[go: up one dir, main page]

CN111876382A - 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用 - Google Patents

一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111876382A
CN111876382A CN202010821035.7A CN202010821035A CN111876382A CN 111876382 A CN111876382 A CN 111876382A CN 202010821035 A CN202010821035 A CN 202010821035A CN 111876382 A CN111876382 A CN 111876382A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
immune
immune cell
universal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010821035.7A
Other languages
English (en)
Inventor
刘华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Xinghua Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Xinghua Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Xinghua Biomedical Technology Co ltd filed Critical Shanghai Xinghua Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202010821035.7A priority Critical patent/CN111876382A/zh
Publication of CN111876382A publication Critical patent/CN111876382A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种简便的制备通用型免疫细胞的方法及其应用，该方法将同种异体的免疫细胞与特定的细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有高度免疫活性的通用型免疫细胞培养物。该方法简便，易于操作，采用同种异体免疫细胞，可以提高免疫细胞制剂的质量、降低细胞疗法的成本和改善其安全性。此外，临床长期大量实际应用证明了该通用型免疫细胞安全可靠、持久有效、没有排异反应。因此，可作为其他类型通用型免疫细胞制剂的母体细胞，例如CAR‑T、TCR‑T，用于过继性细胞免疫治疗等领域。本发明解决了目前细胞免疫治疗成本高、安全性差、效率低等问题，为细胞免疫疗法的应用和推广提供了新的途径。

Description

一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用。
背景技术
近几十年来，肿瘤治疗领域取得了很大进展。特别是针对肿瘤相关抗原(TAA)的基于细胞的疗法已经发展迅速。通过产生由编码scFv，共刺激结构域(CD28或TNFRSF9)的基因和用于T细胞增殖和活化的CD247信号传导结构域组成的CAR构建体，将T细胞工程化以具有攻击肿瘤细胞的能力。原则上，通过T细胞表面上的scFv识别TAA来激活CAR-T细胞，然后通过scFv连接的细胞内的信号传导结构域随后被激活以诱导涉及T细胞增殖，活化和细胞因子产生的下游信号传导途径。
目前，CAR-T细胞疗法的有效功能已经在包括血液恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫疾病和哮喘等过敏性疾病的各种疾病中得到证实。此外，抗原特异性T调节细胞(Tregs)和基因编辑的T细胞似乎有利于控制过敏性哮喘的炎症。
CAR T疗法不同于传统药物，而主要是一种整合了CAR基因的自体T细胞疗法。这一疗法须快速完成抽血、分离、激活、转染、扩增、制剂、放行、冻存、运输和给药。因此CAR T细胞疗法是一个相当昂贵和个性化的过程，需要昂贵的措施来收集患者的细胞，设计这些细胞，并在每个阶段将细胞重新注入患者体内，并进行适当的质量控制。另外，传统的嵌合抗原受体(CAR)具有固定的设计，并且一种类型的CAR T细胞只能靶向一种抗原表位。这种刚性的设计限制了临床应用，并导致极高的制造成本。
2017年FDA批准了两种CAR-T细胞疗法(Yescarta和Kymriah)，CAR T细胞疗法已成为治疗某些类型癌症的最有希望的疗法之一。这一成功为优化CAR T细胞的生产提供了机会，使患者更容易得到治疗。但是，目前两种批准的具有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞产物来自自体T细胞。这些批准用于临床的CAR T细胞必须在定制的基础上生成。由于昂贵且漫长的生产过程，这种自体T细胞生产平台仍然是大规模临床应用的重要限制因素。生产失败也存在固有风险。个性化，定制的自体CAR T细胞生产过程也对各种肿瘤类型的广泛应用产生了影响。
为了更广泛地实施先进细胞疗法并降低成本，使用同种异体“通用”细胞疗法产品将是有利的，所述同种异体“通用”细胞疗法产品可以以类似于生物制药药物产品的方式存储在细胞库中并应要求提供。因此，通用同种异体T细胞可以用于制备通用CAR T细胞，其可以用作大规模临床应用的“现成”即用型生物治疗制剂。这将大大减少传统CAR T细胞治疗所需的费用和时间。目前，通用型CAR-T的研发主要包括免疫细胞的类型及其制备，以及CAR-T的载体和结构。主要的技术路线为：消除内源性αβT细胞受体(TCR)的表达以防止移植物抗宿主反应；基因编辑技术；其他类型的免疫细胞；iPSC技术。
当考虑同种异体CAR T细胞输注时，必须避免宿主与移植物和移植物抗宿主排异反应，以防止过继转移细胞的排斥，宿主组织损伤并引起显著的抗肿瘤结果。目前采用的一种修饰方法是在引入CAR的同时敲除阻止同种异体治疗的基因，例如内源性T细胞受体。使其在其细胞表面不存在TCRαβ受体以防止它们的同种异体反应性。这一技术显然进一步增加了制备操作的复杂性，而且还有敲除TCRαβ受体不完全的隐患。
由于可以同时编辑多个基因靶标，一些临床试验采用CRISPR/Cas9系统用于CAR-T细胞改善。这些强大技术的结合有望为临床应用提供新一代基于CAR-T细胞的免疫疗法，即通过基因编辑技术敲除内源性TCR，并改善T细胞的抗肿瘤活性和安全性。但是，这一方法也会进一步增加制备操作的复杂性，同时也会增加生产成本。
自然杀伤(NK)细胞可以异种移植，并有可能成为现成的产品，使CAR-NK细胞疗法成为通用产品。这些产品可能比CAR-T细胞疗法更安全。科学家报告了一种基于NK-92细胞工程的新型PCa治疗方法，CAR识别人前列腺特异性膜抗原(PSMA)，其在前列腺肿瘤细胞中过表达。在CAR转导后，NK-92/CAR细胞在体外获得针对表达PSMA的前列腺癌细胞的高和特异性裂解活性，并且还进行脱颗粒并响应抗原识别产生高水平的IFN-γ。但是这一技术需要对效应物进行致死照射，这是靶向NK-92细胞临床应用所要求的安全措施，可以完全消除复制，但不影响表型和短期功能。
另有研究者探索了基于诱导多能干细胞(iPSC)衍生的自然杀伤(NK)细胞开发现成细胞疗法的技术路线。提出了设计iPSC衍生的NK(iPSC-NK)细胞以增强免疫细胞的功能，延长持久性和促进细胞归巢的策略。但迄今为止，还没有看到iPSC衍生的CTL(iPSC-CTL)的报道。
本发明在先申请的制备抗原特异性的免疫细胞类药物(CN101626781B、CN102847143B、CN102847144B)在近10年临床应用中，治疗了大约近800例肿瘤病人，年龄范围为18个月-93岁，最多使用500多次，历时最长为十年。外周血白细胞总数的范围为0.9-30.0×109/L。经过临床多中心应用证明：安全性好、无移植物抗宿主排异反应(GVHD)和自体免疫性疾病，而传统的使用DLI治疗的病人大约有50～60％发生GVHD。
因此，本申请人拟基于在先专利的基础设计一种制备通用同种异体T细胞的方法，并且为其他类型通用型免疫细胞制剂提供母体细胞，例如CAR-T、TCR-T或其他免疫细胞类型，用于过继性免疫细胞疗法等领域，以期提高免疫细胞的质量、降低细胞疗法的成本和改善其安全性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供了一种简便的制备通用型免疫细胞的方法及其应用。所制备的通用型免疫细胞安全可靠、持久有效、没有移植物抗宿主排异反应。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1，将同种异体的免疫细胞(例如单个核细胞)与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得通用型免疫细胞培养物；
步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离出细胞群；
其中，细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。
进一步地，上述细胞因子选自白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和转化生长因子中的任意一种或几种。
进一步地，上述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-15、干扰素中的一种或几种。
进一步地，上述细胞因子的浓度为20万-500万单位/L。
进一步地，上述细胞因子的浓度为50万-200万单位/L。
进一步地，上述有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖中的任意一种或几种。
进一步地，上述有丝分裂原的浓度为10万-1000万单位/L。
进一步地，上述有丝分裂原的浓度为0.1mg-10mg/L。
进一步地，上述免疫佐剂选自生物性佐剂、无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂和弗氏佐剂中的任意一种或几种，浓度为0.01ml-1ml/L。
进一步地，免疫细胞来源于外周血或脐带血。
进一步地，免疫细胞可以是异体细胞或自体细胞。
进一步地，上述免疫细胞的浓度为1×103-1×1011个/ml。
进一步地，上述细胞群包括细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、激活的杀伤性单核细胞(AKM)、树突状细胞(DC)中的一种或几种。
进一步地，上述具有免疫活性的细胞群为淋巴细胞，如CTL、NK、CIK和B细胞等，最优选为细胞毒T淋巴细胞。
进一步地，步骤1中的共同培养时间为3～180天。
进一步地，上述培养容器为三维大体积高密度细胞培养容器。
进一步地，该方法还包括克隆步骤：以步骤1中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫活性的细胞群为原料，在液态细胞培养基中进行克隆，得到具有免疫活性的细胞株。该克隆采用间歇循环刺激法或连续刺激法。
本发明的第二方面是提供上述方法制备的通用型免疫细胞，该细胞包括细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、激活的杀伤性单核细胞(AKM)、树突状细胞(DC)中的一种或几种。
本发明的第三个方面是提供第二方面中的通用型免疫细胞在制备免疫细胞制剂中的应用，该免疫细胞制剂的母体细胞为通用型免疫细胞。
进一步地，上述免疫细胞制剂包括CAR-T细胞或TCR-T细胞。
本发明的第四方面是提供一种免疫细胞制剂，该免疫细胞制剂以第二方面的通用型免疫细胞为母体细胞制备获得。
本发明的第五方面是提供一种用于过继性细胞免疫疗法的生物类药物，包括容器以及置于所述容器中的第四方面中的免疫细胞制剂。
进一步地，上述生物类药物还包括生理盐水、白蛋白以及其他稳定剂。
本发明的第六方面是提供本发明第四方面中的免疫细胞制剂在制备治疗和预防淋巴细胞功能和数量异常有关的疾病的药物中的应用。
进一步地，药物的给药途径为静脉、胸腔、腹腔、椎管内、皮内、皮下或瘤体内注射等。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明所采用的制备通用型免疫细胞的方法简便，易于操作，采用同种异体免疫细胞，可以提高免疫细胞制剂的质量、降低细胞疗法的成本和改善其安全性。此外，临床长期大量实际应用证明了该通用型免疫细胞安全可靠、持久有效、没有排异反应。因此，可作为其他类型通用型免疫细胞制剂的母体细胞，例如CAR-T、TCR-T或其他免疫细胞类型，用于过继性细胞免疫治疗等领域，解决了目前细胞免疫治疗成本高、安全性差、效率低等问题，为细胞免疫疗法的应用和推广提供了新的途径。
此外，本发明制备药物的方法，改变了传统疫苗的作用方式，传统疫苗是由病原生物或其抗原性物质制成，输入到人体后，免疫系统产生保护物质(如抗体)，免疫系统依循原有记忆制造更多保护物质来阻止病原菌伤害，本发明将包括具有免疫应答反应的细胞的治疗性疫苗输送的到机体内，直接提高机体免疫功能，不仅增加了机体抗肿瘤、抗HIV和肝炎病毒等病原菌感染、抗冠状病毒或其他类型病毒的能力，可用于治疗和预防癌症、艾滋病和病毒性肝炎，同时对于延缓衰老也有良好的效果。
附图说明
图1为本发明一效果实施例中基于Pathway分析，Cell 1的显著性差异基因通路的分布图；
图2为本发明一效果实施例中Cell 1和Cell 2信号通路之间的激活互相作用关系图；其中，内为阴影的圆圈为没有发生变化的信号通路，内为斜线的圆圈为Cell 1中激活的信号通路，空白圆圈为Cell 2中激活的信号通路；
图3为本发明一效果实施例中基于Pathway分析，Cell 2的显著性差异基因通路的分布图。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，通过大量的实验和摸索，本发明人发现将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养，可以制备出安全可靠、持久有效、没有排异反应的通用型免疫细胞(特别是CTL)，并可为其他类型的通用型免疫细胞制剂，例如CAR-T、TCR-T或其他免疫细胞类型的细胞免疫疗法提供低成本、安全可靠的母体细胞。
本发明的第一方面是提供一种简便的制备通用型免疫细胞的方法，将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养，获得大量通用型免疫细胞。该方法具体包括如下步骤：
步骤1，将同种异体的免疫细胞(例如单个核细胞)与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得具有高度免疫活性的通用型免疫细胞培养物；
步骤2，从步骤1中获得的培养物中分离具有免疫活性的细胞群；
其中，细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。
在本发明一优选的实施例中，上述细胞因子来源于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和转化生长因子中的任意一种或几种；在本发明一优选的实施例中，上述细胞因子选自白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-15、干扰素中的一种或几种。
在本发明一优选的实施例中，上述细胞因子为白细胞介素-2和/或干扰素。在共同培养过程中，同种异体单个核细胞由于受到细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂的刺激，也能自主分泌IL-2和其他细胞因子，因而对IL-2依赖性较低，甚至可以不需要IL-2。当然，在培养时，可以同时加入外源性IL-2，从而更加促进活化的T淋巴细胞大量扩增。
在本发明一优选的实施例中，为了获得具有免疫活性的细胞群的培养物，在进行培养时，上述细胞因子的浓度为20万-500万单位/L。在本发明一优选的实施例中，上述细胞因子的浓度为50万-200万单位/L。
在本发明一优选的实施例中，上述有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖中的任意一种或几种。
在本发明一优选的实施例中，为了获得具有免疫活性的细胞群的培养物，在进行培养时，上述有丝分裂原的浓度为10万-1000万单位/L。在本发明一优选的实施例中，上述有丝分裂原的浓度为50万-500万单位/L。
在本发明一优选的实施例中，为了获得具有免疫活性的细胞群的培养物，在进行培养时，上述有丝分裂原的浓度为0.1mg-10mg/L。在本发明一优选的实施例中，上述有丝分裂原的浓度为0.5mg-5mg/L。
在本发明一优选的实施例中，上述免疫佐剂选自生物性佐剂、无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂和弗氏佐剂中的任意一种或几种；为了获得具有免疫活性的细胞群的培养物，在进行培养时，免疫佐剂的浓度为0.01ml-1ml/L。在本发明一优选的实施例中，上述免疫佐剂的浓度为0.1ml-0.5ml/L。
在本发明一优选的实施例中，免疫细胞来源于外周血或脐带血。在本发明一优选的实施例中，免疫细胞来源于外周血。
在本发明一优选的实施例中，免疫细胞是异体细胞或自体细胞。在本发明一优选的实施例中，免疫细胞为异体细胞。
在本发明一优选的实施例中，为了获得活化的免疫细胞群的培养物，在进行培养时，上述免疫细胞的浓度为1×103-1×1011个/ml。在本发明一优选的实施例中，上述免疫细胞的浓度为1×105-1×109个/ml。
然而，不同类型的免疫细胞(即同种异体单个核细胞)与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂的比例可以是不同的，本领域人员可通过试验或免疫细胞的特性来确定合适的比例。
在本发明一优选的实施例中，上述具有免疫活性的细胞群包括细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、激活的杀伤性单核细胞(AKM)、树突状细胞(DC)。
在本发明一优选的实施例中，上述具有免疫活性的细胞群为淋巴细胞，如CTL、NK、CIK和B细胞等；在更优选的实施例中，上述具有免疫活性的细胞群为细胞毒T淋巴细胞。
在本发明一优选的实施例中，步骤1中的共同培养时间为3～180天；在本发明一优选的实施例中，步骤1中的共同培养时间为3-60天；在本发明一优选的实施例中，步骤1中的共同培养时间为7-28天；在更优选的实施例中，步骤1中的共同培养时间为14-21天。
在本发明一优选的实施例中，上述培养容器为三维大体积高密度细胞培养容器，但也可以是其它任意已知的培养容器，包括生物反应器。
在本发明一优选的实施例中，该方法还包括克隆步骤：以步骤1中得到的培养物，或者步骤2中得到的具有免疫活性的细胞为原料，在液态细胞培养基中进行克隆，得到具有免疫活性的细胞株。所述克隆采用间歇循环刺激法或连续刺激法。
本发明的第二方面是提供上述方法制备的通用型免疫细胞，该细胞包括细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、激活的杀伤性单核细胞(AKM)、树突状细胞(DC)中的一种或几种。
在本发明一优选的实施例中，上述通用型免疫细胞为淋巴细胞，如CTL、NK、CIK和B细胞等。在更优选的实施例中，上述通用型免疫细胞为细胞毒T淋巴细胞。
本发明的第三方面是提供第二方面中的通用型免疫细胞在制备免疫细胞制剂中的应用，该通用型免疫细胞作为免疫细胞制剂的母体细胞。
在本发明一优选的实施例中，上述免疫细胞制剂包括CAR-T细胞或TCR-T细胞；该免疫细胞制剂可用于过继性细胞免疫治疗、临床上可作为用于治疗和预防多种血液系统疾病和各种实体肿瘤的细胞类生物药物。
在本发明一优选的实施例中，上述血液系统疾病包括：1)红细胞疾病，如再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)等；2)白细胞疾病，如各种白血病、恶性淋巴瘤、恶性淋巴-网状细胞增生症、浆细胞病、组织细胞增生性疾病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性疾病(真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、骨髓纤维化)等。
在本发明一优选的实施例中，上述实体肿瘤可选自：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、各种小儿肿瘤等。
本发明的第四方面是提供一种免疫细胞制剂，该免疫细胞制剂以第二方面的通用型免疫细胞为母体细胞制备获得。
本发明的第五方面是提供一种用于过继性细胞免疫疗法的生物类药物，包括容器以及置于所述容器中的第四方面中的免疫细胞制剂。
在本发明一优选的实施例中，上述生物类药物还包括生理盐水、白蛋白以及其他稳定剂。
本发明的第六方面是提供本发明第四方面中的免疫细胞制剂在制备治疗和预防淋巴细胞的功能和数量异常有关的疾病的药物中的应用，包括但不限于如下领域的应用：肿瘤免疫、移植免疫、超敏免疫、自身免疫性疾病、免疫增生性疾病、免疫缺陷病、感染与免疫、衰老与免疫、生殖与免疫、生殖系统与免疫、免疫血液病、呼吸系统疾病与免疫、肾脏病与免疫、消化系统疾病与免疫、内分泌疾病与免疫、心血管系统疾病与免疫、结缔组织病、免疫皮肤病学、创伤与免疫、寄生虫病与免疫。例如治疗和预防肿瘤、艾滋病和病毒性肝炎等疾病，冠状病毒或其他类型病毒、或用于延缓衰老等)。
其中，上述药物可以为用于提高机体免疫功能的疫苗，或者是通过提高机体免疫功能而治疗疾病的药物。该疫苗和药物可制备成任意可用的剂型。
在本发明一优选的实施例中，所述药物的给药途径为静脉、胸腔、腹腔、椎管内、皮内、皮下、或瘤体内注射等。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种简便的制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：
源于正常人外周血的异体单个核细胞，与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态培养基中共同培养，其中，细胞有丝分裂原刀豆素在培养基中用量为10万单位/L；细胞因子白细胞介素-2在培养基中用量为50万单位/L；免疫佐剂(5％吐温-80)用量为0.5mL/L。
将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养30天，获得具有免疫活性的免疫细胞培养物，主要为细胞毒T淋巴细胞。
实施例2
本实施例提供一种简便的制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：
源于同种异体外周血中的单个核细胞，与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态培养基中共同培养，所述培养基包括：细胞有丝分裂原植物血凝素0.5mg/L；细胞因子干扰素500万单位/L；免疫佐剂(5％吐温-80)用量为0.1mL/L。
将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养30天，获得具有免疫活性的免疫细胞培养物，主要为细胞毒T淋巴细胞。
实施例3
本实施例提供一种简便的制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：
源于正常人脐带血的异体单个核细胞，与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态培养基中共同培养，其中，细胞有丝分裂原刀豆素在培养基中用量为100万单位/L；细胞因子白细胞介素-2在培养基中用量为100万单位/L；免疫佐剂(5％吐温-80)用量为0.1mL/L。
将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养45天，获得具有活化的免疫活性的免疫细胞培养物，主要为细胞毒T淋巴细胞。
实施例4
本实施例提供一种简便的制备通用型免疫细胞的方法，包括如下步骤：
源于同种异体脐带血中的单个核细胞，与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态培养基中共同培养，所述培养基包括：细胞有丝分裂原植物血凝素1mg/L；细胞因子干扰素300万单位/L；免疫佐剂(5％吐温-80)用量为0.5mL/L。
将同种异体单个核细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养60天，获得具有免疫活性的免疫细胞培养物，主要为细胞毒T淋巴细胞。
效果实施例1
以T淋巴细胞为例，采用上述方法可获得大量活化扩增的免疫细胞。使用组合标签法单细胞全基因表达测序法和全基因基因表达测序法。特征基因筛选分析2组不同的免疫效应细胞：Cell 2是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养8天；Cell1是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养26天。以下结果为采用两种检测分析方法共同发现的免疫细胞全基因特征(表1)。
表1免疫细胞的全基因特征信息
基因 log2FoldChange Cell类型 分子说明
CFTR 4.91 Cell 1 囊性纤维化跨膜传导调节因子
CFH 4.73 Cell 1 补体因子H
FGR 1.95 Cell 1 FGR原癌基因，Src家族络氨酸激酶
TMEM176A -1.92 Cell 2 跨膜蛋白176A
KLHL13 -5.56 Cell 2 Kelch样蛋白13
CD38 -6.28 Cell 2 CD38分子
在研究两组样本差异时，我们把差异基因作为研究对象，进行进一步的研究。利用DESeq2对两组进行比较，得到样本间的Marker基因差异倍数(Fold-change)；本分析中将两组进行比较，进行差异基因筛选，筛选条件为Fold change经过log转换为log2FoldChange，选择log2FoldChange>1.9或<-1.9的基因作为标志性基因，由表1可知，这些基因的差异表达特征明显。
效果实施例2
以T淋巴细胞为例，采用上述方法，本发明可获得大量活化扩增的免疫细胞。Cell1是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养26天；然后进行Pathway分析。
系统分析基因(及其编码产物)间关系、基因功能、基因组信息的数据库，有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。KEGG提供的整合代谢途径(pathway)，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解。KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。目前KEGG Pathway分为8个类别，分别为总体网络、代谢过程、遗传信息传递、环境信息传递、胞内生物过程、生物体系统、人类疾病及药物研发八大类。
Pathway分析基于KEGG数据库，对差异基因利用Fisher精确检验和卡方检验，把目标基因参与的Pathway进行显著性分析，按照p value<0.05进行筛选，得到显著性的Pathway。根据分析结果中上、下调显著性的差异基因通路中每一差异基因通路的显著性水平(p value)和所包含的差异基因数量可以据此构建显著性差异基因通路的分布图。图中纵坐标为差异基因通路名称，横坐标为p value的负对数(-LgP)，其值越大表明p value越小，亦即该差异基因通路显著性水平越高，气泡的大小代表通路中包含差异基因数量的多少。为了方便研究者查看，我们对部分(p value小于0.05的部分；如果p value小于0.05的部分较多，则只显示p value较小的前30项)上调和下调的显著性差异基因功能分别做了气泡图。以上调显著性通路图为例，展示显著性部分结果如图1所示。
由图1可知，其中有两个信号通路富集有标志性基因，这两个通路分别是：Hematopoietic cell lineage(造血细胞系)信号通路以及Cytokine-cytokine receptorinteraction(细胞因子相互作用)信号通路，这两个信号通路是Cell 1激活的主要特征通路。
效果实施例3
以T淋巴细胞为例，采用上述方法，本发明可获得大量活化扩增的免疫细胞。Cell1是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养26天，Cell2是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养8天；然后分析Cell 1和Cell 2信号通路之间的激活互相作用关系，结果如图2所示。
在图2中，这些效应导致信号通路形成激活传递网络，从而级联诱发免疫细胞表型。我们分析所有免疫信号通路后，发现造血细胞谱系信号通路作为Cell 1的标志性通路，接受来自上游信号通路的刺激，是非常重要的效应型信号通路，而细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路更是作为众多上游信号通路刺激的核心效应目标。
效果实施例4
以T淋巴细胞为例，采用上述方法，本发明可获得大量活化扩增的免疫细胞。Cell2是免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂共同培养8天，然后进行Pathway分析(如图3)，同理，我们分析了Cell 2激活的主要信号通路为ECM受体交互作用(receptorinteraction)信号通路，其标志性基因的富集程度最为明显(-LgP最大)：根据分析结果中上、下调显著性的差异基因通路中每一差异基因通路的显著性水平(p value)和所包含的差异基因数量可以据此构建显著性差异基因通路的分布图。图中纵坐标为差异基因通路名称，横坐标为p value的负对数(-LgP)，其值越大表明p value越小，亦即该差异基因通路显著性水平越高。其中，颜色的深浅代表了上下调的程度以及该信号通路中基因的加和效应，而气泡的大小代表通路中包含差异基因数量的多少。
通过信号通路激活网络发现，ECM受体交互作用(receptor interaction)信号通路在Cell 2中的局部粘连(Focal adhesion)信号通路激活并反向再次强化局部粘连信号通路。
效果实施例5
以T淋巴细胞为例，采用上述方法，本发明可获得大量活化扩增的免疫细胞，利用
Figure BDA0002634415930000131
Rigel荧光分析仪，AOPI染料法对PBMC样品进行细胞浓度活率的检测，具体结果如下表2所示：
表2活化的免疫细胞(
Figure BDA0002634415930000132
Rigel荧光分析仪，AOPI法)
Figure BDA0002634415930000141
流式细胞仪分析免疫细胞亚群显示样品1、2和3的CD8+T淋巴细胞分别为95.34％、96.9％和96.2％。这些结果和我们先前采用类似方法所获得的结果类似：CD8+T淋巴细胞增多，可达95％以上，其中主要是CD45RO阳性细胞，约为93％，强烈提示所获得的免疫效应细胞属于细胞毒T淋巴细胞(CTL)。
效果实施例6
以本发明提供的方法制备的通用型免疫细胞输入受试者体内，以验证其安全性和有效性。
受试者信息：刘某，男性，65岁，近二年每隔三个月静脉输注一个疗程的上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞。每个疗程分为三次静脉回输，每隔一天回输一次，每次回输的细胞数量范围为5×108～1×1010。
效果：整个过程中耐受好，未出现任何皮肤、肝脏和肠道等器官或系统的与排异反应相关的临床症状和体征，例如皮疹、黄疸和腹泻等。并且，输入上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞后，体现出十大好处：(1)老年斑减轻；(2)皮肤质地改善；(3)慢性湿疹消失；(4)白头发减少；(5)记忆力增强；(6)血脂轻度下降；(7)糖化血红蛋白从轻度升高到恢复正常；(8)口腔粘膜溃疡不发；(9)关节损伤减轻；(10)精力旺盛。
效果实施例7
以本发明提供的方法制备的通用型免疫细胞输入受试者体内，以验证其安全性和有效性。
受试者信息：薛某某，男性，56岁，肝癌患者。静脉输注上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞近四年。最初每个月静脉输注一个疗程，每个疗程分为五次静脉回输，二年后改为每隔一个月静脉输注一个疗程，每个疗程仍为五次静脉回输，每隔一天回输一次。每次回输的细胞数量范围为5×108～1×109。
效果：整个过程中耐受好，除偶尔有短暂发热外，未观察到其他不良反应。反复检查血常规、肝功能和肾功能均无特殊异常发现。各项检查，包括影像学检查表明肿瘤处于完全缓解。
效果实施例8
以本发明提供的方法制备的通用型免疫细胞输入受试者体内，以验证其安全性和有效性。
受试者信息：王某某，女性，75岁，结肠癌患者。每个月接受静脉输注一次上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞，历时近十年，每次静脉回输的细胞数量为5×109。
效果：整个过程中耐受好，未观察到任何不良反应。未出现任何皮肤、肝脏和肠道等器官或系统的临床症状和体征，例如皮疹、黄疸和腹泻等。反复检查血常规、肝功能和肾功能均无特殊异常发现。临床上没有任何特殊症状和体征，各项血液学检查和肿瘤标记物正常。肠镜复查无特殊异常发现。患者主诉平时感冒明显减少。
效果实施例9
以本发明提供的方法制备的通用型免疫细胞输入受试者体内，以验证其安全性和有效性。
受试者信息：李某某，男性，70岁。恶性黑色素瘤患者。四年间通过多种途径，包括静脉回输、腹腔输注和皮下(瘤内)注射上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞。最初为每二周一疗程，后来过渡为每个月、每三个月或每六个月一疗程。每个疗程分为四次回输，每隔一天输注一次，每次回输的细胞数量范围为5×108～1×109。
效果：整个过程中耐受好，除皮下注射时有疼痛感，未观察到其他不良反应。反复检查血常规、肝功能和肾功能均无特殊异常发现；未出现任何皮肤、肝脏和肠道等器官或系统的临床症状和体征，例如皮疹、黄疸和腹泻等。患者为晚期恶性黑色素瘤，手术后复发转移，化疗无效。采用上述方法制备的同种异体通用型免疫细胞单一治疗，肿瘤控制良好。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (23)

1.一种制备通用型免疫细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将同种异体的免疫细胞与细胞有丝分裂原、细胞因子和免疫佐剂在液态细胞培养基中置于培养容器中共同培养，从而获得通用型免疫细胞培养物；
步骤2，从步骤1中获得的所述培养物中分离中出细胞群；
其中，所述细胞因子来源于淋巴细胞、单核细胞和其他细胞产生的淋巴因子、单核因子、激活炎症的细胞因子和刺激造血的细胞因子中的任意一种或几种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子来源于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化性细胞因子和转化生长因子中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-15、干扰素中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子的浓度为20万-500万单位/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞因子的浓度为50万-200万单位/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原选自刀豆素、植物血凝素、美洲商陆、脂多糖、葡聚糖中的任意一种或几种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原的浓度为10万-1000万单位/L。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述有丝分裂原的浓度为0.1mg-10mg/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫佐剂选自生物性佐剂、无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂和弗氏佐剂中的任意一种或几种，浓度为0.01ml-1ml/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为异体细胞或自体细胞，来源于外周血或脐带血。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞的浓度为1×103-1×1011个/ml。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞群包括细胞毒T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、树突状细胞的一种或几种。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的共同培养时间为3～180天。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养容器为三维大体积高密度细胞培养容器。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括克隆步骤：以步骤1中得到的所述培养物，或者步骤2中得到的所述细胞群为原料，在液态细胞培养基中进行克隆得到细胞株；
所述克隆采用间歇循环刺激法或连续刺激法。
16.一种如权利要求1-15任一项所述方法制备的通用型免疫细胞，其特征在于，包括细胞毒T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、树突状细胞中的一种或几种。
17.一种如权利要求16所述通用型免疫细胞在制备免疫细胞制剂中的应用，其特征在于，所述免疫细胞制剂的母体细胞为所述通用型免疫细胞。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞制剂包括CAR-T细胞或TCR-T细胞。
19.一种免疫细胞制剂，其特征在于，以如权利要求16所述的通用型免疫细胞为母体细胞制备获得。
20.一种用于过继性细胞免疫疗法的生物类药物，其特征在于，包括容器以及置于所述容器中的如权利要求11所述的免疫细胞制剂。
21.根据权利要求20所述的生物类药物，其特征在于，还包括生理盐水、白蛋白以及其他稳定剂。
22.如权利要求19所述的免疫细胞制剂在制备治疗和预防淋巴细胞功能和数量异常有关的疾病的药物中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为静脉、胸腔、腹腔、椎管内、皮内、皮下或瘤体内注射。
CN202010821035.7A 2020-08-14 2020-08-14 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用 Pending CN111876382A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010821035.7A CN111876382A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010821035.7A CN111876382A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111876382A true CN111876382A (zh) 2020-11-03

Family

ID=73203798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010821035.7A Pending CN111876382A (zh) 2020-08-14 2020-08-14 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111876382A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114908051A (zh) * 2022-05-12 2022-08-16 洪纪宪 一种逆转生物年龄制剂及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101626781A (zh) * 2006-11-22 2010-01-13 刘华 制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法
CN102847144A (zh) * 2012-09-20 2013-01-02 上海星华生物医药科技有限公司 一种提高机体免疫功能的细胞类生物药物、及其制备方法和应用
CN102847143A (zh) * 2012-09-20 2013-01-02 上海星华生物医药科技有限公司 异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的细胞类生物药物及制备方法
CN107074969A (zh) * 2014-09-09 2017-08-18 优努姆治疗公司 嵌合受体及其在免疫治疗中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101626781A (zh) * 2006-11-22 2010-01-13 刘华 制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法
CN102847144A (zh) * 2012-09-20 2013-01-02 上海星华生物医药科技有限公司 一种提高机体免疫功能的细胞类生物药物、及其制备方法和应用
CN102847143A (zh) * 2012-09-20 2013-01-02 上海星华生物医药科技有限公司 异基因过继性细胞免疫治疗血液系统疾病的细胞类生物药物及制备方法
CN107074969A (zh) * 2014-09-09 2017-08-18 优努姆治疗公司 嵌合受体及其在免疫治疗中的应用
US20170281682A1 (en) * 2014-09-09 2017-10-05 Unum Therapeutics Inc. Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114908051A (zh) * 2022-05-12 2022-08-16 洪纪宪 一种逆转生物年龄制剂及其制备方法
WO2023216341A1 (zh) * 2022-05-12 2023-11-16 洪纪宪 一种逆转生物年龄制剂及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bernareggi et al. Development of innate immune cells from human pluripotent stem cells
CN103923879B (zh) 一种nk细胞因子混合物的制备方法及其应用
Arellano et al. Clinical uses of GM-CSF, a critical appraisal and update
CN108676775B (zh) 一种体外扩增脐血nk的方法
CN112424343B (zh) 从脐带血产生cik nkt细胞
Meng et al. Rapid expansion in the WAVE bioreactor of clinical scale cells for tumor immunotherapy
US20210361711A1 (en) CIML NK cells and Methods Therefor
US10125351B2 (en) Industrial preparations of natural killer (NK) cells and injections containing NK cells
WO2021213236A1 (zh) 一种通用型供临床多次回输异体dnt细胞的高效体外扩增方法
Fagan et al. Immunotherapy for cancer: the use of lymphokine activated killer (LAK) cells
CN111876382A (zh) 一种制备通用型免疫细胞的方法及其应用
CN109439627A (zh) 一种极化和扩增cd4+t细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用
CN106399241A (zh) 体外扩增γδT细胞的培养基和方法
JP7618295B2 (ja) ユニバーサル免疫細胞の製造方法及びその応用
CN105106237A (zh) 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂
US20250163376A1 (en) Method for inducing and amplifying stem memory t cell in vitro
Bai et al. Effects of dendritic cell-activated and cytokine-induced killer cell therapy on 22 children with acute myeloid leukemia after chemotherapy
Andreesen et al. Adoptive immunotherapy with autologous macrophages: current status and future perspectives
Lotzová et al. Function of Interleukin-2-Activated NK Cells in Leukemia Resistance and Treatment
CN106565828B (zh) 诱导dc-cik细胞的多肽及其在肿瘤细胞治疗中的应用
EP2053123B1 (en) Method of proliferating lak cell
CN114657124A (zh) 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法
CN102813916A (zh) 一种快速获取树突状细胞疫苗的制备方法及其应用
CN114517181B (zh) 一种人t淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用
TWI729550B (zh) 體外擴增暨活化自然殺手細胞之方法及其醫藥組合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination