CN111892537B

CN111892537B - 阿朴菲类生物碱衍生物及其制备方法与用途

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Publication number: CN111892537B
Application number: CN202010772944.6A
Authority: CN
Inventors: 孙建博; 唐云卿; 王豫锦
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111892537A

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种如式I所示的阿朴菲类生物碱衍生物，其中，R₁、R₂、R₃分别独立的选自H、C1‑C4烷基、C1‑C4烷氧基、卤素、羟基或硝基。本发明阿朴菲类生物碱衍生物制备方法反应条件温和，所用试剂低毒，原料易得，后处理方便。本发明还公开了所述的阿朴菲类生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的阿朴菲类生物碱衍生物对肿瘤细胞株的抑制活性均明显高于NOR，并对正常细胞株具有一定的选择性。

Description

阿朴菲类生物碱衍生物及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于药物化学和药物治疗学领域，涉及一种阿朴菲类生物碱衍生物及其制备方法与在制备抗癌药物中的用途。

背景技术

近年来，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势。天然产物往往具有独特的化学结构且活性广泛，但常因各种原因难以直接成药。因此，选择适宜的天然产物作为先导化合物进行结构修饰，以获得具有高效、低毒抗肿瘤活性的候选化合物，已成为目前肿瘤化疗领域的研究热点之一。

阿朴菲类生物碱具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤作用。研究发现，即使相同骨架的阿朴菲类生物碱，如果取代基不同，也会导致类化合物的生理学活性不同。在自然界中已经分离得到的阿朴菲类生物碱有500多种，如波尔定碱广泛存在于檬立米科植物博路都树(Peumus boldus Molina)的叶和树皮中。研究报道，波尔定碱能有效抑制人侵袭性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(48h,IC₅₀：46.5±3.1μg/mL)和MDA-MB-468(48h,IC₅₀：50.8±2.7μg/mL)的活性。Liu等采用划痕试验、跨井侵袭试验、蛋白印迹分析、定量-聚合酶链式反应等方法研究异紫堇定碱对肝癌细胞的迁移侵袭能力的影响，结果表明异紫堇定碱可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。因此，以阿朴菲类生物碱为先导物进行结构修饰改造，寻找活性更强、成药性更佳的衍生物非常必要。

阿朴菲类生物碱结构通式

发明内容

本发明的目的是以阿朴菲类生物碱为先导物进行结构修饰改造，寻找活性更强的衍生物。

一种如式I所示的阿朴菲类生物碱衍生物：

其中，R₁、R₂、R₃分别独立的选自H、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素、羟基或硝基。

优选的，R₁选自H、甲氧基，R₂选自甲基、甲氧基、Cl，R₃选自H、甲氧基。

进一步优选的，R₁＝R₂＝R₃＝OCH₃，R₁＝H、R₂＝CH₃或OCH₃、R₃＝H。

具体地讲，所述的阿朴菲类生物碱衍生物选自下列化合物：

上述阿朴菲类生物碱衍生物对应的化学名称为：

N-[(4氯)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(3,4,5-三甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(4-甲基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(3,4-二甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(4-氟)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(3-羟基-4-甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(4-甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-苯丙酰基去甲异波尔定；

N-[(4-硝基)苯丙酰基]去甲异波尔定；

N-[(3-甲氧基-4-羟基)苯丙酰基]去甲异波尔定。

本发明所述的C1-C4烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基；所述的C1-C4烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基；所述的卤素选自F、Cl、Br。

本发明的另一目的在于提供式I所示的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，反应式如下：

包括：去甲异波尔定(NOR)与式Ⅱ所示的苯丙烯酸类化合物在缩合剂、缚酸剂作用下反应得到目标化合物。

所述的去甲异波尔定与苯丙烯酸类化合物的摩尔比为1:2。

所述的去甲异波尔定与缩合剂的摩尔比为1:2。

所述的去甲异波尔定与缚酸剂的摩尔比为1:6。

所述的缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)中的一种。

所述的缚酸剂为缚酸剂选自碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、三乙胺(Et₃N)或吡啶中的一种或多种。

所采用的溶剂选自DMF、丙酮、乙腈、甲苯、苯、二甲苯、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙醚中的一种或多种。

反应温度为0℃～60℃。

作为本发明所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法的进一步优选技术方案，反应液用二氯甲烷和水萃取至少两次，每次萃取使用的二氯甲烷和水的体积比为2:1，合并有机层，再用饱和氯化钠萃取一次，有机层无水硫酸钠干燥过夜，抽滤；滤液旋干制砂，硅胶柱层析(PE/EA＝3:2，v/v)分离纯化得到阿朴菲类生物碱衍生物纯品。

本发明阿朴菲类生物碱衍生物制备方法反应条件温和，所用试剂低毒，原料易得，后处理方便。

本发明所述的阿朴菲类生物碱衍生物对肿瘤细胞株的抑制活性均明显高于NOR，并对正常细胞株具有一定的选择性。因此，本发明的另一个目的是提供所述的阿朴菲类生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌。

本发明化合物可以单独或与临床上常用的抗肿瘤药物如抗代谢药物、烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤植物药、激素类联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。

具体实施方案

为进一步阐明本发明，下面列举一系列实施例。这些实施例是例证性的，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1

对照品：去甲异波尔定(NOR，成都普瑞法科技开发有限公司)。

以乌药总生物碱为原料，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱体系，通过硅胶柱层析得到去甲异波尔定，结构式如下：

ESI-MS：314.2[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:1.32(1H,s),2.80(3H,m),3.13(3H,m),3.60(3H,s),3.79(3H,s),4.11(1H,m),6.64(1H,s),6.76(1H,s),7.90(1H,s),9.33(1H,s),9.44(1H,s).

实施例2

化合物Ⅰ₁(N-[(4氯)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

依次将125.3mg(0.4mmol)NOR、304.2mg(0.8mmol)HATU、310μL(2.4mmol)Et₃N、146.1mg(0.8mmol)4-氯肉桂酸加入反应瓶中，再加入2mL DMF作为溶剂，常温搅拌2h。反应液用二氯甲烷和水萃取两次，每次加20mL二氯甲烷、10mL水，合并有机层，再用10mL饱和氯化钠萃取一次，有机层无水硫酸钠干燥过夜，抽滤。滤液旋干制砂，硅胶柱层析(PE/EA＝3:2，v/v)得到黄色固体，产率为10.2％。

ESI-MS：476.2[M-H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,TMS),δppm:2.75(2H,d),2.88(3H,m),3.65(3H,s),4.00(3H,s),5.09(2H,m),6.77(1H,s),6.92(1H,s),7.38(3H,d),7.47(3H,m),7.75(1H,m),8.04(1H,s).实施例3

化合物Ⅰ₂(N-[(3,4,5-三甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以3,4,5-三甲氧基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₂(黄色固体)，产率为12.0％。

ESI-MS：534.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.67(5H,m),3.55(3H,s),3.65(3H,s),3.79(9H,m),4.54(1H,m),4.87(1H,m),6.59(1H,s),6.69(1H,s),7.00(3H,s),7.16(1H,s),7.41(1H,s),7.47(1H,s),7.94(1H,s),9.11(2H,d).

实施例4

化合物Ⅰ₃(N-[(4-甲基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以4-甲基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₃(黄色固体)，产率为11.0％。

ESI-MS：480.3[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,TMS),δppm:2.39(3H,s),2.72(2H,d),2.86(3H,m),3.63(3H,s),3.97(3H,s),5.01(2H,m),6.75(1H,s),6.90(1H,s),7.20(3H,d),7.43(2H,m),7.77(1H,d),8.02(1H,s).

实施例5

化合物Ⅰ₄(N-[(3,4-二甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以3,4-二甲氧基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₄(黄色固体)，产率为13.1％。

ESI-MS：526.2[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.71(5H,m),3.59(3H,s),3.81(6H,s),4.57(1H,m),4.91(1H,m),6.68(2H,d),6.97(1H,d),7.35(5H,m),7.98(1H,s),9.16(2H,d).

实施例6

化合物Ⅰ₅(N-[(4-氟)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以4-氟肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₅(黄色固体)，产率为13.1％。

ESI-MS：462.2[M+H]+。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.69(5H,m),3.59(3H,s),3.81(3H,s),4.54(1H,m),4.91(1H,m),6.63(1H,s),6.71(1H,s),7.62(1H,s),8.01(3H,m),8.25(3H,m),9.18(2H,d).

实施例7

化合物Ⅰ₆(N-[(3-羟基-4-甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以3-羟基-4-甲氧基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₆(黄色固体)，产率为9.3％。

ESI-MS：512.2[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.68(4H,m),2.89(1H,m),3.58(3H,s),3.81(6H,s),4.49(1H,m),4.88(1H,m),6.62(1H,s),6.71(1H,s),7.00(2H,d),7.09(3H,m),7.41(1H,d),7.98(1H,s),9.03(1H,s),9.17(2H,d).

实施例8

化合物Ⅰ₇(N-[(4-甲氧基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以4-甲氧基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₇(黄色固体)，产率为11.4％。

ESI-MS：480.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.68(5H,s),3.79(6H,d),4.51(1H,m),4.89(1H,m),6.61(1H,s),6.70(1H,s),6.95(2H,d),7.20(1H,m),7.49(1H,d),7.66(2H,s),7.97(1H,s),9,17(2H,d).

实施例9

化合物Ⅰ₈(N-苯丙酰基去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以反式肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₈(黄色固体)，产率为15.2％。

ESI-MS：466.2[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.67(5H,S),3.57(3H,s),3.80(3H,s),4.51(1H,m),4.89(1H,m),6.61(1H,s),6.70(1H,s),7.39(5H,m),7.71(2H,s),7.97(1H,s),9.15(2H,d).

实施例10

化合物Ⅰ₉(N-[(4-硝基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以4-硝基肉桂酸替换化4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₉(黄色固体)，产率为5.2％。

ESI-MS：487.2[M-H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.70(5H,m),3.58(3H,s),3.81(3H,s),4.52(1H,m),4.90(1H,m),6.62(1H,s),6.71(1H,s),7.24(3H,t),7.54(1H,d),7.80(2H,s),7.98(1H,s),9.17(2H,d).

实施例11

化合物Ⅰ₁₀(N-[(3-甲氧基-4-羟基)苯丙酰基]去甲异波尔定)的合成

参照化合物Ⅰ₁的制备方法，以4-羟基-3-甲氧基肉桂酸替换4-氯肉桂酸，其他条件不变，制得目标化合物Ⅰ₁₀(黄色固体)，产率为15.2％。

ESI-MS：512.2[M+Na]⁺。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆,TMS),δppm:2.74(4H,s),2.90(1H,s),3.59(3H,s),3.82(6H,s),4.57(1H,m),4.90(1H,m),6.62(1H,s),6.72(1H,s),6.79(1H,d),7.10(2H,m),7.32(1H,m),7.46(1H,d),7.97(2H,d),9.15(2H,d),9.38(1H,s).

实施例12

采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT法)对化合物Ⅰ₁—化合物Ⅰ₁₀进行抗肿瘤活性测试，选取多柔比星(Dox)作为阳性对照药。

仪器：超净工作台(SW-CJ-1FD，AIRTECH，苏净安泰)、恒温CO₂培养箱(3111，Thermo，美国)、倒置生物显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)、酶联免疫检测仪(Model680，BIO-RAD，美国)、平板摇床(Kylin-bell lab Instruments)、高压灭菌锅(YXO.SG41.280，上海华线)，离心机(SIGMA)。

试剂：DMEM(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)，DMSO(SIGMA)。

细胞株：人乳腺癌细胞株MCF-7，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人肝癌细胞HepG2，人非小细胞肺癌细胞株A549，人乳腺正常细胞MCF10A(均由江苏凯基生物技术股份有限公司提供)。

方法：采用含10％胎牛血清的DMEM培养基将冻存的细胞株复苏，置于恒温37℃CO₂培养箱中培养，每天换液一次，待其处于指数生长期状态良好时即可铺板。加入1mL0.25％胰蛋白酶消化液，消化1-2min，在显微镜下观察细胞状态，当贴壁细胞变圆收缩时即可吸除消化液，加入1-2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，按照每孔5×10⁴个细胞数及总孔数计算所需细胞悬液的量，将此细胞悬液接种于96孔板上，200μL/孔，周围用PBS液封，置于恒温37℃CO₂培养箱中培养24h。

用DMEM培养基配制受试药物(化合物Ⅰ₁—化合物Ⅰ₁₀)、Dox和NOR，使其终浓度为10μM/孔，以DMSO为空白对照(DMSO用培养基稀释)，每个药物3个复孔，培养48小时。将MTT试剂加入到96孔板中，20μL/孔，继续孵育4h。吸除板内培养基，每孔加入150μL DMSO，轻摇使结晶溶解。用酶联免疫检测仪在波长570nm处检测每孔的吸光值，并按下列公式计算细胞抑制率。3次初筛结果平均值为其最终抑制率，再进行浓度梯度筛选，以备计算受试药物的IC₅₀值，3次重复实验结果为所测化合物的最终IC₅₀值。

细胞抑制率％＝[(空白对照OD值－给药组OD值)/空白对照组OD值]×100％

表1.目标化合物在10μM浓度下对MCF-7的抑制作用

初筛结果见表1，以10μM为初始浓度作用于MCF-7细胞，仅化合物Ⅰ₂、Ⅰ₃、Ⅰ₇抑制率大于50％。

表2.受试化合物对细胞株的抑制作用

由表2可知，化合物Ⅰ₁—化合物Ⅰ₁₀对肿瘤细胞株的抑制活性均明显高于NOR，部分化合物的IC₅₀＜10μM。其中以化合物Ⅰ₃活性最佳，其对MCF-7的IC₅₀值为3.12±0.28μM，SI值为6.38，对正常细胞株具有一定的选择性。

Claims

1.如式I所示的阿朴菲类生物碱衍生物：

其中，R₁选自H、甲氧基，R₂选自甲基、甲氧基、Cl，R₃选自H、甲氧基。

2.根据权利要求1所述的阿朴菲类生物碱衍生物，其特征在于R₁＝R₂＝R₃＝OCH₃，R₁＝H、R₂＝CH₃或OCH₃、R₃＝H。

3.一种权利要求1所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，其特征在于反应式如下：

。

4.根据权利要求3所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，其特征在于包括：去甲异波尔定与式Ⅱ所示的苯丙烯酸类化合物在缩合剂、缚酸剂作用下反应得到阿朴菲类生物碱衍生物。

5.根据权利要求4所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，其特征在于所述的去甲异波尔定与苯丙烯酸类化合物的摩尔比为1:2；所述的去甲异波尔定与缩合剂的摩尔比为1:2；所述的去甲异波尔定与缚酸剂的摩尔比为1:6；反应温度为0℃～60℃。

6.根据权利要求4所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，其特征在于所述的缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺中的一种；所述的缚酸剂选自碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、三乙胺或吡啶中的一种或多种。

7.根据权利要求4所述的阿朴菲类生物碱衍生物的制备方法，其特征在于所采用的溶剂选自DMF、丙酮、乙腈、甲苯、苯、二甲苯、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或乙醚中的一种或多种。

8.权利要求1所述的阿朴菲类生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的肿瘤为乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌。