CN111905105B - 一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物及其制备方法，所述蛋白类纳米药物为转入了共价交联有三苯基膦(TPP)的人源p53蛋白的外泌体。本发明开发的蛋白类纳米药物递送体系TPP/p53@Exos，能够靶向识别特定的癌细胞，通过激活细胞内源性凋亡通路高效抑制癌细胞生长，且不具毒副作用，为癌症治疗提供了新的手段。所述纳米药物递送体系的制备方法具有较高的蛋白荷载率(～75％)，也可用于其他蛋白类药物的保护与靶向递送。

Description

一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物及其制备方法。

背景技术

随着发病率和死亡数的增加，癌症已成为中国疾病死亡的主要原因，也是主要的公共卫生问题。

化疗和放疗作为目前最主流的癌症治疗方式，面临的问题在于癌细胞耐药和对机体的毒副作用。癌症干细胞(CSCs)通过表达ATP结合盒(ABC)转运蛋白、抗凋亡蛋白和DNA修复酶，可以有效逃避化疗和放疗的清除，导致药物耐受和肿瘤复发。但是基于小分子量的化疗药物(烷基化剂、蒽环类药物、微管抑制剂、抗代谢物、铂类药物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂等)常常会给患者带来副作用，大大降低患者的生活质量[Park,S.B.et al.Chemotherapy-Induced Peripheral Neurotoxicity:ACritical Analysis.CA.Cancer J.Clin.63,419–437(2013).]。

TP53抑癌基因是所有癌症类型中最常见的突变基因，50％的肿瘤中都存在TP53基因突变。所有乳腺癌中的TP53突变约占40％，其中，在三阴性乳腺癌的基底样亚型(80％)和HER2丰富亚型(72％)中频率最高，在管腔A亚型(12％)和管腔B亚型(29％)中频率较低。

人TP53基因定位于17P13.1(17号染色体短臂1区3带1亚带)，由11个外显子和10个内含子组成，转录成2.5kb mRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为43.7kDa。由于蛋白中含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢，蛋白条带出现在Marker所示53kDa处，将其命名为p53。p53是一种高度不稳定的转录因子，被多种不同的压力(包括癌基因激活、DNA损伤、缺氧和营养剥夺等)激活形成四聚体，得以逃避泛素化和蛋白酶体降解而稳定下来，进而进入核内，与位于其启动子区域的p53响应元件结合，反式激活靶基因，并协调抑制肿瘤的众多下游反应(包括调节细胞周期、增殖、衰老、分化、细胞凋亡、铁死亡、DNA修复、代谢、血管生成和自噬)。

除了作为转录因子发挥作用外，p53在介导非转录依赖的细胞死亡过程中也有重要作用。近来一种融合了p53与BH3蛋白(两种蛋白都含有线粒体靶向信号)的基因构建体通过提高转录p53蛋白的线粒体靶向效果在体外呈现出更显著的凋亡诱导效果，暗示p53的线粒体凋亡途径在癌症治疗中的巨大潜力。

p53作为单链蛋白，具有一个N端残基，由于其生理电荷，极有可能暴露在水性溶剂中，因而展露出特定的化学修饰位点。对于由原核生物大肠杆菌表达的人源p53蛋白，N端甲硫氨酸在合成后即被切去，N端变为谷氨酸，由之提供的氨基可作为酰化修饰位点。

最常用的酰化反应催化剂是由水溶性的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)组成的催化体系，能够催化酰胺键的生成。其机理在于：EDC可活化反应物1的羧基，生成更容易与氨基发生酰化反应的O-酰基异脲(易在几分钟内水解为羧酸)，而NHS使O-酰基异脲转变为活性酯(在pH7.0左右半衰期可达数小时)，为提供氨基的反应物2与反应物1交联提供更充足的反应时间。为保证最佳的催化效果，EDC和NHS通常过量。值得注意的是，若提供氨基的反应物2同时具有羧基，则其羧基也可能被EDC/NHS活化，从而生成非目标产物。为避免上述问题，可在EDC活化反应物1后，加入适量的β-巯基乙醇或三乙胺等还原剂淬灭剩余过量的EDC。

为尽可能避免p53蛋白表面暴露的电中性的赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等残基成为化学修饰的位点，可通过控制略偏酸性的反应条件(pH4.5～7)实现。

由于蛋白质不易穿透细胞膜且野生型的p53蛋白在细胞中易水解(半衰期为20min)，胞内递送p53蛋白还需要依赖稳定、特异和高效的纳米载体。外泌体(Exosomes，英文简称Exos)是天然纳米蛋白药物载体的不二之选。外泌体是现今发现最小的纳米级单层囊泡，粒径介于30～150nm之间，由哺乳动物细胞分泌，广泛存在于唾液和尿液等体液中。除了具有比微囊泡(100～1000nm)更微小的粒径外，外泌体还具有独特的起源。外泌体内部通常荷载蛋白质和核酸片段，是细胞间近距离和远距离通讯的媒介，在炎症、免疫响应、血管生成、细胞死亡、神经衰退和癌症迁移中具有重要作用。然而，外泌体被细胞内化的机制以及是否具有特异性尚不清楚，其摄取途径可能更多取决于受体细胞的类型。

外泌体的提纯方法多种多样，最常用的方法是超速离心(≥100,000×g)，也可以将过滤法与超速离心法相结合，先用滤膜过滤掉细胞碎片和大型外囊泡(EVs)，再通过超速离心法分离外泌体。各种刺激如Ca²⁺离子载体、缺氧等均可诱导细胞分泌EVs，也可用于提高外泌体的产量。对于囊泡分离提纯后荷载亲水性蛋白质，主要障碍在于如何使蛋白质跨过脂质双层膜。对此，电穿孔是一项较为成熟的技术，早期用于脂质体荷载化疗药物，其原理是通过控制电压引发脂质膜形成孔隙，进而包载药物。

肿瘤细胞外泌体的膜蛋白和内含物常常在抑制免疫细胞和促进肿瘤增殖方面起作用，因而肿瘤来源的外泌体很少被用作纳米载体。然而，随着外泌体在同种细胞间的通讯作用的深入研究，肿瘤来源的外泌体在靶向同源癌细胞递送药物中也逐渐显示出一定的潜力。然而，这方面的研究十分欠缺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物及其制备方法。具体地，公开了一种用于癌症靶向治疗的重组p53蛋白-外泌体纳米药物的构建策略及其制备方法，所述重组p53蛋白外泌体纳米药物能够在体外有效诱导p53突变或非突变型乳腺癌细胞的凋亡。其制备方法如下：首先从转基因工程菌中获取人源p53蛋白，利用催化剂EDC/NHS催化(3-羧基丙基)-三苯基膦(TPP)与p53蛋白间的酰胺化反应，制得TPP/p53重组蛋白(图1a)；其后采用超速离心技术提取经紫外光刺激或热休克处理的癌细胞分泌的外泌体(图1b)，并利用电穿孔技术将上述TPP/p53重组蛋白导入其中，制得TPP/p53@Exos重组p53蛋白-外泌体纳米药物(图1c)。所述重组p53蛋白-外泌体纳米药物可应用于乳腺癌的促治疗，天然纳米载体外泌体可识别同源癌细胞，将TPP/p53重组蛋白递送至癌细胞内部；线粒体靶向分子TPP可在线粒体膜电位驱动下，将外源重组p53蛋白递送至线粒体外膜；外源重组p53蛋白可与线粒体外膜凋亡相关蛋白作用，最终诱发乳腺癌细胞凋亡。

本发明的第一个目的在于提供一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物。

本发明的第二个目的在于提供一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供任一所述制备方法制备得到的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物。

本发明的第四个目的在于提供所述的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物在制备癌症靶向治疗试剂中的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

本发明以人源乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3以及由鼠源细胞系4T1构建的小鼠模型为主要实验对象展开。首先催化(3-丙羧基)-三苯基溴化膦(英文简称TPP)与购买的转基因工程菌表达的人源p53蛋白共价交联，制得TPP/p53重组蛋白；其后采用超速离心技术提取乳腺癌细胞培养上清中癌细胞所分泌的外泌体(Exosomes，英文简称Exos)，并利用电转技术将上述TPP/p53重组蛋白导入其中，制得一个蛋白类纳米药物递送体系TPP/p53@Exos。

本发明通过傅里叶红外光谱、核磁共振氢谱、圆二相色谱和透射电镜等一系列检测技术对所述纳米药物递送体系进行一系列表征；本发明通过免疫荧光、CCK-8细胞计数分析、Fluo-3 AM钙离子荧光检测和细胞划痕等实验探究所述纳米药物递送体系在体外对癌细胞的靶向能力及生长抑制效果；本发明构建4T1小鼠乳腺癌模型，原位给药28天，记录肿瘤体积变化，并通过H&E染色、免疫组化、血液学检验等探究所述纳米药物递送体系在体内对乳腺癌细胞的杀伤效果以及对机体的毒副作用。结果显示本蛋白类纳米药物递送体系TPP/p53@Exos，能够靶向识别特定的癌细胞，通过激活细胞内源性凋亡通路高效抑制癌细胞生长，且不具毒副作用，为癌症治疗提供了新的手段。所述纳米药物递送体系的制备方法具有较高的蛋白荷载率(75％)，也可用于其他蛋白类药物的保护与靶向递送。

因此本发明要求保护一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物，所述蛋白类纳米药物为转入了共价交联有三苯基膦的人源p53蛋白的外泌体。

优选地，所述癌症为乳腺癌，所述外泌体提取于乳腺癌细胞培养上清。

本发明还要求保护一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

将含羧基官能团的三苯基膦与人源p53蛋白共价交联，得到重组蛋白TPP/p53；

提取外泌体；

将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体。

优选地，所述癌症为乳腺癌，所述外泌体提取于经紫外光照射刺激的乳腺癌细胞培养上清。

更优选的，紫外光功率为25W，照射时长为30min。

优选地，将含羧基官能团的三苯基膦(TPP)与人源p53蛋白共价交联的方法为：制备含羧基官能团的三苯基膦的饱和溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，活化含羧基官能团的三苯基膦的羧基；加入β-巯基乙醇淬灭EDC，将p53溶液与活化的TPP溶液混合，反应，纯化。

所述含羧基官能团的三苯基膦为(3-丙羧基)-三苯基溴化膦。

更优选地，含羧基官能团的三苯基膦的饱和溶液为含羧基官能团的三苯基膦的饱和磷酸盐缓冲盐溶液，饱和磷酸盐缓冲盐溶液pH＝6.2。

更优选地，活化TPP的羧基反应时间为10～20min。

最优选地，活化TPP的羧基反应时间为15min。

更优选地，EDC·HCl和NHS的物质的量的比为4～8:1。

最优选地，EDC·HCl和NHS的物质的量的比为4:1。

更优选地，EDC·HCl和TPP的物质的量的比为10～20:1。

最优选地，EDC·HCl和TPP的物质的量的比为20:1。

更优选地，p53溶液浓度为0.2～1mg/mL。

最优选地，p53溶液浓度为0.6mg/mL。

更优选地，p53溶液与活化的TPP溶液的物质的量的比为1:100～2000。

最优选地，p53溶液与活化的TPP溶液的物质的量的比为1:1000。

更优选地，p53溶液与活化的TPP溶液混合，反应1～4h。

最优选地，p53溶液与活化的TPP溶液混合，反应2h。

更优选地，β-巯基乙醇和EDC的物质的量的比为1～2:1。

最优选地，β-巯基乙醇和EDC的物质的量的比为1:1。

更优选地，β-巯基乙醇溶液与活化的TPP溶液混合，反应3～10min。

最优选地，β-巯基乙醇溶液与活化的TPP溶液混合，反应5min。

更优选地，将反应液转移到1000～5000Da透析袋透析纯化，于PBS透析液中透析12～48h。

最优选地，将反应液转移到1000Da透析袋透析纯化，于PBS透析液中透24h。

优选地，采用超速离心技术提取外泌体。

更优选地，取细胞培养上清，220μm微孔滤膜过滤，收集滤液；将滤液转移至超速离心管中，0～4℃，100,000～150,000×g超速离心1.5～12h；弃去上清，使用PBS或电极缓冲液重悬外泌体沉淀。

最优选地，取细胞培养上清，220μm微孔滤膜过滤，收集滤液；将滤液转移至超速离心管中，4℃，103,000×g超速离心12h；弃去上清，使用PBS或电极缓冲液重悬外泌体沉淀。

优选地，利用电转技术将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体。

更优选地，利用电转技术将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体的具体操作为：使用电极缓冲液悬浮外泌体，电穿孔处理排空外泌体内部物质；加入DMEM或1640基本培养基稀释，孵育；超速离心纯化外泌体，获得空载的外泌体悬液；空载的外泌体悬液与重组蛋白TPP/p53溶液混合，电穿孔处理；孵育，超速离心纯化。

更优选地，所述培养基根据外泌体的来源细胞选择DMEM或1640基本培养基。

最优选地，电穿孔处理的条件为施加0.5～1kV电压，持续2～5ms。

更优选地，电穿孔处理的条件为施加1kV电压，持续2ms。

更优选地，超速离心纯化为0～4℃，100,000～150,000×g超速离心1.5～12h；弃去上清，使用PBS或电极缓冲液重悬外泌体沉淀。

最优选地，超速离心纯化为4℃，128,000×g超速离心12h；弃去上清，使用PBS或电极缓冲液重悬外泌体沉淀。

更优选地，30～40℃孵育10～30min

最优选地，37℃孵育30min

以上任一所述制备方法制备得到的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物。

所述的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物在制备癌症靶向治疗试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

发明中纳米药物递送体系的材料选择及构建方法具有优越性：(1)纳米载体外泌体由于具有与其他囊泡相比更加微小的粒径，能够有效穿透肿瘤组织的血管壁，提高药物递送效率；(2)超速离心技术提取的外泌体，保持了外泌体的膜蛋白完整性，能够实现蛋白药物递送过程中的肿瘤细胞的同亲型识别及与四跨膜分子蛋白CD47有关的免疫逃逸，充分发挥外泌体在药物传递过程中的生物学功能；(3)外泌体荷载p53蛋白前，采用电导技术排出癌细胞分泌的外泌体内部的RNA等致癌物质，避免了其促进肿瘤生长和迁移的作用。

发明中纳米药物递送体系的作用机理具有创新性：(1)天然纳米载体外泌体可识别同源癌细胞，将TPP/p53重组蛋白递送至癌细胞内部；线粒体靶向分子TPP可在线粒体膜电位驱动下，将外源重组p53蛋白递送至线粒体外膜；外源重组p53蛋白可与线粒体外膜凋亡相关蛋白作用，最终诱发乳腺癌细胞凋亡。(2)从细胞凋亡信号通路入手，选择与细胞内源性凋亡相关的外源p53作为蛋白类药物，加以亲脂性修饰，使其能够靶向线粒体发挥促使癌细胞凋亡的作用，不同于直接抑制细胞正常代谢的传统化疗药物，因此容易被细胞代谢，具有较低的毒副作用。

所述纳米药物递送体系具有良好的实用性：(1)能够在体内外有效诱导p53突变或非突变型乳腺癌细胞的凋亡；(2)也能够用于靶向杀伤其他异常组织、细胞或细胞内的细胞器以治疗不同分子亚型的原位癌症和转移性癌症；(3)还用于靶向递送其他化学药物、蛋白质、基因等治疗其他疾病，只需要将癌细胞来源的外泌体替换为目标细胞所分泌的外泌体或囊泡，将p53蛋白替换成其他凋亡促进因子、化学物质、蛋白质或基因等，将TPP换替换为其他细胞器靶向制剂等。

综上所述，本发明开发的蛋白类纳米药物递送体系TPP/p53@Exos，能够靶向识别特定的癌细胞，通过激活细胞内源性凋亡通路高效抑制癌细胞生长，且不具毒副作用，为癌症治疗提供了新的手段。所述纳米药物递送体系的制备方法具有较高的蛋白荷载率(～75％)，也可用于其他蛋白类药物的保护与靶向递送。

附图说明

图1为TPP/p53@Exos纳米药物制备方法。

图2为红外光谱检测TPP/p53化学键变化。

图3为核磁共振氢谱检测TPP/p53氢键变化。

图4为圆二色谱检测TPP/p53蛋白质二级结构。

图5为紫光光谱测定TPP/p53交联率。

图6为免疫印迹检测外泌体标志性膜蛋白。

图7为免疫荧光检测外泌体形态。

图8为动态光散射检测外泌体粒径。

图9为透射电镜检测TPP/p53荷载进入外泌体(标尺：100nm)。

图10为免疫荧光检测TPP/p53荷载进入外泌体(标尺：200nm)。

图11为TPP/p53的外泌体荷载量。

图12为免疫荧光检测癌细胞对外泌体的摄取(标尺：20μm)。

图13为免疫荧光检测TPP/p53@Exos的线粒体靶向效果(标尺：20μm)。

图14为CCK-8试剂盒检测癌细胞在纳米药物作用24h后的细胞活力。

图15为Fluo-3 AM试剂盒检测癌细胞在纳米药物作用24h后Ca²⁺含量。

图16为划痕实验检测癌细胞在纳米药物作用后的迁移情况。

图17为小鼠乳腺癌模型药物治疗28天过程中肿瘤体积变化。

图18为小鼠在治疗28天过程中体重变化。

图19为小鼠乳腺癌模型药物治疗28天后肿瘤大小。

图20为H&E染色肿瘤组织形态观察：生理盐水对照组；p53组；tExos组；TPP/p53组；TPP/p53@tExos组，标尺：200μm；100μm。

图21为免疫组化检测肿瘤组织中Bax，Bcl-2，Caspase-3和Ki67表达情况：生理盐水对照组；p53组；Exo组；TPP/p53组；TPP/p53@tExos组。

图22为H&E染色肿瘤组织形态观察：正常组；生理盐水对照组和TPP/p53@tExos治疗组，标尺：100μm

图23为小鼠治疗28天后血液常规指标检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、细胞株

人乳腺癌细胞细胞系MCF-7由上海生物科学研究所细胞资源中心提供，人乳腺癌SK-BR-3细胞系和小鼠乳腺癌4T1细胞系由中国科学院大学深圳先进技术研究院提供，经本实验室传代培养。

2、主要试剂、仪器

重组人p53蛋白(品牌：CUSABIO，货号：CSB-EP024077HU)(0.6mg/mL，纯度大于90％)、(3-丙羧基)-三苯基溴化膦(TPP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、磷酸缓冲液(PBS)，透析袋(1kDa)

胰酶、青霉素、链霉素、高糖DMEM培养基、1640培养基均为GIBCOBRL公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；CD63抗体、CD81抗体、p53抗体；FITC荧光二抗、Cy5荧光二抗；DAPI；Mito-tracker Green线粒体活性染液；CCK-8细胞计数试剂盒；Fluo-3 AM钙离子探针；其他试剂均为分析级，未进一步纯化使用。

Nikon显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，Thermo CO₂培养箱，电转仪(Gene Pulser Xcell Total System)，CP80NX超速离心机，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

3、体外小鼠模型的构建及给药方式

4T1细胞培养条件：含10％新生小牛血清的1640培养基，37℃，5.0％CO₂。准备48只健康雌性BALB/c小鼠，饲养至体重达到15g左右；体外传代培养4T1细胞，使用0.25％的胰蛋白酶溶液消化15～30min，并用移液枪吹打，1000rpm离心5min，弃去上清，使用PBS重悬细胞，浓度调整为1×10⁷个/mL；制备4T1单细胞悬液，备用。

其中40只小鼠将随机分为5组，每组8只：①控制组；②p53处理组；③外泌体处理组；④TPP/p53处理组；⑤TPP/p53@Exos处理组。使用无菌注射器吸取4T1细胞悬液，接种于小鼠下腹部皮下的乳腺处，每只小鼠注射0.1mL；另外8只为正常组不做任何处理。所有老鼠均处于相同的饲养环境，给予充足的食物与水。从接种后的第二天开始，每天测量小鼠肿瘤长和宽，并利用公式V＝a×b²/2计算肿瘤体积；待肿瘤体积达到100mm³后，开展进一步实验。

使用超速离心法提纯4T1细胞来源的外泌体即tExos，作为蛋白药物载体；制备TPP/p53@tExos，分别向实验组小鼠肿瘤原位注射等体积、等蛋白含量的p53蛋白、外泌体、TPP/p53及TPP/p53@tExos药物，对照组注射等体积的生理盐水，每两天注射一次药物，每次给药量为12μg/kg(p53蛋白含量)，持续28天；每两天测量小鼠肿瘤体积与体重，治疗结束后处死小鼠，解剖肿瘤并测称重，使用Graphpad Prism软件分析数据并作图。

4、数据分析

实验至少进行三次重复。所有值均以平均值±标准误差表示。使用GraphPadPrism6.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本T检验。两组以上比较采用单因素方差分析(P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著)。

实施例1 TPP/p53@Exos的制备

一、TPP/p53的制备与表征

1、实验方法

将(3-丙羧基)-三苯基溴化膦溶解于热磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，pH＝6.2)中，得到浓度约为0.46mg/mL的TPP饱和溶液；加入EDC和NHS(20：1，n/n)，活化TPP的羧基，反应约15min；将p53溶液(0.6mg/mL)加入经活化的TPP溶液(～1:1000，n/n)中，在室温下反应2h，合成TPP/p53；加入β-巯基乙醇淬灭EDC(1：1，n/n)5min；将反应液转移到透析袋(1000Da)中，至于PBS透析液中透析24h。

通过FT-IR傅里叶红外光谱和¹H-NMR氢谱检测TPP/p53的化学键变化。通过圆二色谱检测重组p53的二级结构。使用紫外分光光度计(UV-1800)扫描TPP溶液的最大吸收峰，以不同浓度TPP溶液为横坐标，以最大吸光度为纵坐标，绘制TPP的标准曲线，并通过分析TPP/p53透析液的吸光度计算剩余TPP含量，进而计算交联率。

2、实验结果

(1)图2显示，p53的红外光谱中-OH伸缩振动频率中心位于3394cm^-1，-NH2伸缩振动频率中心位于2915cm^-1，酰胺带的伸缩振动频率介于2847cm^-1与1647cm^-1之间。由于TPP微溶于PBS，低浓度的TPP样品的特征峰较弱。在TPP的红外光谱中，苯环的C＝C伸缩振动频率介于1474cm^-1与1561cm^-1之间，羧基的C＝O伸缩振动中心位于1636cm^-1，苯环氢-H的伸缩振动频率位于3326cm^-1，与羟基-OH伸缩振动频率(3374cm^-1)重合。TPP/p53的红外特征峰同样由于溶质浓度低而较弱。通过仔细比较，苯环氢-H、C＝O和苯环C＝C与TPP相比发生了红移，意味着TPP/p53增强的不稳定性，同时也意味着TPP与p53蛋白的成功交联。

(2)如图3所示，TPP共有22种取代氢，其中有15种比例相等的芳环氢(化学位移介于7.5～8.5ppm)、3种比例相等的烷烃氢(化学位移介于2.5～4.5ppm，峰面积是芳环氢的两倍，其中有两种氢相离甚近，看似重叠)以及一种羧基氢。其余峰可能由样品纯度问题所致。反应产物TPP/p53重组蛋白样品溶解于极性溶液中，其氢谱中出现类似于TPP芳环氢(化学位移介于7.0～8.0ppm)，同时具有p53蛋白复杂的氢谱(化学位移介于0～4.5ppm)，两峰较TPP和p53都向低位移区域移动。另外，化学位移4.7ppm处出现了新的峰，推测是新生成的酰胺氢，表明TPP和p53蛋白不是简单的混合，而发生了化学反应。图4显示人源p53蛋白和TPP/p53重组蛋白的圆二色谱，两者在222nm和208nm处为负峰，在191nm处为正峰，是存在α-螺旋的构象的特征。TPP/p53样品与p53样品圆二色谱的差异在于TPP/p53的各峰都变得更加尖锐。另外，TPP/p53整体峰幅度低于p53，这可能是TPP/p53重组蛋白的浓度较低造成的。综上，TPP/p53的二级结构较p53发生了一定变化，但总体上保留了p53蛋白的α螺旋结构。

(3)实验首先测定了不同浓度TPP溶液的紫外光谱，结果如图5所示，TPP的最大吸收峰为267nm。

接下来测定浓度分别为0.008mg/mL、0.010mg/mL、0.012mg/mL、0.014mg/mL、0.016mg/mL、0.018mg/mL、0.020mg/mL、0.022mg/mL、0.024mg/mL、0.026mg/mL TPP溶液在267nm处的吸光度，结果如图5显示，TPP在267nm处的标准曲线方程y＝35.5x+0.198，R2＝0.99759。反应后TPP/p53透析液的吸光度为0.704，代入上述标准曲线方程，计算出溶液中剩余TPP浓度为21.84μg/mL。反应前溶液中TPP的含量为1mL×0.46mg/mL＝460μg，反应后TPP/p53透析液中TPP的浓度为21.84μg/mL，则反应剩余TPP的含量为21.84μg/mL×21mL＝458.64μg，反应的TPP含量为460μg～458.64μg＝1.36μg(即3.17×10^-9mol)。TPP、p53的交联率为1.36μg÷460μg＝0.30％。由于p53的含量为10μL×0.6mg/mL＝0.006mg(即1.37×10^{- 10}mol)，由此可得反应物质TPP：p53≈23：1，即平均每个p53蛋白分子大约连接了23个TPP分子。

二、外泌体的纯化与表征

1、实验方法

取新生牛血清，超速离心(4℃，100,000×g)90min，收集上清，得到不含外泌体的新生牛血清；使用不含外泌体的新生小牛血清(CS)配置含10％血清的DMEM高糖培养基与10％的1640培养基，分别在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养MCF-7和SKBR-3乳腺癌细胞；待细胞密度达到80％，弃去培养液，使用PBS清洗3次；使用0.25％胰蛋白酶消化2min，制成单细胞悬液，接种至10个直径为10cm的培养皿中培养，获得1×10⁷个细胞；待MCF-7和SKBR-3细胞密度达到80％，25W紫外光照射30min(或将细胞至于43℃热休克处理1h)，刺激细胞分泌外泌体；37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育6h；收集上述细胞培养上清，220μm微孔滤膜过滤，收集滤液；将滤液转移至超速离心管中，超速离心(4℃，103,000×g)12h；弃去上清，使用200μL PBS或电极缓冲液重悬外泌体沉淀，分别得到MCF-7和SK-BR-3来源的外泌体悬液，转移至250μL EP管中，-80℃冻存。(电极缓冲液：120mmol/L KCl；0.15mmol/L CaCl₂；10mmol/L K₂HPO₄；25mmol/L H&EPES；2mmol/L EGTA；5mmol/L MgCl₂；2mmol/L ATP；5mmol/LRGD谷胱甘肽)；

使用动态光散射仪检测外泌体的流体直径；通过免疫印迹检测外泌体的膜上标志性的四跨膜蛋白CD63和CD81；使用CD63一抗(稀释至1：1000)孵育外泌体，FITC二抗(1：1000)荧光标记，荧光显微镜下观察外泌体的形态。

2、实验结果

(1)如图6所示，免疫印迹实验检测到提纯的外泌体样品中含有外泌体表面标志蛋白CD63和CD81，分子量为26kDa。

(2)如图7所示，荧光显微镜下观察到外泌体，形态近似球形，直径约为150nm。

三、TPP/p53@Exos的制备与表征

1、实验方法

使用电极缓冲液悬浮外泌体，转移至电极杯，施加1kV电压，持续2ms，排空外泌体内部物质；根据外泌体的细胞来源向电极杯中加入少量DMEM(MCF-7细胞来源)或1640(SK-BR-3细胞来源)基本培养基稀释，37℃孵育30min；再次超速离心纯化外泌体，获得空载的外泌体悬液；按照1：1的体积比向电极杯中加入外泌体悬液和p53蛋白溶液，以相同的参数进行电穿孔处理，使p53蛋白荷载入外泌体中；再次孵育后超速离心，获得TPP/p53@Exos悬液。

为了检测重组蛋白的荷载率，使用紫外-可见光分光光度计分别检测TPP/p53的紫外光谱，确定其最大吸收峰为213nm；取3μg/mL TPP/p53溶液，作为母液；配置母液含量分别为100％、75％、50％、25％、0％的溶液，检测其在最大吸收波长处的光度；以TPP/p53浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；接下来分别检测TPP/p53(6μg/mL)与外泌体1：1混合液在电穿孔前后在上述最大吸收波长处的吸光度；根据标准曲线计算外泌体电穿孔荷载TPP/p53后的溶液中游离的TPP/p53浓度，进而计算出蛋白的荷载量。

动态光散射检测TPP/p53@Exos的流体直径；透射电镜检测TPP/p53@Exos的形态；使用Cy5荧光二抗标记TPP/p53重组蛋白，使用FITC荧光二抗标记外泌体表面的CD63蛋白，荧光显微镜下观察。

2、实验结果

(1)使用动态光散射粒度仪分别检测外泌体样品、空载外泌体样品及TPP/p53@Exos样品的粒径。

如图8所示，外泌体和空载的外泌体粒径具有异质性，大多为30nm左右和150nm左右，而TPP/p53@Exos的粒径均一性较强，介于67nm，这是两次电穿孔导致部分外泌体发生融合导致。

(2)使用透射电镜分别检测外泌体及TPP/p53@Exos样品的形态，如图9所示，外泌体呈球形，直径接近100nm，内部含有少量微粒。TPP/p53@Exos呈球形，直径接近100nm，平均每个外泌体内部含有了6～7个大小均一的球形微粒，这是TPP/p53重组蛋白。

(3)使用p53蛋白抗体作为一抗，对TPP/p53进行Cy5红色荧光标记，同时对外泌体上的CD63蛋白进行FITC绿色荧光标记。如图10所示，荧光显微镜的一个视野中，使用绿色滤光片，可观测到被红色荧光Cy5标记TPP/p53重组蛋白，切换蓝色滤光片，可观测到该区域内被绿色荧光FITC标记的外泌体，从覆盖后的图像中，可以确定TPP/p53成功荷载进入外泌体中。

(4)使用紫外分光光度计测定外泌体与TPP/p53混合液电穿孔前后在213nm处的吸光度。结果如图11所示，根据紫外分光光度计测得电穿孔后后的吸光度与TPP/p53的标准曲线比较可推算出未荷载的剩余TPP/p53含量为初始含量的26.65％，则载入外泌体的TPP/p53含量为初始含量的73.35％，荷载率接近75％。

实施例2 TPP/p53@Exos的细胞摄取与线粒体靶向表征

一、实验方法

通过免疫荧光观察纳米药物递送体系TPP/p53@Exos的细胞摄取和线粒体靶向递送。纯化MCF-7和SK-BR-3分泌的外泌体，分别制备TPP/p53@Exos。将两种细胞来源的TPP/p53@Exos分别作用于MCF-7和SK-BR-3细胞，37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育2h；使用预冷的4％多聚甲醛室温下固定细胞15min；使用TBS三乙醇胺缓冲盐水溶液透膜处理5min；使用CD63一抗(稀释1：100)孵育，标记外泌体，4℃过夜；使用FITC荧光二抗(稀释1：1000)室温下孵育1h；使用DAPI染液(稀释1：1000)室温下孵育细胞10min，染细胞核；使用荧光显微镜观察。

使用Cy5荧光二抗标记TPP/p53重组蛋白，制备

TPP/p53@Exos；将纳米药物递送体系作用于乳腺癌细胞，37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育2h；使用Mito-tracker Green线粒体活性荧光染液(20～200nM)，37℃孵育细胞30min，标记线粒体；荧光显微镜下观察。

使用动态光散射粒度仪检测TPP/p53@Exos样品的粒径

二、实验结果

(1)将两种乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3来源的外泌体mExos和sExos各自作用于两种乳腺癌细胞系2h后使用FITC荧光染料标志外泌体膜上的标志性蛋白CD81，荧光显微镜观察结果如图12所示，，根据MCF-7和SK-BR-3细胞核周围FITC绿色荧光强度可知，外泌体mExos及sExos对其来源的乳腺癌细胞具有更强的亲和性。

(2)使用Cy5红色荧光标记的TPP/p53重组蛋白

TPP/p53，制备

TPP/p53@Exos，孵育两种乳腺癌细胞2h后，使用Mito-tracker Green线粒体活性荧光染料标记线粒体，荧光显微镜观察结果如图13所示，荧光显微镜的一个视野下，红色荧光标记的TPP/p53定位于癌细胞的线粒体处，从而说明TPP/p53@Exos对细胞的线粒体具有良好的靶向效果。

实施例3 TPP/p53@Exos对同源癌细胞的毒性表征

一、实验方法

(1)进行CCK-8实验法检测TPP/p53@Exos对癌细胞的生长抑制作用。按照1×10⁴细胞密度将MCF-7(ER+，PR+，HER2-)细胞接种在96孔板上，过夜孵育；分别将游离p53蛋白、MCF-7来源的空载外泌体mExos、TPP/p53重组蛋白及TPP/p53@mExos纳米药物递送体系(等p53摩尔量，600ng/孔)作用于MCF-7细胞24h；为了检测纳米药物递送体系对同源乳腺癌细胞系的亲和效果，同时以p53突变乳腺癌细胞系SK-BR-3(ER-，PR-，HER2+)为对照，使用TPP/p53@mExos施加相同处理；加入CCK-8细胞活力检测试剂盒工作液孵育，使用酶标仪(ThermoFisher MK3)测定细胞在450nm波长处的吸光度。

(2)采用Fluo-3 AM钙离子探针检测癌细胞内Ca²⁺含量。按照5×10⁵细胞密度分别将MCF-7和SK-BR-3细胞接种到96孔板中，过夜孵育24h；分别将游离p53蛋白、与癌细胞同源的空载外泌体、TPP/p53重组蛋白及与癌细胞同源的TPP/p53@Exos纳米药物(等p53摩尔量，600ng)作用于两种细胞，孵育24h；使用Fluo-3 AM(稀释1：1000)工作液在37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育细胞45min；用多功能酶标仪(EnSpire)检测每孔在激发波长488nm、发射波长525nm处的荧光强度。

(3)进行细胞划痕实验检测TPP/p53@Exos对癌细胞的迁移抑制效果。按照5×10⁵的细胞密度将SK-BR-3细胞接种至6孔板中，过夜孵育；待细胞密度达到80％后，用消毒的牙签在每个孔中划4～5条平行线；洗去悬浮细胞，加入TPP/p53@Exos(p53蛋白含量为600ng)，分别孵育24h和48h；使用光学显微镜观察划痕愈合情况，ImageJ软件分析划痕宽度。

二、实验结果

(1)CCK-8细胞活力检测结果如图14所示，p53野生株MCF-7较p53突变株SK-BR-3受到TPP/p53@mExos更为明显的抑制，TPP/p53@mExos对同源MCF-7细胞的抑制率高达79％，而对非同源SK-BR-3的抑制率为39％，从而说明TPP/p53@Exos体系中外泌体的来源对于癌细胞的杀伤具有关键作用对。

(2)Fluo-3 AM试剂盒检测Ca²⁺浓度如图15所示，TPP/p53@Exos能促使同源MCF-7及SK-BR-3乳腺癌细胞内Ca²⁺含量显著升高，促凋亡效果优于显著游离p53蛋白、TPP/p53重组蛋白及TPP/p53@Exos。

(3)细胞划痕实验检测纳米粒子TPP/p53@Exos对SK-BR-3细胞迁移抑制效果，结果如图16所示，TPP/p53@Exos对SK-BR-3细胞在24h内的迁移抑制率达到50％，48h内抑制率达到59％。

实施例4 TPP/p53@Exos对乳腺癌肿瘤的体内杀伤效果检测

一、实验方法

原位给药28天过程中，每2天记录各组小鼠体重和肿瘤体积。治疗结束后，采用脊椎脱臼法处死小鼠，解剖肿瘤，并进行H&E染色及免疫组化分析，方法如下。

H&E染色：使用Bouin固定液(饱和苦味酸：甲醛：冰醋酸＝12：5：1)将肿瘤组织固定12h；先后使用70％、90％、95％、100％酒精中浸泡3～5min，以脱去组织样品中的水分；再将组织样品置于酒精二甲苯混合液、二甲苯溶液中透明处理各10min；用滤纸吸干组织样品表面的二甲苯，将样品先后置于烘箱中的液体纯蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透蜡处理各1h；将熔蜡倒入大小合适的薄纸盒中，并把组织样品置于熔蜡中进行包埋，将纸盒置于水上，降低温度使熔蜡凝固；使用刀片将蜡块修整成大小合适的正方体，并将其底部熔化固定于金属持蜡器上，使用轮转式切片机进行切片；取洁净载玻片，涂抹蛋白甘油，滴加蒸馏水，并将样品切片置于其上，高温烘烤使蜡片熔化，转移至烘箱中，37℃烘干；使用二甲苯泡15～20min，使用二甲苯酒精混合液浸泡5min；先后使用100％、95％、80％、70％酒精各浸泡2～3min，蒸馏水中浸泡2min；苏木精染料染色15～20min；自来水缓流冲洗15min直至切片变为蓝色，滴加酸性溶液至切片为浅红色，再用自来水冲洗，使切片恢复蓝色；先后使用70％、80％酒精浸泡脱水；使用95％伊红染料染色3～5min；使用二甲苯浸泡3～5min；滤纸吸干切片上的二甲苯，滴加中性树胶，盖上盖玻片封片，烘箱中37℃烘干；使用显微镜观察样品。

免疫组化：肿瘤组织先后经历石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、内源性阻断、抗原恢复，随后使用Bax、Bcl-2、caspase-3和Ki-67多克隆抗体在室温下孵育2h，再由生物素标记的二抗孵育2h。加入辣根过氧化酶-链霉亲和素(HRP-SA)工作液，用于二氨基联苯胺(DAB)显色。随后，使用苏木精将细胞核染色。显微镜成像。

二、实验结果

(1)原位给药治疗的28天过程中，各组小鼠重量正常且无明显差异(图18)，对照组和外泌体处理组的肿瘤体积显著增加，p53和TPP/p53处理组的肿瘤体积增加较小，TPP/p53@tExos处理组的肿瘤体积下降(图17，19)。TPP/p53@tExos的最终肿瘤体积平均为50mm³，是对照组的17倍，体外抑制率为94％。

(2)原位给药28天后，解剖各组小鼠肿瘤进行H&E染色，，经TPP/p53@tExos纳米药物处理的肿瘤细胞凋亡现象更加显著，细胞核出现染色体凝集，染色质染色加深等现象(图20)。

(3)结果如图21所示，TPP/p53@tExos治疗组的肿瘤组织收到了严重破坏，且促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达明显高于控制组，而抑凋亡蛋白Bcl-2和Ki-67的水平明显低于控制组，这表明TPP/53@tExos具有强烈的细胞凋亡诱导能力和肿瘤细胞转移抑制能力。

实施例5 TPP/p53@Exo毒副作用检测

一、实验方法

原位给药28天后，采用脊椎脱臼法处死小鼠，解剖各组小鼠心肝脾肺肾，并进行H&E染色。另外对小鼠血液指标进行检测，具体方法如下：从尾静脉抽取各组小鼠静脉血，加入EDTA-2Na制备抗凝血，测定白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞等的含量和比例等一些列血液学指标。等各项实验结果

(1)如图22所示，正常组，控制组以及TPP/p53@tExos治疗组小鼠之间H&E染色结果显心肝脾肺肾的形态无明显区别，表明纳米粒子不会对心肝脾肺肾造成伤害。

(2)治疗28天后，进一步对正常组、控制组以及TPP/p53@tExos治疗组进行了血常规检测，结果如图23。根据小鼠血液生化检测参考值，可知在正常小鼠、给予生理盐水和TPP/p53@tExos的小鼠之间未发现明显变化。对纳米粒子治疗组的白细胞，血小板，红细胞数量的评估显示，引起炎症反应的白细胞、血小板等数目也在正常范围之内。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含羧基官能团的三苯基膦与人源p53蛋白共价交联，得到重组蛋白TPP/p53，

采用超速离心技术提取外泌体，其中，超速离心技术为0～4℃，100 ,000～150 ,000×g超速离心1 .5～12h；

将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体；

所述癌症为乳腺癌，所述外泌体提取于经紫外光照射刺激的乳腺癌细胞培养上清；

利用电转技术将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体；

其中，所述利用电转技术将制备的重组蛋白TPP/p53转入提取的外泌体具体操作为：

使用电极缓冲液悬浮外泌体，电穿孔处理排空外泌体内部物质，

加入培养基稀释，孵育，

超速离心纯化外泌体，获得空载的外泌体悬液，

空载的外泌体悬液与重组蛋白TPP/p53溶液混合，电穿孔处理；孵育，超速离心纯化，

所述电穿孔处理的条件为施加0.5～1kV电压，持续2～5ms，

所述孵育为30～40℃孵育10～30min，

所述超速离心纯化为0～4℃，100 ,000～150 ,000×g超速离心1 .5～12h；

其中，所述将含羧基官能团的三苯基膦与人源p53蛋白共价交联的方法为：

含羧基官能团的三苯基膦的饱和磷酸盐溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，活化含羧基官能团的三苯基膦的羧基，

加入β-巯基乙醇淬灭EDC，将p53溶液与活化的TPP溶液混合，反应1～4h，纯化，

所述活化三苯基膦的羧基反应时间为10～20min，

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的物质的量的比为4～8:1，

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和三苯基膦的物质的量的比为10～20:1，

p53溶液浓度为0 .2～1mg/mL，

p53溶液与活化的TPP的物质的量的比为1:100～2000，

β-巯基乙醇和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量的比为1～2:1，

β-巯基乙醇溶液与活化的三苯基膦溶液混合，反应3～10min。

2.权利要求1所述制备方法制备得到的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物。

3.权利要求2所述的用于癌症靶向治疗的蛋白类纳米药物在制备癌症靶向治疗试剂中的应用。

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