CN111876478B

CN111876478B - 肺结节诊断标志物及应用

Info

Publication number: CN111876478B
Application number: CN202010350286.1A
Authority: CN
Inventors: 刘翠华; 柴琪瑶; 陆喆; 汪静
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2025-11-21
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111876478A

Abstract

本发明公开了肺结节诊断标志物及应用，属于生物技术检测技术领域。本发明提供了将PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4基因其中一个或多个作为诊断肺结节病的生物标志物分子的用途，使用这些标志物可以辅助活体组织检查，帮助确诊相关的肺部疾病，本发明提供的用于鉴定结节病的基因在区分健康者、肺腺癌患者和肺结核患者的准确率(ROC曲线下面积)依次为96.5％、90.9％、89.1％、87.5％、87.2％和85.8％，综合准确率为90.9％。本发明收集了一定量的临床样本进行研究和验证，研究成果符合临床实际，具有良好的临床应用前景。

Description

肺结节诊断标志物及应用

技术领域

本发明涉及肺结节诊断标志物及应用，特别是涉及利用病人肺组织样本进行肺结节病的诊断的试剂盒等产品的开发，属于生物技术检测技术领域。

背景技术

肺结节(sarcoidosis)是一种病因未明的多系统多器官的肉芽肿性疾病，常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官，其胸部受侵率高达80％～90％。临床上，肺结节与多种其他慢性肺部疾病具有非常相似的症状、病理学特征及影像学结果，例如肺癌和肺结核，给鉴别诊断带来了巨大挑战。肺癌是引起人类死亡最多的一类癌症，2018年全球因肺癌死亡的人数超过170万。其中，肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的一种肺癌亚型。结节病则是一种病因不清的自身免疫性疾病，常发病于肺部，形成类似结核病特征的肉芽肿(granuloma)结构，从而引起误诊。肺结核、肺腺癌及肺结节病都是国内外常见的、分布广泛的慢性炎症性肺部疾病，为此，筛选上述疾病的特异性生物标志物分子，并将其应用于相关鉴别诊断的试剂盒开发对于这些疾病的及时确诊和治疗具有重要意义。

临床上，对于上述疾病的鉴别诊断常会采取活体组织检查的方法，通过组织病理学的特征进行判别。然而，如上所述，肺结核、肺腺癌及肺结节病在很多情况下不易区分，故需要有效的疾病特异性肺组织生物标志物进行辅助检测和判断。

发明内容

本发明提供了针对肺结节病的特异性肺组织生物标志物分子，通过简便的免疫组织化学染色或实时荧光定量等方法，可以对这些疾病进行区分，十分适合应用于相关疾病的检测、诊断和鉴别试剂盒的开发。

本发明的第一个目的是提供PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7、AKR1C3单独或组合作为肺结节病诊断标志物中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将特异性扩增PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7或AKR1C3的基因片段用于制备辅助诊断肺结节病，或检测肺结节病的存在，或用以选择用于减少患者发生肺结节病风险的试剂，或体外识别用于治疗肺结节病的候选试剂，或评价患者在使用用于减少肺结节病风险的试剂进行治疗中获益的可能性，或用于评价患者在减少肺结节病风险的抗体或抗原结合片段进行治疗中获益可能性的试剂盒。

在一种实施方式中，所述PTGER4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AKR1C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PLA2G6的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述LTA4H的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述PLA2G7的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述AKR1C3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增PTGER4基因的引物和/或探针；所述引物序列为AGGGCTATCATCATCCTACAACTCA和TAGGTCTTCGCAGCCATCAAG。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增AKR1C1基因的引物和/或探针；所述引物序列为TTCATGCCTGTCCTGGGATTT和CTGGCTTTACAGACACTGGAAAA。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增PLA2G6基因的引物和/或探针；所述引物序列为TTTGGCCGCCTGGTCAATAC和CTCCCGAACTCGGTCACTC。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增LTA4H基因的引物和/或探针；所述引物序列为AGACAAAGTTACAAGGGATCGC和AGATATGGGTGTTCCTTCCCAG。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增PLA2G7基因的引物和/或探针；所述引物序列为TCATCAGCATGGGTCAACAAAA和CCAAAGGGTGTCAAGGCGAT。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增AKR1C3基因的引物和/或探针；所述引物序列为GTCATCCGTATTTCAACCGGAG和CCACCCATCGTTTGTCTCGTT。

在一种实施方式中，以ACTB和18S rRNA作为内参基因，评价PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H、PTGER4的mRNA水平。

在一种实施方式中，所述ACTB的特异性引物为CATGTACGTTGCTATCCAGGC和CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

在一种实施方式中，所述18S rRNA的特异性引物为CGAACGTCTGCCCTATCAACT和ACCCGTGGTCACCATGGTAG。

本发明的第二个目的是提供检测所述标志物的试剂在制备肺结节病检测产品中的应用。

在一种实施方式中，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述标志物的表达水平时使用的PCR扩增引物。

在一种实施方式中，所述检测产品通过荧光定量PCR、Southern杂交、Northern杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序法、免疫法检测样本中PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7或AKR1C3中至少一个基因的表达情况。

在一种实施方式中，所述免疫法包括ELISA法、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹法。

在一种实施方式中，所述检测产品中包含能够特异性扩增PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7或AKR1C3中至少一个基因的引物和/或探针；或者能够特异性结合相应蛋白的抗体。

在一种实施方式中，所述样本为组织或外周血。

在一种实施方式中，所述检测产品包括诊断试剂、试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。

在一种实施方式中，所述芯片包括与所述标志物或其DNA序列结合的核酸或抗体。

在一种实施方式中，所述试纸包括与所述标志物或其DNA序列结合的核酸或抗体。

在一种实施方式中，所述高通量测序平台包括与所述标志物或其DNA序列结合的核酸或抗体。

在一种实施方式中，所述试剂盒包括与所述标志物或其DNA序列结合的核酸或抗体。

在一些实施方式中，所述试剂盒可包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。

在一些实施方式中，DNA提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液；所述裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成；所述结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B：清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成；所述洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。

在一种实施方式中，所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；所述去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种；pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液；其中，亚硫酸氢盐选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或多种；保护缓冲液由氧自由基清除剂组成，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或几种。

本发明还提供了一种肺结节病的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的待检测肺组织样本；

(2)检测步骤(1)获得的离体样本中前面所述的标志物的表达水平；

(3)将步骤(2)测得的标志物的表达水平与对照进行比较。

在一种实施方式中，PLA2G6表达量达对照的2.851倍以上，或PLA2G7表达量达对照的3.347倍以上，或AKR1C1表达量达对照9.366倍以上，或AKR1C3表达量达对照的5.588倍以上，或LTA4H表达量达对照的3.132-7.494倍以上，或PTGER4表达量达对照的4.699倍以上，或上述基因的总体表达量达对照的7.677倍以上视为患有肺结节。

本发明还要求保护所述诊断标志物在筛选减少肺结节病风险的药物，或筛选用于减少肺结节患病风险的试剂方面的应用。

在一种实施方式中，所述筛选通过离体实验进行。

有益效果：本发明提供了可鉴别诊断肺结节病的生物标志物分子，使用这些所述标志物可以辅助活体组织检查来帮助确诊相关的肺部疾病，本发明提供的用于鉴定结节病的基因PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4在区分健康者、肺腺癌患者和肺结核患者的准确率(ROC曲线下面积)依次为0.965、0.909、0.891、0.875、0.872和0.858，综合准确率为0.909。本发明收集了一定量的临床样本进行研究和验证，研究成果符合临床实际，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为qPCR分析不同样本中标志物表达量差异的结果；(A)为PLA2G6mRNA，(B)为PLA2G7mRNA，(C)为AKR1C1mRNA，(D)为AKR1C3mRNA，(E)为LTA4H mRNA，(F)为PTGER4mRNA；NC，正常肺组织样本组；TB，肺结核患者肺组织样本组；AD，肺腺癌患者肺组织样本组；SA，肺结节病患者肺组织样本组。

图2(A)为PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4在各类样本中的表达量的冗余分析(RDA)；(B)为基因PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4在各类样本中的表达量的操作特征曲线(ROC)分析；NC，正常肺组织样本组；TB，肺结核患者肺组织样本组；AD，肺腺癌患者肺组织样本组；SA，肺结节病患者肺组织样本组。

图3为不同基因在肺结节病患者与正常者、肺结核病患者及肺腺癌患者的肺组织中的表达情况；(A)，PLA2G4A mRNA；(B)，PLA2G4B mRNA；(C)，PLA2G4C mRNA；(D)，PLA2G4DmRNA；(E)，PLA2G4E mRNA；(F)，PLA2G4F mRNA；(G)，PTGS1mRNA；(H)，PTGS2mRNA；(I)，ALOX5mRNA；(J)ALOX12B mRNA；(K)，ALOX15B mRNA；(L)，AKR1B1mRNA；(M)，AKR1C2mRNA；(N)，CBR1mRNA；(O)，PTGES mRNA；(P)，PTGES2mRNA；(Q)，PTGES3mRNA；(R)，LTC4S mRNA；(S)，GGT1mRNA；(T)，DPEP1mRNA；(U)，PTGDR mRNA；(V)，PTGDR2mRNA；(W)，GLRA3mRNA；(X)，PTGER1mRNA；(Y)，PTGER2mRNA；(Z)，PTGER3mRNA；(AA)，PTGFR mRNA；(AB)，FPR2mRNA；(AC)，GPR32mRNA；(AD)LTB4R mRNA；(AE)，LTB4R2mRNA；(AF)，CYSLTR1mRNA；(AG)，CYSLTR2mRNA；NC，正常肺组织样本组；TB，肺结核患者肺组织样本组；AD，肺腺癌患者肺组织样本组；SA，肺结节病患者肺组织样本组。

具体实施方式

在本发明的上下文中，“诊断”包括判断受试者是否已经患病、判断受试者是否存在患病的风险、判断患者是否已经复发、判断患者对药物治疗的反应性、或者判断患者的预后情况。

在本发明的上下文中，本文使用的术语“标志物”意指允许区分正常和疾病状态、或能够使治疗结果被预测或客观测量的标签。具体地，在与所述疾病相关的情况下，标志物意指在患有肺结节病的受试者中，或肺结节病发病风险的受试者中，相比于正常对照(未患对应疾病的受试者)，其蛋白或基因表达水平显著升高或降低的有机生物分子，例如多肽或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖、二糖、寡糖等)。

实施例1肺结节病病人的病变肺组织中PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7及AKR1C3的mRNA水平显著升高

1)获得待检测的来自肺结核患者(TB)、肺腺癌患者(AD)及肺结节病(SA)患者的肺组织样本(n＝35,48及21)，并以肺腺癌患者的癌旁正常组织作为正常肺组织对照(NC；n＝40)。

2)将肺组织样品研磨，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)提取并纯化mRNA，随后使用Ⅲ1st Strand cDNASynthesis SuperMix(Yeasen)试剂盒逆转录生成cDNA。

3)利用Applied Biosystems 7500Real-Time PCR系统，进行qPCR分析上述cDNA样品，检测PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4的mRNA水平。以ACTB和18S rRNA作为内参基因。所用引物如下：

表1扩增标志物基因的引物

4)利用R package of randomForest 4.6.14和The R package of vegan 2.5.6这两个R语言包进行冗余分析(RA)，确定PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4与各组样品的相关性。

5)利用IBM SPSS Statistics 22.0软件分析PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7及AKR1C3作为肺结节病的鉴别诊断标志物用于区分健康者、肺腺癌患者和肺结核患者的ROC曲线下面积。

结果如图1所示，根据箱型图可知，与NC组相比，PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4的mRNA水平在SA组中显著升高，而在TB和AD组中则无明显变化。PLA2G6表达量为8.981±2.939(均值差±标准误)，2.851-15.11(95％置信区间)；PLA2G7表达量为7.937±2.201(均值差±标准误)，3.347-12.53(95％置信区间)；AKR1C1表达量为17.02±3.671(均值差±标准误)，9.366-24.68(95％置信区间)；AKR1C3表达量为8.475±1.384(均值差±标准误)，5.588-11.36(95％置信区间)；LTA4H表达量为5.313±1.046(均值差±标准误)，3.132-7.494(95％置信区间)；PTGER4表达量为11.91±3.459(均值差±标准误)，4.699-19.13(95％置信区间)；总体表达量(各个样本6个基因表达量相加取平均值)9.941±1.085(均值差±标准误)，7.677-12.2(95％置信区间)。

如图2A所示，箭头方向代表各标志物的表达量与样本成正相关性，箭头长度代表该相关性的强度。由图可知，PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4与SA组的样品成正相关，而与其他组的样品成负相关或相关性不强。

如图2B所示，使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)和线下面积(AUC)评估PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4作为肺结节病的鉴别诊断标志物用于区分健康者、肺腺癌患者和肺结核患者的能力，依次为0.965、0.909、0.891、0.875、0.872和0.858，综合AUC为0.909。该结果提示PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4作为生物标志物具有较高的诊断能力。

实施例2检测试剂盒的制备及使用

合成如表1所示的核苷酸序列，作为扩增内参基因及标志物的引物。

为方便使用，试剂盒还可以包含对照：正常人肺组织样本的cDNA序列。

试剂盒的使用方法为：取受试者肺组织样本，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从肺组织样本提取RNA，使用检测试剂盒中的试剂，并使用试剂盒中正常肺组织样本的cDNA序列作为Real-Time PCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者肺组织中如SEQ ID NO.1～6中至少一个基因的相对表达量变化。

PLA2G6表达量达对照的2.851倍以上，或PLA2G7表达量达对照的3.347倍以上，或AKR1C1表达量达对照9.366倍以上，或AKR1C3表达量达对照的5.588倍以上，或LTA4H表达量达对照的3.132-7.494倍以上，或PTGER4表达量达对照的4.699倍以上，或上述基因的总体表达量达对照的7.677倍以上视为患有肺结节。

实施例3标志物在临床诊断中的应用

按照实施例1的方法，分别对多名受试者进行检测，并将检测结果与现行诊断方法(例如血液检查、结节病抗原试验、活体组织检查、肺部X线检查、胸部计算机体层扫描等)的结果进行比较。结果显示，采用本申请的诊断标志物进行检测获得的诊断结果与病理学诊断结果一致。

对比例

按照实施例1相同的策略，还分别设计引物检测了除PLA2G6、PLA2G7、AKR1C1、AKR1C3、LTA4H及PTGER4之外，在花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)通路中的其他主要酶和受体的编码基因的mRNA水平。所用引物如下：

表2扩增不同基因的引物

如图3所示，这些基因的表达水平在肺结节病患者肺部表达的特异性皆不及实施例1筛选出的上述6个基因的特异性强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 肺结节诊断标志物及应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtccactc ccggggtcaa ttcgtccgcc tccttgagcc ccgaccggct gaacagccca 60

gtgaccatcc cggcggtgat gttcatcttc ggggtggtgg gcaacctggt ggccatcgtg 120

gtgctgtgca agtcgcgcaa ggagcagaag gagacgacct tctacacgct ggtatgtggg 180

ctggctgtca ccgacctgtt gggcactttg ttggtgagcc cggtgaccat cgccacgtac 240

atgaagggcc aatggcccgg gggccagccg ctgtgcgagt acagcacctt cattctgctc 300

ttcttcagcc tgtccggcct cagcatcatc tgcgccatga gtgtcgagcg ctacctggcc 360

atcaaccatg cctatttcta cagccactac gtggacaagc gattggcggg cctcacgctc 420

tttgcagtct atgcgtccaa cgtgctcttt tgcgcgctgc ccaacatggg tctcggtagc 480

tcgcggctgc agtacccaga cacctggtgc ttcatcgact ggaccaccaa cgtgacggcg 540

cacgccgcct actcctacat gtacgcgggc ttcagctcct tcctcattct cgccaccgtc 600

ctctgcaacg tgcttgtgtg cggcgcgctg ctccgcatgc accgccagtt catgcgccgc 660

acctcgctgg gcaccgagca gcaccacgcg gccgcggccg cctcggttgc ctcccggggc 720

caccccgctg cctccccagc cttgccgcgc ctcagcgact ttcggcgccg ccggagcttc 780

cgccgcatcg cgggcgccga gatccagatg gtcatcttac tcattgccac ctccctggtg 840

gtgctcatct gctccatccc gctcgtggtg cgagtattcg tcaaccagtt atatcagcca 900

agtttggagc gagaagtcag taaaaatcca gatttgcagg ccatccgaat tgcttctgtg 960

aaccccatcc tagacccctg gatatatatc ctcctgagaa agacagtgct cagtaaagca 1020

atagagaaga tcaaatgcct cttctgccgc attggcgggt cccgcaggga gcgctccgga 1080

cagcactgct cagacagtca aaggacatct tctgccatgt caggccactc tcgctccttc 1140

atctcccggg agctgaagga gatcagcagt acatctcaga ccctcctgcc agacctctca 1200

ctgccagacc tcagtgaaaa tggccttgga ggcaggaatt tgcttccagg tgtgcctggc 1260

atgggcctgg cccaggaaga caccacctca ctgaggactt tgcgaatatc agagacctca 1320

gactcttcac agggtcagga ctcagagagt gtcttactgg tggatgaggc tggtgggagc 1380

ggcagggctg ggcctgcccc taaggggagc tccctgcaag tcacatttcc cagtgaaaca 1440

ctgaacttat cagaaaaatg tatataa 1467

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggattcga aatatcagtg tgtgaagctg aatgatggtc acttcatgcc tgtcctggga 60

tttggcacct atgcgcctgc agaggttcct aaaagtaaag ctttagaggc caccaaattg 120

gcaattgaag ctggcttccg ccatattgat tctgctcatt tatacaataa tgaggagcag 180

gttggactgg ccatccgaag caagattgca gatggcagtg tgaagagaga agacatattc 240

tacacttcaa agctttggtg caattcccat cgaccagagt tggtccgacc agccttggaa 300

aggtcactga aaaatcttca attggattat gttgacctct accttattca ttttccagtg 360

tctgtaaagc caggtgagga agtgatccca aaagatgaaa atggaaaaat actatttgac 420

acagtggatc tctgtgccac atgggaggcc gtggagaagt gtaaagatgc aggattggcc 480

aagtccatcg gggtgtccaa cttcaaccgc aggcagctgg agatgatcct caacaagcca 540

gggctcaagt acaagcctgt ctgcaaccag gtggaatgtc atccttactt caaccagaga 600

aaactgctgg atttctgcaa gtcaaaagac attgttctgg ttgcctatag tgctctggga 660

tcccaccgag aagaaccatg ggtggacccg aactccccgg tgctcttgga ggacccagtc 720

ctttgtgcct tggcaaaaaa gcacaagcga accccagccc tgattgccct gcgctaccag 780

ctacagcgtg gggttgtggt cctggccaag agctacaatg agcagcgcat cagacagaac 840

gtgcaggtgt ttgaattcca gttgacttca gaggagatga aagccataga tggcctaaac 900

agaaatgtgc gatatttgac ccttgatatt tttgctggcc cccctaatta tccattttct 960

gatgaatatt aa 972

<210> 3

<211> 2421

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgcagttct ttggccgcct ggtcaatacc ttcagtggcg tcaccaactt gttctctaac 60

ccattccggg tgaaggaggt ggctgtggcc gactacacct cgagtgaccg agttcgggag 120

gaagggcagc tgattctgtt ccagaacact cccaaccgca cctgggactg cgtcctggtc 180

aaccccagga actcacagag tggattccga ctcttccagc tggagttgga ggctgacgcc 240

ctagtgaatt tccatcagta ttcttcccag ctgctaccct tctatgagag ctcccctcag 300

gtcctgcaca ctgaggtcct gcagcacctg accgacctca tccgtaacca ccccagctgg 360

tcagtggccc acctggctgt ggagctaggg atccgcgagt gcttccatca cagccgtatc 420

atcagctgtg ccaattgcgc ggagaacgag gagggctgca cacccctgca cctggcctgc 480

cgcaagggtg atggggagat cctggtggag ctggtgcagt actgccacac tcagatggat 540

gtcaccgact acaagggaga gaccgtcttc cattatgctg tccagggtga caattctcag 600

gtgctgcagc tccttggaag gaacgcagtg gctggcctga accaggtgaa taaccaaggg 660

ctgaccccgc tgcacctggc ctgccagctg gggaagcagg agatggtccg cgtgctgctg 720

ctgtgcaatg ctcggtgcaa catcatgggc cccaacggct accccatcca ctcggccatg 780

aagttctctc agaaggggtg tgcggagatg atcatcagca tggacagcag ccagatccac 840

agcaaagacc cccgttacgg agccagcccc ctccactggg ccaagaacgc agagatggcc 900

cgcatgctgc tgaaacgggg ctgcaacgtg aacagcacca gctccgcggg gaacacggcc 960

ctgcacgtgg cggtgatgcg caaccgcttc gactgtgcca tagtgctgct gacccacggg 1020

gccaacgcgg atgcccgcgg agagcacggc aacaccccgc tgcacctggc catgtcgaaa 1080

gacaacgtgg agatgatcaa ggccctcatc gtgttcggag cagaagtgga caccccgaat 1140

gactttgggg agactcctac attcctagcc tccaaaatcg gcagacttgt caccaggaag 1200

gcgatcttga ctctgctgag aaccgtgggg gccgaatact gcttcccacc catccacggg 1260

gtccccgcgg agcagggctc tgcagcgcca catcatccct tctccctgga aagagctcag 1320

cccccaccga tcagcctaaa caacctagaa ctacaggatc tcatgcacat ctcacgggcc 1380

cggaagccag cgttcatcct gggctccatg agggacgaga agcggaccca cgaccacctg 1440

ctgtgcctgg atggaggagg agtgaaaggc ctcatcatca tccagctcct catcgccatc 1500

gagaaggcct cgggtgtggc caccaaggac ctgtttgact gggtggcggg caccagcact 1560

ggaggcatcc tggccctggc cattctgcac agtaagtcca tggcctacat gcgcggcatg 1620

tactttcgca tgaaggatga ggtgttccgg ggctccaggc cctacgagtc ggggcccctg 1680

gaggagttcc tgaagcggga gtttggggag cacaccaaga tgacggacgt caggaaaccc 1740

aaggtgatgc tgacagggac actgtctgac cggcagccgg ctgaactcca cctcttccgg 1800

aactacgatg ctccagaaac tgtccgggag cctcgtttca accagaacgt taacctcagg 1860

cctccagctc agccctcaga ccagctggtg tggcgggcgg cccgaagcag cggggcagct 1920

cctacttact tccgacccaa tgggcgcttc ctggacggtg ggctgctggc caacaacccc 1980

acgctggatg ccatgaccga gatccatgag tacaatcagg acctgatccg caagggtcag 2040

gccaacaagg tgaagaaact ctccatcgtt gtctccctgg ggacagggag gtccccacaa 2100

gtgcctgtga cctgtgtgga tgtcttccgt cccagcaacc cctgggagct ggccaagact 2160

gtttttgggg ccaaggaact gggcaagatg gtggtggact gttgcacgga tccagacggg 2220

cgggctgtgg accgggcacg ggcctggtgc gagatggtcg gcatccagta cttcagattg 2280

aacccccagc tggggacgga catcatgctg gatgaggtca gtgacacagt gctggtcaac 2340

gccctctggg agaccgaggt ctacatctat gagcaccgcg aggagttcca gaagctcatc 2400

cagctgctgc tctcaccctg a 2421

<210> 4

<211> 1836

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgcccgaga tagtggatac ctgttcgttg gcctctccgg cttccgtctg ccggaccaag 60

cacctgcacc tgcgctgcag cgtcgacttt actcgccgga cgctgaccgg gactgctgct 120

ctcacggtcc agtctcagga ggacaatctg cgcagcctgg ttttggatac aaaggacctt 180

acaatagaaa aagtagtgat caatggacaa gaagtcaaat atgctcttgg agaaagacaa 240

agttacaagg gatcgccaat ggaaatctct cttcctatcg ctttgagcaa aaatcaagaa 300

attgttatag aaatttcttt tgagacctct ccaaaatctt ctgctctcca gtggctcact 360

cctgaacaga cttctgggaa ggaacaccca tatctcttta gtcagtgcca ggccatccac 420

tgcagagcaa tccttccttg tcaggacact ccttctgtga aattaaccta tactgcagag 480

gtgtctgtcc ctaaagaact ggtggcactt atgagtgcta ttcgtgatgg agaaacacct 540

gacccagaag acccaagcag gaaaatatac aaattcatcc aaaaagttcc aataccctgc 600

tacctgattg ctttagttgt tggagcttta gaaagcaggc aaattggccc aagaactttg 660

gtgtggtctg agaaagagca ggtggaaaag tctgcttatg agttttctga gactgaatct 720

atgcttaaaa tagcagaaga tctgggagga ccgtatgtat ggggacagta tgacctattg 780

gtcctgccac catccttccc ttatggtggc atggagaatc cttgccttac ttttgtaact 840

cctactctac tggcaggcga caagtcactc tccaatgtca ttgcacatga aatatctcat 900

agctggacag ggaatctagt gaccaacaaa acttgggatc acttttggtt aaatgaggga 960

catactgtgt acttggaacg ccacatttgc ggacgattgt ttggtgaaaa gttcagacat 1020

tttaatgctc tgggaggatg gggagaacta cagaattcgg taaagacatt tggggagaca 1080

catcctttca ccaaacttgt ggttgatctg acagatatag accctgatgt agcttattct 1140

tcagttccct atgagaaggg ctttgcttta cttttttacc ttgaacaact gcttggagga 1200

ccagagattt tcctaggatt cttaaaagct tatgttgaga agttttccta taagagcata 1260

actactgatg actggaagga tttcctgtat tcctatttta aagataaggt tgatgttctc 1320

aatcaagttg attggaatgc ctggctctac tctcctggac tgcctcccat aaagcccaat 1380

tatgatatga ctctgacaaa tgcttgtatt gccttaagtc aaagatggat tactgccaaa 1440

gaagatgatt taaattcatt caatgccaca gacctgaagg atctctcttc tcatcaattg 1500

aatgagtttt tagcacagac gctccagagg gcacctcttc cattggggca cataaagcga 1560

atgcaagagg tgtacaactt caatgccatt aacaattctg aaatacgatt cagatggctg 1620

cggctctgca ttcaatccaa gtgggaggac gcaattcctt tggcgctaaa gatggcaact 1680

gaacaaggaa gaatgaagtt tacccggccc ttattcaagg atcttgctgc ctttgacaaa 1740

tcccatgatc aagctgtccg aacctaccaa gagcacaaag caagcatgca tcccgtgact 1800

gcaatgctgg tggggaaaga cttaaaagtg gattaa 1836

<210> 5

<211> 1326

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

atggtgccac ccaaattgca tgtgcttttc tgcctctgcg gctgcctggc tgtggtttat 60

ccttttgact ggcaatacat aaatcctgtt gcccatatga aatcatcagc atgggtcaac 120

aaaatacaag tactgatggc tgctgcaagc tttggccaaa ctaaaatccc ccggggaaat 180

gggccttatt ccgttggttg tacagactta atgtttgatc acactaataa gggcaccttc 240

ttgcgtttat attatccatc ccaagataat gatcgccttg acaccctttg gatcccaaat 300

aaagaatatt tttggggtct tagcaaattt cttggaacac actggcttat gggcaacatt 360

ttgaggttac tctttggttc aatgacaact cctgcaaact ggaattcccc tctgaggcct 420

ggtgaaaaat atccacttgt tgttttttct catggtcttg gggcattcag gacactttat 480

tctgctattg gcattgacct ggcatctcat gggtttatag ttgctgctgt agaacacaga 540

gatagatctg catctgcaac ttactatttc aaggaccaat ctgctgcaga aataggggac 600

aagtcttggc tctaccttag aaccctgaaa caagaggagg agacacatat acgaaatgag 660

caggtacggc aaagagcaaa agaatgttcc caagctctca gtctgattct tgacattgat 720

catggaaagc cagtgaagaa tgcattagat ttaaagtttg atatggaaca actgaaggac 780

tctattgata gggaaaaaat agcagtaatt ggacattctt ttggtggagc aacggttatt 840

cagactctta gtgaagatca gagattcaga tgtggtattg ccctggatgc atggatgttt 900

ccactgggtg atgaagtata ttccagaatt cctcagcccc tcttttttat caactctgaa 960

tatttccaat atcctgctaa tatcataaaa atgaaaaaat gctactcacc tgataaagaa 1020

agaaagatga ttacaatcag gggttcagtc caccagaatt ttgctgactt cacttttgca 1080

actggcaaaa taattggaca catgctcaaa ttaaagggag acatagattc aaatgtagct 1140

attgatctta gcaacaaagc ttcattagca ttcttacaaa agcatttagg acttcataaa 1200

gattttgatc agtgggactg cttgattgaa ggagatgatg agaatcttat tccagggacc 1260

aacattaaca caaccaatca acacatcatg ttacagaact cttcaggaat agagaaatac 1320

aattag 1326

<210> 6

<211> 972

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

atggattcca aacaccagtg tgtaaagcta aatgatggcc acttcatgcc tgtattggga 60

tttggcacct atgcacctcc agaggttccg agaagtaaag ctttggaggt cacaaaatta 120

gcaatagaag ctgggttccg ccatatagat tctgctcatt tatacaataa tgaggagcag 180

gttggactgg ccatccgaag caagattgca gatggcagtg tgaagagaga agacatattc 240

tacacttcaa agctttggtc cacttttcat cgaccagagt tggtccgacc agccttggaa 300

aactcactga agaaagctca attggactat gttgacctct atcttattca ttctccaatg 360

tctctaaagc caggtgagga actttcacca acagatgaaa atggaaaagt aatatttgac 420

atagtggatc tctgtaccac ctgggaggcc atggagaagt gtaaggatgc aggattggcc 480

aagtccattg gggtgtcaaa cttcaaccgc aggcagctgg agatgatcct caacaagcca 540

ggactcaagt acaagcctgt ctgcaaccag gtagaatgtc atccgtattt caaccggagt 600

aaattgctag atttctgcaa gtcgaaagat attgttctgg ttgcctatag tgctctggga 660

tctcaacgag acaaacgatg ggtggacccg aactccccgg tgctcttgga ggacccagtc 720

ctttgtgcct tggcaaaaaa gcacaagcga accccagccc tgattgccct gcgctaccag 780

ctgcagcgtg gggttgtggt cctggccaag agctacaatg agcagcgcat cagacagaac 840

gtgcaggttt ttgagttcca gttgactgca gaggacatga aagccataga tggcctagac 900

agaaatctcc actattttaa cagtgatagt tttgctagcc accctaatta tccatattca 960

gatgaatatt aa 972

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agggctatca tcatcctaca actca 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taggtcttcg cagccatcaa g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttcatgcctg tcctgggatt t 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctggctttac agacactgga aaa 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tttggccgcc tggtcaatac 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctcccgaact cggtcactc 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agacaaagtt acaagggatc gc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agatatgggt gttccttccc ag 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcatcagcat gggtcaacaa aa 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccaaagggtg tcaaggcgat 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtcatccgta tttcaaccgg ag 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ccacccatcg tttgtctcgt t 21

Claims

1.扩增PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7和AKR1C3基因片段的引物在制备肺结节病检测和/或诊断产品中的应用；其特征在于，所述产品用于在肺结核、肺腺癌及肺结节病中特异性识别肺结节病；

所述引物含有(a)～(f)：

(a)如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的DNA片段；

(b)如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA片段；

(c)如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的DNA片段；

(d)如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的DNA片段；

(e)如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的DNA片段；

(f)如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PTGER4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AKR1C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PLA2G6的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述LTA4H的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述PLA2G7的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；所述AKR1C3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种肺结节病检测产品，其特征在于，含有特异性扩增PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7和AKR1C3的引物；所述引物含有(a)～(f)：

(a)如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的DNA片段；

(b)如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的DNA片段；

(c)如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的DNA片段；

(d)如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的DNA片段；

(e)如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的DNA片段；

(f)如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的DNA片段。

4.根据权利要求3所述的检测产品，其特征在于，还含有内参基因；所述内参基因为ACTB和18S rRNA。

5.根据权利要求3或4所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品通过荧光定量PCR、Southern杂交、Northern杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序法或免疫法检测样本中PTGER4、AKR1C1、PLA2G6、LTA4H、PLA2G7和AKR1C3基因的表达情况。

6.根据权利要求3或4所述的检测产品，其特征在于，所述检测产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。