄糖；i：抑肽酶；j：纤维素酶；k：胰蛋白酶；l：脂肪酶；m：α-淀粉酶；n：α-Chy；o：ELA；p：GGT；q：硫酸酯酶；r：LAP。

图3是本发明二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）的核磁共振氢谱图，氘代试剂为d ₆-CD₃OD。

图4是本发明二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）的核磁共振碳谱图，氘代试剂为d ₆-DMSO。

图5是本发明二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）的高分辨质谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的合成：

二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的氢谱（如图3），氘代试剂为d ₆-CD₃OD。

¹H NMR (d ₆-CD₃OD, 400 MHz, ppm): δ 9.36-9.35 (d, 1H), 7.91-7.90 (d,1H), 7.78-7.77 (d, 2H), 7.66-7.62 (m, 2H), 7.06-7.03 (d, 1H), 6.82-6.78 (m,2H), 6.19-6.17 (m, 1H), 4.41-4.39 (m, 1H), 4.09 (s, 3H), 0.78-0.76 (d, 1H),3.39 (s, 1H), 2.96-2.90 (m, 2H), 2.88-2.80 (m, 2H), 1.38-1.32 (m, 1H), 1.03-1.01 (m, 6H);

二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的碳谱（如图4），氘代试剂为d ₆-DMSO。

¹³C NMR (d ₆-DMSO, 100 MHz): δ 172.31, 169.78, 158.45, 158.21, 157.06,155.98, 145.78, 138.52, 138.33, 127.98, 119.00, 118.68, 116.61, 114.95,113.49, 105.71, 59.76, 58.08, 54.14, 52.38, 51.89, 51.46, 48.41, 44.75,42.01, 29.18, 28.33, 27.79, 23.98, 23.26, 22.48;

二肽修饰的菁染料化合物HCHMC-Leu的高分辨率质谱（如图5）， HRMS [M]⁺ (ESI,m/z) calcd for C₃₂H₄₀N₃O₄S⁺ : 562.27340, Found: 562.27328。

效果例：

参考图1是二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）在PBS缓冲溶液（0.01 mol/L,pH=7.4）中与LAP作用前后的（a）紫外吸收光谱图：新化合物HCHMC-Leu在500 nm处有最大的紫外吸收峰，在加入LAP酶共同孵育之后，吸收峰红移至532 nm处；（b）荧光发射光谱图：在550 nm的光的激发下，新化合物HCHMC-Leu在683 nm处检测到明显的荧光信号，在与LAP酶作用后，683 nm处的荧光信号逐渐减弱，而在620 nm处的荧光逐渐增强。显然，新化合物（HCHMC-Leu）具有荧光比值式检测LAP的用途。其中参考图1中，所有测试均在纯水体系中测得，无需添加任何有机溶剂助溶。其次，由图1可见，HCHMC-Leu对LAP的识别为标准的比值式检测，且荧光发射峰值移动达60 nm以上，可有效降低荧光重叠区域干扰，与传统的荧光增强型检测方法相比，比值式检测方法抗干扰能力更强，具有明显的优点。最后，图1所示的检测区间在600 nm以上，荧光信号发射波长较长，可以有效降低生物实验（应用）中检测LAP时，生物体自发荧光的干扰。

参考图2：二肽修饰的菁染料化合物（HCHMC-Leu）在PBS 缓冲溶液（pH=7.4）中与各种分析物反应前后荧光强度变化示意图，结果显示HCHMC-Leu表现出对LAP优异的选择性，抗干扰能力强。其中：a：无；b：Mg²⁺；c：Ca²⁺；d：Zn²⁺；e：HS^-；f：GSH；g：Cys；h：葡萄糖；i：抑肽酶；j：纤维素酶；k：胰蛋白酶；l：脂肪酶；m：α-淀粉酶；n：α-Chy；o：ELA；p：GGT；q：硫酸酯酶；r：LAP。

本发明提供一种二肽修饰的菁染料新化合物：HCHMC-Leu。该化合物由菁染料衍生物（HCHMC）和二肽（半胱氨酸亮氨酸：Cys-Leu）通过亲核取代反应合成制得。HCHMC-Leu不仅是一种全新的基于菁染料的新化合物，而且在相关性能测试中发现，该化合物还可用于对亮氨酸氨基肽酶（LAP）进行荧光比值式检测。

以上显示描述了本发明的基本内容和用途。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种二肽修饰的菁染料化合物，其结构通式如下：

其中R₁为羟基，R₂为甲基。

2.权利要求1所述二肽修饰的菁染料化合物的制备方法，主要包括以下步骤：

以半花菁染料衍生物为原料，通过与半胱氨酸亮氨酸进行亲核取代反应得到二肽修饰的菁染料化合物；

所述半花菁染料衍生物具有以下所示的结构：

其中R₁为羟基，R₂为甲基。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在氩气保护下，将0.1629 mmol半花菁染料衍生物和0.4272 mmol二肽溶于60 mL乙腈-HEPES缓冲液中，并在40 ℃下搅拌4 h得到二肽修饰的菁染料化合物。

4.权利要求1所述二肽修饰的菁染料化合物在对亮氨酸氨基肽酶进行检测中的应用。

5.根据权利要求1所述二肽修饰的菁染料化合物在制备用于检测亮氨酸氨肽酶的荧光探针中的应用。