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CN111876413A - 两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组 - Google Patents

两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组 Download PDF

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CN111876413A
CN111876413A CN202010746999.XA CN202010746999A CN111876413A CN 111876413 A CN111876413 A CN 111876413A CN 202010746999 A CN202010746999 A CN 202010746999A CN 111876413 A CN111876413 A CN 111876413A
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周大虎
徐杰
贺浩华
姜志树
李婷
林小玲
范寒雨
马莹莹
朱昌兰
彭小松
陈小荣
付海辉
欧阳林娟
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Jiangxi Agricultural University
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Jiangxi Agricultural University
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Abstract

本发明提供一种敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA。针对水稻OsPLS4基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，实现对水稻OsPLS4基因的敲除。其中，sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过CRISPR‑CAS9技术对水稻内源基因OsPLS4进行编辑，获得了OsPLS4敲除突变体。利用本发明制备的sgRNA能高效、快速、精确靶向水稻OsPLS4基因，在基础研究(水稻早衰分子机理)和生产实践(水稻早衰品种改良和抗逆育种)上具有一定的意义。

Description

两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组
技术领域
本发明明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及两个基于 CRISPR-CAS9技术定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组及应用。
背景技术
OsPLS4基因编码3-酰基还原酶，该酶的功能在细菌和动物里面研究较多，主要参与脂肪酸从头合成的第二个阶段，属于KR蛋白酶，是脂肪酸合酶复合体(Fatty AcidSynthase,FAS)的重要组成成分，而FAS酶是脂肪酸合成的重要复合物之一。脂肪酸合成过程分别为饱和脂肪酸的从头合成、脂肪酸碳链的延长和不饱和脂肪酸的生成等。
在植物中，表皮蜡质是植物抵御外来生物和非生物胁迫的第一道屏障，其主要有超长链脂肪酸及其衍生物组成，因此脂肪酸合成对植物表面的蜡质层的形成至关重要。近年来，对植物的表面蜡质研究越来越多，很多研究结果表明水稻表面蜡质积累量减弱导致其抗旱保水能力减弱。同时，不饱和脂肪酸对植物的耐寒性非常重要。因此对水稻脂肪酸合成相关基因进行研究，可以进一步探索脂肪酸调控植物表面蜡质合成作用机理，揭示脂肪酸在植物抗逆方面作用，为粮食安全生产提供理论依据。
最近，CRISPR-CAS9基因编辑技术在作物上研究取得巨大成功。因此利用此技术，敲除脂肪酸合成相关基因OsPLS4来获得其突变体对分析该基因功能以及阐明脂肪酸在水稻生长发育以及抗逆过程中的调控机制具有重要作用。本发明通过设计sgRNA构建基因编辑载体、转基因技术和CRISPR-CAS9技术获得转基因植株、测序分析获得OsPLS4基因编辑(敲除)的植株及序列编辑情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种敲除水稻3-酰基还原酶基因OsPLS4的方法，提供了一种基于CRISPR-CAS9技术敲除水稻OsPLS4的sgRNA以及用于敲除水稻OsPLS4基因的载体。使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsPLS4的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)选择OsPLS4基因编码区第672-690和第766-784核酸序列两个靶位点作为CRISPR/Cas9系统的靶序列(SEQ ID NO.1):TTACAGTGCTGCCAAGGCT
(SEQ ID NO.2):TGTCAGATGCAATGAAACC
根据靶序列设计四条oligo DNA：
(SEQ ID NO.3)PLS4(1)F：GGCATTACAGTGCTGCCAAGGCT
(SEQ ID NO.4)PLS4(1)R：AAACAGCCTTGGCAGCACTGTAA
(SEQ ID NO.5)PLS4(2)F：GGCATGTCAGATGCAATGAAACC
(SEQ ID NO.6)PLS4(2)R：AAACGGTTTCATTGCATCTGACA
b)将oligo DNA组PLS4(1)F和PLS4(1)R、PLS4(2)F和PLS4(2)R混合，通过退火反应形成二聚体结构，然后与线性化的pYL-Hs载体片段进行连接，构建含有水稻OsPLS4基因两个靶序列的pYL-Hs-PLS4-cas9质粒。
c)用含有pYL-PLS4-cas9质粒根癌农杆菌EHA105侵染水稻的愈伤组织，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株。
d)利用CX-PLS4-F(SEQ ID NO.7)和CX-PLS4-R(SEQ ID NO.8)特异引物，对靶序列附近序列进行扩增，扩增基因组片段进行测序，鉴定OsPLS4编辑情况并筛选敲除植株；
(SEQ ID NO.7)CX-PLS4-F:GCTTACAAGTTTAGTCAGGTTTC
(SEQ ID NO.8)CX-PLS4-R:TCGCGCAAATAGAAATCGTG
本发明的有益效果是基因编辑载体pYL-Hs-PLS4-cas9转化水稻后，即可实现高效、快速、特异对水稻OsPLS4基因进行靶向编辑和敲除，可直接用此做研究材料来探讨OsPLS4基因的功能和作用机理，为在生产实践上更好利用OsPLS4基因进行遗传改良奠定基础。
附图说明
图1OsPLS4基因编辑载体pYL-Hs-PLS4-cas9结构示意图
图2pYL-Hs-PLS4-cas9转基因鉴定图
图3转基因2号株系OsPLS4基因编辑情况
图4转基因3号株系OsPLS4基因编辑情况
图5转基因8号株系OsPLS4基因编辑情况
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中如无特殊说明的实验方法，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水稻OsPLS4基因sgRNA序列的设计与合成
水稻OsPLS4基因的编码区序列如SEQ ID NO.9所示。
本实施例CRISPR/Cas9编辑靶序列长度为19bp，位于OsPLS4基因编码区保守序列第八和第九外显子的第672-690和第766-784核酸序列，编辑的靶序列为(SEQ ID NO.1):TTACAGTGCTGCCAAGGCT，(SEQ ID NO.2): TGTCAGATGCAATGAAACC，该序列在水稻基因组上特异，脱靶概率极低。
根据靶序列合成四条oligo DNA：
(SEQ ID NO.3)PLS4(1)F：GGCATTACAGTGCTGCCAAGGCT
(SEQ ID NO.4)PLS4(1)R：AAACAGCCTTGGCAGCACTGTAA
(SEQ ID NO.5)PLS4(2)F：GGCATGTCAGATGCAATGAAACC
(SEQ ID NO.6)PLS4(2)R：AAACGGTTTCATTGCATCTGACA
实施例2、OsPLS4编辑载体pYL-Hs-PLS4-cas9构建
将两个oligo DNA组PLS4(1)F和PLS4(1)R、PLS4(2)F和PLS4(2)R分别加ddH2O溶解至10μM，按反应体系混合后，95℃加热3分钟，自然冷却退火使PLS4(1)F/R和PLS4(2)F/R形成二聚体结构，通过退火反应形成二聚体结构，然后分别与利用融合了水稻的U3启动子，gRNA骨架序列的载体pYL-Hs 进行连接。通过热激法将连接产物转化大肠杆菌，挑选单菌落至LB液体培养基(+kan)培养12小时，测序。挑选测序正确的细菌提取质粒DNA，获得含有水稻OsPLS4基因靶序列的编辑载体pYL-Hs-PLS4-cas9，载体图见图1。
实施例3、pYL-Hs-PLS4-cas9载体农杆菌转化
用冻融法将pYL-Hs-PLS4-cas9质粒转化如农杆菌，将10μL质粒DNA加入200μL农杆菌EHA105感受态中，冰浴30min，液氮冷冻3min，37℃水浴 5min，加入1mL YEB培养基，28℃摇培3-4h。6000rpm，室温离心1min，弃上清，加入200μL YEB培养基重悬菌体，涂于YEB固体培养基上(+利福平)，28℃培养3天。挑单菌落鉴定。
实施例4、水稻转化
本实施选用中花11作为受体进行农杆菌转化。选用300粒左右中花11 种子，去壳后用75％的乙醇浸泡1分钟，倒掉75％乙醇后用次氯酸钠溶液消毒30分钟，用无菌水洗6次，用灭菌纱布吸干水分后将种子种到含 2,4-D(2mg/L)的NB培养基上26℃避光培养2周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有编辑载体(pYL-Hs-PLS4-cas9)的EHA105菌株制备的工程菌液侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX，温度为32℃)。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下(光照强度为13200LX，温度为32℃)培养一个月左右得到抗性转基因植株。用1/2MS培养基生根壮苗获得T0代植株，移入田间种植。
实施例5、OsPLS4基因编辑情况分析
取T0代植株叶片提取DNA，根据潮霉素基因序列设计引物hyg-F和hyg-R，确定阳性转基因植株，见图2。然后用引物SQ-OsPLS4-F和SQ-OsPLS4-R扩增阳性转基因植株(图3)，通过测序分析OsPLS4基因靶位点附近序列(图4-5为部分被编辑植株的测序结果)，总体结果统计见表1。潮霉素基因与靶位点附近序列扩增引物序列为：
SQ-OsPLS4-F(SEQ ID NO.7)：GCTTACAAGTTTAGTCAGGTTTC
SQ-OsPLS4-R(SEQ ID NO.8)：TCGCGCAAATAGAAATCGTG
表1.OsPLS4基因编码情况分析
Figure RE-GDA0002668685370000051
Figure RE-GDA0002668685370000061
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
ttacagtgct gccaaggct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
tgtcagatgc aatgaaacc 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcattacag tgctgccaag gct 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaacagcctt ggcagcactg taa 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcatgtcag atgcaatgaa acc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaacggtttc attgcatctg aca 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcttacaagt ttagtcaggt ttc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgcgcaaat agaaatcgtg 20
<210> 9
<211> 957
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 9
atggcgacct ccgcgaccgc aggggcagca gcagcagtgg cctccccggc ggtggccccg 60
cgcggcgccg ccgtcgcggc ggtggcgcgg cgagggttcg tctcgttcgg cgcggcggcg 120
gccgcgcgct cgcgcgcggt gcggtccggc ggcttctccg gcgtgcagac ccatgttgca 180
gctgttgagc aagcacttgt gcaagatgct acaaagttgg aagctccagt tgttattgtg 240
accggtgcct ccagggggat tggaaaggcg actgcattgg ctcttggaaa agctgggtgc 300
aaggtcctgg tgaactatgc ccgatcctca aaagaggctg aagaagtctc caaagagatc 360
gaagcatgtg gtggtcaggc tattaccttc gggggagatg tttcaaaaga agccgatgtg 420
gattctatga tgaaagcagc tcttgataaa tggggaacaa ttgatgtgct ggtaaacaat 480
gcaggaatta cccgagacac attattaatg aggatgaaga aatcacaatg gcaagacgta 540
attgacctga atcttactgg tgttttcctc tgtacacaag ctgctacaaa aataatgatg 600
aagaagaaaa agggaaaaat catcaacata gcatcagttg ttggtcttgt tggtaatatt 660
ggccaagcta attacagtgc tgccaaggct ggggttattg gtttgacgaa aacagtagct 720
agggaatatg caagcagaaa tatcaatgtg aatgcaattg cacctggttt cattgcatct 780
gacatgactg ctgaacttgg agaggatctt gagaagaaaa tcttgtcaac catcccatta 840
gggagatatg gcaaaccaga ggaggttgct ggcttggttg agtttttggc tctcaatcct 900
gcggccaact acatcacggg acaggttctt accatcgatg gagggatggt gatgtag 957

Claims (4)

1.两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组，其特征在于：包括OsPLS4基因的两个sgRNA的靶位点，其DNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，一个oligo DNA组为PLS4(1)F和PLS4(1)R，另一个oligo DNA组为PLS4(2)F和PLS4(2)R，PLS4(1)F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PLS4(1)R核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PLS4(2)F核苷酸序列如SEQID NO.5所示，PLS4(2)R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.如权利要求1所述的两个定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的oligo DNA组在水稻OsPLS4基因编辑育种中的应用。
3.一种定点敲除水稻OsPLS4基因的sgRNA的载体，其特征在于，该载体为pYL-Hs-PLS4-cas9，该载体通过将oligo DNA组PLS4(1)F和PLS4(1)R、PLS4(2)F和PLS4(2)R混合，通过退火反应形成二聚体结构，然后与线性化pHY-HS载体片段连接，构建含有水稻OsPLS4基因两个靶序列的pYL-Hs-PLS4-cas9质粒，PLS4(1)F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PLS4(1)R核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，PLS4(2)F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PLS4(2)R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.一种鉴定OsPLS4基因的sgRNA靶区域编辑情况的引物对，其特征在于：该引物对的DNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
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