CN111896671B - 一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法 - Google Patents
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其步骤：制备供试品溶液后，将供试品溶液点涂于薄层板，和/或用展开剂展开后，挥干溶剂；将上步制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化；将上步制得的薄层板依次浸渍于黄嘌呤溶液和Na2CO3溶液中，每次浸渍后取出薄层板并置于25～40℃的条件下进行反应，完全反应后将薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应，显色剂溶液为磷钨酸溶液。本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；专属性强，极具应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生化分析技术领域，涉及一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，特别涉及一种利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。
背景技术
痛风(gout)是单钠尿酸盐(MSU)在慢性高尿酸血症的关节内沉积引起的，是最常见的炎性关节炎。除了关节疼痛，痛风和高尿酸血症还与高血压，糖尿病，代谢综合征以及肾和心血管疾病有关，给患者带来极大的痛苦。因此，痛风的治疗对于缓解病人痛苦、提高病人生活质量具有重要意义。
降尿酸治疗(ULT)是治疗痛风的基础，血清尿酸盐浓度降低到6mg/dL及以下时，可以有效减少痛风的发作频率或预防痛风发作。常见的降尿酸药物有三种：黄嘌呤氧化酶抑制剂、促尿酸排泄药和尿酸分解酶。别嘌呤醇是临床上最常用的降低尿酸水平的药物，但使用过程中可能引起过敏反应等毒副作用。
黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)是嘌呤代谢为尿酸的关键酶。它能催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤并进一步转化为尿酸。自1963年引入别嘌呤醇以来，抑制黄嘌呤氧化酶一直是痛风中降尿酸治疗(ULT)的主要方法之一。除了治疗痛风外，黄嘌呤氧化酶抑制剂在治疗肾损伤，高血压，心绞痛和心力衰竭中也具有潜在的作用。故寻找新的低毒、有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂有重要意义。
目前黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法主要分为两类：体内筛选法和体外筛选法。体内筛选一般是通过建立高尿酸血症动物模型对药物进行筛选；体外筛选包括紫外分光光度法、高效液相色谱法和电化学法等。虽然以上筛选方法能够实现对黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，但其主要应用于单体成分，难以适用于复杂体系(如药用植物提取物)即无法在复杂体系(如药用植物提取物)筛选活性化合物。
薄层色谱-生物自显影技术是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合进而对天然产物中的复杂成分进行快速活性测定的方法，其具有操作简单、实验耗费低以及可以实现对活性化合物的快速筛选的优点，因此本领域将薄层色谱-生物自显影技术用于对黄嘌呤氧化酶抑制剂的快速筛选，其反应机理为黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的过程中产生O2 ·-，O2 ·-和NBT反应生成紫色的甲瓒，具有抑制黄嘌呤氧化酶或清除O2 ·-活性的化合物则会表现为紫色背景下的白色斑点。虽然其一定程度上能实现对黄嘌呤氧化酶抑制剂的快速筛选，但采用该体系筛选化合物，无论是抑制XO还是清除O2 ·-都能出现阳性结果，其专属性较差。
因此，开发一种专属性强的利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术无法适用于复杂体系且专属性差的缺陷，提供一种专属性强的利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其步骤如下：
(1)制备供试品溶液后，将供试品溶液点涂于薄层板，和/或用展开剂展开后，挥干溶剂；
(2)将步骤(1)制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化；
(3)将步骤(2)制得的薄层板浸渍于黄嘌呤溶液中，取出薄层板并置于25～40℃的条件下进行反应，再浸渍于Na2CO3溶液中，取出薄层板并置于25～40℃的条件下进行反应，完全反应后将薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应，所述显色剂溶液为磷钨酸溶液。
本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，选用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术作为手段，其相比于紫外分光光度法，以薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，受试样品的范围更为广泛，同时为克服现有黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术专属性较差的问题，提出了一种全新的黄嘌呤氧化酶抑制剂薄层色谱-尿酸-磷钨酸-生物自显影筛选体系，其通过检测尿酸实现对黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，尿酸与磷钨酸反应生成蓝色的钨蓝，使用本发明的方法黄嘌呤氧化酶抑制剂在薄层板上表现为蓝色背景下的白色斑点或黄色斑点，本发明的方法克服了现有技术无法排除O2 ·-清除剂对筛选结果的影响，显著提高筛选的专属性，为利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂提供了一种全新的思路，极具应用前景。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述薄层板为硅胶板，目前较为常用的薄层板为硅胶板，此处的薄层板实际并不限于硅胶板。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述供试品溶液的点样量为2～20μL。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述展开剂选自石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇和水中的一种以上。本发明的展开剂并不仅限于此，本领域技术人员可根据实际需求选择合适的试剂配置展开剂。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述展开剂由三氯甲烷、甲醇和水以体积比4:1:0.1的比例混合而成。本发明的展开剂本领域技术人员可根据实际需求进行灵活选择，此处仅给出一种可行的技术方案而已。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述黄嘌呤氧化酶溶液的制备过程为：
(a)将磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶于水，制得pH＝7.1～8.0的磷酸缓冲液，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的质量比为10.806～22.822：2.245～13.609；
(b)向磷酸缓冲液加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后制得酶促反应缓冲液，酶促反应缓冲液中乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.5～1mmol/L；
(c)向酶促反应缓冲液加入黄嘌呤氧化酶，充分混合即得黄嘌呤氧化酶溶液(在2～10℃条件下保存)。
磷酸盐缓冲液是应用最广泛的缓冲液之一，具有易于配制、pH值范围宽、pH受温度的影响小的优点。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种良好的螯合剂，能够螯合溶液中的2价离子，减少2价离子对黄嘌呤氧化酶催化活性的影响。黄嘌呤氧化酶溶液中加入EDTA，能够确保黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤生成尿酸和超氧阴离子的反应过程中保持较高而且稳定的活性；同时由于尿酸在水中溶解度低，在碱性溶液中溶解度较好，为了给反应提供一个碱性条件，我们需要在反应中加入碱性试剂(Na2CO3溶液)。Na2CO3与较为常见的九水偏硅酸钠(稳定性较差)和氢氧化钠(只能和缓冲溶液一起使用)相比，其稳定性和缓冲能力更好，且尿酸易溶于碱式碳酸盐中。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，步骤(2)中，所述活化的温度为25～40℃，时长为5～10min。以上活化条件能够保证薄层板上的黄嘌呤氧化酶被充分活化，当然本领域技术人员可根据实际需求调整活化条件，如黄嘌呤氧化酶溶液浓度变化，可适当调整活化条件以提高效率。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，步骤(3)中，浸渍后的反应的时长均为5～10min；反应(酶促反应)的温度过高会使酶失活，而反应的温度过低则会使酶活力不足；酶的孵育时间会影响黄嘌呤氧化酶的活力大小，从而影响显色结果；
所述显色反应的温度为25～40℃，时长为5～15min。显色反应的温度过低会使反应速度减缓，温度过高会使反应不完全；显色反应的时长过短会使反应不完全而底色偏浅，时长过长板面则会褪色。
步骤(3)中，完成显色反应后，在薄层板的蓝色背景下出现白色斑点或黄色斑点即供试品溶液中存在黄嘌呤氧化酶抑制剂。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述磷钨酸溶液的制备过程为：将20g钨酸钠溶于150mL蒸馏水后加入16mL磷酸溶液，再加热回流2～4h后冷却至室温，定容至280mL即得磷钨酸贮存液，临用前稀释磷钨酸贮存液即得磷钨酸溶液。
如上所述的一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，所述黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为100～300mU/mL；所述黄嘌呤溶液的浓度为15～25mmol/L；所述Na2CO3溶液的浓度为150～200g/L；磷钨酸贮存液稀释1.45～1.75倍即得磷钨酸溶液。黄嘌呤氧化酶的浓度过低会导致活性斑点扩散较严重且底色较浅，浓度过高则会造成酶液的浪费；黄嘌呤浓度过低会使底色偏浅，过高时底物难以溶解，配成的溶液不稳定易析出沉淀；Na2CO3溶液浓度过低会导致底色偏浅，过高溶液会过饱和有晶体析出；磷钨酸溶液浓度的过高或过低都会使显色效果变差，导致底色偏浅。
有益效果：
(1)本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；
(2)本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；
(3)本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的种类比紫外分光光度法更为广泛；
(4)本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，薄层色谱具有分离功能，对于混合物或者植物提取物，能够先对其进行分离后再检测，极具应用前景。
附图说明
图1为实施例1中利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术对黄芪75％甲醇部分的筛选结果图；
图2为实施例2中利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术对别嘌呤醇的活性检测结果图；
图3为实施例3中利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术对熊果酸的活性筛选结果图(1为熊果酸样品，2为别嘌呤醇样品)；
图4为实施例3中利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术对黄芪甲苷的活性筛选结果图(1为黄芪甲苷样品，2为别嘌呤醇样品)；
图5为实施例3中利用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术对杏黄罂粟碱的活性筛选结果图(1为杏黄罂粟碱样品，2为别嘌呤醇样品)。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述。
以下实施例使用的药物与试剂的生产厂家(采购来源)及型号如下：
黄芪饮片采自甘肃漳县三岔；黄嘌呤氧化酶(X4875-10UN，sigma)，黄嘌呤(X0625-5G，sigma)，别嘌呤醇(A8003-5G，sigma)；磷酸二氢钾(AR，10017618)，磷酸氢二钾(AR，10017518)，氢氧化钠(AR，10019718)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(AR，10019718)，甲醇(AR，10014118)，三氯甲烷(AR，10006818)，磷酸(AR，10015418)等分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司；钨酸钠(adamas-beta)；熊果酸(购自上海中药标准化研究中心)，黄芪甲苷(购自上海伊洪生物化学有限公司)，杏黄罂粟碱(购自成都普瑞法科技开发有限公司)。
使用到的仪器如下：
超级恒温槽(上海比朗仪器有限公司)，电子分析天平(BP211D，Sartorius，德国)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A型，上海一恒科技有限公司)，薄层色谱成像仪(CAMAGREPROSTAR 3，瑞士)。
实施例1
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，具体操作如下：
(1)各类溶液的配制过程如下：
显色剂溶液的配制：称取钨酸钠20g，溶于150mL蒸馏水中，加16mL磷酸溶液，加热回流2小时，冷却至室温，用蒸馏水定容到280mL，为磷钨酸贮存液，避光贮存，临用前用蒸馏水稀释1.45倍使用；
磷酸缓冲液的配制：准确称量磷酸氢二钾(分析纯)22.822g，磷酸二氢钾(分析纯)13.609g，加入到500mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成pH＝7.1的磷酸缓冲液；
黄嘌呤氧化酶溶液的配制：将乙二胺四乙酸二钠盐用pH＝7.1的磷酸缓冲液溶解，最终配制成乙二胺四乙酸二钠盐浓度为0.5mmol/L的酶促反应缓冲液；取黄嘌呤氧化酶，用酶促反应缓冲液配制成黄嘌呤氧化酶浓度为200mU/mL的溶液，在2℃条件下保存；
黄嘌呤溶液的配制：取适量黄嘌呤粉末，精密称定，用少量氢氧化钠溶液溶解，然后用pH＝7.1的磷酸缓冲液定容，配制成20mmol/L的黄嘌呤溶液；
供试品溶液的配制：称取黄芪药材粉末15g，加20倍量的95％乙醇超声30min，重复提取3次，合并滤液，旋干，冷冻干燥，得黄芪提取物1.438g，加水1mL溶解；采用Sep-Pak C18cartridge(Vac 20cc 5g，Waters Associates，Milford，MA，美国)分别用甲醇与水依次洗脱SPE小柱，上样，依次用水(100mL)、30％甲醇(100mL)、45％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、75％甲醇(100mL)、90％甲醇(100mL)、纯甲醇(100mL)洗脱得到五个部分；取75％甲醇部分，用甲醇定容至1mL，配制成黄芪提取物浓度为23.5mg/mL的供试品溶液；
(2)将供试品溶液点涂于薄层板(硅胶板)上，点样量均为10μL，再将薄层板放入展开剂(由三氯甲烷、甲醇和水以体积比4:1:0.1的比例混合而成)中展开，挥干溶剂；
(3)将步骤(2)制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，用滤纸吸干薄层板表面液滴，将薄层板置于37℃水浴的条件下对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化5分钟；
(4)将步骤(3)制得的薄层板依次浸渍于黄嘌呤溶液和浓度为200g/L的Na2CO3溶液中，在每次浸渍后分别取出薄层板并置于37℃的条件下反应10分钟，反应结束后将薄层板浸渍于显色剂溶液中在37℃下进行显色反应10分钟。
最后结果如图1所示，即在薄层板的蓝色背景下出现白色斑点即供试品溶液中存在黄嘌呤氧化酶抑制剂。
经验证，本发明的黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，操作简单，实验耗费低，不需要复杂的仪器和设备；以色彩图像形式提供结果，形象直观，易于辨认和记忆；薄层板作为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的种类比紫外分光光度法更为广泛；薄层色谱具有分离功能，对于混合物或者植物提取物，能够先对其进行分离后再检测，极具应用前景。
实施例2
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，具体操作如下：
(1)各类溶液的配制过程如下：
显色剂溶液的配制：称取钨酸钠20g，溶于150mL蒸馏水中，加16mL磷酸溶液，加热回流3小时，冷却至室温，用蒸馏水定容到280mL，为磷钨酸贮存液，避光贮存，临用前用蒸馏水稀释1.6倍使用；
磷酸缓冲液的配制：准确称量磷酸氢二钾(分析纯)10.806g，磷酸二氢钾(分析纯)2.245g，加入到500mL容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成pH＝7.6的磷酸缓冲液；
黄嘌呤氧化酶溶液的配制：将乙二胺四乙酸二钠盐用pH＝7.6的磷酸缓冲液溶解，最终配制成乙二胺四乙酸二钠盐浓度为0.8mmol/L的酶促反应缓冲液；取黄嘌呤氧化酶，用酶促反应缓冲液配制成黄嘌呤氧化酶浓度为100mU/mL的溶液，在4℃条件下保存；
黄嘌呤溶液的配制：取适量黄嘌呤粉末，精密称定，用少量氢氧化钠溶液溶解，然后用pH＝7.6的磷酸缓冲液定容，配制成25mmol/L的黄嘌呤溶液；
供试品溶液的配制：将别嘌呤醇溶于95％乙醇或氨水制成2mmol/L别嘌呤醇溶液；
(2)将供试品溶液点于薄层板(硅胶板)上，点样量为2μL，挥干溶剂；
(3)将步骤(2)制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，用滤纸吸干薄层板表面液滴，将薄层板置于25℃水浴的条件下对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化8分钟；
(4)将步骤(3)制得的薄层板依次浸渍于黄嘌呤溶液和浓度为150g/L的Na2CO3溶液中，在每次浸渍后分别取出薄层板并置于25℃的条件下反应8分钟，反应结束后将薄层板浸渍于显色剂溶液中在25℃下进行显色反应15分钟。
最后结果如图2所示，即在薄层板的蓝色背景下出现白色斑点即供试品溶液中存在黄嘌呤氧化酶抑制剂。
实施例3
一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，具体操作如下：
(1)各类溶液的配制过程如下：
显色剂溶液的配制：称取钨酸钠20g，溶于150mL蒸馏水中，加16mL磷酸溶液，加热回流4小时，冷却至室温，用蒸馏水定容到280mL，为磷钨酸贮存液，避光贮存，临用前用蒸馏水稀释1.75倍使用；
磷酸缓冲液溶液的配制：准确称量磷酸氢二钾(分析纯)6.008g，磷酸二氢钾(分析纯)3.682g，加入到500ml容量瓶中，用蒸馏水定容，配制成pH＝8.0的磷酸缓冲液；
黄嘌呤氧化酶溶液的配制：将乙二胺四乙酸二钠盐用pH＝8.0的磷酸缓冲液溶解，最终配制成乙二胺四乙酸二钠盐浓度为1mmol/L的酶促反应缓冲液；取黄嘌呤氧化酶，用酶促反应缓冲液配制成黄嘌呤氧化酶浓度为300mU/mL的溶液，在10℃条件下保存；
黄嘌呤溶液的配制：取适量黄嘌呤粉末，精密称定，用少量氢氧化钠溶液溶解，然后用pH＝8.0的磷酸缓冲液定容，配制成15mmol/L的黄嘌呤溶液；
供试品溶液的配制：将别嘌呤醇溶于95％乙醇或氨水制成2mmol/L别嘌呤醇溶液；将熊果酸溶于甲醇制成浓度为5mmol/L的熊果酸溶液；将黄芪甲苷溶于甲醇制成浓度为5mmol/L的黄芪甲苷溶液；将杏黄罂粟碱溶于甲醇制成浓度为5mmol/L的杏黄罂粟碱溶液；
(2)将以上各供试品溶液分别点于薄层板(硅胶板)上，点样量均为2μL，挥干溶剂；
(3)将步骤(2)制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，用滤纸吸干薄层板表面液滴，将薄层板置于40℃水浴的条件下对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化10分钟；
(4)将步骤(3)制得的薄层板依次浸渍于黄嘌呤溶液和浓度为180g/L的Na2CO3溶液中，在每次浸渍后分别取出薄层板并置于40℃的条件下反应5分钟，反应结束后将薄层板浸渍于显色剂溶液中在40℃下进行显色反应5分钟。
最后结果如图3～5所示，图3为熊果酸的活性筛选结果(1为熊果酸样品，2为别嘌呤醇样品)，图4为黄芪甲苷的活性筛选结果(1为黄芪甲苷样品，2为别嘌呤醇样品)，图5为杏黄罂粟碱的筛选结果(1为杏黄罂粟碱样品，2为别嘌呤醇样品)，可以看到在薄层板的蓝色背景下出现白色斑点即供试品溶液中存在黄嘌呤氧化酶抑制剂。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。
Claims (1)
1.一种黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）制备供试品溶液后，将供试品溶液点涂于薄层板，挥干溶剂或者用展开剂展开后挥干溶剂；展开剂由三氯甲烷、甲醇和水以体积比4:1:0.1的比例混合而成；所述薄层板为硅胶板；所述供试品溶液的点样量为2 ~ 20 μL；
（2）将步骤（1）制得的薄层板浸渍于黄嘌呤氧化酶溶液中，取出薄层板，对薄层板上的黄嘌呤氧化酶进行活化；所述黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为100 ~ 300 mU/mL；所述活化的温度为25 ~ 40 ℃，时长为5 ~ 10 min；
所述黄嘌呤氧化酶溶液的制备过程为：
（a）将磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶于水，制得pH = 7.1 ~ 8.0的磷酸缓冲液，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的质量比为10.806 ~ 22.822：2.245 ~ 13.609；
（b）向磷酸缓冲液加入乙二胺四乙酸二钠盐，乙二胺四乙酸二钠盐完全溶解后制得酶促反应缓冲液，酶促反应缓冲液中乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.5 ~ 1 mmol/L；
（c）向酶促反应缓冲液加入黄嘌呤氧化酶，充分混合即得黄嘌呤氧化酶溶液；
（3）将步骤（2）制得的薄层板浸渍于黄嘌呤溶液中，取出薄层板并置于25 ~ 40 ℃的条件下进行反应，再浸渍于Na2CO3溶液中，取出薄层板并置于25 ~ 40 ℃的条件下进行反应，完全反应后将薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应，完成显色反应后，在薄层板的蓝色背景下出现白色斑点或黄色斑点即供试品溶液中存在黄嘌呤氧化酶抑制剂；
浸渍后的反应的时长均为5 ~ 10 min；
所述显色反应的温度为25 ~ 40 ℃，时长为5 ~ 15 min；
所述黄嘌呤溶液的浓度为15 ~ 25 mmol/L；所述Na2CO3溶液的浓度为150 ~ 200 g/L所述显色剂溶液为磷钨酸溶液；其制备过程为：将20 g钨酸钠溶于150 mL蒸馏水后加入16 mL磷酸溶液，再加热回流2 ~ 4 h后冷却至室温，定容至280 mL即得磷钨酸贮存液，临用前稀释磷钨酸贮存液1.45 ~1.75倍即得磷钨酸溶液。
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