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CN111893128A - 利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用 - Google Patents

利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用 Download PDF

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CN111893128A
CN111893128A CN202010593876.7A CN202010593876A CN111893128A CN 111893128 A CN111893128 A CN 111893128A CN 202010593876 A CN202010593876 A CN 202010593876A CN 111893128 A CN111893128 A CN 111893128A
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leu
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陈博
李冉
王儒恺
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Wuhan dangkang Xingzhong Biotechnology Co.,Ltd.
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Suzhou Zeyue Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种利用原核转录系统制备重组真核mRNA分子的方法，所述方法的步骤包括：1)表达用于重组真核mRNA转录与加帽过程的所需的酶系统，获得原核体外转录‑加帽酶系统→2)制备线性化转录模板DNA→3)重组mRNA的转录、加帽与纯化。本发明所制备的重组mRNA分子具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征，因此能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。本发明克服了目前重组mRNA领域的缺陷，能够过程简单、成本低廉地生产遗传特征稳定、无载体阻碍效应的重组真核mRNA，满足大规模地工业化生产需求。

Description

利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用原核转录系统制备重组真核mRNA分子。
背景技术
基因的表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA序列中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。其包括两个阶段：基因的转录和基因的翻译。基因的转录指的是以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成信使RNA(mRNA)的过程。基因的翻译指的是mRNA根据三联体密码，按照其序列顺序合成对应的氨基酸序列的过程。由此可见，mRNA在遗传信息流中起着中间体的作用。和DNA、蛋白质一样，mRNA也有着被开发成生物制品的潜力。
相对于DNA和蛋白质，mRNA有着不稳定的特质，重组mRNA技术也没有重组DNA和重组蛋白质技术那么成熟。因此，长期以来，mRNA在实际中没有得到广泛的应用。但是正是由于mRNA在生物体内环境下半衰期短的特点，使得mRNA的生物制品相对于DNA和蛋白质的生物制品有着更高的安全性。最近十年，mRNA的生物制品越来越受到研究者的关注，其在疫苗和药物开发中的应用已证实其有着极具吸引力的优势。
目前重组mRNA技术大致可以分为两类，一类是基于重组RNA病毒载体(比如：甲病毒)，能够使得目的mRNA实现自我复制的技术。但这类技术如果用于疫苗或药物的生产则容易出现以下的缺点。首先，由于RNA聚合酶本身的严谨性较差，RNA病毒基因组在自身复制过程中容易发生突变，使得目的mRNA也有随之发生变异的可能。其次，重组RNA病毒载体在注射到动物体内后有可能引发动物的免疫反应，从而产生载体阻碍效应，使得疫苗或药物的效果大打折扣。另外一类技术是基于体外转录(比如：RNActive技术)。该技术利用线性化的DNA模板，使用体外转录酶反应，从而大量生产mRNA。该技术需要分别使用多步酶反应来完成mRNA的生产，包括DNA模板的线性化、mRNA的转录、5`端加帽和3`端加尾等步骤。因此，容易造成mRNA的不稳定以及生产成本升高。
重组mRNA技术的开发的难度主要在以下几点：1.mRNA的不稳定性。能够分解mRNA的RNA水解酶种类繁多并且量大，在环境中几乎无处不在。大量转录重组mRNA时，其在体外极有可能被RNA酶水解，从而影响mRNA的产量。因此设计合理的生产工艺流程对减少mRNA的损失至关重要。2.原核生物与真核生物在转录和翻译过程中使用不同的机制。诸多原核生物，比如大肠杆菌，常常被用来当做工业化生产重组DNA和重组蛋白质的重要平台，其有着生长快速、成本低以及遗传操作简单等优点。但当使用大肠杆菌来生产重组mRNA时，则需要克服原核生物和真核生物在转录和翻译过程中的不同机制所造成的兼容问题，例如：原核生物产生的mRNA不含有5′端“帽子”结构和3′端Poly(A)序列，而5′端“帽子”结构和3′端Poly(A)序列对mRNA在真核细胞内的稳定性以及后续的翻译过程至关重要。3.目的mRNA的纯化。无论是真核生物还是原核生物在生命活动过程中都需要转录产生各种RNA，包括mRNA、tRNA以及rRNA等。mRNA只占RNA总量的3-5％，而mRNA又是上千种不同基因转录产物的总和。如何提高目的mRNA的含量，以及将目的mRNA从总RNA中纯化出，都存在一定的难度。
目前缺乏适合工业化大生产的重组mRNA制备技术。建立一个操作简单、成本低廉以及生产稳定的重组mRNA制备技术将对mRNA疫苗和药物的开发以及生产带来极大的便利。
发明内容
针对目前技术上的问题，本发明提供了一种新的重组真核mRNA制备方法，利用原核转录系统制备重组真核mRNA。利用本发明的方法，可操作简单、成本低廉地稳定生产重组mRNA，满足工业化大生产的需求。
本发明的另一个目的在于提供了一种基于原核细胞裂解物的体外转录-加帽酶系统的制备方法。使用该体系可在体外制备重组真核mRNA，并使重组真核mRNA含有5′端“帽子”结构。
本发明还有一个目的在于提供一种融合了原核转录元件和真核翻译元件杂合表达框。该表达框可经原核转录系统而制备重组真核mRNA分子，所制备的重组真核mRNA分子还能进一步的被真核生物的翻译系统所识别并利用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法。
所述利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法包括以下步骤：1)表达用于重组真核mRNA转录与加帽过程的所需的酶系统，获得原核体外转录-加帽酶系统→2)制备线性化转录模板DNA→3)重组mRNA的转录、加帽与纯化。
其中，所制备的重组真核mRNA分子具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征，能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。
其中，所述步骤1)是在原核细胞体内同时表达转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞经裂解，制得含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，即原核体外转录-加帽酶系统。
其中，所述步骤2)包括：重组mRNA转录模板质粒的设计→将重组目的mRNA对应的DNA序列克隆至转录模板质粒的多克隆位点处，得到重组mRNA转录模板质粒→将重组模板质粒的线性化，得到线性化转录模板DNA。
其中，所述步骤3)是，将步骤1)所制得的原核体外转录-加帽酶系统和步骤2)所制得的线性化DNA模板混合后反应，在体外条件下反应合成制备出重组目的mRNA分子，再将重组目的mRNA纯化。
其中，所述所述重组mRNA所需的RNA聚合酶可以是任意的RNA聚合酶，包括单亚基的RNA聚合酶，或者多亚基的RNA聚合酶。
优选的，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶为单亚基的RNA聚合酶。
其中，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶至少包括T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、K11RNA聚合酶或N4RNA聚合酶。
优选的，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶采用T7RNA聚合酶。
其中，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统是任意能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构的酶或酶系统。
优选的，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统采用牛痘病毒的mRNA加帽酶系统。
其中，所述重组mRNA转录模板DNA采用线性化的质粒；所述重组mRNA转录模板质粒含有一个融合了原核转录元件和真核翻译元件的杂合表达框，其至少包括以下特征：起始重组mRNA转录的原核启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中的多克隆位点、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、包括30-200个连续的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及紧随其后的质粒线性化位点。
优选的，所述起始重组mRNA转录的原核启动子采用T7启动子，其对应的DNA序列为：5′-TCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG-3′。
优选的，所述5′UTR序列来源于烟草蚀纹病毒，其对应的DNA序列为：5′-AAATAACAAATCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACGAACGGCCACC-3′。
优选的，所述多克隆位点的序列为：5′-ATGGGTACCGTCGACTCTAGACTCGAGGGATCCGAATTCAGCTAGCCTTAA-3′。
优选的，所述3′UTR序列来源于人血红素beta亚基。
优选的，所述3′UTR序列由两段重复的人血红素beta亚基组成；其对应的DNA序列为：5′-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACIAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC-3′。
优选的，所述多聚腺苷酸序列直接由质粒DNA编码。
优选的，所述多聚腺苷酸序列由连续的120个腺苷和紧随其后的一个线性化位点序列组成。
优选的，所述线性化位点选择SapI的识别序列，其序列为：5′-TGCAGAAGAGC-3′。
优选的，所述重组mRNA转录模板质粒命名为pRRNA1，其序列见SEQ ID NO：10。
本发明中，以绿色荧光蛋白(EGFP)为例，进一步阐明所述的将重组目的mRNA对应的DNA序列克隆至转录模板质粒的多克隆位点处的过程，其过程如下：
a、采用EGFP作为目的功能基因，所述EGFP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；
b、用PCR方法，以P1：5′-ATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′；P2：5′-CGAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′为上下游引物，以所述EGFP基因为模板，进行扩增；
c、扩增产物经Nco I和EcoR I双酶切后回收纯化；
d、所述重组mRNA转录模板质粒pRRNA1经Nco I和EcoR I双酶切后回收纯化；
e、将处理纯化后的pRRNA1和EGFP连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞，平板培养；
f、培养测序验证正确的菌落再次培养，之后抽提质粒，真空干燥保存待用，即为重组模板质粒，命名为pRRNA1-EGFP。
其中，所述重组mRNA转录模板质粒的线性化是将所述重组mRNA转录模板质粒经SapI单酶切后回收纯化，即为线性化转录模板DNA。
其中，所述步骤3)中，原核体外转录-加帽酶系统和线性化DNA模板的混合反应体系是：
Figure BDA0002555460450000081
其中，所述步骤3)中，重组mRNA纯化是先提取出总RNA后再通过oligo(dT)特异性地将重组mRNA纯化出来。
进一步地，本发明还提供了一种基于原核细胞裂解物的体外转录-加帽酶系统的制备方法。所述制备方法是在原核细胞体内同时表达转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞经裂解，制得含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，即原核体外转录-加帽酶系统。
进一步地，本发明还提供了一种融合了原核转录元件和真核翻译元件的杂合表达框。所述杂合表达框可经原核转录系统而制备重组真核mRNA分子，所制备的重组真核mRNA分子能进一步地被真核生物的翻译系统所识别并利用；所述杂合表达框至少包括以下部分：起始重组mRNA转录的原核启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中的多克隆位点、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、包括30-200个连续的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及转录终止序列。
进一步地，本发明还提供了一种重组真核mRNA的体外转录-加帽方法。所述方法是将a)原核体外转录-加帽酶系统和b)包含了重组真核mRNA的线性化DNA模板混合后反应，在体外条件下反应合成制备出加帽的重组真核mRNA分子。
在本发明中，表达“原核细胞”和“原核生物”、“真核细胞”和“真核生物”可互换使用。表达“体外转录-加帽酶系统”和“原核细胞裂解物”可互换使用。
本发明首先制备了基于原核细胞裂解物的体外转录-加帽酶系统，在此基础上，以线性化的DNA为模板，体外转录合成出能够被真核生物翻译系统识别并利用的重组mRNA分子。因此，本发明提供了一种新的重组mRNA的制备方法。具体的，本发明在原核细胞体内同时表达了转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞再经一定条件地裂解，从而制得原核体外转录-加帽酶系统。同时，本发明也设计了一个可用于大量复制转录模板DNA的质粒载体。目的mRNA的DNA模板可通过酶切-连接的形式克隆至该载体。还可以通过水解预留在该质粒上的特定酶切位点，进一步获得转录所需的线性化DNA模板。将所制得的原核体外转录-加帽酶系统和线性化的DNA模板按一定的比例混合后，并在一定的条件下反应即可制备出重组目的mRNA分子。随后，经过目的mRNA的富集或纯化等操作，可得最终纯化的重组目的mRNA，并用于后续应用。不同于一般的原核细胞转录的mRNA，该重组mRNA具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征(包括5′端“帽子”结构、翻译起始的Kozak序列和Poly(A)序列等)，因此该重组mRNA分子可以具有真核mRNA的生物学功能。这种制备重组真核mRNA的技术是本发明首次提出。
本发明的技术可以包括但不限于以下特征：1.通过在原核细胞体内表达RNA聚合酶和5′端加帽所需的酶系统来制备体外转录-加帽酶系统。该体外转录-加帽酶系统通过一定的条件下裂解原核细胞而获得。2.通过原核细胞制备转录重组mRNA所需的线性化DNA模板。3.在一定的反应条件下，将体外转录-加帽酶系统与线性化的DNA模板混合后，可制备出重组mRNA分子。
本发明中，用来制备体外转录-加帽酶系统的细胞属于原核生物。原核生物是指一类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物。它包括细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体、支原体、蓝细菌和古细菌等。它是本领域公知的，本领域常常使用一些经基因工程改造过的原核生物作为工程菌，用于生物制品工业化大生产。在本发明中，原核生物可以是任何一种细菌、任何一种放线菌、任何一种立克次氏体、任何一种衣原体、任何一种支原体、任何一种蓝细菌和任何一种古细菌等。原核生物可以是野生型的，也可以是人工改造后的菌株。优选地，本发明中使用大肠杆菌来制备体外转录-加帽酶系统。其它原核生物，如枯草芽孢杆菌，也可用于制备体外转录-加帽酶系统。
本发明中，在制备体外转录-加帽酶系统时，用于表达加帽酶的质粒被称为加帽酶质粒。加帽酶质粒和一般的重组蛋白表达质粒相比，其特征在于其重组表达了与mRNA转录与加帽有关的酶系统，以完成完整的重组mRNA转录与5′端加帽过程。其质粒骨架可以来源于任何一种质粒。加帽酶质粒可以是一个质粒，也可以是一组质粒。在一些实施方案中，所有的转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)被克隆到同一个质粒上。在另一些实施方案中，每个转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)被分别克隆到独立的质粒上。在另一些实施方案中，加帽酶质粒也可以同时表达一些增加mRNA转录量、稳定性以及其他辅助功能的酶或者蛋白。还要一些实施方案中，所选择的原核生物基因组上自带部分转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)基因，则加帽质粒上相应的可以不带有这些基因。还有些实施方案中，转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)全部在原核细胞的基因组上表达，因此没有使用加帽酶质粒。由于这种方案的本质也是额外表达了转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)，可以视为本发明的一种备选方案，等同使用了加帽酶质粒。
在本发明中，作为优选，在表达加帽酶质粒上的转录与加帽过程相关的酶(或酶亚基)基因时，采用了诱导表达技术。使用诱导表达技术只是为了增加RNA聚合酶和5′端加帽所需的酶的表达量。不使用诱导表达技术(即组成型表达)同样也可以制备出体外转录-加帽酶系统。
本发明中，RNA聚合酶，也称转录酶，是以一条DNA链或RNA链为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。它是本领域公知的，本领域熟知存在多种RNA聚合酶，例如在原核生物或真核生物或病毒或线粒体或叶绿体中的RNA聚合酶。本发明的RNA聚合酶可以是任何具有RNA聚合酶功能的酶，可以是任何来源的RNA聚合酶，例如病毒(或噬菌体)中的RNA聚合酶，优选的，是T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、K11RNA聚合酶或N4RNA聚合酶。本发明的RNA聚合酶可以是野生型RNA聚合酶，也可以是具有相同功能的RNA聚合酶的变异体。
在本发明中，优选地，使用DNA链作为RNA聚合酶的模板，以保证遗传信息的稳定。RNA链模板在本发明的系统和方法中仅作为一种备选方案。
在本发明中，优选地，使用单亚基的RNA聚合酶。相对于多亚基的RNA聚合酶，单亚基的RNA聚合酶操作更为简单。多亚基的RNA聚合酶在本发明的系统和方法中仅作为一种备选方案。
本领域的人都知道，启动子是RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列。有些RNA聚合酶具有高度专一性，即其所识别的启动子序列非常保守。例如：T7RNA聚合酶所对应的T7启动子的序列为5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′；T3RNA聚合酶所对应的T3启动子的序列为5′-AATTAACCCTCACTAAAGG-3′；SP6RNA聚合酶所对应的SP6启动子的序列为5′-ATTTAGGTGACACTATAGA-3′。优选地，本发明选择这类有高度专一性的RNA聚合酶用于重组mRNA的转录，同时选用相应的启动子(位于转录模板质粒)。其优势在于可以特异性的只转录目的mRNA，从而增加重组目的mRNA的含量。在本发明中，更为优选地使用T7RNA聚合酶和其对应的启动子序列用于重组mRNA的转录。
原核生物的mRNA与真核生物的mRNA在5′端有着不一样的结构。真核生物mRNA的5′端有着类似“帽子”的结构(m7Gppp(5′)N)，而原核生物的mRNA没有这种结构。5′端帽子结构对mRNA的半衰期以及mRNA在真核细胞内的翻译等过程都有着重要影响。因此，本发明在制备体外转录-加帽酶系统的同时，也利用原核细胞重组表达了mRNA加帽所必须的酶系统。所有的真核生物都拥有完整的mRNA加帽酶系统。这一系列酶反应通常由三步酶反应组成。首先，mRNA 5′三磷酸酶将mRNA 5′端的三磷酸水解成二磷酸；然后在鸟苷酸转移酶的作用下，一磷酸鸟苷(GMP)与mRNA的5′端二磷酸发生缩合，形成类似“帽子”的结构；最后，在甲基转移酶的作用下，5′端最末端上鸟苷酸被甲基化修饰。
在原生动物和真菌中，加帽酶系统通常是三组分的，即由三个酶完成三步酶反应。而在后生动物中，这套加帽酶系统通常是二组分的，即由两个酶完成三步酶反应。部分DNA病毒也编码自己的加帽酶系统。本发明的加帽酶系统可以是任何能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构的酶或酶系统。这样的酶或酶系统，包括各种mRNA加帽酶系统、病毒的戴帽系统(cap-snatching mechanisms)以及其他尚未发现的酶或酶系统。这些酶或酶系统的特征就是能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构。该酶或酶系统可以是任何来源的，例如：真核生物或DNA病毒。也可以是具有相同功能的酶或酶系统的变异体。在优选实施方案中，本发明使用来自于牛痘病毒的mRNA加帽酶系统用于重组mRNA的5′端加帽。
其他任何能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构的酶或酶系统，在本发明中可被认为是加帽酶系统的替代方案。在一些实施方案中，加帽酶系统也可以被病毒的戴帽酶机制(cap-snatching mechanisms)取代。病毒的戴帽酶系统是本领域的人熟知的，由于其和加帽酶系统一样，能够使mRNA的5′端戴上一个“帽子”结构，在本发明中被视为一种备选方案。
本发明的“帽子”结构可以是由一磷酸鸟苷与mRNA的5′端二磷酸缩合而成，也可以是一磷酸鸟苷类似物与mRNA的5′端二磷酸缩合而成，还可以是帽结构类似物(例如：抗-反向帽类似物)与mRNA的5′端二磷酸缩合而成，或者其他能起到mRNA“帽子”功能的分子与mRNA的5′端二磷酸缩合而成。
原核细胞裂解步骤可以是通过任何合适的方法执行，例如通过机械或压力处理的细胞裂解、冻融处理、渗透休克、提取剂或热处理。此类提取方法是本领域众所周知的。裂解原核细胞时，还可以使用一定的裂解缓冲液。裂解缓冲液对提高原核细胞裂解物的保存以及体外转录-加帽反应效率等方面能起到一定的作用。裂解原核细胞时的缓冲液可以是任何合适的配方。
本发明中，用于制备线性化DNA模板的质粒被称为转录模板质粒。转录模板质粒可以包括但不限于以下特征：起始重组mRNA转录的启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、多克隆位点(MCS)，提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、多聚腺苷酸序列(通常30-200个连续的腺苷酸)以及紧随其后的质粒线性化位点。
本发明中，转录模板质粒上起始重组mRNA转录的启动子可以是任何一种启动子。它可以是诱导型的，也可以是组成型的。该启动子的选择由用于转录重组mRNA的RNA聚合酶的序列识别特性决定。
5′UTR序列和3′UTR序列是mRNA的5′端和3′端不被翻译的区域。但是这两段区域直接影响着所转录的mRNA的稳定性和翻译效率。在本发明里，转录模板质粒上5′UTR序列和3′UTR序列是任何能够具有5′UTR序列和3′UTR序列功能的序列，它们可以是任何来源的。
多聚腺苷酸序列(Poly(A)序列)是mRNA的3′端最末端的一连串腺苷酸(A)序列。本领域的人都知道，这段序列对于真核mRNA的稳定和翻译非常重要，其长度影响着真核mRNA的翻译效率。一般情况下其长度为30-200个A。在真核生物细胞内，Poly(A)序列不是由DNA编码的，而是转录后的前mRNA以ATP为前体，由RNA末端腺苷酸转移酶，即Poly(A)聚合酶，催化聚合到3′末端。优选地，在本发明里，Poly(A)尾是直接由重组mRNA转录模板质粒直接编码，其长度可以是30-200碱基，甚至更长。本发明中的Poly(A)序列也可以是由Poly(A)聚合酶催化聚合而成，但其在本发明的系统和方法中仅作为一种备选方案。
在真核细胞内，mRNA的转录不能及时终止将影响后续的蛋白质翻译过程。在原核细胞里，mRNA的终止有两种形式，一类是不依赖于蛋白质辅因子就能实现的终止作用。另一类则依赖蛋白辅因子才能实现的终止作用。但是这两种终止形式都不能保证转录的完全终止。因此，本发明在转录终止位点后设计了线性化位点，线性化后的模板可以使得重组mRNA在转录完成最后一个碱基后完全终止。本发明中，转录模板质粒的线性化可以通过使质粒DNA在转录终止位点发生断裂而获得。这种断裂可以是由限制性内切酶水解而获得，也可以是任何能够水解DNA的酶催化后获得。该位点在转录模板质粒上是唯一的，并且其切割位点紧接着mRNA转录模板的最后一个碱基。在优选的实施方案中，限制性内切酶SapI的识别序列被选择作为转录模板质粒线性化的位点。
转录模板质粒线性化可以在任何合适的条件下进行，不同的DNA水解酶可能有不同的最适反应条件。
重组真核mRNA的体外转录-加帽反应需要在合适的条件下进行。其混合反应体系特征至少包括：原核体外转录-加帽酶系统和线性化DNA模板。混合反应中可以添加一些化合物用以提高体外转录-加帽反应效率，如本领域常用的一些反应助剂、缓冲液等。当然，还有合成扩增所需的ATP、GTP、CTP和UTP。添加这些化合物可被视为本发明的优选实施方案。混合反应体系中原核体外转录-加帽酶系统和线性化模板DNA之间可以以任何合适的比列混合。
重组真核mRNA的体外转录-加帽反应可以在任何合适温度执行，例如16℃-42℃。在一些优选的实施方案中，选择28℃-37℃。
重组真核mRNA的体外转录-加帽反应的时间可以是任何合适的反应时长。不同的重组mRNA长度，不同的RNA聚合酶系统以及不同的原核体外转录-加帽酶系统可以有不同的合适反应时长。
当转录合成出重组目的mRNA后，可采用相应的技术纯化目的mRNA。作为优选，可先提取总RNA后再进一步纯化出重组目的mRNA。提取总RNA的方法是本领域的人熟知的，包括Trizol法、CTAB法等。在本发明中，可以采用任何一种合适的方法提取总RNA。在一些实施方案中，不提取总RNA，直接利用重组目的mRNA的特性将其直接纯化出来也是可以的。
由于原核生物的mRNA没有poly(A)序列。而本发明中，重组mRNA包含一段poly(A)序列。因此，可以利用poly(A)序列与oligo(dT)序列结合的特性，特异的将合成的重组mRNA纯化出来。在有些优选地实施方案中，总RNA先被从转录-加帽反应后体系中提取出来。随后再利用oligo(dT)序列将目的mRNA从总RNA中分离纯化出来。
根据中心法则，指遗传信息从DNA传递给mRNA，再从mRNA传递给蛋白质。因此，DNA、mRNA和蛋白质之间有着对应的关系，这是本领域的人熟知的。制备重组真核mRNA的目的，也是希望其在真核细胞中能够被进一步的翻译成有生物学功能的蛋白质。本发明中，重组目的mRNA可以是任何有生物学功能的蛋白质的对应mRNA，只需将其对应的DNA序列克隆至转录模板质粒的多克隆位点处，然后根据本发明描述的方法，即可制备出重组目的mRNA。
本发明中，重组mRNA最后在真核生物的细胞中应用。真核生物是本领域的人熟知的，是一大类细胞核具有核膜，能进行有丝分裂，细胞之中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的生物。包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界。本发明可以应用于任何一种真核生物。可以是单细胞真核生物，也可以是多细胞真核生物。可以是自然存在的真核生物，也可以是人工改造过的真核生物。可以是人工培养的细胞，也可以是多种细胞组成的复杂生命体。
本发明与现有技术相比，具有显著的优点。
与RNA病毒载体相比，本方法有以下优点：
1.生产成本低。RNA病毒增殖依托于宿主细胞而生长，其生产成本较高。而本方法使用原核生物(比如：大肠杆菌)作为主要生产平台，其生产成本十分低廉。
2.遗传稳定性高。由于RNA病毒普遍有着易于突变的特点，使得插入的外源目的RNA片段易于发生突变。而本方法使用DNA作为遗传信息的载体，使得所转录的重组mRNA有非常高的准确性。
3.没有载体阻碍效应。当所制备的重组mRNA用于疫苗或药物的研发时，RNA病毒载体容易产生载体阻碍效应，从而使得重组mRNA无法发挥作用。而本发明所制备的重组mRNA由于没有载体，因此不会发生载体阻碍效应。
与体外转录技术相比，本方法有以下优点：
1.生产成本低。以目前应用较多的RNActive技术为例，其生产过程使涉及2-3次酶反应过程，包括RNA的转录、5′端加帽和3′端加尾(poly(A)序列)。在有的方案中，还需要使用抗-反向帽类似物。这些步骤都增加了重组mRNA的生产成本。而本发明中，所有的转录-加帽酶全部由原核生物表达，并且一步反应过程可以完成所有的酶反应。因此生产成本更低，操作也更为简单。
2.更适合工业化生产。本发明使用的原核生物，特别是大肠杆菌，已经被广泛应用于生物制品的工业化生产中。其相应的技术参数以及配套设备也易于获得，有利于本技术的推广与应用。
本发明创造性地提出了一种利用原核生物制备重组真核mRNA的方法，所制备的重组mRNA分子能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。本发明克服了目前重组mRNA领域的缺陷，能够过程简单、成本低廉地生产遗传特征稳定、无载体阻碍效应的重组真核mRNA，满足大规模地工业化生产需求。
附图说明
图1是加帽酶质粒p4helpers图谱。
图2是转录模板质粒pRRNA1图谱。
图3是EGFP重组mRNA的功能验证。荧光显微镜下观察HEK-293细胞转染EGFP重组mRNA(A)，转染阴性对照mRNA(B)后的绿色荧光信号。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
制备用于重组mRNA转录与加帽的原核细胞裂解物
实施例1加帽酶质粒的设计
优选地，本发明选择牛痘病毒的加帽酶系统用于重组mRNA的加帽。牛痘病毒加帽酶由两个亚基(D1和D12)组成，具有三种酶活性(D1亚基具有RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶活性；D12亚基具有鸟嘌呤甲基转移酶活性)，所有这些活性都是添加一个完整的帽子结构，即m7Gppp(5′)N所必需的。
优选地，本发明选择T7RNA聚合酶基因用于重组mRNA的转录。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7启动子下游的DNA。因此适合用于转录重组目的mRNA。部分原核细胞，比如大肠杆菌BL21(DE3)，其基因组上含有T7RNA聚合酶基因。因此非常方便后续的操作。如果选用的原核生物不含有高度专一的RNA聚合酶，则可以单独表达一个专一的RNA聚合酶用于转录重组目的mRNA，从而提高目的mRNA的产量。
本发明选用大肠杆菌BL21(DE3)用于制备原核细胞裂解物。虽然BL21(DE3)的基因组含有T7RNA聚合酶基因。但是为了进一步提高目的mRNA的转录水平，在本发明中，加帽酶质粒还表达一个额外的T7RNA聚合酶。同时，优选地，在加帽酶质粒上，还表达了一个来自于牛痘病毒的甲基化酶(vp39)，其可以进一步地增加重组目的mRNA“帽子”结构的甲基化水平。甲基化酶(vp39)和T7RNA聚合酶的表达属于本发明的改进优化，即使不表达这两个酶同样可以达成本发明的目的。
T7RNA聚合酶(T7pol)的核酸序列见SEQ ID NO：1。其对应的氨基酸序列见SEQ IDNO：5。
为了适应大肠杆菌的表达系统，甲基化酶(vp39)、亚基D1和亚基D12的核酸序列在保持对应氨基酸序列不变的前提下分别进行了密码子优化。
甲基化酶(vp39)的核酸序列见：SEQ ID NO：2。VP39对应的氨基酸序列见SEQ IDNO：6
亚基D1的核酸序列见：SEQ ID NO：3。亚基D1对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：7。
亚基D12的核酸序列见：SEQ ID NO：4。亚基D12对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：8。
上述所有基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。随后依次克隆到表达载体pRSFduet-1上。所得的新载体命名为p4helpers，其图谱见图1。该质粒上，d1和d12共用一个T7启动子、vp39和T7pol共用一个T7启动子。p4helpers最终序列见SEQ ID NO：9。
实施例2制备含有重组RNA聚合酶与加帽酶的细胞裂解物
1)重组表达加帽酶的菌株构建
将实施例1中所述的p4helpers转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，即可得到重组表达加帽酶的菌株，命名为CAP4。
2)菌株裂解缓冲液的配制
裂解缓冲液的配制为(均为终浓度)：10mM Tris-Ac pH 7.4、14mM乙酸锰、60mM乙酸钾、1mM DTT、0.5ml/L 2-巯基乙醇。
3)重组加帽酶的诱导表达以及细胞裂解物的制备
将CAP4按照1∶1000的比例接种于含有卡那霉素的液体LB中培养过夜。再取过夜培养的CAP4菌液以1∶100接种到1L新鲜的含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇床上培养3h，使OD600的值达到1。然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃，200rpm进行诱导表达3小时。随后离心收集菌体。
用2)中配制的裂解缓冲液20ml将收集的菌体重悬，然后使用高压均质机将菌体破碎。随后加入终浓度1mM的DTT到菌体裂解物中。4℃离心去除不可溶部分，可溶部分即为含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，可用于后续的实验。
线性化转录模板DNA的制备
实施例3重组mRNA转录模板质粒的设计
作为优选，本发明使用线性化的质粒DNA作为重组mRNA的转录模板。该质粒DNA能够满足克隆并转录各种mRNA的要求，在其多克隆位点处，可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中。随后可通过水解质粒上预留的质粒线性化位点，直接获得线性化的转录模板DNA。
为了提高重组mRNA的稳定性和后续翻译的效率，本发明对质粒DNA序列作为了如下设计：
优选地，本发明选用T7启动子起始重组mRNA的转录，其对应的DNA序列为：5′-TCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGG-3′。
优选地，本发明的重组mRNA的5′UTR区来源于烟草蚀纹病毒，其对应的DNA序列为：5′-AAATAACAAATCTCAACACAACATATACAAAACAAACGAATCTCAAGCAATCAAGCATTCTACTTCTATTGCAGCAATTTAAATCATTTCTTTTAAAGCAAAAGCAATTTTCTGAAAATTTTCACCATTTACGAACGGCCACC-3′。
优选地，本发明设计了一段多克隆位点序列用于重组mRNA对应的DNA的通用克降。该多克降位点的序列为：5′-ATGGGTACCGTCGACTCTAGACTCGAGGGATCCGAATTCAGCTAGCCTTAA-3′。
优选地，本发明的重组mRNA的3′UTR区来源于人血红素beta亚基。更为优选地，由两段重复的人血红素beta亚基组成。其对应的DNA序列为：5′-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC-3′。
优选地，多聚腺苷酸序列直接由质粒DNA编码。更为优选地，本发明使用连续的120个腺苷组成。在连续120个腺苷后紧接着设计了一个限制性内切酶位点用于载体的线性化，作为优选，本发明选择限制性内切酶SapI(5′-GCTCTTC(N)1-3′/3′-CGAGAAG(N)4-5′)，在本发明中的序列为：5′-TGCAGAAGAGC-3′。
本发明选用质粒pUC19作为基本骨架，将上述所有序列按照一定的顺序连接并克隆到pUC19骨架上，所形成的最终质粒命名为pRRNA1，其序列为SEQ ID NO：10，图谱见图2。
实施例4制备线性化绿色荧光蛋白转录模板DNA
1)重组转录绿色荧光蛋白mRNA模板载体的构建
作为优选，本发明使用绿色荧光蛋白(EGFP)作为目的功能基因用于验证本系统。根据EGFP基因序列，设计合成一对引物用于特异性扩增，并在产物两端分别设计了Nco I和EcoR I位点。所述的EGFP基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示。
利用PCR方法，以P15′-ATACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′：P2：5′-CGAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′为上下游引物。以合成的EGFP基因为模板，进行扩增。扩增产物经NcoI和EcoR I双酶切后回收纯化。pRRNA1经Nco I和EcoR I双酶切后回收纯化。将处理好的pRRNA1和EGFP在16℃连接过夜，之后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12-16h。挑取平板上的单菌落，然后进行菌落PCR鉴定和送测序。将测序正确的菌落加入到新鲜的含卡那霉素的LB中，培养过夜，之后抽提质粒，真空干燥保存待用，重组质粒命名为pRRNA1-EGFP。
2)重组模板质粒的线性化
取1μg模板质粒pRRNA1-EGFP，经SapI单酶切后回收纯化，即线性化转录模板DNA。另外，以线性化的空质粒pRRNA1质粒为阴性对照，其余所有操作与线性化的pRRNA1-EGFP相同。
重组mRNA的转录与纯化
实施例5重组mRNA的转录与加帽
按照表1配制反应体系，反应条件为37℃，30分钟。反应结束后，反应体系可-80℃保存备用。
表1转录-加帽反应体系
Figure BDA0002555460450000271
实施例6重组mRNA的纯化
1)总RNA的提取
将实施例5中反应完毕的反应体系中加入20倍体积的Trizol，混匀后静置5分钟。然后以1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。12000g离心10分钟。取上层水相于一新的离心管，按1ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，加入1ml 75％乙醇，涡旋混匀，4℃下12000g离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟。随后加入50μl无RNA酶水溶解后备用。
2)重组目的mRNA的纯化
由于反应体系中包含原核生物的各种RNA(mRNA、rRNA或tRNA等)，重组转录的mRNA需要从总RNA中进一步的纯化。原核生物的RNA没有poly(A)序列，而重组mRNA带有poly(A)序列，因此，可以通过oligo(dT)磁珠特异性的将重组mRNA纯化出来。
结合缓冲液配方(终浓度)：0.5mol/L氯化锂、0.1mol/LTris-HCl(pH 8.0)、0.01mol/L EDTA、1％十二烷基硫酸锂(m/V)、5mM/L DTT。
洗涤缓冲液配方(终浓度)：0.15mol/L氯化锂、0.01mol/LTris-HCl(pH 8.0)、1mM/L EDTA。
将置于EP管中的RNA，用DEPC处理水或10mM/L Tris-HCl(pH 7.5)调整总RNA样品体积为100μl。加入100μl结合缓冲液，溶液在65～70℃加热2～5分钟。立即置于冰上。加入100μl用结合缓冲液重悬的oligo(dT)磁珠。完全混匀并在室温连续旋转5分钟复性。将管子置于磁架1～2分钟收集磁珠。小心并完全去除上清。随后，从磁架上移走管子，用1ml洗涤缓冲液洗涤磁珠3次。最后，加入DEPC处理水或10mM/L Tris-HCl(pH 7.5)75～80℃孵育2分钟，从磁珠上洗脱mRNA。把管子置于磁架上，把含有mRNA的上清迅速转移至一新的无RNA酶的EP管中。-80℃保存备用。
重组mRNA的生物功能验证
实施例7重组mRNA的细胞转染
将HEK-293细胞种植在24孔板中，使其贴壁生长至汇合度30％左右。取1μg(50pmol)的重组mRNA，加入一定量OPTI-MEM，充分混匀，制成mRNA稀释液，终体积为25μl。取1.5μl的Entranster TM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。室温静置5分钟。将Entranster TM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合，室温静置15分钟。转染复合物即制备完成。将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10％血清和抗生素)的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。转染后6小时观察细胞状态，继续培养24-96小时得到结果。
实施例8转染后细胞荧光信号的观察
为了验证重组mRNA在真核细胞内能发挥正常的生物学功能，重组EGFP的mRNA-EGFP被转染进入HEK-293细胞。同时，以实施例4中所述阴性对照为线性DNA模板转录出的重组mRNA，命名为mRNA-CK，作为mRNA-EGFP的阴性对照用于评估荧光信号的背景值。
所有细胞置于倒置荧光显微镜下，EGFP重组mRNA的功能验证，如图3所示，荧光显微镜下观察HEK-293细胞转染EGFP重组mRNA(A)，转染阴性对照mRNA(B)后的绿色荧光信号。也就是说，转入了mRNA-EGFP的HEK-293细胞可见荧光信号(A)，而转入mRNA-CK的HEK-293细胞未见明显荧光(B)。可见，本发明制备的重组真核mRNA-EGFP能够被细胞翻译系统识别并翻译成有正常生物学活性的绿色荧光蛋白。该结果进一步说明了本发明描述的新方法所制备的重组mRNA能够达到预期的技术效果，也就是和真核细胞转录出的mRNA具有相同的功能。
本发明创造性地提出了一种利用原核生物制备重组真核mRNA的方法，所制备的重组mRNA分子能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。本发明克服了目前重组mRNA领域的缺陷，能够过程简单、成本低廉地生产遗传特征稳定、无载体阻碍效应的重组真核mRNA，满足大规模地工业化生产需求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州市泽悦生物技术有限公司
<120> 利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法及其应用
<130> 0
<141> 2020-06-24
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2652
<212> DNA
<213> T7pol
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2652)
<400> 1
atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60
ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120
catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180
gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240
atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300
acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360
accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420
atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480
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gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600
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attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720
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ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840
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tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040
atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100
tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160
aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220
aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280
attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340
aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400
aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460
gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 2
<211> 883
<212> PRT
<213> T7pol
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(883)
<400> 2
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys
65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys
145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp
225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe
385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys
465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
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tggagagatt cttcgcaagc gttgcgctgt gcattgggta actcctgatg gtttccctgt 2280
gtggcaggaa tacaagaagc ctattcagac gcgcttgaac ctgatgttcc tcggtcagtt 2340
ccgcttacag cctaccatta acaccaacaa agatagcgag attgatgcac acaaacagga 2400
gtctggtatc gctcctaact ttgtacacag ccaagacggt agccaccttc gtaagactgt 2460
agtgtgggca cacgagaagt acggaatcga atcttttgca ctgattcacg actccttcgg 2520
taccattccg gctgacgctg cgaacctgtt caaagcagtg cgcgaaacta tggttgacac 2580
atatgagtct tgtgatgtac tggctgattt ctacgaccag ttcgctgacc agttgcacga 2640
gtctcaattg gacaaaatgc cagcacttcc ggctaaaggt aacttgaacc tccgtgacat 2700
cttagagtcg gacttcgcgt tcgcgtaagg atccccatct tagtatatta gttaagtata 2760
agaaggaggt atactaatgg atgttgtgag cctggataaa ccgtttatgt atttcgaaga 2820
gatcgacaac gaactggatt atgaaccgga aagcgcaaat gaagttgcaa aaaaactgcc 2880
gtatcagggt cagctgaaac tgctgctggg tgaactgttt tttctgagca aactgcagcg 2940
tcatggtatt ctggatggtg caaccgttgt ttatattggt agcgcaccgg gtacacatat 3000
tcgttatctg cgtgatcatt tctataatct gggcgtcatt atcaagtgga tgctgattga 3060
tggtcgtcat catgatccga ttctgaatgg cctgcgtgat gttaccctgg ttacccgttt 3120
tgttgatgaa gaatatctgc gcagcatcaa aaaacagctg catccgagca aaattatcct 3180
gattagtgat gttcgtagca aacgcggtgg taatgaaccg agcacagccg atctgctgag 3240
caattatgca ctgcagaatg tgatgattag cattctgaat ccggttgcaa gcagcctgaa 3300
atggcgttgt ccgtttccgg atcagtggat taaagatttc tatattccgc acggcaacaa 3360
aatgctgcag ccgtttgcac cgagctatag cgcagaaatg cgtctgctga gtatttatac 3420
cggtgaaaac atgcgtctga cccgtgttac caaaagtgat gcagttaatt acgagaaaaa 3480
aatgtattac ctgaacaaaa tcgtgcgcaa caaagtggtg gtgaattttg attatccgaa 3540
tcaagagtac gactacttcc acatgtattt catgctgcgt accgtgtatt gcaacaaaac 3600
ctttccgacc accaaagcca aagttctgtt tctgcagcag agtatttttc gctttctgaa 3660
tattccgaca accagcaccg aaaaagttag ccatgaaccg attcagcgta aaatcagcag 3720
caaaaacagc atgagcaaaa accgtaatag caaacgtagc gtgcgtagca acaaataagt 3780
cgacaagctt gcggccgcat aatgcttaag tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg 3840
ccgcataatc gaaattaata cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc 3900
catcttagta tattagttaa gtataagaag gagatataca tatggatgcc aatgttgtta 3960
gcagcagcac cattgcaacc tatattgatg cactggcaaa aaatgcaagc gaactggaac 4020
agcgtagcac cgcgtatgaa attaacaatg agctggaact ggtgttcatt aaaccgcctc 4080
tgattaccct gaccaatgtg gtgaatatta gcaccattca agaaagcttt atccgcttta 4140
ccgtgaccaa caaagaaggt gtgaaaatcc gtaccaaaat tccgctgagc aaagttcatg 4200
gtctggatgt taaaaatgtg cagctggttg atgccattga taatattgtg tgggagaaaa 4260
aaagcctggt gaccgaaaat cgtctgcata aagaatgtct gctgcgtctg agcaccgaag 4320
aacgtcatat ttttctggac tacaaaaaat acggtagcag cattcgtctg gaacttgtta 4380
atctgattca ggccaaaacc aagaacttca ccatcgattt caagctgaaa tactttttag 4440
gtagcggtgc acagagcaaa agcagcctgc tgcatgcaat taatcatccg aaaagccgtc 4500
cgaataccag cctggaaatt gaatttacac cgcgtgataa tgaaaccgtg ccgtatgatg 4560
aactgattaa agaactgacc acactgagcc gtcatatctt tatggcaagt ccggaaaatg 4620
ttattctgag ccctccgatt aatgcaccga ttaaaacctt tatgctgccg aaacaggata 4680
ttgttggcct ggatctggaa aatctgtatg cagttaccaa aaccgatggt attccgatta 4740
ccattcgtgt taccagcaat ggtctgtatt gttatttcac ccatctgggc tatattatcc 4800
gttatccggt gaaacgtatt atcgatagcg aagttgttgt gtttggtgaa gccgtgaaag 4860
ataaaaactg gaccgtgtat ctgatcaaac tgattgaacc ggtgaatgcc attaatgatc 4920
gcctggaaga aagcaaatat gtggaaagca aactggtgga tatttgcgat cgtatcgtgt 4980
tcaaaagcaa aaagtatgaa ggtccgttta ccaccaccag tgaagttgtg gatatgctga 5040
gcacctatct gcctaaacag ccggaaggcg ttattctgtt ttatagcaaa ggtcccaaaa 5100
gcaacatcga ctttaagatc aaaaaagaga acaccattga tcagaccgcg aatgtggttt 5160
ttcgttatat gagcagcgaa ccgattatct ttggtgaaag cagcatcttc gtggaataca 5220
aaaagttcag caacgataaa ggcttcccga aagaatatgg tagcggtaaa attgtgctgt 5280
ataatggcgt gaactacctg aacaacattt actgcctgga atatatcaac acccataacg 5340
aagtgggtat taaaagcgtt gttgtgccga ttaaattcat tgccgaattt ctggtgaatg 5400
gcgaaattct gaaaccgcgt attgacaaaa ccatgaagta tatcaatagc gaggactact 5460
atggcaacca gcataacatt attgttgaac atctgcgtga ccagagcatt aaaatcggcg 5520
atatctttaa cgaggataaa ctgagtgatg tgggtcatca gtatgccaac aatgataaat 5580
ttcgtctgaa tccggaagtg agctacttta ccaataaacg tacccgtggt ccgctgggta 5640
ttctgagtaa ttatgttaaa accctgctga ttagcatgta ctgcagcaaa acctttctgg 5700
atgatagcaa taaacgcaaa gttctggcca ttgattttgg taatggtgca gacctggaaa 5760
aatacttcta tggtgaaatt gcactgctgg tagcaaccga tccggatgca gatgcaattg 5820
cccgtggtaa tgaacgttat aacaaactga atagcggcat caagaccaaa tactacaaat 5880
tcgactacat ccaagaaacc attcgcagcg atacctttgt gagcagcgtt cgtgaagttt 5940
tctatttcgg caaattcaac atcatcgatt ggcagtttgc catccactat agctttcatc 6000
cgcgtcatta tgcaaccgtg atgaataatc tgagcgaact gaccgcaagc ggtggtaaag 6060
tgctgattac cacgatggat ggtgataaac tgtcaaaact gaccgacaaa aagaccttca 6120
tcatccataa aaatctgccg agcagcgaga attatatgtc cgttgaaaaa attgccgatg 6180
atcgcatcgt tgtttataat ccgagcacca tgagcacccc gatgaccgaa tacattatca 6240
aaaaaaacga tattgtgcgc gtgttcaacg aatatggctt tgttctggtt gataacgttg 6300
attttgccac cattattgag cgcagcaaga aattcattaa cggtgcaagc acgatggaag 6360
atcgtccgag cacacgtaac ttttttgaac tgaatcgtgg tgccattaaa tgcgaaggcc 6420
tggatgtaga agatctgctg agctattatg tggtgtatgt gtttagcaaa cgctaacctg 6480
tagaaataat tttgtttaac tttaataagg aggtatacta tggatgagat cgtgaaaaac 6540
attcgtgaag gcacccatgt tctgctgccg ttttatgaaa ccctgccgga actgaatctg 6600
agcctgggta aaagtccgct gccgagcctg gaatatggtg caaactattt tctgcagatt 6660
agccgtgtga atgatctgaa tcgtatgccg accgatatgc tgaaactgtt tacccatgat 6720
attatgctgc cggaaagcga tctggataaa gtgtatgaaa tcctgaaaat caacagcgtg 6780
aaatattacg gtcgtagcac caaagcagat gcagttgttg cagatctgag cgcacgtaat 6840
aaactgttca aacgtgaacg tgatgccatc aaaagcaata atcatctgac cgagaacaac 6900
ctgtatatca gcgattacaa aatgctgacc tttgatgttt ttcgtccgct gtttgatttc 6960
gtgaacgaga aatattgcat catcaaactg ccgacactgt ttggtcgtgg tgttattgat 7020
accatgcgta tttattgcag cctgtttaaa aacgtgcgtc tgctgaaatg tgttagcgat 7080
agctggctga aagatagcgc aattatggtt gcaagtgatg tgtgcaaaaa aaacctggac 7140
ctgtttatga gccatgttaa aagcgttacc aaaagcagca gctggaaaga tgttaatagc 7200
gtgcagttta gcattctgaa taatccggtt gataccgagt ttatcaacaa attcctggaa 7260
ttcagcaacc gtgtttatga agcgctgtat tatgttcata gcctgctgta tagcagcatg 7320
accagcgata gcaaaagcat cgaaaacaaa catcagcgtc gtctggttaa actgctgctg 7380
taaggtaccc tcgagtctgg taaagaaacc gctgctgcga aatttgaacg ccagcacatg 7440
gactcgtcta ctagcgcagc ttaattaacc taggctgctg ccaccgctga gcaataacta 7500
gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa acctcaggca 7560
tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag 7620
acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga caagctgacg accgggtctc 7680
cgcaagtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 7740
acattcaaat atgtatccgc tcatgaatta attcttagaa aaactcatcg agcatcaaat 7800
gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 7860
gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 7920
ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 7980
ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt 8040
tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 8100
tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcggt 8160
cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 8220
gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 8280
tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 8340
tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 8400
cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 8460
acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 8520
ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa 8580
tatggctcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 8640
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggcatg cagcgctctt 8700
ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga gcggtgtcag 8760
ctcactcaaa agcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataaagcc ggaaagaaca 8820
tgtgagcaaa aagcaaagca ccggaagaag ccaacgccgc aggcgttttt ccataggctc 8880
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagcc agaggtggcg aaacccgaca 8940
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 9000
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 9060
catagctcac gctgttggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 9120
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 9180
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgatttaga 9240
ggactttgtc ttgaagttat gcacctgtta aggctaaact gaaagaacag attttggtga 9300
gtgcggtcct ccaacccact taccttggtt caaagagttg gtagctcagc gaaccttgag 9360
aaaaccaccg ttggtagcgg tggtttttct ttatttatga gatgatgaat caatcggtct 9420
atcaagtcaa cgaacagcta ttccgttact ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa 9480
tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata taagttgtaa ttctcatgtt agtcatgccc 9540
cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc 9600
ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 9660
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 9720
ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt 9780
gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag 9840
caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt 9900
atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc 9960
gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc 10020
ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg 10080
ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag 10140
acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc 10200
gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat 10260
gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac 10320
agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc 10380
gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac 10440
caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg 10500
cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag 10560
ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc 10620
ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga 10680
gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa 10740
ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt 10800
gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat taggaaatta atacgactca 10860
ctata 10865
<210> 10
<211> 2777
<212> DNA
<213> pRRNA1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2777)
<400> 10
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60
cgacaggttt tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tataggaaat aacaaatctc 120
aacacaacat atacaaaaca aacgaatctc aagcaatcaa gcattctact tctattgcag 180
caatttaaat catttctttt aaagcaaaag caattttctg aaaattttca ccatttacga 240
acggccacca tgggtaccgt cgactctaga ctcgagggat ccgaattcag ctagccttaa 300
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 360
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 420
tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 480
ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 540
taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatgca gaagagcatc cgcttacaga caagctgtga 720
ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 780
gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 840
agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 900
aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 960
attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 1020
cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 1080
aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 1140
ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 1200
gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 1260
attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 1320
tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 1380
tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 1440
atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 1500
agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 1560
aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 1620
caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 1680
ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 1740
gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 1800
tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 1860
atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 1920
tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 1980
accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 2040
gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 2100
caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 2160
tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 2220
ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 2280
tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 2340
gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 2400
tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 2460
gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 2520
gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 2580
ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 2640
ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 2700
ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 2760
tgagcgagga agcggaa 2777
<210> 11
<211> 720
<212> DNA
<213> EGFP
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(720)
<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims (26)

1.利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法。
2.如权利要求1所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：1)表达用于重组真核mRNA转录与加帽过程所需的酶系统，获得原核体外转录-加帽酶系统→2)制备线性化转录模板DNA→3)重组真核mRNA的转录、加帽与纯化。
3.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所制备的重组真核mRNA分子具备真核生物在蛋白翻译过程中所需的所有mRNA特征，能够进一步被真核翻译系统所识别并利用。
4.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤1)是，在原核细胞体内同时表达转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞经裂解，制得含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，即原核体外转录-加帽酶系统。
5.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤2)包括：重组mRNA转录模板质粒的设计→将重组目的mRNA对应的DNA序列克隆至转录模板质粒的多克隆位点处，得到重组mRNA转录模板质粒→将重组mRNA转录模板质粒线性化，得到线性化转录模板DNA。
6.根据权利要求2所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤3)是，将步骤1)所制得的原核体外转录-加帽酶系统和步骤2)所制得的线性化DNA模板混合后反应，在体外条件下反应合成制备出重组目的mRNA分子，再将重组目的mRNA纯化。
7.根据权利要求4所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶为单亚基的RNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的单亚基RNA聚合酶至少包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶或N4 RNA聚合酶。
9.根据权利要求8所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA所需的RNA聚合酶采用T7 RNA聚合酶。
10.根据权利要求4所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统是任意能够将mRNA的5′端修饰成“帽子”结构或类似“帽子”结构的酶或酶系统。
11.根据权利要求10所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述mRNA 5′端加帽所需的酶系统采用牛痘病毒的mRNA加帽酶系统。
12.根据权利要求5所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA转录模板DNA采用线性化的质粒；所述重组mRNA转录模板质粒含有一个融合了原核转录元件和真核翻译元件的杂合表达框，其至少包括以下特征：起始重组mRNA转录的原核启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中的多克隆位点、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、包括30-200个连续的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及紧随其后的质粒线性化位点。
13.根据权利要求12所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述多克隆位点的序列为：5′-ATGGGTACCGTCGACTCTAGACTCGAGGGATCCGAATTCAGCTAGCCTTAA-3′。
14.根据权利要求12所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述多聚腺苷酸序列直接由质粒DNA编码。
15.根据权利要求12所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述多聚腺苷酸序列由连续的120个腺苷和紧随其后的一个线性化位点序列组成。
16.根据权利要求15所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述线性化位点选择SapI的识别序列，其序列为：5′-TGCAGAAGAGC-3′。
17.根据权利要求12所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA转录模板质粒命名为pRRNA1，其序列见SEQ ID NO：10。
18.根据权利要求5所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述重组mRNA转录模板质粒的线性化是将所述重组mRNA转录模板质粒经SapI单酶切后回收纯化，即为线性化转录模板DNA。
19.根据权利要求6所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述步骤3)中，重组目的mRNA纯化是先提取出总RNA后再通过oligo(dT)特异性地将重组mRNA纯化出来。
20.如权利要求1所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述方法可用于任何一种有生物学功能的真核mRNA的制备。
21.如权利要求1所述的利用原核转录系统制备重组真核mRNA的方法，其特征在于，所述方法制备得到的重组真核mRNA在真核生物的细胞中应用。
22.一种基于原核细胞裂解物的体外转录-加帽酶系统的制备方法。
23.如权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法是在原核细胞体内同时表达转录重组mRNA所需的RNA聚合酶和mRNA 5′端加帽所需的酶系统，表达后的原核细胞经裂解，制得含有重组RNA聚合酶和加帽酶的细胞裂解物，即原核体外转录-加帽酶系统。
24.一种融合了原核转录元件和真核翻译元件的杂合表达框。
25.如权利要求24所述的杂合表达框，其特征在于，所述杂合表达框可经原核转录系统而制备重组真核mRNA分子，所制备的重组真核mRNA分子能进一步地被真核生物的翻译系统所识别并利用；所述杂合表达框至少包括以下部分：起始重组mRNA转录的原核启动子、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的5′UTR序列、可以直接通过酶切-连接的形式将目的mRNA对应的DNA序列插入基因表达框中的多克隆位点、提高真核生物翻译效率以及mRNA稳定性的3′UTR序列、包括30-200个连续的腺苷酸的多聚腺苷酸序列以及转录终止序列。
26.一种重组真核mRNA的体外转录-加帽方法，其特征在于，将a)原核体外转录-加帽酶系统和b)包含了重组真核mRNA的线性化DNA模板混合后反应，在体外条件下反应合成制备出加帽的重组真核mRNA分子。
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