CN111868244A

CN111868244A - 降低了毒性的反义寡核苷酸

Info

Publication number: CN111868244A
Application number: CN201980019422.4A
Authority: CN
Inventors: 正木庆昭; 清尾康志; 井上敦; 入山友辅; 金木达朗; 中嶋宏之
Original assignee: Nissan Chemical Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Nissan Chemical Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2020-10-30
Also published as: MX2020009765A; US20210054377A1; CA3094303A1; AU2019237599A1; JPWO2019182037A1; EP3770256A1; WO2019182037A1; BR112020018902A2; EP3770256A4

Abstract

提供降低了毒性的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸，其是具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域的反义寡核苷酸，其特征在于，在中央区域具有将糖部分的2’位与3’位桥联而成的核苷酸(2’‑3’桥联核苷酸)及/或在3’位具有取代基的非桥联的核苷酸(3’位修饰非桥联核苷酸)。

Description

降低了毒性的反义寡核苷酸

技术领域

本发明涉及降低了毒性的反义寡核苷酸。

背景技术

核酸医药是包含形成与作为靶标的DNA或RNA互补的碱基对的核酸(寡核苷酸)的医药品，其作为新型医药品而备受期待。并且，作为核酸医药中使用的核酸单元，开发了各种人造核酸单元(人造核苷或作为其磷酸加成物的人造核苷酸)。例如，通过将核糖核苷酸的糖部2’位的氧原子进行甲氧基乙基(MOE)化，从而与靶核酸的亲和性、及核酸酶耐性得以提高是已知的(例如，参见专利文献1)。另外，2’,4’-BNA及2’,4’-LNA是将核酸单元的糖部分的2’位与4’位桥联而成的化合物，其与靶核酸的高亲和性是已知的(例如，参见专利文献2～5)。此外，将2’位与3’位桥联而成的核苷酸(2’-3’桥联核苷酸)、向糖部3’位碳原子的β位引入烷基而成的核苷酸(3’位修饰非桥联核苷酸)也是已知的。研究了将这些人造核酸导入DNA链对于RNaseH的RNA链切割活性所造成的影响(例如，参见非专利文献1及2)。

对在单链寡脱氧核糖核苷酸的两个末端导入人造核酸单元而成的间隔体(gapmer)型反义核酸进行了开发。已知间隔体型反义核酸与靶RNA形成双链复合体，细胞内的RNaseH识别脱氧核糖核苷酸部分与靶RNA形成的双链部分，对RNA链进行切割。

为了在临床上应用间隔体型反义核酸，要求高序列特异性。然而，近年来，报道了由脱靶效应导致的毒性(例如，参见非专利文献3及4)。脱靶效应是由于反义核酸与靶标以外的具有类似序列RNA形成双链复合体、从而该靶标以外的RNA被切割而发生的。然而，没有与降低这样的毒性的修饰方法相关的报道。

另外，将具有单核苷酸多态性(SNP)的基因作为靶标的情况下，要求针对野生型的突变型选择性，报道了使用了糖部被氟修饰而成的人造核酸的研究(例如，参见非专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平7-2889号公报

专利文献2：国际公开第98/39352号

专利文献3：国际公开第2009/006478号

专利文献4：国际公开第2011/052436号

专利文献5：国际公开第2015/125783号

非专利文献：

非专利文献1：Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2008,18,pp 2296-2300

非专利文献2：The Journal of Biological Chemistry,2004,279,pp 36317-36326

非专利文献3：Nucleic Acids Research,2016,44,pp 2093-2109

非专利文献4：Scientific Reports,2016,6,30377

非专利文献5：Molecular Therapy-Nucleic Acids,2017,7,pp 20-30

发明内容

发明所要解决的课题

需要降低间隔体型反义核酸中由“脱靶效应”引起的毒性的新技术。

另外，将单核苷酸多态性(SNP)部分作为靶标的情况下，要求针对野生型的突变型选择性提高，但间隔体型反义核酸的序列仅包含与野生型RNA的序列的一个碱基的错配，仍然难以得到野生型/突变型的选择性。因为，需要解决该问题的新技术。

本发明的目的在于提供降低了毒性的反义寡核苷酸。

用于解决课题的手段

本申请的发明人发现，在中央区域具有将糖部分的2’位与3’位桥联而成的核苷酸(2’-3’桥联核苷酸)及/或在3’位具有取代基的非桥联的核苷酸(3’位修饰非桥联核苷酸)的间隔体型反义核酸的毒性低，且具有高序列选择性，从而完成了本发明。需要说明的是，虽然已报道了一部分的糖部修饰核苷酸的使用会对来自RNaseH的RNA链切割活性造成影响，但既没有报道这些核苷酸会降低由脱靶效应导致的毒性，也没有报道对来自RNaseH的RNA链切割活性的控制与降低由脱靶效应导致的毒性之间的关系。通过控制切割位置能够降低由脱靶效应导致的毒性是由本发明发现的。即，本发明包括以下的方式。

1.反义寡核苷酸，其是具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域的反义寡核苷酸，

其中，

-中央区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少5个核苷酸组成，包含至少一个选自由2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的糖部修饰核苷酸，其3’末端及5’末端各自独立地为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸或3’位修饰非桥联核苷酸，并且，

包含至少一段由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链；

-5’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其3’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该3’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

不包含由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链；

-3’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其5’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该5’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

不包含由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链。

2.如1.所述的反义寡核苷酸，其中，所述中央区域由5～15个核苷酸组成，

所述5’侧区域及所述3’侧区域各自独立地由1～7个核苷酸组成。

3.如1或2.所述的反义寡核苷酸，其中，所述中央区域由8～12个核苷酸组成，

所述5’侧区域及所述3’侧区域各自独立地由2～5个核苷酸组成。

4.如1.至3.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸为包含下式(I)表示的部分结构的核苷酸，

[化学式1]

(式(I)中，m为1、2、3或4，

Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

-Q-各自独立地为-CR⁴R⁵-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NR⁶)-、-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，

m为2、3或4时，2个相邻的-Q-可连接在一起形成式-CR⁷＝CR⁸-表示的基团，

R¹、R²、R³、R⁴及R⁵各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，所述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组，J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团；

R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团，

R⁷及R⁸各自独立地为氢原子或C1-C6烷基)。

5.如1.至3.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的3’位修饰非桥联核苷酸为包含下式(II)表示的部分结构的核苷酸，

[化学式2]

(式(II)中，Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

R¹²为C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，所述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组；

R¹、R²、R³及R¹¹各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，所述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组；

J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团)。

6.如4.所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸为下式(III)表示的核苷酸，

[化学式3]

(式(III)中，Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

-Q¹-及-Q²-各自独立地为-CR⁴R⁵-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NR⁶)-、-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，或者，

-Q¹-Q²-为-CR⁷＝CR⁸-；并且，式中，R⁷及R⁸独立地为氢原子或C1-C6烷基，

R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团)。

7.如6.所述的反义寡核苷酸，其中，-Q¹-为-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，R⁶为C1-C12烷基，-Q²-为-CH₂-。

8.如6.或7.所述的反义寡核苷酸，其中，-Q¹-为-O-，-Q²-为-CH₂-。

9.如4.至8.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，R¹、R²及R³为氢原子。

10.如4.至9..中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，X为O。

11.如1.至10.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，

所述中央区域为间隔区域(gap region)，

所述5’侧区域为5’翼区域(wing region)，

所述3’侧区域为3’翼区域。

12.如1.至11.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，所述5’侧区域及所述3’侧区域所包含的糖部修饰核苷酸各自独立地选自由2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA组成的组。

13.如12.所述的反义寡核苷酸，其中，所述2’位修饰非桥联核苷酸为选自由2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟代核苷酸、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸及2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸组成的组中的至少一者。

14.如12.所述的反义寡核苷酸，其中，所述2’,4’-BNA为选自由LNA、cEt-BNA、ENA、BNA^NC、AmNA及scpBNA组成的组中的至少一者。

15.如1.至14.中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，反义寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。

16.如1.至15.中任一项所述的反义寡核苷酸，其还包含来源于功能性分子的基团，所述功能性分子具有选自由标记功能、纯化功能及向靶标部位递送的功能组成的组中的至少1种功能。

17.如16.所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子选自由糖、脂质、肽及蛋白质以及它们的衍生物组成的组。

18.如16.或17.所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为选自由胆固醇、生育酚及生育三烯酚组成的组中的脂质。

19.如16.或17.所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为与脱唾液酸糖蛋白受体相互作用的糖衍生物。

20.如16.或17.所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为选自由受体的配体及抗体组成的组中的肽或蛋白质。

21.1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸的前体药物。

22.寡核苷酸复合体，其包含：

(i)1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸；及

(ii)寡核苷酸，其包含下述区域，所述区域包含至少1个核糖核苷酸，且可与所述(i)的反义寡核苷酸进行杂交。

23.寡核苷酸，其包含：

(i)来源于1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸的基团；及

(ii)来源于包含下述区域的寡核苷酸的基团，所述区域包含至少1个核糖核苷酸，且可与所述(i)的反义寡核苷酸进行杂交，

所述寡核苷酸是将所述(i)来源于反义寡核苷酸的基团、与所述(ii)来源于寡核苷酸的基团连接而成的。

24.寡核苷酸复合体，其包含：

(iii)寡核苷酸，其在来源于1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

(iv)寡核苷酸，其包含下述寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸，

其中，

所述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链、与所述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的寡核苷酸链进行杂交。

25.寡核苷酸，其包含：

(iii)来源于寡核苷酸的基团，所述寡核苷酸在来源于1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

(iv)来源于寡核苷酸的基团，所述寡核苷酸包含下述寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸，

其中，所述(iii)来源于寡核苷酸的基团与所述(iv)来源于寡核苷酸的基团连接，

所述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链与所述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的寡核苷酸链进行杂交。

26.医药组合物，其含有：药理学上允许的载体；和1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸、21.所述的前体药物、22.或24.所述的寡核苷酸复合体、或者23.或25.所述的寡核苷酸

27.对靶RNA的功能加以控制的方法，其包括下述步骤：使细胞与1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸、21.所述的前体药物、22.或24.所述的寡核苷酸复合体、或者23.或25.所述的寡核苷酸接触。

28.对哺乳动物中的靶RNA的功能加以控制的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施予26.所述的医药组合物。

29.对靶基因的表达加以控制的方法，其包括下述步骤：使细胞与1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸、21.所述的前体药物、22.或24.所述的寡核苷酸复合体、或者23.或25.所述的寡核苷酸接触。

30.对哺乳动物中的靶基因的表达加以控制的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施予26.所述的医药组合物。

31.使用选自由2’-3’桥联核苷酸、及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的核苷酸来制造1.至20.中任一项所述的反义寡核苷酸或21.所述的前体药物的方法。

发明效果

通过本发明，可提供降低了毒性的反义寡核苷酸。

附图说明

[图1]为表示本实施方式涉及的反义寡核苷酸(实施例1)对于小鼠脑内皮细胞中的SOD-1的表达水平的影响的图。

[图2]为表示本实施方式涉及的反义寡核苷酸(实施例1)对于小鼠脑内皮细胞的细胞存活率的影响的图。

[图3]为表示本实施方式涉及的反义寡核苷酸(实施例2)对于小鼠脑内皮细胞的细胞存活率的影响的图。

[图4]为表示针对反义寡核苷酸(比较例1)对于小鼠脑内皮细胞中的基因表达量变化的影响进行综合性分析的结果的图。

[图5]为表示本实施方式涉及的反义寡核苷酸(实施例1)对于小鼠脑内皮细胞中的基因表达量变化的影响进行综合性分析的结果的图。

具体实施方式

除特别说明的情况之外，本说明书中所用的用语以该领域中通常所用的含义来使用。以下，对本说明书中使用的各用语进行说明。需要说明的是，本说明书中，各用语在单独使用的情况下、或在与其他用语一同使用的情况下，只要没有特别说明，则具有相同的意义。

“n-”表示正，“i-”表示异，“s-”表示仲，“t-”表示叔，“m-”表示间，“p-”表示对。“Ph”表示苯基，“Me”表示甲基，“Pr”表示丙基，“Bu”表示丁基，“DMTr”表示二甲氧基三苯甲基。

被保护基团取代而得的官能团表示官能团所具有的氢原子被保护基团取代而得的官能团。

所谓“卤素原子”，是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。

所谓“C1-C12烷基”，是指碳原子数为1至12的直链或支链状的饱和脂肪族烃的1价基团。作为C1-C12烷基，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。

所谓“C1-C6烷基”，表示前述“C1-C12烷基”之中的、碳原子数为1至6的直链或支链状的饱和脂肪族烃的1价基团。作为C1-C6烷基，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基等。同样地，所谓“C1-C3烷基”，表示碳原子数为1至3的直链或支链状的饱和脂肪族烃的1价基团。

所谓“卤代C1-C6烷基”，表示前述“C1-C6烷基”的任意位置的氢原子中的至少1个被前述“卤素原子”取代而得的基团。

所谓“C2-C6链烯基”，表示包含至少1个碳-碳双键的、碳原子数为2至6的直链或支链状的不饱和脂肪族烃的1价基团。作为C2-C6链烯基，可举出例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基、戊烯基、异戊烯基、戊二烯基、己烯基、异己烯基、己二烯基等。

所谓“C2-C6炔基”，表示包含至少1个碳-碳三键的、碳原子数为2至6的直链或支链状的不饱和脂肪族烃的1价基团。作为C2-C6炔基，可举出例如乙炔基、炔丙基、3-丁炔基或4-戊炔基等。

所谓“酰基”，表示氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基或芳基与羰基(-C(＝O)-)键合而成的基。作为酰基，可举出例如甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基等。

所谓“卤代酰基”，表示前述“酰基”的任意位置的氢原子中的至少1个被前述“卤素原子”取代而得的基团。

所谓“酰胺基”，表示氨基羰基(-CONH₂)基、或氨基羰基中的至少1个氢原子被独立地选自由C1-C6烷基、C2-C6链烯基及芳基组成的组中的基团取代而得的基团。作为酰胺基，可举出例如氨基甲酰基、甲基氨基羰基、异丙基氨基羰基、苯基氨基羰基等。

所谓“C1-C6烷氧基”，表示前述“C1-C6烷基”与氧基(-O-)键合而成的基团。作为C1-C6烷氧基，可举出例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基等。

所谓“C1-C6烷基硫基”，表示前述“C1-C6烷基”与硫基(-S-)键合而成的基团。作为C1-C6烷基硫基，可举出例如甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、异丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基、正戊基硫基、异戊基硫基、正己基硫基等。

所谓“C2-C50亚烷基”，表示碳原子数为2至50的直链或支链状的饱和脂肪族烃的2价基团。

所谓“C2-C20亚烷基”，表示碳原子数为2至20的直链或支链状的饱和脂肪族烃的2价基团。

所谓“C8-C12亚烷基”，表示前述“C2-C20亚烷基”之中的、碳原子数为8至12的直链或支链状的饱和脂肪族烃的2价基团。

所谓“C2-C6亚烷基”，表示前述“C2-C20亚烷基”之中的、碳原子数为2至6的直链或支链状的饱和脂肪族烃的2价基团，作为例子，可举出亚乙基(乙烷二基)、亚丙基、丙烷-1,3-二基(三亚甲基)、丙烷-2,2-二基(异亚丙基)、2,2-二甲基-丙烷-1,3-二基、己烷-1,6-二基(六亚甲基)及3-甲基丁烷-1,2-二基等。

所谓“C2-C20亚链烯基”，表示碳原子数为2至20的、包含至少1个碳-碳双键的、直链或支链状的不饱和脂肪族烃的2价基团。

所谓“单C1-C6烷基氨基”，表示氨基(NH₂)中的1个氢原子被前述“C1-C6烷基”取代而得的基团，可举出例如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、异丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基、正戊基氨基、正己基氨基及异己基氨基。

所谓“二C1-C6烷基氨基”，表示氨(NH₂)基中的2个氢原子被相同或不同的2个前述“C1-C6烷基”取代而得的基团，可举出例如二甲基氨基、二乙基氨基、二正丙基氨基、二异丙基氨基、二正丁基氨基、二正戊基氨基、二正己基氨基、N-甲基-N-乙基氨基、及N-甲基-N-异丙基氨基。

“C1-C6烷基羰基”、“卤代C1-C6烷基羰基”、“C1-C6烷氧基羰基”、“单C1-C6烷基氨基羰基”及“二C1-C6烷基氨基羰基”分别表示前述“C1-C6烷基”、“卤代C1-C6烷基”、“C1-C6烷氧基”、“单C1-C6烷基氨基”及“二C1-C6烷基氨基”与羰基(-C(＝O)-)基键合而成的基团。

“C1-C6烷基磺酰基”、“卤代C1-C6烷基磺酰基”、“C1-C6烷氧基磺酰基”、“单C1-C6烷基氨基磺酰基”及“二C1-C6烷基氨基磺酰基”分别表示前述“C1-C6烷基”、“卤代C1-C6烷基”、“C1-C6烷氧基”、“单C1-C6烷基氨基”及“二C1-C6烷基氨基”与磺酰基(-S(O)₂-)键合而成的基团。

核糖核苷基”是指碱基结合于核糖的1’位的碳原子上、且除去了该核糖的3’位及5’位的羟基的基团。本发明中的核糖核苷基的碱基部分可以是天然存在的碱基，也可以是天然存在的碱基经修饰而成的碱基。前述碱基部分的修饰可以针对1个核糖核苷基而组合实施多种。前述修饰记载于例如《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，第21期，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal ChemistryCommunications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future MedicinalChemistry)(2011年，第3卷，第3期，339-365页)中。

脱氧核糖核苷基”是指碱基结合于2’-脱氧核糖的1’位的碳原子上、且除去了该2’-脱氧核糖的3’位及5’位的羟基的基团。本发明中的脱氧核糖核苷基的碱基部分可以是天然存在的碱基，也可以是天然存在的碱基经修饰而成的碱基。前述碱基部分的修饰可以针对1个脱氧核糖核苷基而组合实施多种。前述修饰记载于例如《药物化学杂志》(Journalof Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，第21期，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal Chemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)(2011年，第3卷，第3期，339-365页)等中。

所谓“氧代”，表示氧原子介由双键进行取代的基团(＝O)。氧代在碳原子上进行了取代的情况下，与该碳原子连接在一起形成羰基。

所谓“硫代”，表示氧原子介由双键进行取代的基团(＝S)。硫代基在碳原子上进行了取代的情况下，与该碳原子连接在一起形成硫羰基。

羟基保护基团、氨基保护基团只要在合成反义寡核苷酸时稳定即可，因此没有特别限定，可举出例如本领域技术人员熟知的《有机合成中的保护基团》(Protective Groupsin Organic Synthesis)，第4版，T.W.Greene、P.G.M.Wuts著，John Wiley&Sons Inc.(2006年)等中记载的保护基团。例如，作为“氨基保护基团”，可举出：酰基(可举出例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基(Pv)、巴豆酰基等)、卤代酰基(可举出例如氟乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基等)、芳基羰基(可举出例如苯甲酰基、对溴苯甲酰基、对硝基苯甲酰基、2,4-二硝基苯甲酰基等)等酰胺系保护基团；C1-C6烷氧基羰基(可举出例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基、正丁氧基羰基、异丁氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、叔戊氧基羰基，可优选举出Boc等)、C2-C6链烯基氧基羰基(可举出例如乙烯基氧基羰基(Voc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)等)、三(C1-C3烷基)甲硅烷基乙氧基羰基(可举出例如2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(Teoc)等)、卤代C1-C6烷氧基羰基(可举出例如2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)等)、芳基氧基羰基(可举出例如苄氧基羰基(Z或Cbz)、对硝基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基(Moz)等)等氨基甲酸酯系保护基团；及烷基磺酰基(可举出例如甲磺酰基(Ms)、乙磺酰基等)、芳基磺酰基(可举出例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基(Ts)、对氯苯磺酰基、对甲氧基苯磺酰基(MBS)、间硝基苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基、对硝基苯磺酰基、2,4-硝基苯磺酰基、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰基(iMds)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mds)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰基(Mtb)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mte)、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰基(Mtr)、2,4,6-三甲基苯磺酰基(Mts)、五甲基苯磺酰基(Pme)等)等磺酰胺系保护基团等。

关于本发明中的“羟基保护基团”及“氨基保护基团”的保护及去保护，可参见《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第4版，T.W.Greene、P.G.M.Wuts著，John Wiley&Sons Inc.(2006年)等。

所谓“反义效果”是指：通过与靶基因对应地选择的靶RNA、和例如具有与其部分序列互补的序列的寡核苷酸进行杂交，从而对靶RNA的功能加以控制。例如，在靶RNA为mRNA的情况下是指：通过杂交而抑制前述靶RNA的翻译；外显子遗漏(exon skipping)等剪接功能转换效果；通过已杂交的部分被识别而使得前述靶RNA被分解；等等。

“反义寡核苷酸”是产生前述反义效果的寡核苷酸。可举出例如DNA及寡脱氧核糖核苷酸等，但不限于此，也可以是RNA、寡核糖核苷酸或以通常会产生反义效果的方式设计而成的寡核苷酸等。关于反义核酸也是同样。

“靶RNA”是指mRNA、mRNA前体或ncRNA，包括由编码靶基因的基因组DNA转录的mRNA、未经碱基的修饰的mRNA、未经剪接的mRNA前体及ncRNA等。作为通过反义效果而控制了功能的“靶RNA”，没有特别限制，可举出与在各种疾病中表达亢进的基因相关的RNA。“靶RNA”可以是由DNA依赖性RNA聚合酶合成的任何RNA，优选为mRNA或mRNA前体。更优选为哺乳动物的mRNA或mRNA前体，进一步优选为人的mRNA或mRNA前体，特别优选为人的mRNA。

所谓“杂交”，是指使包含互补的序列的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团彼此形成双链的行为、及包含互补的序列的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团彼此形成双链的现象。

所谓“互补的”，是指2个核酸碱基能够介由氢键而形成沃森-克里克(Watson-Crick)型碱基对(天然型碱基对)或非沃森-克里克型碱基对(胡斯坦(Hoogsteen)型碱基对等)。2个寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团在它们的序列互补的情况下可进行“杂交”。为了使2个寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团杂交，它们并非必须是完全互补的，用于使2个寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团杂交的互补性优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、或99％以上)。序列的互补性可以利用能自动鉴定寡核苷酸的部分序列的计算机程序来确定。例如，OligoAnalyzer为这样的软件中的一种，是Integrated DNA Technologies公司提供的。该程序也可以在网站上利用。本领域技术人员可以容易地确定2个寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团能够进行杂交的条件(温度、盐浓度等)。另外，本领域技术人员可以例如基于靶RNA的核苷酸序列的信息、通过利用BLAST程序等而容易地设计与靶RNA互补的反义寡核苷酸。BLAST程序可以参见《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America)(1990年，第87卷，2264～2268页；1993年，第90卷，5873～5877页)、及《分子生物学杂志》(Journal of Molecular Biology)(1990年，第215卷，403～410页)等。

“核苷酸”是指可成为核酸(寡核苷酸)的构成单元的分子，通常具有碱基作为构成要素。核苷酸例如由糖、碱基及磷酸构成。核苷酸包括后述的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸。

寡核苷酸”是指具有1个以上的前述核苷酸聚合而成的结构的分子。“寡核苷酸”由1个核苷酸构成时，该寡核苷酸可以称为“核苷酸”。

本发明的“反义寡核苷酸”分子所包含的核苷酸各自独立地彼此通过磷酸二酯键、后述的经修饰的磷酸二酯键或后述的包含非核苷酸结构的连接基团而连接。就本发明的反义寡核苷酸分子的3’末端的核苷酸而言，在其3’位优选具有羟基或磷酸基，更优选具有羟基，通常具有羟基。就反义寡核苷酸分子的5’末端的核苷酸而言，在其5’位优选具有羟基或磷酸基，更优选具有羟基，通常具有羟基。

“来源于寡核苷酸的基团”是指从前述寡核苷酸的3’末端及5’末端中的至少一者的羟基除去氢原子、羟基等而得的基团，与其他基团(例如，来源于其他寡核苷酸的基团等)形成磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键而间接地通过共价键连接。所谓前述3’末端或5’末端的羟基，包括磷酸基所具有的羟基。例如，从寡核苷酸的3’末端的羟基除去氢原子而得的基团、与从其他寡核苷酸的5’末端的磷酸基除去羟基而得的基团形成磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键。

“核苷酸序列”是指构成寡核苷酸的核苷酸的碱基序列。

本说明书中，“序列部分”是指寡核苷酸链的部分结构。例如，包含核苷酸的序列部分为寡核苷酸链中的包含该核苷酸的区域的部分结构。

“脱氧核糖核苷酸”是指糖为2’-脱氧核糖、碱基结合于2’-脱氧核糖的1’位的碳原子上、且在3’位或5’位具有磷酸基的分子。本发明中的脱氧核糖核苷酸可以是天然存在的脱氧核糖核苷酸，也可以是天然存在的脱氧核糖核苷酸中的碱基部分或磷酸二酯键部分经修饰而成的脱氧核糖核苷酸。碱基部分的修饰、磷酸二酯键部位的修饰可以针对1个脱氧核糖核苷酸而组合实施多种。前述经修饰而成的脱氧核糖核苷酸记载于例如《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal Chemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)(2011年，第3卷，339-365页)等中。

前述“脱氧核糖核苷酸”构成本发明的反义寡核苷酸分子时，通常，脱氧核糖核苷酸的3’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与其他核苷酸等连接，脱氧核糖核苷酸的5’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与另外的核苷酸等连接。就本发明的反义寡核苷酸分子的3’末端的脱氧核糖核苷酸而言，在其3’位优选具有羟基或磷酸基，5’位如上文所述。就反义寡核苷酸分子的5’末端的脱氧核糖核苷酸而言，在其5’位优选具有羟基或磷酸基，3’位如上文所述。

寡脱氧核糖核苷酸”是指由前述脱氧核糖核苷酸构成的寡核苷酸。构成寡脱氧核糖核苷酸的脱氧核糖核苷酸各自可以相同或者也可以不同。

“DNA”是指由天然的脱氧核糖核苷酸构成的寡核苷酸。构成DNA的天然的脱氧核糖核苷酸各自可以相同或者也可以不同。

核糖核苷酸”是指糖为核糖、碱基结合于核糖的1’位的碳原子上、且在2’位、3’位或5’位具有磷酸基的分子。本发明中的核糖核苷酸可以是天然存在的核糖核苷酸，也可以是天然存在的核糖核苷酸中的碱基部分或磷酸二酯键部分经修饰的核糖核苷酸。碱基部分的修饰、磷酸二酯键部位的修饰可以针对1个核糖核苷酸而组合实施多种。前述经修饰的核糖核苷酸记载于例如《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal Chemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)(2011年，第3卷，339-365页)等中。

前述“核糖核苷酸”构成本发明的反义寡核苷酸分子时，典型而言，核糖核苷酸的3’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与其他核苷酸连接，核糖核苷酸的5’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与另外的核苷酸等连接。就本发明的反义寡核苷酸分子的3’末端的核糖核苷酸而言，在其3’位优选具有羟基或磷酸基，5’位如上文所述。就反义寡核苷酸分子的5’末端的核糖核苷酸而言，在其5’位优选具有羟基或磷酸基，3’位如上文所述。

“寡核糖核苷酸”是指由前述核糖核苷酸构成的寡核苷酸。构成寡核糖核苷酸的核糖核苷酸各自可以相同或者也可以不同。

“RNA”是指由天然的核糖核苷酸构成的寡核苷酸。构成RNA的天然的核糖核苷酸各自可以相同或者也可以不同。

“糖部修饰核苷酸”是指：上述脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的糖部分的一部分被1个以上的取代基取代、或者其糖骨架整体被替换成与核糖及2’-脱氧核糖不同的糖骨架(例如，己糖醇、苏糖等5～6元的糖骨架)、或者其糖骨架整体或糖骨架的环的部分被替换成5～7元的饱和或不饱和环(例如，环己烷、环己烯、吗啉等)或可通过氢键而形成5～7元的环的部分结构(例如，肽结构)、或者糖部分的环开环、或进一步地对该开环的部分进行了修饰的核苷酸。“糖部修饰核苷酸”的碱基部分可以是天然存在的碱基，也可以是经修饰的碱基。另外，“糖部修饰核苷酸”的磷酸二酯键部分可以是磷酸二酯键，也可以是经修饰的磷酸二酯键。碱基部分的修饰、磷酸二酯键部位的修饰可以针对1个糖部修饰核苷酸而组合实施多种。前述开环的部分的修饰还包括例如卤化、烷基化(例如，甲基化、乙基化)、羟基化、氨基化、及硫化等、以及脱甲基化等。

“糖部修饰核苷酸”可以是桥联化核苷酸，也可以是非桥联化核苷酸。作为糖部修饰核苷酸，可举出例如在日本特开平10-304889号公报、国际公开第2005/021570号、日本特开平10-195098号公报、日本特表2002-521310号公报、国际公开第2007/143315号、国际公开第2008/043753号、国际公开第2008/029619号、《药物化学杂志》(Journal of MedicinalChemistry)(2008年，第51卷，2766页)、及国际公开第2008/049085号(以下，将上述文献称为“与反义法相关的文献”)等中作为适合用于反义法的核苷酸而公开的核苷酸等。前述文献中公开了己糖醇核苷酸(HNA)、环己烯核苷酸(CeNA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核苷酸(TNA，threonucleotide)、吗啉基核酸、三环DNA(tcDNA)、2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟化核苷酸、2’-F-阿糖基核苷酸(2’-F-ANA，2’-F-arabinonucleotide)、桥联化核苷酸(BNA(Bridged NucleicAcid))、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸、2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸等核苷酸。此外，《生物有机与药物化学》(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters)(2008年，第18卷，2296-2300页)(上述的非专利文献1)、《生物化学杂志》(The Journal ofBiological Chemistry)(2004年，第279卷，36317～36326页)(上述的非专利文献2)中公开了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸等核苷酸。另外，《药物化学杂志》(Journalof Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(MedicinalChemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(FutureMedicinal Chemistry)(2011年，第3卷，339-365页)等中也公开了糖部修饰核苷酸。

前述“糖部修饰核苷酸”构成本发明的反义寡核苷酸分子时，例如，该糖部修饰核苷酸的3’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与其他核苷酸等连接，该糖部修饰核苷酸的5’位通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)与另外的核苷酸等连接。就本发明的反义寡核苷酸分子的3’末端的糖部修饰核苷酸而言，例如在其3’位优选具有羟基或磷酸基，5’位如上文所述。就反义寡核苷酸分子的5’末端的糖部修饰核苷酸而言，例如在其5’位优选具有羟基或磷酸基，3’位如上文所述。

作为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸中的磷酸二酯键部分的修饰的例子，可举出硫代磷酸酯化、甲基膦酸酯化(包括手性-甲基膦酸酯化)、甲基硫代膦酸酯化、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)化、氨基磷酸酯(phosphoramidate)化、二氨基磷酸酯(phosphorodiamidate)化、硫代磷酰胺酯(phosphoroamidothioate)化及硼烷磷酸酯(boranophosphate)化等。另外，《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal ChemistryCommunications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future MedicinalChemistry)(2011年，第3卷，339-365页)等中，公开了核苷酸中的磷酸二酯键部分的修饰的例子，可以将它们用于脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸中的磷酸二酯键部分。

所谓“桥联化核苷酸”，是通过糖部分中的2个位置的取代而被取代为桥联单元的糖部修饰核苷酸，可举出例如2’-4’桥联核苷酸、及2’-3’桥联核苷酸、3’-5’桥联核苷酸等。

2’-4’桥联核苷酸(2’,4’-BNA)是具有2’位的碳原子与4’位的碳原子通过2个以上的原子进行了桥联的糖部分的核苷酸，例如，可举出具有通过C2-C6亚烷基(该亚烷基未被取代、或者被选自由卤素原子、氧代及硫代组成的组中的1个以上取代基取代，且该亚烷基的1个或2个亚甲基未被替换，或者独立地被选自由-O-、-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基)及-S-组成的组中的基团所替换)而进行了桥联的糖部分的核苷酸。

组合前述取代和替换、并将2’,4’-BNA的2’位与4’位桥联的基团可以包含由-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基)、-C(＝O)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基)、-C(＝S)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基)等表示的基团。

作为这样的BNA，可举出例如也被称为LNA的锁核酸(Locked Nucleic Acid(注册商标)、α-L-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’)BNA或β-D-亚甲基氧基(4’-CH₂-O-2’)BNA、也被称为ENA的亚乙基氧基(4’-(CH₂)₂-O-2’)BNA、β-D-硫代(4’-CH₂-S-2’)BNA、氨基氧基(4’-CH₂-O-N(R²¹)-2’)BNA(R²¹为H或CH₃)、也被称为2’,4’-BNA^NC的氧基氨基(4’-CH₂-N(R²²)-O-2’)BNA(R²²为H或CH₃)、2’,4’-BNA^COC、3’-氨基-2’,4’-BNA、5’-甲基BNA、也被称为cEt-BNA的(4’-CH(CH₃)-O-2’)BNA、也被称为cMOE-BNA的(4’-CH(CH₂OCH₃)-O-2’)BNA、也被称为AmNA的酰胺型BNA(4’-C(＝O)-N(R¹⁴)-2’)BNA(R¹⁴为H或CH₃)、也被称为scpBNA的(4’-C(螺环丙基)-O-2’)BNA、本领域技术人员知晓的其他BNA等。

2’-3’桥联核苷酸是具有2’位的碳原子与3’位的碳原子通过1个以上的原子进行了桥联的糖部分的核苷酸，可举出例如具有下式(I)表示的部分结构(糖部分及碱基部分)的核苷酸。

[化学式4]

式(I)中，m为1、2、3或4，

Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

R¹、R²、R³、R⁴及R⁵各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组，J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团；

R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团，

R⁷及R⁸各自独立地为氢原子或C1-C6烷基。

3’-5’桥联核苷酸是具有3’位的碳原子与5’位的碳原子通过2个以上原子进行了桥联的糖部分的核苷酸。可举出例如三环-DNA(tcDNA)。

3’位修饰非桥联核苷酸是3’位的碳原子经修饰的非桥联的核苷酸，可举出例如具有下式(II)表示的部分结构(糖部分及碱基部分)的核苷酸。

[化学式5]

式中，Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

R¹²为C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组；

R¹、R²、R³及R¹¹各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组；

J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团。

2’位修饰非桥联核苷酸是2’位的氧原子或碳原子经修饰的非桥联的核苷酸，可举出例如2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟代核苷酸、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸及2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸等。

糖部修饰核苷酸并不限于这里例示的核苷酸。许多糖部修饰核苷酸在该领域中是已知的，例如，也可以将Tachas等人的美国专利第8299039号说明书(特别是17～22栏)、或《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal Chemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)(2011年，第3卷，339-365页)等中记载的糖部修饰核苷酸作为本发明的实施方式加以利用。

本领域技术人员可以基于反义效果、与靶RNA的部分序列的亲和性、对于核酸分解酶的耐性等的观点进行考虑，从如上所述的糖部修饰核苷酸中选择适当的糖部修饰核苷酸加以利用。

所谓“核酸碱基”，一般而言为构成核酸的碱基成分，作为天然的核酸碱基，包括嘌呤碱基：腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)、以及嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(u)。本说明书中使用的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸的碱基部分中，可使用天然的核酸碱基及对其进行修饰而得的核酸碱基。经修饰的核酸碱基可与任意的核酸碱基(优选与修饰前的核酸碱基互补的碱基)形成碱基对(即，可形成氢键)。典型而言，经修饰的核酸碱基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基及其他的烷基衍生物、腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基及其他的烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶及胞嘧啶、嘧啶碱基的5-丙炔基(-C≡C-CH₃)尿嘧啶及胞嘧啶及其他的炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其他的8位被取代而得的腺嘌呤及鸟嘌呤、5-卤代、尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他的5位被取代而得的尿嘧啶、及胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤及7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤及8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤及7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤及3-去氮腺嘌呤。经过进一步修饰的核酸碱基包括吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、被取代的吩噁嗪胞苷等G-clamp(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3’,2’：4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)等三环系嘧啶。另外，经修饰的核酸碱基可包括嘌呤或嘧啶碱基被其他的杂环取代而得的核酸碱基，例如7-去氮腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶及2-吡啶酮。另外，《药物化学杂志》(Journal of Medicinal Chemistry)(2016年，第59卷，9645-9667页)、《医学化学通讯》(Medicinal Chemistry Communications)(2014年，第5卷，1454-1471页)、未来医药化学(Future Medicinal Chemistry)(2011年，第3卷，339-365页)、国际公开第2007/090071号等中公开了核苷酸中的碱基部分的修饰的例子，可将它们用于脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸中的碱基部分。碱基部分的氨基及羟基可各自独立地经过保护。

脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸中的碱基部分优选为选自由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及5-甲基胞嘧啶(5-me-C)组成的组中的至少1种。

“RNaseH”通常作为对DNA与RNA杂交而成的双链进行识别并剪切该RNA使其产生单链DNA的核糖核酸酶而为人所知。对于RNaseH而言，并不限于DNA与RNA杂交而成的双链，也可识别DNA及RNA中的至少一者的碱基部分、磷酸二酯键部分及糖部分中的至少一者经修饰的双链。例如，也可识别寡脱氧核糖核苷酸与寡核糖核苷酸杂交而成的双链。

因此，DNA在与RNA进行了杂交时，可被RNaseH识别。在DNA及RNA中的至少一者中碱基部分、磷酸二酯键部分及糖部分中的至少一者经修饰的情况下也同样。例如，作为代表例，可举出DNA的磷酸二酯键部分被修饰成硫代磷酸酯而得到的寡核苷酸等。

RNA在与DNA进行了杂交时，可被RNaseH剪切。在DNA及RNA中的至少一者中碱基部分、磷酸二酯键部分及糖部分中的至少一者经修饰的情况下也同样。

可被RNaseH识别的DNA及/或RNA的修饰例记载于例如《核酸研究》(Nucleic AcidResearch)(2014年，第42卷，5378～5389页)、《生物有机化学与医药化学通讯》(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters)(2008年，第18卷，2296～2300页)(上述的非专利文献1)、《分子生物系统》(Molecular BioSystems)(2009年，第5卷，838～843页)、《核酸治疗学》(Nucleic Acid Therapeutics)(2015年，第25卷，266～274页)、《生物化学杂志》(The Journal of Biological Chemistry)(2004年，第279卷，36317～36326页)(上述的非专利文献2)等中。

本发明中使用的RNaseH优选为哺乳动物的RNaseH，更优选为人的RNaseH，特别优选为人RNaseH1。

“间隔区域”是包含“可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸”的区域，只要包含4个以上的连续的核苷酸、且可被RNaseH识别即可，没有特别限定，该连续的核苷酸优选独立地选自脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸。

“5’翼区域”是与间隔区域的5’侧连接、不包含前述“可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸”且包含“至少1个核苷酸”的区域，其中，5’翼区域的3’末端的核苷酸的糖部分与间隔区域的5’末端的核苷酸的糖部分不同。基于糖部分的区别，可确认5’翼区域与间隔区域的边界。(例如，间隔区域的5’末端的核苷酸为脱氧核糖核苷酸，5’翼区域的3’末端的核苷酸为糖部修饰核苷酸。)5’翼区域的3’末端的核苷酸一般而言为糖部修饰核苷酸。5’翼区域只要满足上述定义即可，没有特别限定，该至少1个核苷酸优选独立地选自脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸，且包含至少1个糖部修饰核苷酸。

“3’翼区域”是与间隔区域的3’侧连接、不包含前述“可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸”且包含“至少1个核苷酸”的区域，其中，3’翼区域的5’末端的核苷酸的糖部分与间隔区域的3’末端的核苷酸的糖部分不同。基于糖部分的区别，可确认3’翼区域与间隔区域的边界。(例如，间隔区域的3’末端的核苷酸为脱氧核糖核苷酸，3’翼区域的5’末端的核苷酸为糖部修饰核苷酸。)3’翼区域的5’末端的核苷酸一般而言为糖部修饰核苷酸。3’翼区域只要满足上述定义即可，没有特别限定，该至少1个核苷酸优选独立地选自脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸，且包含至少1个糖部修饰核苷酸。

具有间隔区域、5’翼区域及3’翼区域反义寡核苷酸被称为间隔体型反义寡核苷酸。

“中央区域”为寡核苷酸中的中央的区域。

“5’侧区域”为与前述“中央区域”的5’侧连接、且包含至少1个核苷酸的区域。

“3’侧区域”为与前述“中央区域”的3’侧连接、且包含至少1个核苷酸的区域。

3’侧区域的5’末端的核苷酸的糖部分与中央区域的3’末端的核苷酸的糖部分不同。基于糖部分的区别，可确认3’侧区域与中央区域的边界。5’侧区域的3’末端的核苷酸的糖部分与中央区域的5’末端的核苷酸的糖部分不同。基于糖部分的区别，可确认5’侧区域与中央区域的边界。

对于“可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸”而言，只要包含4个以上连续的核苷酸、且可被RNaseH识别即可，没有特别限定，可举出例如“至少4个连续的脱氧核糖核苷酸”及“独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸”等。核苷酸的数目为例如5～30个，优选为5～15个，更优选为8～12个。

关于某至少4个连续的核苷酸是否是“可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸”，本领域技术人员可基于该连续的核苷酸的糖部分的结构进行判断。

接下来，对本发明的反义寡核苷酸进行说明。

本发明的反义寡核苷酸不需要与靶RNA的整体杂交，只要与靶RNA的至少一部分杂交即可，通常，与靶RNA的至少一部分杂交。例如，通过具有与靶RNA的部分序列互补的反义序列的寡核苷酸(DNA、寡脱氧核糖核苷酸或以通常会产生反义效果的方式进行了设计的寡核苷酸等)与靶RNA的至少一部分杂交，从而可对靶基因的表达加以控制。另外，不需要使反义寡核苷酸的整体进行杂交，可以有一部分不进行杂交。就反义序列部分的整体而言，可以有一部分不进行杂交，但优选反义序列部分的整体进行杂交。

所谓“反义序列”，是指构成能与靶RNA杂交的寡核苷酸的核苷酸的碱基序列，“反义序列部分”是指寡核苷酸链中的具有前述反义序列的区域的部分结构。

前述反义寡核苷酸的反义序列部分与靶RNA的部分序列的互补性优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)。为了使反义寡核苷酸的反义序列部分与靶RNA的至少一部分杂交，不需要它们的序列完全互补，但进一步更优选完全互补。

本领域技术人员可以利用BLAST程序等而容易地确定适合于“能与靶RNA杂交的”反义序列的碱基序列。

本发明的反义寡核苷酸具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域。中央区域优选为间隔区域，5’侧区域优选为5’翼区域，3’侧区域为3’翼区域。

中央区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少5个核苷酸组成，包含至少一个选自由2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的糖部修饰核苷酸，其3’末端及5’末端各自独立地为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸或3’位修饰非桥联核苷酸，并且，包含至少一段由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链。

中央区域所包含的核苷酸的数目为5～30个，优选为5～15个，更优选为8～12个，特别优选为9或10个。中央区域所包含的核苷酸的数目通常可根据针对前述靶RNA的反义效果的强度、毒性的高低、费用、合成收率等其他要素来选择。

中央区域包含至少一个选自由2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的糖部修饰核苷酸。接下来，对中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸进行说明。

中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸的部分结构优选由下式(I)表示。

[化学式6]

式(I)中，Bx为核酸碱基部分。

核酸碱基部分中可使用前述的“核酸碱基”。

式(I)中，X为O或S。X优选为O。

m为1、2、3或4。

-Q-各自独立地为-CR⁴R⁵-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NR⁶)-、-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，m为2、3或4时，2个相邻的-Q-可连接在一起形成式-CR⁷＝CR⁸-表示的基团。

式(I)中，R¹、R²、R³、R⁴及R⁵各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组，J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团；R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团，R⁷及R⁸各自独立地为氢原子或C1-C6烷基。

式(I)中，核酸碱基部分优选为选自由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及5-甲基胞嘧啶(5-me-C)组成的组中的至少1种。R¹优选为氢原子或C1-C3烷基，更优选为氢原子。R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷及R⁸各自独立地优选为氢原子或C1-C3烷基，更优选为氢原子。

R⁶优选为C1-C3烷基，更优选为甲基。

式(I)中，m优选为1、2或3，进一步优选为2或3，特别优选为2。

m为2的情况下，中央区域所包含的优选的2’-3’桥联核苷酸的部分结构由下式(III)表示。

[化学式7]

式(III)中，Bx为核酸碱基部分。

核酸碱基部分中可使用前述的“核酸碱基”。

X为O或S。

-Q¹-及-Q²-各自独立地为-CR⁴R⁵-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-C(＝NR⁶)-、-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，或者，-Q¹-Q²-为-CR⁷＝CR⁸-；并且，式中，R⁷及R⁸独立地为氢原子或C1-C6烷基。

R¹、R²、R³、R⁴及R⁵各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组，J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团；R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团。

式(III)中的X、Bx及R¹～R⁸与式(I)中的X、Bx及R¹～R⁸的定义相同，优选方式也是同样。

优选的是，-Q¹-为-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，该R⁶为C1-C12烷基，-Q²-为-CH₂-，进一步优选的是，-Q¹-为-O-，-Q²-为-CH₂-。

中央区域所包含的3’位修饰非桥联核苷酸的部分结构优选由下式(II)表示。

[化学式8]

式(II)中，Bx为核酸碱基部分。

X为O或S。

R¹²为C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组。

R¹、R²、R³及R¹¹各自独立地为氢原子、C1-C6烷基、C2-C6链烯基、C2-C6炔基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6链烯基、被1个以上取代基取代而得的C2-C6炔基、酰基、被1个以上取代基取代而得的酰基、被1个以上取代基取代而得的酰胺基、羟基、C1-C6烷氧基、被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷氧基、硫烷基、C1-C6烷基硫基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基硫基；其中，前述取代基各自独立，独立地选自由卤素原子、氧代、OJ¹、NJ¹J²、SJ¹、叠氮、OC(＝Y)J¹、OC(＝Y)NJ¹J²、NJ³C(＝Y)NJ¹J²及氰基组成的组；J¹、J²及J³各自独立地为氢原子或C1-C6烷基，且Y为O、S或NJ⁴，J⁴为C1-C12烷基或氨基保护基团。

式(II)中的X、Bx及R¹～R³与式(I)中的X、Bx及R¹～R³的定义相同，优选方式也是同样。

R¹¹优选为氢原子或C1-C3烷基，更优选为氢原子。

R¹²优选为C1-C6烷基或被1个以上取代基取代而得的C1-C6烷基，更优选为C1-C3烷基，特别优选为甲基。

中央区域可同时包含2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸。中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸的数目(总数)为1～30个，优选为1～5个，更优选为1～2个，特别优选为1个。中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸的数目通常可根据针对前述靶RNA的反义效果的强度、毒性的高低、费用、合成收率等其他要素来选择。

对于中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸而言，可在中央区域的任意的位置包含，优选在中央区域的自3’末端起数为第3个的核苷酸到5’末端之间包含。包含2’-3’桥联核苷酸或3’位修饰非桥联核苷酸的位置通常可根据针对前述靶RNA的反义效果的强度、毒性的高低等其他要素来选择。

将具有SNP的部分作为靶标的情况下，某一实施方式中，优选在接近可与突变的碱基形成碱基对的碱基的序列部分(例如，自可与突变的碱基形成碱基对的碱基起数、为第5个以内、第4个以内、第3个以内、第2个以内、第1个以内)包含2’-3’桥联核苷酸或3’位修饰非桥联核苷酸。可与突变的碱基形成碱基对的碱基特别优选为2’-3’桥联核苷酸或3’位修饰非桥联核苷酸。

优选的是，中央区域所包含的核苷酸之中的、至少1个核苷酸被硫代磷酸酯化，更优选80％的核苷酸被硫代磷酸酯化，进一步更优选90％的核苷酸被硫代磷酸酯化，特别优选全部被硫代磷酸酯化。

5’侧区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其3’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该3’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，不包含由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链。

3’侧区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其5’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该5’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，不包含由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链。

5’侧区域所包含的核苷酸的数目为1～15个，优选为1～7个，更优选为2～5个，特别优选为3个。5’侧区域所包含的核苷酸的数目通常可根据针对前述靶RNA的反义效果的强度、毒性的高低、费用、合成收率等其他要素来选择。3’侧区域与5’侧区域同样。

5’侧区域所包含的糖部修饰核苷酸优选为通过取代等从而与靶RNA的部分序列的亲和性增大的核苷酸、或针对核酸分解酶的耐性增大的核苷酸。更优选独立地选自2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA。

2’位修饰非桥联核苷酸优选独立地选自由2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟化核苷酸、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸及2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸组成的组，更优选为独立地选自2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸及2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸，特别优选为2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸。

2’,4’-BNA优选为LNA、cEt-BNA、ENA、BNA^NC、AmNA及scpBNA，更优选为包含下式(VI)表示的部分结构的LNA。3’侧区域与5’侧区域同样。

[化学式9]

式中，Bx表示核酸碱基部分，与式(I)中的Bx的定义相同。

5’侧区域中的糖部修饰核苷酸、脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸的种类、数目及位置会对这里公开的反义寡核苷酸所发挥的反义效果等产生影响。其种类、数目及位置也根据靶RNA的序列等的不同而不同，因此不能一概而论，本领域技术人员可以参考与前述反义法相关的文献的记载来确定优选的方式。另外，对碱基部分、糖部分或磷酸二酯键部分经修饰后的寡核苷酸所具有的反义效果进行测定，若得到的测定值与修饰前的寡核苷酸的测定值相比并未显著降低(例如，修饰后的寡核苷酸的测定值为修饰前的寡核苷酸的测定值的30％以上)，则可以评价该修饰为优选的方式。反义效果的测定例如可以通过下述方式进行：如后述的实施例中所示的那样，向细胞等中导入被检寡核苷酸，适当地利用Northern印迹法、定量PCR、Western印迹法等已知的方法，来测定通过该被检寡核苷酸所发挥的反义效果而被控制的靶RNA的表达量、与靶RNA相关的cDNA的表达量、与靶RNA相关的蛋白质的量等。3’侧区域与5’侧区域同样。

5’侧区域的优选方式为下述寡核苷酸：其由独立地选自由2’位修饰非桥联核苷酸、2’,4’-BNA、及脱氧核糖核苷酸组成的组中的2～5个核苷酸组成，且包含至少2个选自由2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA组成的组中的核苷酸。更优选为由独立地选自由2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA组成的组中的2～5个核苷酸组成的寡核苷酸，进一步优选为由独立地选自由2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA组成的组中的2～3个核苷酸组成的寡核苷酸。进一步优选为由独立地选自LNA及2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸的2～3个核苷酸组成的寡核苷酸，特别优选为由2～3个LNA组成的寡核苷酸。

作为另一优选方式，为由5个2’位修饰非桥联核苷酸组成的寡核苷酸。

作为另一优选方式，5’侧区域为由独立地选自由2’,4’-BNA及脱氧核糖核苷酸组成的组中的2～5个核苷酸组成，且包含至少2个2’,4’-BNA的寡核苷酸，这样的寡核苷酸可参考国际公开第2016/127002号等。3’侧区域与5’侧区域同样。

优选的是，5’侧区域所包含的核苷酸之中的、至少1个核苷酸被硫代磷酸酯化，更优选50％的核苷酸被硫代磷酸酯化，进一步更优选80％的核苷酸被硫代磷酸酯化，特别优选全部被硫代磷酸酯化。作为另一方式，优选5’侧区域所包含的全部核苷酸被以磷酸二酯键连接。3’侧区域与5’侧区域同样。

对于本发明的反义寡核苷酸而言，5’侧区域的3’末端与中央区域的5’末端形成磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键而连接，3’侧区域的5’末端与中央区域的3’末端形成磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键而连接。优选的是，5’侧区域的3’末端与中央区域的5’末端形成经修饰的磷酸二酯键而连接，3’侧区域的5’末端与中央区域的3’末端形成经修饰的磷酸二酯键而连接。进一步优选的是，5’侧区域的3’末端与中央区域的5’末端以硫代磷酸酯键连接，3’侧区域的5’末端与中央区域的3’末端形成硫代磷酸酯键而连接。

在本发明的反义寡核苷酸中，可以直接地或间接地结合有功能性分子。功能性分子与反义寡核苷酸的结合可以是直接结合，也可以介由其他物质而间接地结合，但优选寡核苷酸与功能性分子通过共价键、离子键或氢键而结合。从该结合的稳定性高这样的观点考虑，更优选通过共价键而直接结合、或通过共价键而介由接头(连接基团)结合。

前述功能性分子通过共价键而与反义寡核苷酸结合的情况下，前述功能性分子优选直接地或间接地结合于反义寡核苷酸分子的3’末端或5’末端。前述接头或功能性分子、与反义寡核苷酸分子的末端核苷酸的结合可根据功能性分子来选择。

前述接头或功能性分子、与反义寡核苷酸分子的末端核苷酸优选通过磷酸二酯键或经修饰的磷酸二酯键而连接，更优选通过磷酸二酯键而连接。

前述接头或功能性分子可以与反义寡核苷酸分子的3’末端的核苷酸所具有的3’位的氧原子或5’末端的核苷酸所具有的5’位的氧原子直接连接。

“功能性分子”的结构没有特别限制，可通过其结合而向反义寡核苷酸赋予所期望的功能。作为所期望的功能，可举出标记功能、纯化功能及向靶标部位递送的功能。作为赋予标记功能的分子的例子，可举出荧光蛋白质、荧光素酶等化合物。作为赋予纯化功能的分子的例子，可举出生物素、亲和素、His标签肽、GST标签肽、FLAG标签肽等化合物。

另外，从将反义寡核苷酸以高特异性高效地递送至靶标部位(例如，靶细胞)、并且通过该反义寡核苷酸来非常有效地控制靶基因的表达这样的观点考虑，作为功能性分子，优选结合有具有使反义寡核苷酸递送至靶标部位的功能的分子。该具有递送功能的分子可以参见例如《欧洲药剂学与生物药剂学杂志》(European Journal of Pharmaceuticalsand Biopharmaceutics)，2016年，第107卷，321～340页；《先进药物递送综述》(AdvancedDrug Delivery Reviews)，2016年，第104卷，78～92页；《药物递送专家评论》(ExpertOpinion on Drug Delivery)，2014年，第11卷，791～822页等。

作为赋予向靶RNA递送的功能的分子，例如，从能够以高特异性向肝脏等中高效地递送反义寡核苷酸这样的观点考虑，可举出脂质、糖。作为这样的脂质，可举出胆固醇；脂肪酸；维生素E(生育酚类、生育三烯酚类)、维生素A、维生素D、维生素K等脂溶性维生素；酰肉碱、酰基CoA等中间代谢物；糖脂；甘油酯；它们的衍生物等。这些中，从安全性更高这样的观点考虑，优选为胆固醇、维生素E(生育酚类、生育三烯酚类)。其中，更优选为生育酚类，进一步优选为生育酚，特别优选为α-生育酚。作为糖，可举出与脱唾液酸糖蛋白受体具有相互作用的糖衍生物。

“脱唾液酸糖蛋白受体”存在于肝脏细胞表面，具有识别脱唾液酸糖蛋白的半乳糖残基、将该分子摄入细胞内并进行分解的作用。“与脱唾液酸糖蛋白受体相互作用的糖衍生物”优选为具有与半乳糖残基类似的结构、通过与脱唾液酸糖蛋白受体的相互作用而被摄入细胞内的化合物，可举出例如GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)衍生物、半乳糖衍生物及乳糖衍生物。另外，从能够以高特异性向脑中高效地递送本发明的反义寡核苷酸这样的观点考虑，作为“功能性分子”，可举出糖(例如，葡萄糖、蔗糖等)。另外，从能够通过与存在于各器官的细胞表面的各种蛋白质相互作用从而以高特异性向该器官高效地递送反义寡核苷酸这样的观点考虑，作为“功能性分子”，可举出受体的配体、抗体、它们的片段的肽或蛋白质。

关于介导功能性分子与反义寡核苷酸的结合的接头，只要能够以反义寡核苷酸分子的形式发挥功能性分子所具有的功能即可，因此，只要是使该功能性分子与该寡核苷酸稳定地结合的接头，则没有特别限定。作为该接头，可举出例如来源于核苷酸数目为1～20个的寡核苷酸的基团、来源于氨基酸数目为2～20个的多肽的基团、碳原子数为2～20的亚烷基及碳原子数为2～20的亚链烯基等。前述来源于核苷酸数目为2～20个的寡核苷酸的基团是从核苷酸数目为2～20个的寡核苷酸除去羟基、氢原子等而得的基团。前述来源于核苷酸数目为1～20的寡核苷酸的基团可参见例如国际公开第2017/053995号。国际公开第2017/053995号中记载了例如具有TCA基序的3个碱基的接头、不具有TCA基序的1～5个碱基的接头等。前述来源于氨基酸数目为2～20个的多肽的基团是从氨基酸数目为2～20个的多肽除去羟基、氢原子、氨基等而得的基团。

接头优选为C2-C20亚烷基或C2-C20亚链烯基(该亚烷基及亚链烯基中包含的亚甲基各自独立地未被取代，或者被选自由卤素原子、羟基、经保护的羟基、氧代及硫代组成的组中的1个或2个取代基取代。另外，该亚烷基及亚链烯基的亚甲基各自独立地未被替换，或者被-O-、-NR^B-(R^B为氢原子、C1-C6烷基或卤代C1-C6烷基)、-S-、-S(＝O)-或-S(＝O)₂-所替换)。这里，将前述取代与替换组合，接头可以包含由-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-6烷基或卤代C1-6烷基)、-C(＝O)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-6烷基或卤代C1-6烷基)、-C(＝S)-NR¹³-(R¹³表示氢原子、C1-6烷基或卤代C1-6烷基)、-NR¹³-C(＝O)-NR¹³-(R¹³各自独立地表示氢原子、C1-6烷基或卤代C1-6烷基)等表示的基团。

接头更优选为C2-C20亚烷基(该亚烷基的亚甲基各自独立地未被替换，或者被-O-所替换。未被替换的亚甲基各自独立地未被取代，或者被羟基或经保护的羟基取代)，进一步优选为C8-C12亚烷基(该亚烷基的亚甲基各自独立地未被替换，或者被-O-所替换。未被替换的亚甲基各自独立地未被取代，或者被羟基取代)，特别优选为1,8-亚辛基。另外，作为其他方式，接头特别优选为由下式(VII)表示的基团。

[化学式10]

式中，一个＊表示与来源于寡核苷酸的基团的结合位置(构成核苷酸的原子)，另一个＊表示与来源于功能性分子的基团的结合位置(构成来源于功能性分子的基团的原子)。

作为其他方式，接头更优选为C2-C20亚烷基(该亚烷基的亚甲基各自独立地未被替换，或者被-O-或-NR^B-(R^B为氢原子或C1-C6烷基)替换。未被替换的亚甲基各自独立地未被取代，或者被氧代基取代)，进一步优选为由下式表示的基团，

[化学式11]

-N(H)C(＝O)-(CH₂)_e-N(H)C(＝O)-(CH₂)_e-C(＝O)-

(式中，e各自独立地为1至6的整数)，

特别优选为由下式表示的基团：

[化学式12]

-N(H)C(＝O)-(CH₂)_e-N(H)C(＝O)-(CH₂)_e-C(＝O)-。

前述“经保护的羟基”的保护基只要在使功能性分子与寡核苷酸结合时稳定即可，因此，没有特别限定。作为接头，没有特别限定，可举出例如《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第4版，T.W.Greene、P.G.M.Wuts著，JohnWiley&Sons Inc.(2006年)等中记载的任意的保护基。具体而言，可举出C1-C6烷基(可举出例如甲基、叔丁基等)、三芳基甲基(可举出例如三苯基甲基(三苯甲基)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMTr)、三甲氧基三苯甲基等)等醚系保护基团；甲氧基甲基、甲基硫基甲基、甲氧基乙基、苄氧基甲基、2-四氢吡喃基、乙氧基乙基等缩醛系保护基团；酰基(可举出例如甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基等)等酰基系保护基团；三(C1-C6烷基)甲硅烷基(可举出例如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基等)、(C1-C6烷基)二芳基甲硅烷基(可举出例如叔丁基二苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基等)、三芳基甲硅烷基(可举出例如三苯基甲硅烷基等)、三苄基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom基)等甲硅烷基系保护基团；1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep基)、9-苯基呫吨-9-基(Pixyl基)、9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基(MOX基)等。“经保护的羟基”的保护基优选为苯甲酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三苯基甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基呫吨-9-基或9-(对甲氧基苯基)呫吨-9-基，更优选为单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基，进一步更优选为二甲氧基三苯甲基。

本发明中也包括该反义寡核苷酸的前体药物(prodrug)。

所谓前体药物，是具有能够化学性地或代谢性地分解的基团的医药品化合物的衍生物，是通过加溶剂分解或在生理条件下的体内(in vivo)被分解从而衍生为具有药理活性的医药品化合物的化合物。适当的前体药物衍生物的选择方法及制造方法记载于例如《前体药物设计》(爱思唯尔出版社，阿姆斯特丹1985)(Design of Prodrugs(Elsevier，Amsterdam 1985))中。本发明的情况下，具有羟基时，可例示通过使该化合物与适当的酰卤、适当的酸酐或适当的卤代烷基氧基羰基化合物反应来制造的酰基氧基衍生物这样的前体药物。关于特别优选作为前体药物的结构，可举出-O-C(＝O)C₂H₅、-O-C(＝O)(t-Bu)、-O-C(＝O)C₁₅H₃₁、-O-C(＝O)-(m-CO₂Na-Ph)、-O-C(＝O)CH₂CH₂CO₂Na-OC(＝O)CH(NH₂)CH₃、-O-C(＝O)CH₂N(CH₃)₂或-O-CH₂OC(＝O)CH₃等。形成本发明的反义寡核苷酸具有氨基的情况下，可例示通过使具有氨基的化合物与适当的酰卤、适当的混合酸酐或适当的卤代烷基氧基羰基化合物反应来制造的前体药物。关于特别优选作为前体药物的结构，可举出-NH-C(＝O)-(CH₂)₂₀OCH₃、-NH-C(＝O)CH(NH₂)CH₃、-NH-CH₂OC(＝O)CH₃等。

本发明所包括的前体药物的其他优选结构可举出与反义寡核苷酸互补的、包含核糖核苷酸的寡核苷酸(例如，寡核糖核苷酸核苷酸、RNA)、包含肽核酸(PNA)的寡核苷酸、或包括包含脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸(例如，寡脱氧核糖核苷酸、DNA)在内的双链寡核苷酸(记载于例如国际公开第2013/089283号、国际公开第2017/068791号、国际公开第2017/068790号或国际公开第2018/003739号中)、反义寡核苷酸与互补的RNA寡核苷酸经由接头结合而成的单链寡核苷酸(记载于例如国际公开第2017/131124号中)等。前述接头不限于记载于国际公开第2017/131124号中的接头，例如，也可包含非核苷酸结构。另外，也可举出反义寡核苷酸与互补的RNA寡核苷酸直接连接而成的单链寡核苷酸。

以下，举出本发明的前体药物的更具体的例子。

(A)

寡核苷酸复合体，其包含：

(i)前述反义寡核苷酸；及

(B)

寡核苷酸，其包含：

(i)来源于前述反义寡核苷酸的基团；及

(B)中，(i)来源于反义寡核苷酸的基团、与(ii)来源于寡核苷酸的基团可经由来源于可在生理条件下被分解的寡核苷酸的基团而连接，可经由包含非核苷酸结构的连接基团而连接，可直接地连接。

(C)

寡核苷酸复合体，其包含：

(iii)寡核苷酸，其在来源于前述反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

其中，

所述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的所述寡核苷酸链、与所述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的所述寡核苷酸链进行杂交。

(D)

寡核苷酸，其包含：

(iii)来源于寡核苷酸的基团，所述寡核苷酸在来源于前述反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

(D)中，(iii)来源于寡核苷酸的基团、与(iv)来源于寡核苷酸的基团可经由来源于可在生理条件下被分解的寡核苷酸的基团而连接，可经由包含非核苷酸结构的连接基团而连接，可直接地连接。

(C)及(D)中，来源于反义寡核苷酸的基团、与包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链可经由来源于可在生理条件下被分解的寡核苷酸的基团而连接，可经由包含非核苷酸结构的连接基团而连接，可直接地连接。

“可在生理条件下被分解的寡核苷酸”只要是在生理条件下可被各种DNase(脱氧核糖核酸酶)及RNase(核糖核酸酶)等酶分解的寡核苷酸即可，就构成该寡核苷酸的核苷酸而言，可以在其一部分或全部中对碱基、糖或磷酸盐键进行了化学修饰，也可以未进行化学修饰。“可在生理条件下被分解的寡核苷酸”包含例如至少1个磷酸二酯键，优选为通过磷酸二酯键连接而成的寡核苷酸，更优选为寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸，进一步优选为DNA或RNA，进一步更优选为RNA。

对于可在生理条件下被分解的寡核苷酸而言，在可在生理条件下被分解的寡核苷酸内可以包含部分互补的序列，也可以不包含部分互补的序列，优选不包含部分互补的序列。作为这样的寡核苷酸的例子，可举出通过磷酸二酯键而连接的(N)_k’(N各自独立地为腺苷、尿苷、胞苷、鸟苷、2’-脱氧腺苷、胸苷、2’-脱氧胞苷、或2’-脱氧鸟苷，k为1～40的整数(重复数)。其中，k’优选为3～20，更优选为4～10，进一步优选为4～7，进一步更优选为4或5，特别优选为4。

“包含非核苷酸结构的连接基团”为具有至少1个“非核苷酸结构”作为构成单元的连接基团。作为非核苷酸结构，可举出例如不具有核酸碱基的结构。“包含非核苷酸结构的连接基团”可包含或不包含核苷酸(脱氧核糖核苷基、核糖核苷基等)。“包含非核苷酸结构的连接基团”为例如下述结构的基团。

[化学式13]

-[P¹¹-(-O-V¹¹-)q₁₁-O-]q₁₂-P¹¹-

{式中，V¹¹为：

C2-C50亚烷基(该C2-C50亚烷基为未取代、或者被独立地选自取代基组V^a中的1个以上取代基取代)；

选自由下式(XIII-1)至(XIII-11)组成的组中的基团，

[化学式14]

(式中，o¹为0至30的整数，p¹为0至30的整数，d¹为1至10的整数，w为0至3的整数，Rb为卤素原子、羟基、氨基、C1-C6烷氧基、被C1-6烷氧基或氨基甲酰基取代的C1-C6烷氧基、单C烷基氨基、二C1-C6烷基氨基或C烷基，Rc为氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C1-C6烷基羰基、卤代C1-C6烷基羰基、C1-C6烷氧基羰基、被C1-6烷氧基或氨基甲酰基取代的C1-C6烷氧基羰基、单C1-C6烷基氨基羰基、二C1-C6烷基氨基羰基、C1-C6烷基磺酰基、卤代C1-C6烷基磺酰基、C1-C6烷氧基磺酰基、被C1-6烷氧基或氨基甲酰基取代的C1-C6烷氧基磺酰基、单C1-C6烷基氨基磺酰基或二C1-C6烷基氨基磺酰基)；

核糖核苷基；或

脱氧核糖核苷基，

至少1个V¹¹为C2-C50亚烷基(该C2-C50亚烷基未被取代、或者被独立地选自取代基组V^a中的1个以上的取代基取代)、或为选自前述式(XIII-1)至(XIII-11)中的基团，

取代基组V^a表示由羟基、卤素原子、氰基、硝基、氨基、羧基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、膦酰基、磺基、四唑基及甲酰基构成的取代基组，

P¹¹各自独立地为-P(＝O)(OH)-或-P(＝O)(SH)-，

至少1个P¹¹为-P(＝O)(OH)-，

q₁₁为1至10的整数，q₁₂为1至20的整数，q₁₁及q₁₂中的至少一者为2以上时，V¹¹相同或不同。}

这里，o¹优选为1至30的整数，p¹优选为1至30的整数。q₁₁优选为1至6的整数，更优选为1至3的整数。q₁₂优选为1至6的整数，更优选为1至3的整数。P¹¹优选为-P(＝O)(OH)-。

以下，对上述(A)中的(ii)的寡核苷酸、上述(B)中的(ii)的来源于寡核苷酸的基团、上述(C)及(D)所示的寡核苷酸或寡核苷酸复合体中的(iii)的寡核苷酸之中包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链(与包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的寡核苷酸链进行杂交的部分)进行说明。

糖部修饰核苷酸、脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸的种类、数目及位置会对这里公开的反义寡核苷酸的前体药物所发挥的反义效果等产生影响。其种类、数目及位置也根据靶RNA的序列等的不同而不同，因此不能一概而论，本领域技术人员可以参考与前述反义法相关的文献的记载而确定优选的方式。另外，对碱基部分、糖部分或磷酸二酯键部分经修饰后的反义寡核苷酸的前体药物所具有的反义效果进行测定，若得到的测定值与修饰前的反义寡核苷酸的前体药物的测定值相比并未显著降低(例如，修饰后的反义寡核苷酸的前体药物的测定值为修饰前的前体药物的测定值的30％以上)，则可以评价该修饰为优选的方式。反义效果的测定例如可以通过下述方式进行：如后述的实施例中所示的那样，向细胞等中导入被检寡核苷酸，适当地利用Northern印迹法、定量PCR、Western印迹法等已知的方法，来测定通过该被检寡核苷酸所发挥的反义效果而被控制的靶RNA的表达量、与靶RNA相关的cDNA的表达量、与靶RNA相关的蛋白质的量等。

前述(A)所示的寡核苷酸复合体中的(ii)的寡核苷酸或前述(B)所示的寡核苷酸中的(ii)的来源于寡核苷酸的基团独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、糖部修饰核苷酸，优选选自核糖核苷酸。(ii)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团选自核糖核苷酸时，该核糖核苷酸优选彼此通过磷酸二酯键连接。

作为其他方式，(ii)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团选自核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸，该糖部修饰核苷酸选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸。此时，该寡核苷酸的末端优选为至少1个糖部修饰核苷酸。该糖部修饰核苷酸优选为2’-O-甲基化核苷酸，且优选通过硫代磷酸酯键而与相邻的核苷酸结合。前述(C)所示的寡核苷酸复合体或(D)所示的寡核苷酸中，(iii)的寡核苷酸之中的包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链(与包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的寡核苷酸链进行杂交的部分)也是同样。

(A)的情况下，(ii)的寡核苷酸的3’末端及5’末端的核苷酸优选为糖部修饰核苷酸。(B)的情况下，(ii)的来源于寡核苷酸的基团的3’末端及5’末端之中的、未与(i)来源于反义寡核苷酸的基团结合的末端的核苷酸优选为糖部修饰核苷酸。(C)及(D)的情况下，(iii)的来源于寡核苷酸的基团的3’末端及5’末端之中的、未与上述来源于反义寡核苷酸的基团结合的末端的核苷酸优选为糖部修饰核苷酸。

(ii)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团的碱基数目没有特别限定，可以与(i)反义寡核苷酸(或来源于其的基团)的碱基数目相同或不同。(A)中，(i)及(ii)的寡核苷酸的碱基数目优选相同，且优选(i)及(ii)的寡核苷酸的整体进行杂交。(B)中，(i)和(ii)的来源于寡核苷酸的基团通过来源于可在生理条件下被分解的寡核苷酸的基团或包含非核苷酸结构连接基团而连接的情况下也是同样。

前述(C)所示的寡核苷酸复合体中的(iv)的寡核苷酸、及前述(D)中的寡核苷酸中的(iv)的来源于寡核苷酸的基团独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、糖部修饰核苷酸，优选选自脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸。(iv)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团所包含的糖部修饰核苷酸优选选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸。此时，该寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团的5’末端及3’末端优选为至少1个糖部修饰核苷酸。该至少1个糖部修饰核苷酸优选为选自2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA中的至少一者，更优选为选自由2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟代核苷酸、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸、2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸、LNA、cEt-BNA、ENA、BNA^NC、AmNA及scpBNA组成的组中的至少一者。(iv)或来源于寡核苷酸的基团的寡核苷酸所包含的核苷酸优选彼此通过硫代磷酸酯键连接。

前述(A)中，

可以认为，上述(i)反义寡核苷酸、与(ii)包含至少1个核糖核苷酸、且可与上述(i)反义寡核苷酸进行杂交的区域经杂交而成的部分可被RNaseH识别，(ii)包含至少1个核糖核苷酸、且可与上述(i)反义寡核苷酸进行杂交的区域可被切割。可以认为，其结果是，靶细胞等中生成本发明的反义寡核苷酸，(A)的前体药物发挥治疗效果等。关于前述(B)也是同样。

前述(C)中中，

可以认为，前述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的前述寡核苷酸链、与前述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的前述寡核苷酸链杂交而成的部分可被RNaseH识别，(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的前述寡核苷酸链可被切割。可以认为，其结果是，靶细胞等中生成本发明的反义寡核苷酸，(C)的前体药物发挥治疗效果等。关于前述(D)也是同样。

前述(A)所示的寡核苷酸复合体具有功能性分子时，(ii)的寡核苷酸优选包含功能性分子，该功能性分子优选与(ii)的寡核苷酸的末端结合。前述(B)所示的寡核苷酸也是同样。前述(C)所示的寡核苷酸复合体具有功能性分子时，(iv)的寡核苷酸优选包含功能性分子，该功能性分子优选与(iv)的寡核苷酸的末端结合。前述(D)所示的寡核苷酸也是同样。功能性分子与其结合的优选方式如前所述。

前述(A)及(B)之中的、(ii)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团可还具有来源于反义寡核苷酸的基团。该(ii)的来源于反义寡核苷酸的基团可以与(i)的反义寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团相同或者也可以不同。另外，可以是或者不是来源于本发明的反义寡核苷酸的基团。前述(ii)的来源于反义寡核苷酸的基团优选不与(i)的反义寡核苷酸或来源于反义寡核苷酸的基团杂交。

前述(C)及(D)之中的、(iv)的寡核苷酸或来源于寡核苷酸的基团可以是反义寡核苷酸或来源于反义寡核苷酸的基团。该(iv)的反义寡核苷酸或来源于反义寡核苷酸的基团可以与(iii)的寡核苷酸所包含的来源于反义寡核苷酸的基团相同或者也可以不同。另外，可以是或者不是来源于本发明的反义寡核苷酸的基团。前述(iv)的反义寡核苷酸或来源于反义寡核苷酸的基团优选不与(iii)的反义寡核苷酸或来源于反义寡核苷酸的基团杂交。

作为不是本发明的反义寡核苷酸的反义寡核苷酸，可举出例如以下的反义寡核苷酸。

(1)反义寡核苷酸，其是具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域的反义寡核苷酸，其中，

-中央区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少5个核苷酸组成，所述糖部修饰核苷酸为选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，

其3’末端及5’末端各自独立地为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且，

包含至少一段由独立地选自脱氧核糖核苷酸的、连续的至少4个核苷酸构成的寡核苷酸链；

-5’侧区域为下述区域：

-3’侧区域为下述区域：

其中，可举出以下(2)的反义寡核苷酸。

(2)反义寡核苷酸，其是具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域的反义寡核苷酸，其中，

-中央区域为下述区域：

所述区域由独立地选自脱氧核糖核苷酸中的至少5个核苷酸组成，

-5’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其3’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该3’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

-3’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其5’末端为糖部修饰核苷酸，其中，该5’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

其中，优选以下(3)的反义寡核苷酸。

(3)反义寡核苷酸，其是具有中央区域、5’侧区域及3’侧区域的反义寡核苷酸，其中，

-中央区域为下述区域：

-5’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自糖部修饰核苷酸中的至少1个核苷酸组成，其3’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，

-3’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自脱氧核糖核苷酸中的至少1个核苷酸组成，其5’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸。

前述(1)、(2)及(3)中，中央区域优选为间隔区域，5’侧区域优选为5’翼区域，3’侧区域优选为3’翼区域。另外，5’侧区域及3’侧区域的优选方式与本发明的反义寡核苷酸中的5’侧区域及3’侧区域相同。对于中央区域的优选方式而言，除了不包含选自由2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的糖部修饰核苷酸以外，与本发明的反义寡核苷酸中的中央区域相同。

除此以外，可举出以下(4)的反义寡核苷酸(所谓混合体(mixmer))。

(4)反义寡核苷酸，其由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少5个核苷酸组成，并且

包含非核苷酸结构的连接基团与寡核苷酸能通过通常的酰胺法或H-膦酸酯法进行结合。例如，能够在对具有2个羟基化合物的一方的羟基进行保护后，利用酰胺化试剂(例如，氯(二异丙基氨基)亚膦酸2-氰基乙酯、双(二异丙基氨基)亚膦酸2-氰基乙酯等)而衍生为酰胺体，或利用H-膦酸酯试剂(例如，亚磷酸二苯酯、亚磷酸等)而衍生为H-膦酸酯体，使其与寡核苷酸结合，并将前述被保护的羟基去保护，使用市售的核酸自动合成仪，进一步延伸核苷酸。前述具有2个羟基的化合物能组合利用本领域技术人员已知的保护·去保护反应(可参见例如所述《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis)第4版)、氧化反应、还原反应、缩合反应(氧化反应、还原反应、缩合反应可以参见例如《有机转换大全第2版》(Comprehensive Organic Transformations)，R.C.Larock著，Wiley-VCH(1999年)等)等，从例如氨基酸、羧酸、二元醇化合物等原料合成。包含非核苷酸结构的连接基团中具有前述2个羟基以外的官能团(例如，氨基、羟基或巯基)的情况下，可以使用本领域技术人员已知的保护基(可参见例如《有机合成中的保护基》(Protective Groups inOrganic Synthesis)第4版)进行保护，另外，具有连接基团(其包含非核苷酸结构)的寡核苷酸的合成可以参见WO2012/017919、WO2013/103146、WO2013/133221、WO2015/099187、WO2016/104775等。

另外，能够在另行合成两个寡核苷酸后，使包含非核苷酸结构的连接基团结合。以下示出合成方法的一例。在寡核苷酸的5’末端，通过本领域技术人员已知的方法使具有氨基等官能团的部分结构结合(例如，使用6-(三氟乙酰基氨基)己基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺等)，在另外的寡核苷酸的3’末端，通过本领域技术人员已知的方法使具有氨基等官能团的部分结构结合(例如，使用2-((4,4’-二甲氧基三苯甲基)氧基甲基)-6-芴基甲氧基羰基氨基-己烷-1-琥珀酰基-长链烷基氨基-CPG(Glen RESEARCH公司制品编号20-2958)等)。可以将包含非核苷酸结构的连接基团所具有的2个官能团转化为与前述氨基等反应的所期望的官能团，将两个寡核苷酸连接。例如，可以在将包含非核苷酸结构的连接基团所具有的2个官能团转化为羧酸、酯、活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺化等)、酰氯、活化碳酸二酯(4-硝基苯基化碳酸二酯等)、异氰酸酯等后，通过已知的N-羰基化条件使其反应，由此进行连接。前述的N-羰基化条件可以参见例如{《有机转换大全第2版》(Comprehensive Organic Transformations Second Edition)，1999年，John Wiley&Sons,INC.}等。本领域技术人员可以根据需要而保护前述2个官能团中的一方、使1个寡核苷酸与包含非核苷酸结构的连接基团结合，在去保护后，同样地使另一个寡核苷酸与包含非核苷酸结构的连接基团结合。

反义寡核苷酸或其前体药物也包括经由它们的互变异构、几何异构而存在的物质、以及以其混合物或各异构体的混合物的形式存在的物质。另外，存在手性中心的情况下、或者由于异构化而导致产生手性中心的情况下，也包括各光学异构体及以任意比率的混合物的形式存在的物质。另外，具有2个以上的手性中心的化合物的情况下，进一步还存在由于各自的光学异构而产生的非对映异构体。本发明也包括以任意比例含有它们中的所有类型的物质。另外，光学活性体可通过用于实现该目的而熟知的方法来得到。

例如，本发明的反义寡核苷酸或其前体药物包含经修饰的磷酸二酯键(例如，硫代磷酸酯键)、且磷原子成为手性原子的情况下，磷原子的立体被控制的寡核苷酸及磷原子的立体未被控制的寡核苷酸中的任一种方式均包括在本发明的范围内。

本发明的反义寡核苷酸、其前体药物或它们的医药学上允许的盐可以根据制造条件而以任意的晶型存在，可以以任意的水合物的形式存在，这些晶型、水合物及它们的混合物也包括在本发明的范围内。另外，有时也以包含丙酮、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等有机溶剂的溶剂合物的形式存在，这些形态也均包括在本发明的范围内。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物可以根据需要而转化为医药学上可允许的盐，或者也可以从生成的盐中使其游离。作为反义寡核苷酸或其前体药物的医药学上可允许的盐，可举出例如与碱金属(锂、钠、钾等)、碱土金属(镁、钙等)、铵、有机碱(三乙胺、三甲胺等)、氨基酸(甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸等)、无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸等)或有机酸(乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等)形成的盐。

特别地，由-P(＝O)(OH)-表示的部分结构可以被转化为由-P(＝O)(O^-)-表示的阴离子性的部分结构，与碱金属(锂、钠、钾等)、碱土金属(镁、钙等)或铵等形成盐。另外，形成硫代磷酸酯键的由-P(＝O)(SH)-表示的部分结构可以被转化为由-P(＝O)(S^-)-表示的阴离子性的部分结构，同样地与碱金属、碱土金属或铵等形成盐。关于其他经修饰的磷酸二酯键也是同样。

对于本发明的反义寡核苷酸或其前体药物而言，本领域技术人员可以通过适当地选择已知的方法来制备。例如，本领域技术人员可以基于靶RNA的核苷酸序列的信息来设计反义寡核苷酸的核苷酸序列，使用市售的核酸自动合成仪(Applied Biosystems公司制、Beckman公司制、GeneDesign公司等)进行合成。另外，也可以通过使用酶的反应来合成。作为前述酶，可举出聚合酶、连接酶及限制性内切酶等，但并不限于此。即，本实施方式涉及的反义寡核苷酸或其前体药物的制造方法可以包括在3’末端或5’末端延伸核苷酸链的步骤。

用于使功能性分子与该寡核苷酸结合的许多方法在该领域中已为人们所熟知，例如可以参见《欧洲药剂学与生物药剂学杂志》(European Journal of Pharmaceuticalsand Biopharmaceutics)，2016年，第107卷，321～340页；《先进药物递送综述》(AdvancedDrug Delivery Reviews)，2016年，第104卷，78～92页；《药物递送专家评论》(ExpertOpinion on Drug Delivery)，2014年，第11卷，791～822页等。例如，可以在利用已知的方法使功能性分子与接头结合后，将其利用酰胺化试剂衍生为酰胺体、或利用H-膦酸酯试剂衍生为H-膦酸酯体，并使其与寡核苷酸结合。

可以利用反相柱色谱法等将得到的寡核苷酸纯化，由此制备反义寡核苷酸或其前体药物。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物能够有效地控制靶基因的表达。因此，本发明可以提供含有本发明的反义寡核苷酸作为有效成分的、用于例如通过反义效果来控制靶基因表达的组合物。特别地，本发明的反义寡核苷酸或其前体药物能够通过低浓度的施予而获得高药效，在一些实施方式中也可以提供用于治疗、预防、改善代谢性疾病、肿瘤、感染症这样的伴随靶基因的表达亢进而出现的疾病的医药组合物。

包含本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的组合物可以利用已知的制剂学方法而制剂化。例如，可以以胶囊剂、片剂、丸剂、液剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、膜涂敷剂、丸粒剂、含片剂、舌下剂、咀嚼剂、舌下含片(buccal)剂、糊剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂(elixirs)、乳剂、涂敷剂、软膏剂、硬膏剂、巴布剂、经皮吸收型制剂、洗剂、吸入剂、气雾剂、注射剂、栓剂等的形式而经肠道地(经口等)或非经肠道地进行使用。

在上述制剂化中，可以与药理学上允许的或作为饮食品允许的载体(具体为无菌水、生理盐水、植物油、溶剂、基剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、pH调节剂、稳定剂、香味剂、芳香剂、赋形剂、载色剂(vehicle)、防腐剂、粘合剂、稀释剂、等渗剂、无痛化剂、增量剂、崩解剂、缓冲剂、包衣剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、增粘剂、矫味矫臭剂、助溶剂或其他添加剂等)适当地组合。

作为包含本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的组合物的施予形态，没有特别限制，可举出经肠道的(经口的等)施予或非经肠道的施予。可更优选举出静脉内施予、动脉内施予、腹腔内施予、皮下施予、皮内施予、气管内施予、直肠施予、肌肉内施予、髓腔内施予、脑室内施予、经鼻施予及玻璃体内施予等、及基于输液的施予。

利用本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的核酸医药品能治疗、预防、改善的疾病没有特别限制，可举出例如代谢性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染症、眼病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、遗传性罕见疾病等由基因的表达导致的疾病等。更具体而言，可举出高胆固醇血症、高甘油三酯血症、脊髓性肌萎缩症、肌营养不良症(Duchenne型肌营养不良症、肌强直性营养不良症、先天性肌营养不良症(福山型先天性肌营养不良症、Ullrich型先天性肌营养不良症、Merosin缺陷型先天性肌营养不良症、整联蛋白(integrin)缺损症、Walker-Warburg综合征等)、Becker型肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、三好型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症等)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)、阿尔茨海默病、转甲状腺素蛋白淀粉样变性(transthyretin amyloidosis)、家族性淀粉样心肌病、多发性硬化症、克罗恩氏病、炎症性大肠疾病、肢端肥大症、II型糖尿病、慢性肾病、RS病毒感染症、埃博拉出血热、马尔堡热(Marburg fever)、HIV、流行性感冒、B型肝炎、C型肝炎、肝硬化、慢性心力衰竭、心肌纤维化、心房颤动、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、大肠癌、肾细胞癌、胆管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、特应性皮炎、青光眼、老年性黄斑变性等。可以根据前述疾病的种类而将成为该疾病的原因的基因设定为前述靶基因，进而，根据前述靶基因的序列而适当地设定前述表达控制序列(例如，反义序列)。

除了人类等灵长类之外，还可以利用包含本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的组合物来治疗、预防、改善各种其他哺乳类的疾病。例如，虽然并不仅限于此，但可以治疗包括牛(母牛(cow))、绵羊(sheep)、山羊、马(horse)、犬(家犬(dog))、猫(cat)、豚鼠、或其他的牛(bovine)、绵羊(ovine)、马(马科动物(equine))、犬(犬科动物(canine))、猫(猫科动物(feline))、小鼠等啮齿类的物种在内的哺乳类的物种的疾病。另外，包含反义寡核苷酸的组合物也可以在鸟类(例如，鸡)等其他的物种中应用。

将包含本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的组合物施予或摄入至包括人在内的动物中的情况下，其施予量或摄入量可根据对象的年龄、体重、症状、健康状态、组合物的种类(医药品、饮食品等)等而适当地选择，其施予量或摄入量按反义寡核苷酸换算计优选为0.0001mg/kg/日～100mg/kg/日。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物能够有效地控制靶基因的表达，同时较之以往的反义寡核苷酸而言，能够降低毒性。因此，可以提供向包括人在内的动物施予本发明的反义寡核苷酸或其前体药物、通过反义效果来更安全地控制靶基因的表达的方法。另外，还可以提供用于治疗、预防、改善伴有靶基因的表达亢进等的各种疾病的方法，所述方法包括将包含本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的组合物施予至包括人在内的动物。

作为使用本发明的反义寡核苷酸的优选方法，可举出以下所示的方法。

对靶RNA的功能加以控制的方法，其包括使本发明的反义寡核苷酸或其前体药物与细胞接触的步骤。

对哺乳动物中的靶RNA的功能加以控制的方法，其包括向该哺乳动物施予含有本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的医药组合物的步骤。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的、用于在哺乳动物中对靶RNA的功能加以控制的用途。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的、用于制造用于在哺乳动物中对靶RNA的功能加以控制的药剂的用途。

对靶基因的表达加以控制的方法，其包括使本发明的反义寡核苷酸或其前体药物与细胞接触的步骤。

对哺乳动物中的靶基因的表达加以控制的方法，其包括向该哺乳动物施予含有本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的医药组合物的步骤。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的、用于在哺乳动物中对靶基因的表达加以控制的用途。

本发明的反义寡核苷酸或其前体药物的、用于制造用于在哺乳动物中对靶基因的表达加以控制的药剂的用途。

本发明中的靶RNA的功能的控制是指：由于反义序列部分通过杂交而覆盖靶RNA的一部分从而产生的、对翻译的抑制或对外显子遗漏等剪接功能的调节或转换；或者，通过会因反义序列部分与靶RNA的一部分进行了杂交的部分被识别而发生的前述靶RNA的分解，来抑制靶RNA的功能；等等。

前述哺乳动物优选为人。

施予途径优选为经肠道施予。作为其他的方式，施予途径为非经肠道施予。

本发明的实施方式涉及的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸可利用以下依次示出的方法来制造，但下述制造方法示出的是通常的制造方法的一例，对本实施方式涉及的2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸的制造方法不构成限定。关于原料化合物，没有说明它们的具体制造方法时，可使用市售的原料化合物，也可按照已知的方法或基于其的方法来制造。

首先，记载作为代表性的三元环2’-3’桥联核苷酸的下述化合物C的通常的制造方法。

[化学式15]

式中，P¹及P²各自独立地为羟基保护基团，L^G1表示离去基团，-Q-表示-CR⁴R⁵-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、或-C(＝NR⁶)-，R⁴、R⁵、R⁶、及其他的符号与前述定义相同。

需要说明的是，作为离去基团，可举出乙酸酯基(AcO)、对硝基苯甲酸酯基(PNBO)、磺酸酯基(例如，甲磺酸酯基(mesylate：MsO)、对甲苯磺酸酯基(tosylate：TsO)、对溴苯磺酸酯基(brosylate：BsO)、对硝基苯磺酸酯(nosylate：NsO)、氟甲磺酸酯基、二氟甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基(triflate：TfO)及乙磺酸酯基)及卤素原子等。

作为起始原料的化合物A可通过例如将3’及5’羟基经保护的核糖核苷的2’羟基转化为离去基团来合成。对于向离去基团的转化而言，可实施例如醇的磺酸酯化(例如，甲磺酸酯化、对甲苯磺酸酯化)，使甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯与适当的碱(例如，三乙胺或N,N-二甲基-4-氨基吡啶)一同反应来实施。

具有多种多样的R¹、R²的化合物A可利用例如以下记载的化合物A-1、组合使用本领域技术人员已知的保护·去保护反应(例如，前述《有机合成中的保护基》(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)第4版中记载的反应)、氧化反应、还原反应(可以参见例如《有机转换大全》(Comprehensive Organic Transformations)第2版，R.C.Larock著，Wiley-VCH(1999年)等)来合成。

[化学式16]

式中，P³表示羟基保护基团，其他的符号与前述定义相同。

例如，为了合成R¹及R²中的至少一者为烷基的化合物A，首先，通过羟基的保护·去保护反应，对3’位的羟基进行保护，并对5’位的羟基进行去保护，得到化合物(化合物A-2)。然后，将化合物A-2的5’位的羟基氧化，使用与R¹对应的烷基金属试剂或格氏试剂等，可导入所期望的R¹。另外，若有需要，可再次将5’位的羟基氧化，使用与R²对应的烷基金属试剂、金属氢化物或格氏试剂等，可导入所期望的R²。对得到的化合物的3’位的经保护的羟基进行去保护，由此可合成R¹及R²中的至少一者为烷基的化合物A。

(化合物B的合成)：烯烃化

使用合适的碱(例如，DBU或苯甲酸钠)，使离去基团离去，由此可得到烯烃化体(化合物B)。例如，可举出在溶剂中使苯甲酸钠反应的方法。

(化合物C的合成)：环化

-Q-为-CR⁴R⁵-的情况下，可利用通常已知的环丙烷化反应来合成环化体(C)。例如，可举出在溶剂中，使可被烷基取代的二碘甲烷与二乙基锌一同反应的方法。

-Q-为-C(＝O)-的情况下，例如，通过使经保护的羟基二碘甲烷与二乙基锌一同反应、然后对经保护的羟基进行去保护、进行氧化的方法，可合成环化体(C)。-Q-为-C(＝S)-的情况下，对上述为-C(＝O)-的化合物使用劳森试剂等进行硫代羰基化，另外，-Q-为-C(＝NR⁶)-的情况下，对-Q-为-C(＝O)-的前述化合物使用具有对应的氨基的胺进行亚氨基化，由此可合成环化体(化合物C)。

接下来，记载代表性的四元环、五元环或六元环的2’-3’桥联核苷酸的通常的制造方法。

[化学式17]

式中，P¹及P²为羟基保护基团，L^G1及L^G2各自独立地为离去基团，Q¹¹为O、NH或NR⁶，H为氢原子，k为0～3的整数，R⁶及其他的符号与前述定义相同。

起始原料化合物D可基于《美国化学会志》(Journal of the American ChemicalSociety)1998,120,p 5458、《化学会志》(Journal of the Chemical Society)PerkinTransaction 1,1999,p 2543记载的方法等、本领域技术人员已知的方法来合成。

具有多种多样的R¹、R²的化合物D可利用例如以下记载的化合物D-1、组合使用本领域技术人员已知的保护·去保护反应(例如，前述《有机合成中的保护基》(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)第4版中记载的反应)、氧化反应、还原反应(可以参见例如《有机转换大全》(Comprehensive Organic Transformations)第2版，R.C.Larock著，Wiley-VCH(1999年)等)来合成。具体的方法与具有多种多样的R¹、R²化合物A的合成方法相同。

[化学式18]

式中，P³表示羟基保护基团，其他的符号与前述定义相同。

(化合物E的合成)：2’位的立体翻转取代及烯烃的羰基化

对于2’位的离去基团，使其在溶剂中与例如氢氧化钠水溶液等碱进行反应，由此可得到羟基位于2’位的β位的羟基体。对于2’位的离去基团，使其在溶剂中与可具有取代基的胺或氨进行反应，由此可得到可具有取代基的氨基位于2’位的β位的氨基体。或者，通过基于叠氮化钠的还原也可得到氨基体。

此外，将末端烯烃二羟基化，使用氧化剂进行氧化解离，由此可得到羰基化合物E。例如，可举出在溶剂中使催化剂量的四氧化锇和高碘酸钠进行反应的方法。

(化合物G的合成)：羰基的还原及向离去基团的转化

使用合适的还原剂(例如，硼氢化钠)，可将羰基转化为羟基。将生成的羟基进行例如磺酸酯化(例如，甲磺酸酯化、对甲苯磺酸酯化)，由此可合成化合物G。例如，可通过使甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯与合适的碱(例如，三乙胺或N,N-二甲基-4-氨基吡啶)一同反应来实施。

(化合物K的合成)：环化

例如，在溶剂中使其与合适的碱(例如，氢化钠)进行反应，可合成化合物K。另外，存在即使不添加碱也可环化的情况。

(化合物G’的合成)：醛向羧酸的转化

例如，在溶剂中使其与合适的氧化剂(例如，亚氯酸)、磷酸二氢钠及2-甲基-2-丁烯进行反应，由此可得到羧酸化合物G’。

(化合物K’的合成)：环化

通过将化合物G’的羧基、与羟基或氨基利用已知的方法缩合，可合成化合物K’。另外，可将羧基向酯、活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺化等)、酰氯等转化后，利用已知的缩合反应来合成。

从化合物E经由化合物G而得到化合物K的过程中，在对位于2’位的β位的羟基、可具有取代基的氨基进行保护后进行反应，得到化合物G的2’位的羟基或可具有取代基的氨基被保护的化合物(2’位被保护的化合物G)，可对该2’位被保护的化合物G的2’位进行去保护，进行环化反应。从化合物E经由化合物G’得到化合物K’的过程也是同样。

接下来，记载代表性的3’位修饰非桥联核苷酸的通常的制造方法。3’位修饰非桥联核苷酸的合成可以参见《化学会志》(Journal of the Chemical Society)PerkinTransaction 1,1998,p 1409记载的方法等。

[化学式19]

式中，P¹为羟基保护基团，其他的符号与前述定义相同。

作为起始原料的化合物M可基于《化学会志》(Journal of the ChemicalSociety)Perkin Transaction 1,1998,p 1409中记载的方法等、本领域技术人员已知的方法来合成。

具有多种多样的R¹、R²、R³、R¹¹的化合物M可利用例如以下记载的化合物M-1或M-2、组合使用本领域技术人员已知的保护·去保护反应(例如，前述《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis)第4版中记载的反应)、氧化反应、还原反应(可以参见例如《有机转换大全》(Comprehensive Organic Transformations)第2版，R.C.Larock著，Wiley-VCH(1999年)等)来合成。具体的方法与具有多种多样的R¹、R²化合物A的合成方法相同。

[化学式20]

式中的符号与前述定义相同。

[化学式21]

式中的符号与前述定义相同。

例如，对于R³及R¹¹中的至少一者为烷基的化合物M而言，可首先将羟基氧化，然后使用烷基金属试剂或格氏试剂等进行还原来合成。

(化合物N的合成)：烯烃的二羟基化

对于3’位的烯烃，在溶剂中使用合适的二羟基化试剂进行反应，由此可合成化合物N。二羟基化可通过例如使用催化剂量的氯化钌和化学计量以上的高碘酸钠来实施。

(化合物S的合成)：伯醇的烷基化

对于伯醇化合物N，在溶剂中使用合适的烷基化试剂进行反应，由此可合成化合物S。烷基化可在例如合适的碱(例如，N,N-二异丙基乙胺)的存在下、使其与卤代烷基进行反应来实施。

(化合物T及U的合成)：伯醇的烷基化

化合物U可通过化合物M的环氧化、得到的环氧化合物(化合物T)的还原来合成。合成方法可以参见《化学会志》(Journal of the Chemical Society)Perkin Transaction1,1998,p 1409中记载的方法等。

实施例

以下，基于实施例及比较例来更具体地说明本发明，但实施方式不限于以下的实施例。

没有特殊记载的情况下，核酸自动合成仪使用了nS-8II(GeneDesign公司制)。

实施例中的序列标示(表1、2、4、5、7、8、10)中，只要没有特殊记载，则“(L)”是指LNA，小写的字母是指脱氧核糖核苷酸，大写的字母(带有前述(L)的字母除外)是指核糖核苷酸，“＾”是指硫代磷酸酯键，“5”是指该核苷酸的碱基为5-甲基胞嘧啶，“(m)”是指2’-O-MOE化核苷酸，“FAM-”是指5’末端被6-羧基荧光素标记。另外，Z₁是指下式(Z₁)表示的核苷酸结构。

[化学式22]

另外，Z₂是指下式(Z₂)表示的核苷酸结构。

[化学式23]

5’末端的利用6-羧基荧光素的标记是指：在从5’末端的羟基中除去氢原子而得的部分中，介由式-P(＝O)-O-(CH₂)₆-N(H)-表示的基团而结合有从6-羧基荧光素的1个羧基中除去羟基而得的部分。需要说明的是，式中，氮原子键合于从6-羧基荧光素的1个羧基中除去羟基而得的部分，磷原子键合于从5’末端的羟基中除去氢原子而得的部分。

[核苷酸的合成例1]

2’-O-3’-C-桥联的修饰核苷酸(1R,2R,4R,5S)-1-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-4-(胸腺嘧啶-1-基)-3,6-二氧杂双环-[3.2.0]庚烷基于《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society)1998,120,p5458-5463中记载的方法合成。

(实施例1、比较例1)

使用核酸自动合成仪制备表1中记载的反义寡核苷酸。靶基因为小鼠超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)-1(SOD-1)。在间隔区域没有修饰的比较例1的反义寡核苷酸已被报道产生由脱靶效应导致的高毒性(《核酸研究》(Nucleic Acids Research),2016年,44卷,2093页)。

合成的寡核苷酸的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。结果示于表1。

[表1]

[评价例1]

将小鼠脑内皮细胞株bEND.3的细胞以成为5000个细胞/孔的方式悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，接种至96孔板(Corning公司制，#3585)，在5％CO₂环境下于37℃培养约24小时。将表1的各寡核苷酸以其最终浓度成为10nM、30nM、100nM、300nM或1000nM的方式溶解于含有10mM的氯化钙的、含有10％胎牛血清的DMEM培养基(试验培养基)中，在约24小时后更换为试验培养基进行培养(参见《核酸研究》(Nucleic Acids Research),2015年,43卷,e128页)。然后，在7日后回收细胞，使用RNeasy mini kit(QIAGEN公司制)从细胞中提取总RNA。

使用PrimeScript RT Master Mix(Takara Bio Inc.制)从总RNA得到cDNA。使用得到的cDNA及TaqMan(注册商标)Gene Expression ID(Applied Biosystems公司制)通过7500实时PCR系统(Applied Biosystems公司制)来进行实时PCR，对PTEN的mRNA量进行定量。实时PCR中，同时也对持家基因的亲环蛋白(cyclophilin)的mRNA量进行定量，将相对于亲环蛋白的mRNA量而言的PTEN的mRNA量作为PTEN的表达水平进行评价。使用未添加寡核苷酸的细胞作为对照。结果示于图1。

需要说明的是，使用的引物为TaqMan Gene Expression Assay(AppliedBiosystems公司制)，Assay ID如下所述：

小鼠SOD-1定量用：Mm01344233_g1

小鼠cyclophilin定量用：Mm0234230_g1

如由图1表明的那样，确认了本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例1)显示出与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例1)为相同程度的反义效果。

[评价例2]

将小鼠脑内皮细胞株bEND.3的细胞以成为5000个细胞/孔的方式悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，接种至96孔板(Corning公司制，#3585)，在5％CO₂环境下于37℃培养约24小时。将表1的各寡核苷酸以其最终浓度成为10nM、30nM、100nM、300nM或1000nM的方式溶解于含有10mM的氯化钙的、含有10％胎牛血清的DMEM培养基(试验培养基)中，在约24小时后更换为试验培养基进行培养(参见《核酸研究》(Nucleic Acids Research),2015年,43卷,e128页)。然后，对于7日后的细胞培养液添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo^TMLuminescent Cell Viability Assay,Promega公司制)并使其悬浮，于室温静置约10分钟后，使用FlexStation 3(Molcular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅有培养基时的发光值，以3点的平均值的形式测定活细胞数量。使用未添加寡核苷酸的细胞作为对照。

如由图2表明的那样，确认了本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例1)与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例1)相比，细胞毒性低。该结果显示，比较例1中观察到的由脱靶效应导致的细胞毒性通过向间隔区域插入将2’位与3’位桥联而成的核酸而得以降低。

[评价例3]

合成表2中记载的、5’末端被6-羧基荧光素标记、且与实施例1及比较例1的寡核苷酸互补的RNA(RNA(SOD-1))。RNA(SOD-1)的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值为5645.58(M-H^-)。

[表2]

向水(150μL)中加入表1的各寡核苷酸(150pmol)、表2的RNA(450pmol)、及退火缓冲液(200mM KCl,2mM EDTA,pH＝7.5)(60μL)，于90℃加热2分钟。然后，缓缓降温至30℃，维持该温度。加入溶液A(750mM KCl，500mM Tris-HCl，30mM MgCl₂，100mM二硫苏糖醇，pH＝8.0)(30μL)、及来源于大肠杆菌的重组RNaseH(和光纯药工业(株)制)(1个单位)，使其于30℃反应2小时。移至90℃的油浴中，保持5分钟从而使酶失活，利用反相HPLC测定切割RNA的活性。

(HPLC分析条件)

洗脱液：含有0.1M的六氟异丙醇和8mM的三乙胺的水溶液/甲醇＝95/5(1分钟)→(14分钟)→75/25(3.5分钟)

流速：1.0mL/min

色谱柱：Waters X Bridge^TM C18 2.5μm,4.6mm×75mm

柱温：60℃

检测：荧光(Em518nm，Ex494nm)

结果示于表3。表3中，“转化率”示出了RNA(16mer)被切割的比例，是由[100-(RNA(16mer)÷(各峰的面积值的总和)×100)]表示的。另外，“粗体标示的数字(mer)”表示被切割的RNA片段，各自由自5’末端起计数的核苷酸的数目表示。“切割RNA面积(％)”表示各RNA片段峰的面积百分率(％)。

[表3]

关于表3，确认了几乎没有1mer至7mer、13mer至15mer的峰。需要说明的是，7mer至11mer使用核酸自动合成仪另行制备，其分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值如下。

11mer：4095.60(M-H^-)

10mer：3764.68(M-H^-)

9mer：3420.65(M-H^-)

8mer：3074.77(M-H^-)

7mer：2746.23(M-H^-)

确认了上述HPLC分析条件1下的上述峰的保留时间。其他的表3中的RNA片段可根据上述HPLC分析条件1下的峰的保留时间推定。

如由表3表明的那样，本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例1)与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例1)相比，显示出在接近修饰位置的区域中，切割位置的选择性得以提高。由上述评价例1至3的结果显示，提高切割位置的选择性的修饰可降低细胞毒性。

(实施例2、比较例2)

使用核酸自动合成仪制备表4中记载的反义寡核苷酸。靶基因为小鼠凝血因子(coagulation factor)XI(FXI)。在间隔区域没有修饰的比较例2的反义寡核苷酸已被报道产生由脱靶效应导致的高毒性(《核酸研究》(Nucleic Acids Research),2016年,44卷,2093-2109页)。

合成的寡核苷酸的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。结果示于表4。

[表4]

[评价例4]

使用与评价例2相同的评价方法，使表4的各寡核苷酸的最终浓度成为10nM、30nM、100nM、300nM或1000nM，测定活细胞的数量。使用未添加寡核苷酸的细胞作为对照。

结果示于图3。

如由图3表明的那样，确认了本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例2)与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例2)相比，细胞毒性低。该结果显示，比较例2中观察到的由脱靶效应导致的细胞毒性通过向间隔区域插入将2’位与3’位桥联而成的核酸而得以降低。

[评价例5]

合成表5中记载的、5’末端被6-羧基荧光素标记、且与实施例2及比较例2的寡核苷酸互补的RNA(RNA(FXI))。RNA(FXI)的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值为5773.54(M-H^-)。

[表5]

使用与评价例3相同的评价方法，测定切割RNA的活性。但是，反应时间为1.5小时。

结果示于表6。表6中的标示与表3相同。

[表6]

关于表6，确认了几乎没有1mer至6mer、14mer及15mer的峰。需要说明的是，6mer至10mer使用核酸自动合成仪另行制备，分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值如下。

10mer：3828.08(M-H^-)

9mer：3521.67(M-H^-)

8mer：3177.46(M-H^-)

7mer：2873.46(M-H^-)

6mer：2543.94(M-H^-)

如由表6表明的那样，本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例2)与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例2)相比，显示在接近修饰位置的区域中，切割位置的选择性提高(8mer及10mer的生成抑制)。由上述评价例4及评价例5的结果显示，提高切割位置的选择性的修饰可降低细胞毒性。

(实施例3、比较例3)

使用核酸自动合成仪制备表7中记载的反义寡核苷酸。靶基因为人突变型Huntington(muHTT)的、具有由野生型的A突变为G的SNP的位置(参见《分子疗法-核酸》(Molecular Therapy-Nucleic Acids),2017年,第7卷,20-30页)。

[表7]

合成表8中记载的、5’末端被6-羧基荧光素标记的、突变型RNA(mu-HTT，与反义寡核苷酸完全互补)和野生型RNA(wt-HTT，包含与反义寡核苷酸的一个碱基的错配)。

[表8]

上述mu-HTT及wt-HTT的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值如下。

mu-HTT：5367.79(M-H^-)

wt-HTT：5382.02(M-H^-)

[评价例6]

使用表7的各寡核苷酸、和表8的各RNA，使用与评价例3相同的评价方法，测定切割RNA的活性。但是，反应时间为0.5小时。

结果示于表9。表9中的标示与表3相同。

[表9]

关于表9，确认了几乎没有1mer至7mer、13mer至14mer的峰。需要说明的是，mu-HTT的被切割的RNA片段之中的、7mer至13mer使用核酸自动合成仪另行制备，分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。分子量实测值如下。

13mer：4730.56(M-H^-)

12mer：4425.41(M-H^-)

11mer：4117.98(M-H^-)

10mer：3788.92(M-H^-)

9mer：3460.61(M-H^-)

8mer：3154.41(M-H^-)

7mer：2825.87(M-H^-)

确认了上述HPLC分析条件1下的上述峰的保留时间。其他的表9中的RNA片段可根据上述HPLC分析条件1下的峰的保留时间推定。

如由表9表明的那样，就相对于wt-HTT而言的mu-HTT的敲低的选择性而言，与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例2)(91.8÷69.8＝1.3)相比，本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例3)(88.7÷39.4＝2.3)更高。

[评价例7]

将小鼠脑内皮细胞株bEND.3的细胞以成为40000个细胞/孔的方式悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，接种至6孔板(Corning公司制，#3516)，在5％CO₂环境下于37℃培养约24小时。将表1的各寡核苷酸以其最终浓度成为3000nM的方式溶解于含有10mM的氯化钙的、含有10％胎牛血清的DMEM培养基(试验培养基)中，在约24小时后更换为试验培养基进行培养(参见《核酸研究》(Nucleic Acids Research),2015年,43卷,e128页)。进而在24小时后回收细胞，使用RNeasy mini kit(QIAGEN公司制)从细胞中提取总RNA。使用未添加寡核苷酸的细胞作为对照。

按照常规方法，从总RNA制作被Cy3[花青素-3]荧光标记的互补的RNA。通过单色法(one-color protocol)使经荧光标记的互补的RNA、与SurePrint G3 Mouse GeneExpression 8×60K v2(Agilent Technologies公司制)杂交。使用GeneSpring软件(Agilent Technologies公司制)分析得到的信号数据，对相对于对照而言的基因的表达量的变化综合性地进行分析。比较例1的结果示于图4，实施例1的结果示于图5。需要说明的是，图4及图5中，横轴(对照实验的log 2表达量(log 2 expression of controlexperiment))表示对照检体中的表达量(log2)，纵轴(log 2倍数变化(log 2 foldchange))表示相对于对照的表达变化的比例(log2)。

根据图4及图5来计数表达量成为50％以下的基因的数量后，确认了在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例1)为760，而本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例1)为564。由此确认，本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例1)抑制了脱靶效应。

[核苷酸的合成例2]

3’-甲基-核苷酸(2R,3S,5R)-2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-甲基-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)亚磷酰胺基于《化学会志》(Journal of the Chemical Society)Perkin Transactions 1，1998年,120卷,5458-5463页中记载的方法合成。

(实施例4、比较例2)

使用核酸自动合成仪制备表10中记载的反义寡核苷酸。靶基因与实施例2及比较例2同样地为小鼠凝血因子XI(FXI)。

合成的寡核苷酸的分子量利用MALDI-TOF-MASS进行测定。结果示于表10。

[表10]

[评价例8]

使用与评价例5相同的评价方法，测定切割RNA的活性。反应时间为1.5小时。

结果示于表11。表11中的标示与表3相同。

[表11]

关于表11，确认了几乎没有1mer至6mer、14mer及15mer的峰。

由表11可见，本发明涉及的反义寡核苷酸(实施例4)与在间隔区域没有修饰的反义寡核苷酸(比较例2)相比，显示在接近修饰位置的区域中，切割位置的选择性得以提高(8mer及10mer的生成抑制)。

产业上的可利用性

本发明的寡核苷酸能够抑制脱靶效应，因此可认为其能够降低毒性，作为用于对代谢性疾病、肿瘤、感染症等伴随靶RNA的功能及/或靶基因的表达亢进而出现的疾病进行治疗、预防的医药组合物等是有用的。

日本专利申请2018-052578(申请日：2018年3月20日)及日本专利申请2018-129296(申请日：2018年7月6日)的全部公开内容通过参照被并入本说明书中。本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准通过参照被并入本说明书中，各文献、专利申请及技术标准通过参照被并入的程度与具体且分别地记载的情况的程度相同。

Claims

其中，

-中央区域为下述区域：

-5’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其3’末端为糖部修饰核苷酸，其中，所述3’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

-3’侧区域为下述区域：

所述区域由独立地选自由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及糖部修饰核苷酸组成的组中的至少1个核苷酸组成，其5’末端为糖部修饰核苷酸，其中，所述5’末端的糖部修饰核苷酸与中央区域结合，选自除了2’-3’桥联核苷酸及3’位修饰非桥联核苷酸以外的糖部修饰核苷酸，并且，

2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中，所述中央区域由5～15个核苷酸组成，

3.如权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中，所述中央区域由8～12个核苷酸组成，

4.如权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸为包含下式(I)表示的部分结构的核苷酸，

[化学式1]

式(I)中，m为1、2、3或4，

Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团，

R⁷及R⁸各自独立地为氢原子或C1-C6烷基。

5.如权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的3’位修饰非桥联核苷酸为包含下式(II)表示的部分结构的核苷酸，

[化学式2]

式(II)中，Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

6.如权利要求4所述的反义寡核苷酸，其中，中央区域所包含的2’-3’桥联核苷酸为下式(III)表示的核苷酸，

[化学式3]

式(III)中，Bx为核酸碱基部分，

X为O或S，

R⁶为C1-C12烷基或氨基保护基团。

7.如权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中，-Q¹-为-O-、-NH-、-NR⁶-或-S-，R⁶为C1-C12烷基，-Q²-为-CH₂-。

8.如权利要求6或7所述的反义寡核苷酸，其中，-Q¹-为-O-，-Q²-为-CH₂-。

9.如权利要求4至8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，R¹、R²及R³为氢原子。

10.如权利要求4至9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，X为O。

11.如权利要求1至10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，

所述中央区域为间隔区域，

所述5’侧区域为5’翼区域，

所述3’侧区域为3’翼区域。

12.如权利要求1至11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，所述5’侧区域及所述3’侧区域所包含的糖部修饰核苷酸各自独立地选自由2’位修饰非桥联核苷酸及2’,4’-BNA组成的组。

13.如权利要求12所述的反义寡核苷酸，其中，所述2’位修饰非桥联核苷酸为选自由2’-O-甲基化核苷酸、2’-O-甲氧基乙基(MOE)化核苷酸、2’-O-氨基丙基(AP)化核苷酸、2’-氟代核苷酸、2’-O-(N-甲基乙酰胺)(NMA)化核苷酸及2’-O-甲基氨基甲酰基乙基(MCE)化核苷酸组成的组中的至少一者。

14.如权利要求12所述的反义寡核苷酸，其中，所述2’,4’-BNA为选自由LNA、cEt-BNA、ENA、BNA^NC、AmNA及scpBNA组成的组中的至少一者。

15.如权利要求1至14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中，反义寡核苷酸包含硫代磷酸酯键。

16.如权利要求1至15中任一项所述的反义寡核苷酸，其还包含来源于功能性分子的基团，所述功能性分子具有选自由标记功能、纯化功能及向靶标部位递送的功能组成的组中的至少1种功能。

17.如权利要求16所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子选自由糖、脂质、肽及蛋白质以及它们的衍生物组成的组。

18.如权利要求16或17所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为选自由胆固醇、生育酚及生育三烯酚组成的组中的脂质。

19.如权利要求16或17所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为与脱唾液酸糖蛋白受体相互作用的糖衍生物。

20.如权利要求16或17所述的反义寡核苷酸，其中，所述功能性分子为选自由受体的配体及抗体组成的组中的肽或蛋白质。

21.权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸的前体药物。

22.寡核苷酸复合体，其包含：

(i)权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸；及

23.寡核苷酸，其包含：

(i)来源于权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸的基团；及

(ii)来源于包含下述区域的寡核苷酸的基团，所述区域包含至少1个核糖核苷酸，且可与所述(i)的反义寡核苷酸进行杂交所述寡核苷酸是将所述(i)来源于反义寡核苷酸的基团、与所述(ii)来源于寡核苷酸的基团连接而成的。

24.寡核苷酸复合体，其包含：

(iii)寡核苷酸，其在来源于权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

其中，

所述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链、与所述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的所述寡核苷酸链进行杂交。

25.寡核苷酸，其包含：

(iii)来源于寡核苷酸的基团，所述寡核苷酸在来源于权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸的基团上连接有包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链；及

所述(iii)的包含至少1个核糖核苷酸的寡核苷酸链与所述(iv)的包含可被RNaseH识别的至少4个连续的核苷酸的所述寡核苷酸链进行杂交。

26.医药组合物，其含有：药理学上允许的载体；和权利要求1至25中任一项所述的反义寡核苷酸、权利要求21所述的前体药物、权利要求22或24所述的寡核苷酸复合体、或者权利要求23或25所述的寡核苷酸。

27.对靶RNA的功能加以控制的方法，其包括下述步骤：使细胞与权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸、权利要求21所述的前体药物、权利要求22或24所述的寡核苷酸复合体、或者权利要求23或25所述的寡核苷酸接触。

28.对哺乳动物中的靶RNA的功能加以控制的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施予权利要求26所述的医药组合物。

29.对靶基因的表达加以控制的方法，其包括下述步骤：使细胞与权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸、权利要求21所述的前体药物、权利要求22或24所述的寡核苷酸复合体、或者权利要求23或25所述的寡核苷酸接触。

30.对哺乳动物中的靶基因的表达加以控制的方法，其包括下述步骤：向所述哺乳动物施予权利要求26所述的医药组合物。

31.方法，所述方法使用选自由2’-3’桥联核苷酸、及3’位修饰非桥联核苷酸组成的组中的核苷酸来制造权利要求1至20中任一项所述的反义寡核苷酸或权利要求21所述的前体药物。