[go: up one dir, main page]

CN111893097A - 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法 - Google Patents

一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111893097A
CN111893097A CN202010545785.6A CN202010545785A CN111893097A CN 111893097 A CN111893097 A CN 111893097A CN 202010545785 A CN202010545785 A CN 202010545785A CN 111893097 A CN111893097 A CN 111893097A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ser
thr
val
asn
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010545785.6A
Other languages
English (en)
Inventor
秦晓峰
吴飞
韦治明
龙丽梅
杨仁祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruifengkang biomedical technology (Zhejiang) Co., Ltd
Original Assignee
Huijun Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huijun Biomedical Technology Hangzhou Co ltd filed Critical Huijun Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Priority to CN202010545785.6A priority Critical patent/CN111893097A/zh
Publication of CN111893097A publication Critical patent/CN111893097A/zh
Priority to CN202110089069.6A priority patent/CN112760297B/zh
Priority to PCT/CN2021/100164 priority patent/WO2021254341A1/zh
Priority to US18/010,885 priority patent/US20230332177A1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/20242—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种冠状病毒假病毒的包装系统，包括Fluc、EGFP双报告基因置换GP基因的水泡性口炎病毒VSV载体、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞，所述双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光素酶报告基因优选Fluc基因；荧光蛋白报告基因优选EGFP基因，所述的装配细胞优选293T。本发明还涉及到该包装系统的一步法包装方法，通过简便、快捷操作可快速包装出单周期感染、低背景值、高滴度、相较于慢病毒介导的假病毒系统具备检测快速的特性，可用于COVID‑19、SARS、MERS等冠状病毒及其他病毒的研究，为抗病毒制剂和疫苗的评价提供了强有力的筛选工具，具备广泛的应用价值。

Description

一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法
技术领域
本发明涉及基因工程和病毒学领域，具体涉及假病毒包装载体及包装系统，所述假病毒包装载体及包装系统用于制备冠状病毒假病毒的一步法包装方法。
背景技术
新冠病毒COVID-19是一种可使人类感染致命肺炎的病毒。除新冠病毒以外，自21世纪初以来，另外两种冠状病毒，即严重的急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）也在人类中造成致命的肺炎。此外，人类中还流行四种低致病性冠状病毒：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV- NL63和HCoV-229E。迄今为止，尚未有任何针对人类感染冠状病毒的疗法或疫苗获得批准。
冠状病毒侵染过程装配细胞是由跨膜刺突（S）糖蛋白介导的，该糖蛋白形成从病毒表面突出的同型三聚体，表面有大量糖基化的修饰。S蛋白包含两个功能亚基，即负责与装配细胞受体结合的S1亚基和与病毒膜及细胞膜融合的S2亚基。冠状病毒侵染易感细胞的过程非常复杂，需要S蛋白的受体结合和蛋白水解过程协同作用以促进病毒-细胞融合。同时，S蛋白三聚体被N-多聚糖修饰，这一修饰对S蛋白正确折叠至关重要，并可调节宿主蛋白酶及中和抗体的可及性。冠状病毒S糖蛋白暴露于病毒表面并介导其侵染过程装配细胞，因此它是感染后中和抗体的潜在靶标，也是预防性疫苗设计的主要靶点，和SARS病毒相比，新冠病毒S蛋白膜外结构域与ACE2的亲和力更强，要高出10-20倍。这种高亲和力，推测可能是新冠病毒更容易发生人传人的原因。已知的假病毒是指一种复制缺陷的病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，形成的具有外源性病毒的包膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒由于核酸分子的缺陷性而只有一个细胞感染周期，因此具有较高的生物安全性，这对研究具有致病率高，传染性强、不易在体外培养的病毒如HIV等提供了一种安全有效的研究方法。体外构建的假病毒还具有稳定性强、宿主嗜性广等优点，因此被广泛应用于病毒装配细胞的筛选、疫苗的研发、中和抗原表位的发现等方面。目前有关COVID-19的基础研究较为薄弱、流行病学调查较少，已有的研究表明通过气溶胶传播的COVID-19传播能力是SARS的十倍以上，因此在非P3实验室操作COVID-19活病毒具有极大的生物安全隐患。包装制备出生物安全性等级较低的COVID-19的假病毒具有重要意义。
发明内容
不能产生传染性子代的假病毒提供了一种安全的模拟野生病毒侵染过程宿主的模式。VSV的组装发生在细胞膜上，涉及从细胞表面出芽的病毒离子。在出芽过程中，VSV获得一个由来自质膜的脂质双层和由VSV糖蛋白（VSV-G）三聚体形成的包膜。当VSV-GP部分或全部被双报告基因置换，外源病毒的包膜蛋白在rVSV-ΔG感染的细胞中充分表达时，外源病毒糖蛋白可以组装到VSV的包膜上。本研究比较了全长COVID-19的S蛋白，截短的C19蛋白以及C末端19aa截短并融合HA（C19-HA）包装的假病毒VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA，发现VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒的感染效率远高于VSVΔG-COVID-19-S，同时也显著优于VSVΔG-COVID-19-S-C19，同时稳定表达人ACE2的293T-hACE2对假病毒感染最敏感，Vero-E6也有中等的感染效率，293T细胞对新冠假病毒不敏感。以VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA和293T-hACE2细胞为基础，建立了中和抗体的检测方法，评价了多种蛋白疫苗免疫的血清中抗体的中和活性。
一种冠状病毒假病毒包装系统，包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换部分或全部GP基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP。
优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述双报告基因包括荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因，所述荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白对应的报告基因；所述荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶对应的报告基因。
优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述荧光蛋白报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，对应基因序列为SEQ ID NO：1；所述荧光素酶报告基因选自密码子优化的萤火虫荧光素酶Fluc基因，所述萤火虫荧光素酶Fluc基因的序列为SEQ ID NO：2。
优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP具有SEQ ID NO：3的基因序列。
优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞选自293T，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，对应的所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。
优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞表达的包膜蛋白对应冠状病毒SARS或MERS或COVID-19中的S基因，所述SARS冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQ ID NO：4序列；所述MERS 冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQ ID NO：5序列；所述COVID-19冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白3’端缺失19个氨基酸后的序列，即SEQ ID NO：6序列,或者所述COVID-19冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸且同时融合HA蛋白后对应的序列，即SEQ ID NO：7序列；所述装配细胞表达的包膜蛋白对应的真核表达载体均选自pCAGGS,且在装配细胞中瞬时表达包膜蛋白的四种质粒分别命名为pCA-SARS-C19、pCA-MERS-C19、pCA-COVID-19-C19以及pCA- COVID-19-C19-HA。优选的，所述S-C19-HA中S的3’端19aa缺失后融合的对象并不限定于HA，还可以是flag、myc、his等其它具备标记功能的肽。
一种假病毒包装系统的一步法包装方法，假病毒包装系统包括dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞，其中所述dVSVΔG-Fluc-EGFP表面装配完整的GP囊膜蛋白且遗传物质中GP基因部分或全部被Fluc、EGFP双报告基因置换，所述冠状病毒刺突蛋白S的表达为pCAGGS介导，所述冠状病毒刺突蛋白S选自S基因的3’端16aa～28aa的截短体，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液得到冠状病毒假病毒。优选的，所述冠状病毒刺突蛋白S选自S基因的3’端19aa的截短体时表现最优。
优选的，一步法包装方法一种假病毒包装系统的一步法包装方法，具体实施步骤如下：
（1）在稳定表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；
（2）将表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mm dish中，利用脂质体LipoLTX转染pCA-COVID-19-C19-HA真核表达质粒,转染12h后，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI=0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养， 24h后收获假病毒上清液，再加入VSV中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到冠状病毒假病毒。
一种其他假病毒包装系统，包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达其他病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换部分或全部GP基因的VSV复制缺陷病毒，所述VSV复制缺陷病毒命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述pCAGGS真核表达包装质粒在装配细胞中表达目的病毒的包膜蛋白，所述pCAGGS真核表达包装质粒细胞水平表达的包膜蛋白选自冠状病毒、疱疹病毒、痘病毒、嗜肝病毒、丝状病毒、棒状病毒、流感病毒、副粘病毒、黄病毒、弹状病毒、副粘病毒、黄病毒、包膜病毒、布尼亚病毒或逆转录病毒的一种病毒或多种病毒。
优选的，所述一种其他假病毒包装系统，所述冠状病毒为COVID-19、SARS、MERS、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV- NL63或HCoV-229E；所述嗜肝病毒为乙肝病毒或丙肝病毒；所述丝状病毒为Ebola病毒；所述弹状病毒为狂犬病毒；所述副粘病毒为麻疹病毒或呼吸道合胞病毒；所述黄病毒为寨卡病毒或登革热病毒。
优选的，所述一种其他假病毒包装系统，包括dVSVΔG-Fluc-EGFP及装配细胞，所述装配细胞选自转染效率高且稳定性佳的293、293T、293sus、HEK293、HEK293T HEK293FT或Vero。即运用本发明涉及的假病毒包装系统可以应用于除本发明详细描述外的其他多种病毒使用，可被广泛推广应用到其他病毒种类的假病毒制备。
利用本发明的包装系统及包装方法可以包装出具有囊膜蛋白的多种病毒的假病毒，这些假病毒可安全、快速、准确用于与病毒一一对应的中和抗体的检测。本发明涉及的冠状病毒假病毒可快速包装出单周期感染、具备低背景值、高滴度的假病毒，相较于慢病毒介导的假病毒系统具备检测快速，操作简便的特性包装系统，且本发明涉及的假病毒包装系统具有通用扩展性，不仅仅限定于文中具体描述的冠状病毒，还可扩展延伸到其他种类的病毒，相对应的假病毒包装系统的一步法包装方法也可适用于其他种类的假病毒一步法包装方法。
附图说明
图1基于dVSVΔG-Fluc-EGFP假病毒构建示意图。
图2 COVID-19/SARS/MERS-S表达质粒构建。
图3 不同S截短体包装的新冠假病毒在不同细胞中感染效率的比较。
图4不同新冠假病毒在293T-hACE2中滴度测定。
图5不同收样时间对不同类型（S基因3’端不同截短体）假病毒滴度的影响。
图6预转染不同量的包膜质粒（pCA-C19-HA）对假病毒滴度的影响。
图7不同细胞中探究刺突蛋白S的转染量对包装新冠假病毒滴度的影响。
图8 dVSVΔG-Fluc-EGFP按照不同的MOI感染293T细胞后荧光报告基因的表达情况。
图9在293T细胞中加入不同MOI的VSV复制缺陷病毒对装配新冠假病毒的效率影响。
图10新冠包膜质粒（ pCA-COVID-19-C19HA ）转染不同时间对包装效率的影响。
图11不同类型的冠状假病毒在不同温度下的包装滴度测定。
图12 VSV载体介导的不同冠状假病毒的稳定性测试，不同温度对冠状病毒假病毒稳定性的影响。
图13 VSV载体介导的不同冠状假病毒的稳定性测试，反复冻融对冠状病毒假病毒稳定性的影响。
图14 dVSVΔG-Fluc-EGFP双报告基因介导的新冠假病毒体系 vs pRV-Fluc（逆转录病毒载体）介导的新冠假病毒体系在4℃保存时间对假病毒稳定性的影响。
图15新冠假病毒-中和抗体效价检测（IC90），293T-hACE2细胞感染-假病毒中和抗体检测。
图16 新冠假病毒-中和抗体效价检测（IC90），假病毒中和抗体-检测Fluc酶活检测。
图17 SARS病毒载体疫苗-中和抗体检测。
图18MERS蛋白疫苗-中和抗体检测。
附图中COVID19代表COVID-19。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本公开做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而非限定，本公开主要是将COVID-19-S、SARS-CoV-S、MERS-S基因或其截短序列整合到表达系统中，进一步通过构建的dVSVΔG-EGFP-FLuc双报告包装系统可整合该囊膜抗原的VSV假病毒，并用于检测相关抗原蛋白在小鼠体内免疫后获得的免疫血清中和抗体生成情况。
本公开采用的试剂及耗材如下：Lipofectamine LTX（Invitrogen 15338100），PBS(Hyclone SH30256.01)，DMEM高糖培养基 (Gibco C11995500)，双抗(Gibco 15140-122)，胎牛血清 (Gibco 10091-148)，Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco 31985-070)，96孔细胞培养板 (Corning 3599)，6孔细胞培养板 (Corning 3516)，6cm细胞培养板（Corning 430166），COVID-19 RBD蛋白（Genescript Biotechnology Ltd Z03485），COVID-19 S1蛋白（Genescript Biotechnology Ltd Z03485），SARS-CoV S RBD蛋白(SinoBiological 40150-V08B2)，MERS-CoV S1蛋白（Sino Biological 40069-V08B1）。
细胞系：
Vero-E6（ATCC、CRL-1586）、293T（ATCC来源）细胞维持在高糖DMEM（SIGMA-ALDRICH）中，并补充10%FBS（Gibco）、青霉素（100 IU/mL），链霉素（100μg/mL），在37℃的5%二氧化碳环境中，每2天传代一次，通过感染表达hACE2的慢病毒72h，经嘌呤霉素抗性筛选，获得293T-hACE2细胞。
抗体制备：
用COVID-19刺突蛋白（RBD/S1）、SARS-CoV S RBD、MERS-CoV S1免疫Balb/c小鼠，按50μg/只，每隔一周免疫一次。初次免疫加入完全佐剂，后续加强免疫加入不完全佐剂，制备COVID-19、SARS-CoV、MERS-CoV刺突蛋白特异性多克隆抗体，并对中和抗体的活性进行鉴定。
不同修饰的包膜表达载体的构建：
分子构建以COVID-19的Spike蛋白（S蛋白）克隆作为重点密码子优化后，分别将S全长序列（1-3822bp）、S缺失C端19个氨基酸序列（1-3765bp）、S缺失C端19个氨基酸序列并加上HA标签（1-3792bp）、S缺失C端27个氨基酸序列（1-3735bp）、S缺失C端53个氨基酸序列（1-3663bp）克隆至pCAGGS载体上，SARS-CoV 和MERS-CoV则选取S缺失C端19个氨基酸作为首选。
实施例1 不同类型包膜质粒的构建：
根据NCBI发布的S基因序列经过密码子优化以便于其在细胞内表达，将序列交由南京金斯瑞生物分别合成至pCDNA3.1载体上，PCR扩增目的基因后，经过片段纯化试剂盒回收纯化目的条带，将该片段和pCAGGS载体用限制性核酸内切酶MCS1(Xhol)和MCS2(Nhel）于37℃酶切3h，胶回收载体和目的片段后进行连接反应，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆及酶切和测序验证鉴定质粒构建情况，具体实施步骤如下：1.引物合成及引物信息：引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其中构建扩增COVID-19-S基因所选PCR引物如表1所示：
表1 COVID-19-S基因扩增与检测引物
Figure RE-233410DEST_PATH_IMAGE002
1.1扩增COVID-19-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表2所示：
表2 COVID-19-S-C19基因扩增
Figure RE-727714DEST_PATH_IMAGE004
1)扩增COVID-19-S-C27基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表3所示：
表3 COVID-19-S-C27基因扩增
Figure RE-54921DEST_PATH_IMAGE006
2)扩增COVID-19-S-C53基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表4所示：
表4 COVID-19-S-C53基因扩增
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE008
3)扩增COVID-19-S-C19HA基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表5所示：
表5 COVID-19-S-C19HA基因扩增
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE010
4)扩增SARS-COV-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表6所示：
表6 SARS-COV-S-C19基因扩增
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE012
5)扩增MERS-CoV-S-C19基因所选PCR引物及菌液PCR引物如表7所示：
表7 MERS-CoV-S-C19基因扩增
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE014
6)目的基因的获取：以带目的基因序列的pCDNA3.1质粒为模板以表表4引物进行PCR扩增；
7)参照AxyPrepTM PCR Cleanup kit 说明书纯化上述酶切产物，用Nano-300测定产物浓度；
8)将上述纯化产物以及载体进行双酶切（37℃酶切3h）；
9)用1% Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物，用Nano-300测定产物浓度；
10)将上述纯化产物与载体进行连接（16℃连接过夜，连接比按1:5进行）；
11)参照E.coli DB3.1 Competent Cells (TaKaRa)说明书转化连接产物；
12)挑取LB（Kana）平板上的单克隆到事先加有200μL LB（Kana）培养基的无菌1.5 mL管中，37℃，250 rpm，培养3h后，进行Colony PCR筛选阳性克隆；
13)经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆按1：500比例转接到15mL摇瓶中，37℃、250rpm摇床培养14-16h；
14)按照TIANGEN无内毒素小提中量试剂盒说明书进行质粒提取；
15)将筛选的阳性质粒进行双酶切鉴定（XhoI和NheI在37℃酶切3 h）；
16)酶切鉴定后，选取其中鉴定正确的质粒进行质粒测序。
所构建的不同类型假病毒PCR产物如图2所示，根据实验结果可知，六个基因进行PCR扩增后在相应位置处均出现特异性条带且条带分子大小均正确，表明成功扩增出目的条带，测序结果也表明质粒构建成功。
实施例2 VSV-COVID-19-S-C19-HA在293T-hACE2细胞上的感染显示出更高的效率：
为获得COVID-19不同截短体的刺突蛋白（S）的VSV假病毒，质粒pCAGGS- COVID-19-S、pCAGGS-COVID-19-S-C19、pCAGGS-COVID-19-S-C19-HA、pCAGGS- COVID-19-S-C27、pCAGGS-COVID-19-S-C53分别通过脂质体（lipo2000）转染包装293T）细胞。转染12小时后，将dVSVΔG-Fluc-EGFP（实验室制备保存）即VSV复制缺陷的病毒株分别接种到表达COVID-19完整刺突蛋白或COVID-19-S-C19/C27/C53/C19-HA截短蛋白的细胞对应的培养基中（真核表达质粒提前瞬转12h），收集上清液，加入抗VSV-G的中和血清，阻断细胞上清液残留dVSVΔG-Fluc-EGFP的感染性，收获得到子代病毒，得到病毒表面携带COVID-19不同修饰的刺突蛋白的假病毒，在dVSVΔG-FLuc-EGFP-GP感染后24h、48h、72h收集上清液，然后离心和过滤（0.45μm孔径， Millipore）以去除细胞碎片，并在-80°C下长期储存。用梯度稀释计数293T-hACE2假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度（单位TU/ml）。
如图3～5所示，通过VSV介导的新冠病毒假病毒的感染效率进行比较发现，全长的S包装出的假病毒感染效率非常低（EGFP和Fluc双报告基因检测），表明新冠病毒全长S不适合作为新冠病毒假病毒的包装，而截短的S-C19-HA假病毒比S-C19的感染效率提高了1倍左右，尽管S-C19也可以包装出较高滴度的假病毒，但是在S-C19的3’端融合一个非功能性的标签蛋白（其他短肽亦适用）可以进一步提高包装出的新冠病毒假病毒的滴度，提示融合的短肽发挥了稳定冠状病毒S的空间结构，进一步实验发现MERS或者SARS-S-C19HA的包装滴度显著高于对照组（S基因C端缺失19氨基酸）。
进一步测试 293T-hACE2（稳定高表达的hACE2）细胞对新冠假病毒的敏感性，首先在 293细胞和BHK21细胞，新冠假病毒几乎不能感染（图3），在稳定表达hACE2受体蛋白的细胞系中，新冠假病毒近乎全部感染（荧光显微镜下每个细胞都表达绿色荧光）。进一步在上述一步法包装系统，获得的VSV-COVID-19-S-C19-HA（简写S-C19-HA）假病毒包装滴度是VSV-COVID-19-S全长组的4000倍左右，同样S-C19-HA比VSV-COVID-19-S-C27（简写S-C27）组高15倍。同时新冠病假毒滴度随着收集次数（24h、48h、72h各收集一次）的增加而下降，尤其是第三次收集的上清（72h）中新冠假病毒较低，主要原因是细胞状态不佳以及长时间培养后培养基中pH值的改变导致（图4、图5），若采取持续灌流培养技术进行补液可以解决上述问题。
实施例3 在293T细胞中包装的dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒的滴度最高
新冠假病毒的包装效率的问题是体外进行高通量检测中和抗体试验的主要限制因素之一。为了选择最适合产生新冠假型病毒的细胞系，通过将不同的细胞系预铺在6孔细胞培养板中，在本技术中比较了Vero-E6、BHK21、293T-hACE2和293等常规细胞，首选在上述不同的细胞系中分别转染不同浓度的质粒，然后参照下述的一步法包装方法进行dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA新冠假病毒包装，具体实施步骤如下：
1)Vero/BHK21/293T /293T-hACE2细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70%左右为宜；
2)pCAGGS-S/pCAGGS-S-C19/pCAGGS-S-C19-HA/pCAGGS-S-C27/pCAGGS-S-C53/pCAGGS-VSVG(阳性包膜质粒)分别取0ug、0.25ug、0.5ug、1ug、2ug稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；
3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；
4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5%CO2培养6h后更换成完全培养基；
5)细胞培养12h后按MOI=1加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；
6)病毒感染24h、48h、72h各收集一次病毒上清液，按每1mL病毒液加入1ul抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；
7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度（单位TU/ml）；
8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；
9)根据假病毒包装滴度确定最适的包装用细胞类型。
统计结果表明，293T-hACE2在包装过程中产生了较为强烈的细胞融合（图6），其他几种细胞则较为少见，并且病毒滴度随着转染质粒量的增加而逐步提高，转染2μg时包装得到的假病毒滴度最高，但是高浓度的质粒也对细胞的状态产生影响（过量的S蛋白聚集对细胞产生一定的毒性），标准的TCID50（Karber法）统计结果显示dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒滴度最高（图7），同时得出在24h收集的包装上清液中含有约每毫升5E5个有效的病毒颗粒。
实施例4一步式假病毒包装方法中，VSV复制缺陷病毒的起始接毒量（MOI）对新冠假病毒产量的影响：
为了进一步提升包装系统获得更高的假病毒包装滴度，进一步测试了VSV复制缺陷病毒（dVSVΔG-Fluc-EGFP）的起始接毒量，首先按不同MOI感染293T装配细胞（稳定表达COVID-S-C19-HA蛋白），感染24h后收取病毒液，测定病毒滴度，具体实施步骤如下：
1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70%左右为宜；
2)取pCAGGS-S-C19-HA质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；
3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；
4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5%CO2培养6h后更换成完全培养基；
5)细胞培养12h后按MOI=0、0.01、0.1、0.5、1、2、5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；
6)病毒感染24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1μL抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；
7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度（单位TU/mL）；
8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；
9)根据假病毒包装滴度确定最适的包装用细胞类型。
结果表明，随着加入的dVSVΔG-Fluc-EGFP复制缺陷病毒MOI值的升高，细胞感染逐步增强（图8），且收获的新冠假病毒滴度逐渐升高，当起始MOI=1后包装得到的新冠假病毒滴度逐步进入平台期（图9），因此起始感染复数MOI可以控制在0.1～5的区间，最佳选自MOI=1。
实施例5 预转染冠状病毒包膜表达质粒的时间对包装假病毒滴度的影响
在冠状病毒假病毒包装系统中，冠状病毒包膜质粒的预转染时间也是影响假病毒滴度的另一个因素，进一步测试包膜真核表达质粒的预转染时间对假病毒滴度的影响，第一步在质粒转染12h、24h后按MOI=1感染dVSVΔG-Fluc-EGFP复制缺陷病毒，24h后收取病毒液，并测定包装出的假病毒滴度，具体实施步骤如下：
1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70%左右为宜；
2)取pCAGGS-S-C19-HA质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；
3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；
4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5%CO2培养6h后更换成完全培养基；
5)细胞分别培养12h、24h后按最适MOI=1的条件加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；
6)病毒感染24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1μL抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；
7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算新冠假病毒的滴度（单位TU/mL）；
8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况。
结果表明，在包膜质粒预转染12h时，假病毒滴度略高于转染24h时的病毒滴度（图10），当预转染时间持续延长后，发现收毒时细胞状态较差，培养基pH改变影响细胞产毒，因此最适预转染时间在12h,同时，瞬时表达系统的最优预转染时间在12h附近，当采取TetOn诱导表达冠状病毒S蛋白时，需要提前12h加入诱导剂，诱导细胞稳定表达包膜蛋白，之后再加入VSV复制缺陷病毒进行冠状病毒假病毒的包装。
实施例6 培养温度对不同包膜改良的假病毒的产毒滴度的影响：
病毒包装时的温度可以影响细胞状态，也会影响培养基pH的变化，对某些病毒的稳定性也会造成巨大的影响，因而进一步检测了假病毒包装的关键因素，即装配细胞的培养温度，具体实施步骤如下：
1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70%左右为宜；
2)取pCAGGS-COVID-19-C19-HA、pCAGGS-SARS-CoV-C19、pCAGGS-MERS-CoV-C19、VSVG质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；
3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；
4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5%CO2培养6h后更换成完全培养基；
5)细胞培养12h后按MOI=0.5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；
6)将感染后的细胞分别放置在37℃、35℃、32℃培养箱中培养24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1μL抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；
7)梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目，测算假病毒的滴度（单位TU/mL）；
8)病毒感染48h后观察EGFP荧光表达情况；
结果表明，对于新冠假病毒而言，温度能够极大的影响病毒滴度，随着温度的降低，病毒滴度逐步升高，在包装新冠假病毒时，最适培养装配细胞的温度是32℃，而SARS、MERS、VSV复制缺陷假病毒则在35℃时就能获得较为理想的病毒载量（图11）。
实施例7 不同包膜修饰型的新冠假病毒稳定性测试：
已知包装出的假病毒的原液滴度和稳定性是影响病毒长期储存和病毒载量的重要因素，将基于VSV复制缺陷载体包装出的新冠假病毒和RV（逆转录病毒载体系统）体系包装出的新冠假病毒滴度和储存稳定性进行平行对比实验，具体实施步骤如下：
1)293T细胞铺6孔板，以24h后细胞密度在70%左右为宜；
2)取pCAGGS-COVID-19-C19-HA、质粒1μg稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；取pCAGGS-COVID-19-C19-HA 1ug、pcgp 1.5ug、pRV 2ug稀释于100ul opti-MEM并混匀，Lipofectamine LTX稀释于100ul opti-MEM并混匀（质粒：转染试剂=1：3）；
3)将质粒稀释液与Lipofectamine LTX稀释液缓慢混匀，混匀后室温静置20min；
4)将完全培养基更换成opti-MEM，将混合液加入到培养基中轻轻混匀，37℃，5%CO2培养6h后更换成完全培养基；
5)VSV型假病毒在细胞培养12h后按MOI=0.5加入dVSVΔG-Fluc-EGFP病毒感染细胞；
6)VSV型假病毒将感染后的细胞分别放置在37℃培养箱中培养24h收集病毒上清液，按每1mL病毒液加入1抗VSVG血清并放置于细胞培养箱中孵育2h；
7)VSV包装的新冠假病毒反复冻融0次、1次、2次、3次，以及病毒原液储存至4℃、-20℃、-80℃ 3d、7d，梯度稀释后感染293T-hACE2细胞，计算假病毒感染后EGFP阳性的细胞数目(VSV假病毒体系)；pRV包装得到的新冠假病毒则在感染后36h收取样本，完毕后储存在4℃、-80℃不同时间，然后根据TCID50（Karber法）计算病毒滴度。
结果表明，如图12～图14所示，四种假病毒在冻融3次后病毒滴度变化较小，保存在4℃、-20℃、-80℃的新冠滴度在第7天时滴度影响不大，由pRV系统介导的新冠假病毒滴度较低并且保存时间较短，不适合大规模检测使用，同时起始病毒滴度低会影响病毒长久储存的稳定性，而基于VSV系统一步法包装得到的dVSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒起始滴度6E5pfu/ml，高于pRV系统的假病毒近100倍，同时在4℃放置7天时间仍保持滴度的稳定性。
实施例8 基于假病毒的中和抗体检测
预先在96孔板中的接种293T-hACE2细胞，通过眼眶静脉取血的方式，收集小鼠血清，分别用DMEM完全培养基进行稀释，然后按照2倍的梯度稀释，分别与dVSV-COVID-19-S-C19-HA病毒（6000TU）、dVSV-SARS-CoV-S-C19（500TU）、dVSV-MERS-CoV-S-C19（500TU）进行混合，37℃孵育2h，用10%FBS-DMEM重悬病毒和抗体的混合物，将混合物添加到293T-hACE2待检测的细胞悬液中。培养48h后，用荧光拍照设备（Nikon显微镜）拍照获得绿色荧光图像。为了定量检测，测定Fluc报告基因的冷萤光读值，计算出抗体的中和效价。
为了验证包制备的假病毒能否通过中和实验进行抗体中和活性的检测，利用制备的COVID-19、SARS-CoV、MERS-CoV抗血清进行假病毒中和实验验证，具体操作步骤如下：
1)293T-hACE2细胞铺96孔板，以24h后细胞在70%左右；
2)将血清进行梯度稀释后与等体积的假病毒混合，设置复孔，同时设置未与血清混合的假病毒对照和只加培养基的空白细胞对照；
3)于37℃，5%CO2培养箱中放置2h；
4)将上一步中的血清-假病毒混合液接种至96孔板中，37℃，5%CO2培养48h；
5)拍照及计算检测萤火虫荧光素酶活性（FLuc）；
根据结果可知（如图15～图18），利用本专利涉及的包装SARS或MERS的假病毒分别用来检测不同类型的疫苗产生的具备病毒中和效力的抗体，由图16可知本次S1蛋白疫苗的血清IC50为56.9；RBD 蛋白疫苗IC50为68.35（定义为血清样本稀释68.35倍后可以有效组织E3的病毒粒子的感染），新冠假病毒系统使用的是COVID-19-S-C19-HA，对照组背景值很低，同时不同稀释度的稳定性高。在本实施例中，设计路线参照附图1所示的方法，利用dVSVΔG-Fluc-EGFP一步法包装假病毒的技术，持续开发出SARS-CoV和MERS-CoV假病毒，如图17、18所示，利用上述已操作技术包装的SARS假病毒和MERS假病毒分别检测了候选疫苗产生的中和抗体的活性，SARS病毒载体疫苗免疫小鼠血清中的IC50约为864.3(图17)，在本技术方案中，SARS假病毒使用的是dVSVΔG-Fluc-EGFP-SARS-C19,使用293T-hACE2细胞来检测中和抗体的活性，与新冠中和抗体的测定方法一致，同时进一步分析发现，SARS疫苗免疫的血清与新冠假病毒没有明显的交叉反应，在下一个技术方案中，基于VSV的MERS假病毒也成功建立（如图1），基于dVSVΔG-Fluc-EGFP-MERS-C19假病毒，在293T-CD26（稳定表达受体蛋白）细胞中检测MERS蛋白疫苗的中和抗体的效价，统计结果计算出蛋白疫苗免疫后小鼠血清的中和抗体IC50数值约为1338（图18），无论是SARS还是MERS的假病毒在本实施例中，都展现了极佳的置信区间，同时对照血清检测得到的本底Fluc数值趋于平行线，表明了两个假病毒进行中和抗体活性检测的稳定性和可重复性，与VSV介导的新冠假病毒的结论一致，同时基于dVSVΔG-Fluc-EGFP包装系统开发的SARS和MERS的假病毒都保持了较高的生物学滴度（ SARS假病毒滴度为8E6pfu/ml，MERS假病毒滴度约为7E6 pfu/ml），滴度显著高于新冠假病毒，而稳定性与其他冠状假病毒保持一致，进一步推断dVSVΔG-Fluc-EGFP包装系统可适用于开发已知的其他冠状病毒假病毒。
序列表
<110> 苏州奥特铭医药科技有限公司
<120> 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法
<130> 2020
<141> 2020-06-16
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 2
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atggaagatg ccaagaacat caagaaaggc cctgccccct tctaccccct ggaagatggc 60
acagccggcg agcagctgca caaggccatg aagagatacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gccttcaccg acgcccacat cgaggtggac atcacctacg ccgagtattt cgagatgagc 180
gtgcggctgg ccgaggccat gaaacgctac ggcctgaaca ccaaccaccg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga acagcctgca gttcttcatg cccgtgctgg gcgccctgtt catcggcgtg 300
gccgtggccc ctgccaacga catctacaac gagcgggagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtggtgtt cgtgagcaag aagggcctgc agaaaatcct gaacgtgcag 420
aagaagctgc ccatcatcca gaaaatcatc atcatggaca gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccagagca tgtacacctt cgtgaccagc cacctgcccc ctggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaag accatcgccc tgatcatgaa cagcagcggc 600
agcaccggcc tgcctaaagg cgtggccctg cctcaccgga ccgcctgcgt gcggttcagc 660
cacgcccggg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgccat cctgagcgtg 720
gtgcccttcc accacggctt cggcatgttc accaccctgg gctacctgat ctgcggcttc 780
cgggtggtgc tgatgtaccg gttcgaggaa gagctgttcc tgcggagcct gcaggactac 840
aagatccaga gcgccctgct ggtgcccacc ctgttcagct ttttcgccaa gagcaccctg 900
atcgacaagt acgacctgag caacctgcac gagatcgcca gcggcggagc ccccctgtcc 960
aaagaagtgg gcgaagccgt cgccaagcgg ttccacctgc ccggcatccg gcagggctat 1020
ggcctgaccg agaccacaag cgccattctg atcacccccg agggcgacga caagcctggc 1080
gccgtgggca aggtggtgcc tttcttcgag gccaaggtgg tggacctgga caccggcaag 1140
accctgggcg tgaaccagcg gggcgagctg tgcgtgaggg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgtgaaca accccgaggc caccaacgcc ctgattgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaagt acaagggcta ccaggtggcc ccagccgagc tggaaagcat cctgctgcag 1380
caccccaaca tcttcgatgc cggggtggcc ggactgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440
cctgccgccg tggtggtgct ggaacacggc aaaaccatga ccgagaaaga aatcgtggac 1500
tacgtggcca gccaggtgac caccgccaag aaactgagag gcggcgtggt gtttgtggac 1560
gaggtgccca agggcctgac aggcaagctg gacgcccgga agatccggga gatcctgatc 1620
aaggccaaga agggcggcaa gggcggcggc ggcagctaa 1659
<210> 3
<211> 15443
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tttaattttt atgaaaaaaa ctaacagcaa tcatggaagt ccacgatttt gagaccgacg 60
agttcaatga tttcaatgaa gatgactatg ccacaagaga attcctgaat cccgatgagc 120
gcatgacgta cttgaatcat gctgattaca acctgaattc tcctctaatt agtgatgata 180
ttgacaattt aatcaggaaa ttcaattctc ttccaattcc ctcgatgtgg gatagtaaga 240
actgggatgg agttcttgag atgttaacgt catgtcaagc caatcccatc ccaacatctc 300
agatgcataa atggatggga agttggttaa tgtctgataa tcatgatgcc agtcaagggt 360
atagtttttt acatgaagtg gacaaagagg cagaaataac atttgacgtg gtggagacct 420
tcatccgcgg ctggggcaac aaaccaattg aatacatcaa aaaggaaaga tggactgact 480
cattcaaaat tctcgcttat ttgtgtcaaa agtttttgga cttacacaag ttgacattaa 540
tcttaaatgc tgtctctgag gtggaattgc tcaacttggc gaggactttc aaaggcaaag 600
tcagaagaag ttctcatgga acgaacatat gcaggattag ggttcccagc ttgggtccta 660
cttttatttc agaaggatgg gcttacttca agaaacttga tattctaatg gaccgaaact 720
ttctgttaat ggtcaaagat gtgattatag ggaggatgca aacggtgcta tccatggtat 780
gtagaataga caacctgttc tcagagcaag acatcttctc ccttctaaat atctacagaa 840
ttggagataa aattgtggag aggcagggaa atttttctta tgacttgatt aaaatggtgg 900
aaccgatatg caacttgaag ctgatgaaat tagcaagaga atcaaggcct ttagtcccac 960
aattccctca ttttgaaaat catatcaaga cttctgttga tgaaggggca aaaattgacc 1020
gaggtataag attcctccat gatcagataa tgagtgtgaa aacagtggat ctcacactgg 1080
tgatttatgg atcgttcaga cattggggtc atccttttat agattattac actggactag 1140
aaaaattaca ttcccaagta accatgaaga aagatattga tgtgtcatat gcaaaagcac 1200
ttgcaagtga tttagctcgg attgttctat ttcaacagtt caatgatcat aaaaagtggt 1260
tcgtgaatgg agacttgctc cctcatgatc atccctttaa aagtcatgtt aaagaaaata 1320
catggcccac agctgctcaa gttcaagatt ttggagataa atggcatgaa cttccgctga 1380
ttaaatgttt tgaaataccc gacttactag acccatcgat aatatactct gacaaaagtc 1440
attcaatgaa taggtcagag gtgttgaaac atgtccgaat gaatccgaac actcctatcc 1500
ctagtaaaaa ggtgttgcag actatgttgg acacaaaggc taccaattgg aaagaatttc 1560
ttaaagagat tgatgagaag ggcttagatg atgatgatct aattattggt cttaaaggaa 1620
aggagaggga actgaagttg gcaggtagat ttttctccct aatgtcttgg aaattgcgag 1680
aatactttgt aattaccgaa tatttgataa agactcattt cgtccctatg tttaaaggcc 1740
tgacaatggc ggacgatcta actgcagtca ttaaaaagat gttagattcc tcatccggcc 1800
aaggattgaa gtcatatgag gcaatttgca tagccaatca cattgattac gaaaaatgga 1860
ataaccacca aaggaagtta tcaaacggcc cagtgttccg agttatgggc cagttcttag 1920
gttatccatc cttaatcgag agaactcatg aattttttga gaaaagtctt atatactaca 1980
atggaagacc agacttgatg cgtgttcaca acaacacact gatcaattca acctcccaac 2040
gagtttgttg gcaaggacaa gagggtggac tggaaggtct acggcaaaaa ggatggagta 2100
tcctcaatct actggttatt caaagagagg ctaaaatcag aaacactgct gtcaaagtct 2160
tggcacaagg tgataatcaa gttatttgca cacagtataa aacgaagaaa tcgagaaacg 2220
ttgtagaatt acagggtgct ctcaatcaaa tggtttctaa taatgagaaa attatgactg 2280
caatcaaaat agggacaggg aagttaggac ttttgataaa tgacgatgag actatgcaat 2340
ctgcagatta cttgaattat ggaaaaatac cgattttccg tggagtgatt agagggttag 2400
agaccaagag atggtcacga gtgacttgtg tcaccaatga ccaaataccc acttgtgcta 2460
atataatgag ctcagtttcc acaaatgctc tcaccgtagc tcattttgct gagaacccaa 2520
tcaatgccat gatacagtac aattattttg ggacatttgc tagactcttg ttgatgatgc 2580
atgatcctgc tcttcgtcaa tcattgtatg aagttcaaga taagataccg ggcttgcaca 2640
gttctacttt caaatacgcc atgttgtatt tggacccttc cattggagga gtgtcgggca 2700
tgtctttgtc caggtttttg attagagcct tcccagatcc cgtaacagaa agtctctcat 2760
tctggagatt catccatgta catgctcgaa gtgagcatct gaaggagatg agtgcagtat 2820
ttggaaaccc cgagatagcc aagtttcgaa taactcacat agacaagcta gtagaagatc 2880
caacctctct gaacatcgct atgggaatga gtccagcgaa cttgttaaag actgaggtta 2940
aaaaatgctt aatcgaatca agacaaacca tcaggaacca ggtgattaag gatgcaacca 3000
tatatttgta tcatgaagag gatcggctca gaagtttctt atggtcaata aatcctctgt 3060
tccctagatt tttaagtgaa ttcaaatcag gcactttttt gggagtcgca gacgggctca 3120
tcagtctatt tcaaaattct cgtactattc ggaactcctt taagaaaaag tatcataggg 3180
aattggatga tttgattgtg aggagtgagg tatcctcttt gacacattta gggaaacttc 3240
atttgagaag gggatcatgt aaaatgtgga catgttcagc tactcatgct gacacattaa 3300
gatacaaatc ctggggccgt acagttattg ggacaactgt accccatcca ttagaaatgt 3360
tgggtccaca acatcgaaaa gagactcctt gtgcaccatg taacacatca gggttcaatt 3420
atgtttctgt gcattgtcca gacgggatcc atgacgtctt tagttcacgg ggaccattgc 3480
ctgcttatct agggtctaaa acatctgaat ctacatctat tttgcagcct tgggaaaggg 3540
aaagcaaagt cccactgatt aaaagagcta cacgtcttag agatgctatc tcttggtttg 3600
ttgaacccga ctctaaacta gcaatgacta tactttctaa catccactct ttaacaggcg 3660
aagaatggac caaaaggcag catgggttca aaagaacagg gtctgccctt cataggtttt 3720
cgacatctcg gatgagccat ggtgggttcg catctcagag cactgcagca ttgaccaggt 3780
tgatggcaac tacagacacc atgagggatc tgggagatca gaatttcgac tttttattcc 3840
aagcaacgtt gctctatgct caaattacca ccactgttgc aagagacgga tggatcacca 3900
gttgtacaga tcattatcat attgcctgta agtcctgttt gagacccata gaagagatca 3960
ccctggactc aagtatggac tacacgcccc cagatgtatc ccatgtgctg aagacatgga 4020
ggaatgggga aggttcgtgg ggacaagaga taaaacagat ctatccttta gaagggaatt 4080
ggaagaattt agcacctgct gagcaatcct atcaagtcgg cggatgtata ggttttctat 4140
atggagactt ggcgtataga aaatctactc atgccgagga cagttctcta tttcctctat 4200
ctatacaagg tcgtattaga ggtcgaggtt tcttaaaagg gttgctagac ggattaatga 4260
gagcaagttg ctgccaagta atacaccgga gaagtctggc tcatttgaag aggccggcca 4320
acgcagtgta cggaggtttg atttacttga ttgataaatt gagtgtatca cctccattcc 4380
tttctcttac tagatcagga cctattagag acgaattaga aacgattccc cacaagatcc 4440
caacctccta tccgacaagc aaccgtgata tgggggtgat tgtcagaaat tacttcaaat 4500
accaatgccg tctaattgaa aagggaaaat acagatcaca ttattcacaa ttatggttat 4560
tctcagatgt cttatccata gacttcattg gaccattctc tatttccacc accctcttgc 4620
aaatcctata caagccattt ttatctggga aagataagaa tgagttgaga gagctggcaa 4680
atctttcttc attgctaaga tcaggagagg ggtgggaaga catacatgtg aaattcttca 4740
ccaaggacat attattgtgt ccagaggaaa tcagacatgc ttgcaagttc gggattgcta 4800
aggataataa taaagacatg agctatcccc cttggggaag ggaatccaga gggacaatta 4860
caacaatccc tgtttattat acgaccaccc cttacccaaa gatgctagag atgcctccaa 4920
gaatccaaaa tcccctgctg tccggaatca ggttgggcca attaccaact ggcgctcatt 4980
ataaaattcg gagtatatta catggaatgg gaatccatta cagggacttc ttgagttgtg 5040
gagacggctc cggagggatg actgctgcat tactacgaga aaatgtgcat agcagaggaa 5100
tattcaatag tctgttagaa ttatcagggt cagtcatgcg aggcgcctct cctgagcccc 5160
ccagtgccct agaaacttta ggaggagata aatcgagatg tgtaaatggt gaaacatgtt 5220
gggaatatcc atctgactta tgtgacccaa ggacttggga ctatttcctc cgactcaaag 5280
caggcttggg gcttcaaatt gatttaattg taatggatat ggaagtgcgg gattcttcta 5340
ctagcctgaa aattgagacg aatgttagaa attatgtgca ccggattttg gatgagcaag 5400
gagttttaat ctacaagact tatggaacat atatttgtga gagcgaaaag aatgcagtaa 5460
caatccttgg tcccatgttc aagacggtcg acttagttca aacagaattt agtagttctc 5520
aaacgtctga agtatatatg gtatgtaaag gtttgaagaa attaatcgat gaacccaatc 5580
ccgattggtc ttccatcaat gaatcctgga aaaacctgta cgcattccag tcatcagaac 5640
aggaatttgc cagagcaaag aaggttagta catactttac cttgacaggt attccctccc 5700
aattcattcc tgatcctttt gtaaacattg agactatgct acaaatattc ggagtaccca 5760
cgggtgtgtc tcatgcggct gccttaaaat catctgatag acctgcagat ttattgacca 5820
ttagcctttt ttatatggcg attatatcgt attataacat caatcatatc agagtaggac 5880
cgatacctcc gaacccccca tcagatggaa ttgcacaaaa tgtggggatc gctataactg 5940
gtataagctt ttggctgagt ttgatggaga aagacattcc actatatcaa cagtgtttag 6000
cagttatcca gcaatcattc ccgattaggt gggaggctgt ttcagtaaaa ggaggataca 6060
agcagaagtg gagtactaga ggtgatgggc tcccaaaaga tacccgaatt tcagactcct 6120
tggccccaat cgggaactgg atcagatctc tggaattggt ccgaaaccaa gttcgtctaa 6180
atccattcaa tgagatcttg ttcaatcagc tatgtcgtac agtggataat catttgaaat 6240
ggtcaaattt gcgaagaaac acaggaatga ttgaatggat caatagacga atttcaaaag 6300
aagaccggtc tatactgatg ttgaagagtg acctacacga ggaaaactct tggagagatt 6360
aaaaaatcat gaggagactc caaactttaa gtatgaaaaa aactttgatc cttaagaccc 6420
tcttgtggtt tttatttttt atctggtttt gtggtcttcg tgggtcggca tggcatctcc 6480
acctcctcgc ggtccgacct gggcatccga aggaggacgt cgtccactcg gatggctaag 6540
ggaggggccc ccgcggggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 6600
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 6660
tgctgaaagg aggaactata tccggatcga gacctcgata ctagtattgc gttgcgctca 6720
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 6780
gcggggagag gcggtttgcg tagagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa 6840
accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc 6900
atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg 6960
acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag 7020
cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc 7080
ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg 7140
ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta 7200
acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc 7260
agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc 7320
gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa tcccccttac 7380
acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg ctttatcaga 7440
agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga acaggcagac 7500
atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct cgcgcgtttc 7560
ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 7620
taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 7680
cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg 7740
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 7800
gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 7860
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 7920
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 7980
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 8040
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 8100
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 8160
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 8220
ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 8280
ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 8340
acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 8400
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 8460
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 8520
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 8580
gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 8640
ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 8700
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 8760
ggtctgacag ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 8820
gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 8880
ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 8940
caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 9000
gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt 9060
caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca 9120
ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa 9180
caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg 9240
aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc agggatcgca gtggtgagta 9300
accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg 9360
tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat 9420
gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg 9480
attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat 9540
ttaatcgcgg cctagagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcatactc ttcctttttc 9600
aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 9660
tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgcga 9720
tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 9780
ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa 9840
ttgtaatacg actcactata ggacgaagac aaacaaacca ttattatcat taaaaggctc 9900
aggagaaact ttaacagtaa tcaaaatgtc tgttacagtc aagagaatca ttgacaacac 9960
agtcgtagtt ccaaaacttc ctgcaaatga ggatccagtg gaatacccgg cagattactt 10020
cagaaaatca aaggagattc ctctttacat caatactaca aaaagtttgt cagatctaag 10080
aggatatgtc taccaaggcc tcaaatccgg aaatgtatca atcatacatg tcaacagcta 10140
cttgtatgga gcattaaagg acatccgggg taagttggat aaagattggt caagtttcgg 10200
aataaacatc gggaaagcag gggatacaat cggaatattt gaccttgtat ccttgaaagc 10260
cctggacggc gtacttccag atggagtatc ggatgcttcc agaaccagcg cagatgacaa 10320
atggttgcct ttgtatctac ttggcttata cagagtgggc agaacacaaa tgcctgaata 10380
cagaaaaaag ctcatggatg ggctgacaaa tcaatgcaaa atgatcaatg aacagtttga 10440
acctcttgtg ccagaaggtc gtgacatttt tgatgtgtgg ggaaatgaca gtaattacac 10500
aaaaattgtc gctgcagtgg acatgttctt ccacatgttc aaaaaacatg aatgtgcctc 10560
gttcagatac ggaactattg tttccagatt caaagattgt gctgcattgg caacatttgg 10620
acacctctgc aaaataaccg gaatgtctac agaagatgta acgacctgga tcttgaaccg 10680
agaagttgca gatgaaatgg tccaaatgat gcttccaggc caagaaattg acaaggccga 10740
ttcatacatg ccttatttga tcgactttgg attgtcttct aagtctccat attcttccgt 10800
caaaaaccct gccttccact tctgggggca attgacagct cttctgctca gatccaccag 10860
agcaaggaat gcccgacagc ctgatgacat tgagtataca tctcttacta cagcaggttt 10920
gttgtacgct tatgcagtag gatcctctgc cgacttggca caacagtttt gtgttggaga 10980
taacaaatac actccagatg atagtaccgg aggattgacg actaatgcac cgccacaagg 11040
cagagatgtg gtcgaatggc tcggatggtt tgaagatcaa aacagaaaac cgactcctga 11100
tatgatgcag tatgcgaaaa gagcagtcat gtcactgcaa ggcctaagag agaagacaat 11160
tggcaagtat gctaagtcag aatttgacaa atgaccctat aattctcaga tcacctatta 11220
tatattatgc tacatatgaa aaaaactaac agatatcatg gataatctca caaaagttcg 11280
tgagtatctc aagtcctatt ctcgtctgga tcaggcggta ggagagatag atgagatcga 11340
agcacaacga gctgaaaagt ccaattatga gttgttccaa gaggatggag tggaagagca 11400
tactaagccc tcttattttc aggcagcaga tgattctgac acagaatctg aaccagaaat 11460
tgaagacaat caaggcttgt atgcaccaga tccagaagct gagcaagttg aaggctttat 11520
acaggggcct ttagatgact atgcagatga ggaagtggat gttgtattta cttcggactg 11580
gaaacagcct gagcttgaat ctgacgagca tggaaagacc ttacggttga catcgccaga 11640
gggtttaagt ggagagcaga aatcccagtg gctttcgacg attaaagcag tcgtgcaaag 11700
tgccaaatac tggaatctgg cagagtgcac atttgaagca tcgggagaag gggtcattat 11760
gaaggagcgc cagataactc cggatgtata taaggtcact ccagtgatga acacacatcc 11820
gtcccaatca gaagcagtat cagatgtttg gtctctctca aagacatcca tgactttcca 11880
acccaagaaa gcaagtcttc agcctctcac catatccttg gatgaattgt tctcatctag 11940
aggagagttc atctctgtcg gaggtgacgg acgaatgtct cataaagagg ccatcctgct 12000
cggcctgaga tacaaaaagt tgtacaatca ggcgagagtc aaatattctc tgtagactat 12060
gaaaaaaagt aacagatatc acgatctaag tgttatccca atccattcat catgagttcc 12120
ttaaagaaga ttctcggtct gaaggggaaa ggtaagaaat ctaagaaatt agggatcgca 12180
ccaccccctt atgaagagga cactagcatg gagtatgctc cgagcgctcc aattgacaaa 12240
tcctattttg gagttgacga gatggacacc tatgatccga atcaattaag atatgagaaa 12300
ttcttcttta cagtgaaaat gacggttaga tctaatcgtc cgttcagaac atactcagat 12360
gtggcagccg ctgtatccca ttgggatcac atgtacatcg gaatggcagg gaaacgtccc 12420
ttctacaaaa tcttggcttt tttgggttct tctaatctaa aggccactcc agcggtattg 12480
gcagatcaag gtcaaccaga gtatcacgct cactgcgaag gcagggctta tttgccacat 12540
aggatgggga agacccctcc catgctcaat gtaccagagc acttcagaag accattcaat 12600
ataggtcttt acaagggaac gattgagctc acaatgacca tctacgatga tgagtcactg 12660
gaagcagctc ctatgatctg ggatcatttc aattcttcca aattttctga tttcagagag 12720
aaggccttaa tgtttggcct gattgtcgag aaaaaggcat ctggagcgtg ggtcctggac 12780
tctatcggcc acttcaaatg agctagtcta acttctagct tctgaacaat ccccggttta 12840
ctcagtctcc cctaattcca gcctctcgaa caactaatat cctgtctttt ctatccctat 12900
gaaaaaaact aacagagatc gatctgttta cgcgtcacta tggaagatgc caagaacatc 12960
aagaaaggcc ctgccccctt ctaccccctg gaagatggca cagccggcga gcagctgcac 13020
aaggccatga agagatacgc cctggtgccc ggcaccatcg ccttcaccga cgcccacatc 13080
gaggtggaca tcacctacgc cgagtatttc gagatgagcg tgcggctggc cgaggccatg 13140
aaacgctacg gcctgaacac caaccaccgg atcgtggtgt gcagcgagaa cagcctgcag 13200
ttcttcatgc ccgtgctggg cgccctgttc atcggcgtgg ccgtggcccc tgccaacgac 13260
atctacaacg agcgggagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtggtgttc 13320
gtgagcaaga agggcctgca gaaaatcctg aacgtgcaga agaagctgcc catcatccag 13380
aaaatcatca tcatggacag caagaccgac taccagggct tccagagcat gtacaccttc 13440
gtgaccagcc acctgccccc tggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac 13500
cgggacaaga ccatcgccct gatcatgaac agcagcggca gcaccggcct gcctaaaggc 13560
gtggccctgc ctcaccggac cgcctgcgtg cggttcagcc acgcccggga ccccatcttc 13620
ggcaaccaga tcatccccga caccgccatc ctgagcgtgg tgcccttcca ccacggcttc 13680
ggcatgttca ccaccctggg ctacctgatc tgcggcttcc gggtggtgct gatgtaccgg 13740
ttcgaggaag agctgttcct gcggagcctg caggactaca agatccagag cgccctgctg 13800
gtgcccaccc tgttcagctt tttcgccaag agcaccctga tcgacaagta cgacctgagc 13860
aacctgcacg agatcgccag cggcggagcc cccctgtcca aagaagtggg cgaagccgtc 13920
gccaagcggt tccacctgcc cggcatccgg cagggctatg gcctgaccga gaccacaagc 13980
gccattctga tcacccccga gggcgacgac aagcctggcg ccgtgggcaa ggtggtgcct 14040
ttcttcgagg ccaaggtggt ggacctggac accggcaaga ccctgggcgt gaaccagcgg 14100
ggcgagctgt gcgtgagggg ccccatgatc atgagcggct acgtgaacaa ccccgaggcc 14160
accaacgccc tgattgacaa ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac 14220
gaggacgagc acttcttcat cgtggaccgg ctgaagagcc tgatcaagta caagggctac 14280
caggtggccc cagccgagct ggaaagcatc ctgctgcagc accccaacat cttcgatgcc 14340
ggggtggccg gactgcccga cgacgatgcc ggcgagctgc ctgccgccgt ggtggtgctg 14400
gaacacggca aaaccatgac cgagaaagaa atcgtggact acgtggccag ccaggtgacc 14460
accgccaaga aactgagagg cggcgtggtg tttgtggacg aggtgcccaa gggcctgaca 14520
ggcaagctgg acgcccggaa gatccgggag atcctgatca aggccaagaa gggcggcaag 14580
ggcggcggcg gcagctaact caaatcctgc taggtatgaa aaaaactaac agatatcacg 14640
ctcgagatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 14700
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 14760
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 14820
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 14880
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 14940
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 15000
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 15060
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 15120
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 15180
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 15240
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 15300
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 15360
aagtaagcta gccagattct tcatgtttgg accaaatcaa cttgtgatac catgctcaaa 15420
gaggcctcaa ttatatttga gtt 15443
<210> 4
<211> 1236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1 5 10 15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
20 25 30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
35 40 45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val
65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
85 90 95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
115 120 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
130 135 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145 150 155 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
195 200 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225 230 235 240
Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
435 440 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
450 455 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465 470 475 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
515 520 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
530 535 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545 550 555 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
565 570 575
Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
580 585 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
595 600 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
610 615 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625 630 635 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
645 650 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
660 665 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
675 680 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
690 695 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
725 730 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
740 745 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
755 760 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
770 775 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785 790 795 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
805 810 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
820 825 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
835 840 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
850 855 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865 870 875 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
885 890 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
900 905 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
915 920 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
930 935 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945 950 955 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
965 970 975
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
980 985 990
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
995 1000 1005
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe
1010 1015 1020
Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025 1030 1035 1040
Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn
1045 1050 1055
Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro
1060 1065 1070
Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln
1075 1080 1085
Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val
1090 1095 1100
Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr
1105 1110 1115 1120
Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys
1125 1130 1135
Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser
1140 1145 1150
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
1155 1160 1165
Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
1170 1175 1180
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu
1185 1190 1195 1200
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Met Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu
1205 1210 1215
Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys
1220 1225 1230
Gly Ser Cys Cys
1235
<210> 5
<211> 1334
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu
1 5 10 15
Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu
20 25 30
Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile
35 40 45
Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr
50 55 60
Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp
65 70 75 80
His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr
85 90 95
Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe
100 105 110
Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly
115 120 125
Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr
130 135 140
Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys
145 150 155 160
Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys
165 170 175
Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly
180 185 190
Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His
195 200 205
Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser
210 215 220
Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met
225 230 235 240
Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile
245 250 255
Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp
260 265 270
Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp
275 280 285
Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln
290 295 300
Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro
305 310 315 320
Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala
325 330 335
Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu
340 345 350
Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala
355 360 365
Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp
370 375 380
Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys
385 390 395 400
Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser
405 410 415
Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala
420 425 430
Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr
435 440 445
Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile
450 455 460
Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile
465 470 475 480
Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys
485 490 495
Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr
500 505 510
Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser
515 520 525
Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln
530 535 540
Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr
545 550 555 560
Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln
565 570 575
Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn
580 585 590
Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr Ser Leu
595 600 605
Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala Val Gly
610 615 620
Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu Val Gly
625 630 635 640
Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Tyr Tyr Cys Leu Arg Ala Cys Val Ser
645 650 655
Val Pro Val Ser Val Ile Tyr Asp Lys Glu Thr Lys Thr His Ala Thr
660 665 670
Leu Phe Gly Ser Val Ala Cys Glu His Ile Ser Ser Thr Met Ser Gln
675 680 685
Tyr Ser Arg Ser Thr Arg Ser Met Leu Lys Arg Arg Asp Ser Thr Tyr
690 695 700
Gly Pro Leu Gln Thr Pro Val Gly Cys Val Leu Gly Leu Val Asn Ser
705 710 715 720
Ser Leu Phe Val Glu Asp Cys Lys Leu Pro Leu Gly Gln Ser Leu Cys
725 730 735
Ala Leu Pro Asp Thr Pro Ser Thr Leu Thr Pro Arg Ser Val Arg Ser
740 745 750
Val Pro Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile
755 760 765
Gln Val Asp Gln Leu Asn Ser Ser Tyr Phe Lys Leu Ser Ile Pro Thr
770 775 780
Asn Phe Ser Phe Gly Val Thr Gln Glu Tyr Ile Gln Thr Thr Ile Gln
785 790 795 800
Lys Val Thr Val Asp Cys Lys Gln Tyr Val Cys Asn Gly Phe Gln Lys
805 810 815
Cys Glu Gln Leu Leu Arg Glu Tyr Gly Gln Phe Cys Ser Lys Ile Asn
820 825 830
Gln Ala Leu His Gly Ala Asn Leu Arg Gln Asp Asp Ser Val Arg Asn
835 840 845
Leu Phe Ala Ser Val Lys Ser Ser Gln Ser Ser Pro Ile Ile Pro Gly
850 855 860
Phe Gly Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Val Ser Ile Ser
865 870 875 880
Thr Gly Ser Arg Ser Ala Arg Ser Ala Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asp
885 890 895
Lys Val Thr Ile Ala Asp Pro Gly Tyr Met Gln Gly Tyr Asp Asp Cys
900 905 910
Met Gln Gln Gly Pro Ala Ser Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Tyr
915 920 925
Val Ala Gly Tyr Lys Val Leu Pro Pro Leu Met Asp Val Asn Met Glu
930 935 940
Ala Ala Tyr Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ser Ile Ala Gly Val Gly Trp
945 950 955 960
Thr Ala Gly Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ile Pro Phe Ala Gln Ser Ile
965 970 975
Phe Tyr Arg Leu Asn Gly Val Gly Ile Thr Gln Gln Val Leu Ser Glu
980 985 990
Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Lys Phe Asn Gln Ala Leu Gly Ala Met
995 1000 1005
Gln Thr Gly Phe Thr Thr Thr Asn Glu Ala Phe Gln Lys Val Gln Asp
1010 1015 1020
Ala Val Asn Asn Asn Ala Gln Ala Leu Ser Lys Leu Ala Ser Glu Leu
1025 1030 1035 1040
Ser Asn Thr Phe Gly Ala Ile Ser Ala Ser Ile Gly Asp Ile Ile Gln
1045 1050 1055
Arg Leu Asp Val Leu Glu Gln Asp Ala Gln Ile Asp Arg Leu Ile Asn
1060 1065 1070
Gly Arg Leu Thr Thr Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Gln Leu Val Arg
1075 1080 1085
Ser Glu Ser Ala Ala Leu Ser Ala Gln Leu Ala Lys Asp Lys Val Asn
1090 1095 1100
Glu Cys Val Lys Ala Gln Ser Lys Arg Ser Gly Phe Cys Gly Gln Gly
1105 1110 1115 1120
Thr His Ile Val Ser Phe Val Val Asn Ala Pro Asn Gly Leu Tyr Phe
1125 1130 1135
Met His Val Gly Tyr Tyr Pro Ser Asn His Ile Glu Val Val Ser Ala
1140 1145 1150
Tyr Gly Leu Cys Asp Ala Ala Asn Pro Thr Asn Cys Ile Ala Pro Val
1155 1160 1165
Asn Gly Tyr Phe Ile Lys Thr Asn Asn Thr Arg Ile Val Asp Glu Trp
1170 1175 1180
Ser Tyr Thr Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Ile Thr Ser Leu
1185 1190 1195 1200
Asn Thr Lys Tyr Val Ala Pro Gln Val Thr Tyr Gln Asn Ile Ser Thr
1205 1210 1215
Asn Leu Pro Pro Pro Leu Leu Gly Asn Ser Thr Gly Ile Asp Phe Gln
1220 1225 1230
Asp Glu Leu Asp Glu Phe Phe Lys Asn Val Ser Thr Ser Ile Pro Asn
1235 1240 1245
Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ile Asn Thr Thr Leu Leu Asp Leu Thr Tyr
1250 1255 1260
Glu Met Leu Ser Leu Gln Gln Val Val Lys Ala Leu Asn Glu Ser Tyr
1265 1270 1275 1280
Ile Asp Leu Lys Glu Leu Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Lys Trp Pro
1285 1290 1295
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Val Ala Leu Ala Leu
1300 1305 1310
Cys Val Phe Phe Ile Leu Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Asn Cys Met
1315 1320 1325
Gly Lys Leu Lys Cys Asn
1330
<210> 6
<211> 1254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys
1250
<210> 7
<211> 1263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1250 1255 1260
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ctagctagct taggtgtagt gcagcttcac 30
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ctagctagct taacagcagc ttccacaaga aca 33
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ctagctagct tagcccttca ggcaggaaca gcag 34
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ctagctagct tagaagccca gccagatgta cc 32
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ccgctcgaga tgttcgtgtt tctggtg 27
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ctagctagct taggcataat ctggcacatc ataagggtaa cagcagcttc cacaagaaca 60
gca 63
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ccgctcgaga tgttcatctt tctgctgttc 30
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ctagctagct taacagcaag atccacagga gca 33
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
ccgctcgaga tgatacactc agtgtttc 28
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
ctagctagct taattacact taagttttcc c 31

Claims (5)

1.一种冠状病毒假病毒包装系统，其特征在于：包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述冠状病毒为SARS、MERS或COVID-19病毒，所述刺突蛋白S的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换结构基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述VSV的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的基因序列为SEQ ID NO：3所示。
2.如权利要求1所述一种冠状病毒假病毒包装系统, 其特征在于：所述装配细胞选自293、293T、293sus、HEK293、HEK293T、HEK293FT或Vero，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。
3.一种假病毒包装系统的一步法包装方法，其特征在于：假病毒包装系统包括权利要求1或2中所述的冠状病毒假病毒包装系统，所述冠状病毒刺突蛋白S的表达为pCAGGS介导，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液得到冠状病毒假病毒。
4.如权利要求3所述一种假病毒包装系统的一步法包装方法，具体实施步骤如下：
（1）在稳定表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；
（2）将表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mm dish中，利用脂质体LipoLTX转染真核表达质粒，转染12h后，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI=0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h后收获假病毒上清液，再加入抗VSV的中和抗体处理2h，用0.22um滤膜过滤后即可得到冠状病毒假病毒。
5.权利要求1或2中所述假病毒包装系统包装出的假病毒用于中和抗体效价的检测。
CN202010545785.6A 2020-06-16 2020-06-16 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法 Pending CN111893097A (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010545785.6A CN111893097A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法
CN202110089069.6A CN112760297B (zh) 2020-06-16 2021-01-22 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
PCT/CN2021/100164 WO2021254341A1 (zh) 2020-06-16 2021-06-15 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
US18/010,885 US20230332177A1 (en) 2020-06-16 2021-06-15 Coronavirus pseudovirus packaging system, packaging method therefor, and application of coronavirus pseudovirus in evaluating disinfection efficacy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010545785.6A CN111893097A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111893097A true CN111893097A (zh) 2020-11-06

Family

ID=73206778

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010545785.6A Pending CN111893097A (zh) 2020-06-16 2020-06-16 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法
CN202110089069.6A Active CN112760297B (zh) 2020-06-16 2021-01-22 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110089069.6A Active CN112760297B (zh) 2020-06-16 2021-01-22 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230332177A1 (zh)
CN (2) CN111893097A (zh)
WO (1) WO2021254341A1 (zh)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN112442514A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 云舟生物科技（广州）有限公司 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
CN112553172A (zh) * 2021-02-19 2021-03-26 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途
CN112626035A (zh) * 2020-12-03 2021-04-09 中国科学院微生物研究所 一种新冠肺炎疫苗以及疫苗套件
CN112646787A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 武汉生物工程学院 一种以痘苗病毒天坛株为载体的新冠疫苗及其构建方法
CN112724209A (zh) * 2021-01-18 2021-04-30 广东华南疫苗股份有限公司 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用
CN113559254A (zh) * 2021-08-09 2021-10-29 苏州大学 一种狂犬病毒疫苗及其制备方法
CN113621651A (zh) * 2021-07-19 2021-11-09 南昌五元生物科技有限公司 一种基于s-tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法
CN113621646A (zh) * 2021-08-10 2021-11-09 杭州医学院 一种新型冠状病毒侵染细胞的筛选系统及其应用
CN113717990A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 武汉大学 一种基于双报告基因的新型水泡性口炎假病毒系统及其应用
WO2021254341A1 (zh) * 2020-06-16 2021-12-23 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
WO2021254327A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN113957097A (zh) * 2021-09-27 2022-01-21 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN114807292A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 西安交通大学 一种基于荧光素酶的新冠病毒膜融合抑制剂筛选方法
CN114913920A (zh) * 2022-07-19 2022-08-16 中科南京生命健康高等研究院 双报告基因假病毒检测系统的建立与应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113430228A (zh) * 2021-05-26 2021-09-24 中核同辐（长春）辐射技术有限公司 用于检测消毒灭菌的生物指示剂的制备与检测方法
CN114015725B (zh) * 2021-10-18 2024-04-26 重庆医科大学 一种新冠病毒SARS-CoV-2完整病毒颗粒的检测方法
CN115594742A (zh) * 2021-07-09 2023-01-13 复旦大学（Cn） 一种冠状病毒s蛋白变体及其应用
CN113832188A (zh) * 2021-07-18 2021-12-24 杭州迈尔德生物科技有限公司 一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及应用
CN116144704A (zh) * 2021-09-15 2023-05-23 四川大学华西医院 制备新型冠状病毒的病毒样颗粒的载体系统及方法
CN113943832B (zh) * 2021-10-25 2024-10-18 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种基于vsv载体的新型冠状病毒核酸诊断假病毒质控品及其制备方法
CN114134175A (zh) * 2021-11-01 2022-03-04 中国医学科学院输血研究所 一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法
CN114381437A (zh) * 2021-12-30 2022-04-22 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种利用可诱导表达狂犬病病毒蛋白的稳定细胞系生产狂犬病病毒假病毒系统的方法
CN114561492A (zh) * 2022-02-28 2022-05-31 宁夏回族自治区疾病预防控制中心(宁夏回族自治区性病艾滋病防治中心) 一种新冠病毒核酸检测阳性质控品及其制备方法和用途
CN115287271B (zh) * 2022-06-30 2024-04-09 中国食品药品检定研究院 一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法
CN115725657B (zh) * 2022-09-16 2024-06-04 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种节段化的水泡性口炎病毒载体及其制备方法和应用
CN116024269B (zh) * 2022-11-18 2024-02-02 复百澳(苏州)生物医药科技有限公司 一种冠状病毒假病毒颗粒的制备方法
CN119174831A (zh) * 2024-11-26 2024-12-24 中国医学科学院医学实验动物研究所 基于冠状病毒Spike与hACE2互作介导的细胞特异性基因递送系统

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005537802A (ja) * 2002-09-09 2005-12-15 ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・ファウンデーション ラブドウイルスの組み換え型変異体及びその使用方法
CN1552851A (zh) * 2003-06-06 2004-12-08 北京大学 Sars冠状病毒的假病毒及其制备方法和用途
CN1590552A (zh) * 2003-09-01 2005-03-09 北京大学 重组vsv病毒载体和重组vsv病毒及其制备方法和用途
CN102653781B (zh) * 2011-03-02 2014-07-23 李琦 一种筛选肿瘤化疗增敏剂的方法
EP3246410A1 (en) * 2016-05-19 2017-11-22 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Vsv/ndv hybrid viruses for oncolytic therapy of cancer
CN109055427B (zh) * 2018-08-09 2022-10-11 中国食品药品检定研究院 感染动物的假型MERS-CoV病毒、其制备方法和用途
CN111593073B (zh) * 2020-03-18 2022-03-08 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN111088283B (zh) * 2020-03-20 2020-06-23 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗
CN111603557B (zh) * 2020-06-15 2023-11-28 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
CN111893097A (zh) * 2020-06-16 2020-11-06 惠君生物医药科技(杭州)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及一步法包装方法

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021254327A1 (zh) * 2020-06-15 2021-12-23 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
WO2021254341A1 (zh) * 2020-06-16 2021-12-23 睿丰康生物医药科技(浙江)有限公司 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
CN112375768A (zh) * 2020-11-16 2021-02-19 同济大学 Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN112442514A (zh) * 2020-11-25 2021-03-05 云舟生物科技（广州）有限公司 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
CN112442514B (zh) * 2020-11-25 2022-04-12 云舟生物科技(广州)股份有限公司 慢病毒包装载体系统、慢病毒及其构建方法、试剂盒
CN112626035A (zh) * 2020-12-03 2021-04-09 中国科学院微生物研究所 一种新冠肺炎疫苗以及疫苗套件
CN112646787A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 武汉生物工程学院 一种以痘苗病毒天坛株为载体的新冠疫苗及其构建方法
CN112724209A (zh) * 2021-01-18 2021-04-30 广东华南疫苗股份有限公司 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用
CN112724209B (zh) * 2021-01-18 2022-03-08 广东华南疫苗股份有限公司 可形成纳米颗粒的冠状病毒重组蛋白及其载体和应用
CN112553172A (zh) * 2021-02-19 2021-03-26 吴江近岸蛋白质科技有限公司 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途
CN113621651A (zh) * 2021-07-19 2021-11-09 南昌五元生物科技有限公司 一种基于s-tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法
CN113559254A (zh) * 2021-08-09 2021-10-29 苏州大学 一种狂犬病毒疫苗及其制备方法
CN113559254B (zh) * 2021-08-09 2023-02-10 苏州大学 一种狂犬病毒疫苗及其制备方法
CN113621646A (zh) * 2021-08-10 2021-11-09 杭州医学院 一种新型冠状病毒侵染细胞的筛选系统及其应用
CN113717990A (zh) * 2021-08-30 2021-11-30 武汉大学 一种基于双报告基因的新型水泡性口炎假病毒系统及其应用
CN113717990B (zh) * 2021-08-30 2023-08-15 武汉大学 一种基于双报告基因的新型水泡性口炎假病毒系统及其应用
CN113957097A (zh) * 2021-09-27 2022-01-21 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN113957097B (zh) * 2021-09-27 2023-11-28 中国食品药品检定研究院 一种对新冠变异株广谱中和保护的免疫原及其制备方法和应用
CN114807292A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 西安交通大学 一种基于荧光素酶的新冠病毒膜融合抑制剂筛选方法
CN114913920A (zh) * 2022-07-19 2022-08-16 中科南京生命健康高等研究院 双报告基因假病毒检测系统的建立与应用
CN114913920B (zh) * 2022-07-19 2022-12-27 中科南京生命健康高等研究院 双报告基因假病毒检测系统的建立与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112760297B (zh) 2023-04-25
US20230332177A1 (en) 2023-10-19
CN112760297A (zh) 2021-05-07
WO2021254341A1 (zh) 2021-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112760297B (zh) 一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
CN1250731C (zh) 正链rna病毒复制子颗粒的包装
CN110551752B (zh) xCas9n-epBE碱基编辑系统及其在基因组碱基替换中的应用
AU2017329654B2 (en) New swine influenza vaccine
CN109475619A (zh) 神经元蜡样脂褐质沉积症的基因治疗
CN107090441A (zh) 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法
AU2017329669B2 (en) New EHV insertion site ORF70
CN110819650A (zh) 一种产β-榄香烯工程菌株及应用
CN110656114B (zh) 一种烟草色素合成相关的基因及其应用
CN113302303A (zh) 经修饰的丝状真菌宿主细胞
AU2017329672B2 (en) New promoters
CN107446895B (zh) 分泌型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
CN111867637A (zh) 新ehv插入位点ul43
CN111867625B (zh) 具有失活ul18和/或ul8的新ehv
CN101120093A (zh) 包含新的调控元件的载体
CN111635461A (zh) 一种ACE2-Albumin重组蛋白及其制备方法和应用
CN113355288B (zh) 一种治疗covid-19的通用型嵌合抗原受体t细胞的制备方法及应用
CN106754982B (zh) 表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用
CN113061626A (zh) 一种组织特异性敲除斑马鱼基因的方法及应用
CN111518833B (zh) 一种携带aim2基因的溶瘤腺病毒的构建方法及应用
CN107574182A (zh) 跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
CN109485707B (zh) 蛋白质OsVPE1在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用
CN101717787A (zh) 肝组织特异性表达rtTA的载体及其应用
CN104237508A (zh) 一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及应用
CN112662672B (zh) 一种启动子及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20201116

Address after: Office 1201-1, innovation building, 1000 Linjiang East Road, bailongqiao Town, Wucheng District, Jinhua City, Zhejiang Province 321000

Applicant after: Ruifengkang biomedical technology (Zhejiang) Co., Ltd

Address before: 311200 4th floor, building 2, ChuanHua Kechuang building, ningwei street, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant before: Huijun biomedical technology (Hangzhou) Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201106

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication