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CN111867624A - 乙型肝炎病毒(hbv)疫苗的递送方法和装置 - Google Patents

乙型肝炎病毒(hbv)疫苗的递送方法和装置 Download PDF

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CN111867624A
CN111867624A CN201880089692.8A CN201880089692A CN111867624A CN 111867624 A CN111867624 A CN 111867624A CN 201880089692 A CN201880089692 A CN 201880089692A CN 111867624 A CN111867624 A CN 111867624A
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electrode
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H·霍顿
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S·罗伊
A·W·汉纳曼
R·M·伯纳德
S·A·莫尔斯
O·拉克
A·哈特曼
T·D·考克斯
D·德普特尔
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Janssen Sciences Ireland ULC
Ichor Medical Systems Inc
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Abstract

本公开涉及将HBV疫苗可重复、一致和有效地递送至受试者的方法和装置。本公开包括通过孔向受试者受控地给药HBV疫苗的装置，相对于孔以预定空间关系排列的多个穿透电极，以及可操作地连接至电极的电信号发生器。

Description

乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的递送方法和装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月19日提交的国际专利申请号PCT/US2017/067269和2017年12月19日提交的美国临时专利申请号62/607,430的优先权，其公开内容整体援引加入本文。
电子提交的序列表的引用
本申请包含序列表，其通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名“688097-405Sequence Listing”，创建日期2018年12月10日，大小为46.6KB。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的部分，并且其整体援引加入本文。
技术领域
本公开涉及向有需要的受试者给药预防性和/或治疗性乙型肝炎病毒(HBV)疫苗，更特别地，涉及预防性和/或治疗性HBV疫苗的可重复性、一致和有效的递送，如编码HBV抗原的核酸，递送至所关注的所选组织部位中的定义区域，通过电场的局部应用促进，以跨越异质受者群体的安全、有效和一致的方式，同时用户培训最少。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种3.2-kb的小型嗜肝DNA病毒，其编码4个开放阅读框和7个蛋白。约有20亿人感染HBV，并且约有2.4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性HBV)，其特征是血液中持续存在病毒和亚病毒颗粒超过6个月(Cohen et al.J.Viral Hepat.(2011)18(6),377-83)。持续HBV感染通过病毒肽和循环抗原长期刺激HBV特异性T细胞受体导致循环的和肝内HBV特异性CD4+和CD8+T细胞中的T-细胞衰竭。结果，T细胞多功能性降低(即，IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ的水平降低，缺少增殖以及脱颗粒)。治疗性疫苗接种有可能消除慢性感染受试者的HBV(Michel et al.J.Hepatol.(2011)54(6),1286-1296)。包含编码一种或多种HBV抗原的一种或多种核酸分子的免疫原性组合物可以用来向有需要的受试者提供治疗性免疫，如患有慢性HBV感染的人。
虽然裸DNA可以在体内递送至细胞并导致基因表达，但是基因转移的效率相对较低且变化很大。已显示电信号的局部应用增强大分子在活组织中的分布和吸收。与预防性或治疗性HBV疫苗给药关联的这类电信号在组织中的应用可以对组织和/或待递送的药剂产生理想的效应。具体地，诸如电穿孔和离子导入的技术已用来显著提高核酸(包括DNA和RNA序列)的分布和/或吸收。这类技术的潜在临床应用包括用于预防性和治疗性免疫的核酸序列的递送，以及编码治疗性蛋白或肽的核酸序列的递送。
应用过程包括将所关注的药剂给药至靶组织部位，并且结合施加足够大小和持续时间的电场，以便在药剂的递送、分布和/或效力上诱导期望的效应。电场通过与组织导电连通的两个或更多个电极传播。适合用于这些技术的电极配置包括组织穿透电极、表面接触电极和气隙电极。特定电极配置包括但不限于细长的针状或棒状电极、点电极、曲折电极(即，成形线)、平面电极以及它们的组合。基于靶组织类型和程序的目的选择电极的特定类型和排列。当电场在所关注的药剂存在下在靶组织内传播时，可以达到最佳期望的效果。
为了增强皮肤和肌肉组织中的药剂递送的目的，已描述了在所关注的药剂存在下在组织中施加电场的各种方法和设备。所述设备包括使用表面和组织穿透电极系统以及它们的组合。尽管有与电介导的药剂递送相关的预期以及这些技术的潜在临床应用，但仍然需要将所关注的核酸可靠且持续递送至受试者。这种可变性的重要来源是由于技术和操作人员技能水平的差异。目前系统未解决的其他可变性来源包括受试者之间生理特征的差异，这可以影响程序的应用。开发合适设备的其他考虑因素包括它们的易用性以及实施减少潜在用户错误的频率和重要性的设计。
鉴于非常期望安全、可靠、准确和一致的临床疗法应用，开发改进的应用系统势在必行。这样的开发应当包括最小化与操作人员相关的可变性的手段，同时提供适应在电介导的药剂递送的广泛临床应用中可能遇到的受试者特征差异的手段。换句话说，改进的特定领域包括在异质受者群体中保持一致性能的能力，以及降低用户有效使用所需的培训和技能水平。此外，所述设备、系统或方法应当设计为有助于避免用户或设备错误，并且在错误发生时最小化它们的影响。
提供此发明背景是为后面的发明概述和详细说明引入简短的上下文。此发明背景并非旨在帮助确定要求保护的主题的范围，也不视作将要求保护的主题限于解决上述任何或所有缺点或问题的实施方式。
发明内容
本公开提供利用电介导的治疗剂递送(EMTAD)向有需要的受试者可重复、一致和有效地递送包含编码HBV抗原的核酸分子的HBV疫苗的装置、试剂盒和方法。在本文描述的实施方案中，治疗剂是HBV疫苗。
在本公开的一方面，提供一种用于将HBV疫苗递送至受试者的预定部位的装置，其包括将HBV疫苗受控地给药至受试者的组件，所述组件包括含有HBV疫苗的储存器，至少一个用于给药的孔，以及受控能量源，其足以将预定量的HBV疫苗以预定速率从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。此外，所述装置可以包含相对于孔以预定空间关系排列的多个穿透电极，以及可操作地连接至电极的电信号发生器。
在本公开的另一方面，提供一种用于将HBV疫苗递送至受试者的预定部位的试剂盒，其包含HBV疫苗和装置，所述装置包括将HBV疫苗受控地给药至受试者的组件，其中所述装置包括HBV疫苗的储存器，至少一个用于给药HBV疫苗的孔，以及受控能量源，其足以将预定量的HBV疫苗以预定速率从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。此外，所述装置可以包含相对于孔以预定空间关系排列的多个穿透电极，以及可操作地连接至电极的电信号发生器。
本申请的装置或试剂盒中包括的HBV疫苗可以包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中。
本公开的其他方面包括方法，所述方法包括与电信号管理(ESA)具有可控的空间和时间关系的HBV疫苗给药。
根据本申请原理的某些实施方式的益处和优势是多方面的。一些实施方式允许选择针和电极插入的深度，允许插入各种类型的期望组织，(例如，真皮、肌肉等)跨越不同体重和身体组成的异质群体。这些实施方式还促进所述方法适用于特定靶群体，例如但不限于患有慢性HBV感染和/或HBV诱导的疾病的人类患者。本文提供包含设计特征的系统和方法，所述设计特征使得所述系统和方法能够抵抗意外放电或潜在滥用，例如，由于掉落、震动和/或跌落。在一些实施方案中提供配置为多种注射深度的设备。根据本申请原理的系统和方法允许许多安全联锁以减少用户错误的频率和/或影响。这些包括有助于正确准备和配置待给药剂量的特征，确保设备以必要的力施加至受者的组织，确保已移除安全帽等。根据本申请原理的系统、装置、试剂盒和方法可以允许递送高度一致的疗法，与施用者或受者的类型无关。本文描述的系统、装置、试剂盒和方法可以允许例如在治疗递送之前和期间获得一致的力分布，从而具有不同皮肤和肌肉特征的受者可以一致地剂量给药。
提供本发明概述是为了以简化形式介绍一些概念。在发明详述部分中进一步描述了这些概念。本发明概述中描述的那些以外的元素或步骤是可能的，并且没有元素或步骤是必需的。本发明概述既不旨在鉴定要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于辅助确定要求保护的主题的范围。要求保护的主题不限于解决本公开的任何部分中指出的任何或所有缺点的实施方式。
本发明的其他方面、特征和优点从以下公开显而易见，包括本发明的详细描述及其优选实施方案和所附权利要求书。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本公开的特征。参考以下阐述说明性实施方案的详细描述会更好地理解本公开的特征和优点，其中利用了本公开的原理以及附图：
图1说明与常规针头注射器注射相关的空间变异性的潜在来源。
图2是根据本申请原理的系统的概括，包括药筒组件100、施加器400和控制系统器700。
图3A-3B示出本文描述的设备各方面的视图。图3A示出根据本申请原理的药筒组件100的侧视图。图3B示出根据本申请原理的体现为注射器的HBV疫苗的储存器101的侧视图。
图4示出根据本申请原理的药筒组件100的各种示例性部件。
图5A-5E示出本文描述的设备中的内部药筒和药筒后膛(breech)各方面的视图。图5A说明根据本申请原理的内部药筒103的顶视图。图5B说明根据本申请原理的内部药筒103和药筒后膛的底视图。图5C说明根据本申请原理的内部药筒103的细节侧面透视图。图5D示出根据本申请原理的药筒后膛112的侧视图。图5E说明储存器联锁120，其具有改进的锁定功能部件以防止药筒后膛112意外地向前移动。
图6说明药筒组件的细节，其示出根据本申请原理的齿条154、启动标志172和继续标志174。
图7A-7B示出本文描述的设备中的电极和/或电极接触部各方面的视图。图7A示出根据本申请原理的电极接触部130和各种电极接触部部分的细节。图7B示出根据本申请原理的电极122和各种电极接触部部分的细节。
图8A-8B示出本文描述的设备中的力接触联锁系统各方面的视图。图8A示出根据本申请原理的力接触联锁系统的顶视图。图8B说明根据本申请原理的力接触联锁系统的细节。
图9A-9D示出本文描述的设备各方面的视图。图9A示出根据本申请原理的用于组织插入的针头105和远端内部药筒电极137。图9B说明根据本申请原理的棒护罩134的细节。图9C说明根据本申请原理的对齐引导器108和展开盾168。图9D说明集成至外部药筒盖106的棒护罩(stick shield)支撑。
图10A-10D示出本文描述的设备中的外部药筒盖各方面的视图。图10A示出根据本申请原理的外部药筒盖110。图10B示出根据本申请原理的外部药筒盖110的侧面视图。图10C示出根据本申请原理的对齐引导器108和展开盾(splay shield)中使用的外部药筒盖110。图10D示出外部药筒盖110，其具有设计成在操作和装载期间将内部药筒103保持就位的延伸构件。
图11A-11C示出本文描述的设备各方面的棒护罩的细节。图11A示出根据本申请原理的棒护罩134的棒护罩保持钩182。图11B示出根据本申请原理的棒护罩134的细节。图11C示出根据本申请原理的将棒护罩134保持就位的棒护罩支撑件132。
图12示出根据本申请原理的电极支撑件(electrode support)124的细节。
图13A-13B示出本文描述的设备中的施加器(applicator)的视图。图13A示出根据本申请原理的施加器400的侧面视图。图13B示出根据本申请原理的施加器400的顶视图。
图14示出根据本申请原理的施加器400的分解图。
图15示出根据本申请原理的施加器400的侧面壳和电穿孔电极连接(electrodeconnection)496的细节。
图16是根据本申请原理的施加器的分解图，示出药筒装载子组件456。
图17A-17B示出本文描述的设备中的施加器的视图。图17A是根据本申请原理的施加器的分解图，示出装载驱动子组件454。图17B示出根据本申请原理的装载驱动子组件454中的齿条154。
图18A-18C示出本文描述的设备中的施加器各方面的视图。图18A示出根据本申请原理的药筒装载子组件456的细节，显示施加器的插入/注射驱动组件与药筒组件配合的位置。图18B示出根据本申请原理的药筒组件的横断面视图，显示施加器的插入/注射驱动组件与药筒组件配合的位置。图18C示出根据本申请原理的施加器400的药筒装载、电极插入和注射子组件452的细节。
图19示出根据本申请原理的控制器系统的各种组件。
图20A-20D示出本文描述的设备的视图。图20A示出根据本申请原理的控制器系统的各种组件。图20B示出根据本申请原理的控制器系统的施加器连接器端口708和托盘710的细节。图20C示出根据本申请原理的控制器系统的刺激器显示屏的细节。图20D示出根据本申请原理的控制器系统的后视图的细节。
图21是示出根据本申请原理的操作方法的流程图。
图22说明用于肌肉内(IM)递送的TriGrid电极阵列(横截面)，其包含4个以两个等边三角形排列的电极以形成围绕中心注射针的菱形。
图23A-23B示出适用于小鼠模型(图23A)和非人灵长类(NHP)模型(图23B)的TDS-IM v1.0 TriGrid设备。
图24示出适用于非人灵长类(NHP)模型的TDS-IM v2.0 TriGrid设备。
图25A-25H示出如实施例1描述的编码HBV pol和核心抗原的表达盒和DNA质粒的设计和优化。图25A是表达策略的示意图，其中将HBV核心和pol抗原的编码序列符合读框地融合。图25B是表达策略的示意图，其中核心和pol抗原的编码序列通过核糖体FA2滑动位点从单个质粒表达。图25C是表达策略的示意图，其中核心和pol抗原从两个分别的质粒表达。图25D是用表达有或无转录后调节元件WPRE的核心的质粒转染的HEK293T细胞中核心抗原表达的蛋白印迹；利用α-核心抗体在细胞裂解物(左)和上清(sup；右)中测试表达。图25E是蛋白印迹分析，示出用包括源自人载脂蛋白A1前体的内含子/外显子序列(“AI内含子”)，人T-细胞白血病病毒1型(HTLV-1)长末端重复(LTR)的非翻译R-U5结构域(“HTLV R”)或者HTLV-1LTR、合成的兔β-珠蛋白内含子和剪接增强子的三重增强子复合序列(“三重”)的核心表达质粒转染的HEK293T细胞中的核心表达比较；未标记的泳道是作为大小标记的纯化的核心蛋白；在裂解物(左)和上清(sup；右)中测试表达；具有三重增强子复合序列的核心抗原表达最高。图25F是利用融合至HBV核心抗原的N-末端的不同信号肽的核心抗原分泌的蛋白印迹分析；用Cystatin S信号肽观察到最高效的蛋白分泌。图25G是图25A-25C中说明的三种表达策略中每个的优化的HBV核心/pol抗原表达盒的示意图；CMVpr：人CMV-IE启动子；TRE：三增强子序列；SP：cystatin S信号肽；FA2：FMDV核糖体滑动位点；pA：BGH多腺苷酸化信号。图25H是包含图25G中示出的每个表达盒的pDK载体的HBV核心和pol抗原表达的蛋白印迹分析；泳道1和2：pDK-核心；泳道3和4：pDK-pol；泳道5和6：pDK-coreFA2Pol；泳道7和8：pDK-core-pol融合；当通过分别的载体编码抗原时观察到细胞和分泌的核心和pol抗原的最一致的表达谱。
图26A-26B示出根据本申请的实施方案的DNA质粒的示意图。图26A示出根据本申请的实施方案的编码HBV聚合酶(pol)抗原的DNA质粒；图26B示出根据本申请的实施方案的编码HBV核心抗原的DNA质粒；HBV核心和pol抗原在CMV启动子的控制下表达，具有在从细胞分泌时从表达的抗原切割的N-末端cystatin S信号肽；质粒的转录调节元件包括位于CMV启动子和编码HBV抗原的多核苷酸序列之间的增强子序列，以及位于编码HBV抗原的多核苷酸序列下游的bGH多腺苷酸化序列；第二表达盒反向包含在质粒中，包括Ampr(bla)启动子控制下的卡那霉素抗性基因；还包含反向的复制起点(pUC)。
在全文中，相似的参考数字是指相似地元件。除非另有说明，元件未按照比例。
具体实施方式
以下描述和实施例详细说明本发明的实施方案。应当理解本发明并不限于本文描述的具体实施方案，因此可以变化。本领域技术人员会认识到本发明有许多变化和修改，这涵盖在其范围内。
所有术语理解为它们被本领域技术人员理解的那样。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本文所用的段落标题仅用于组织目的，而不应当理解为限制所述主题。
虽然本发明的各种特征可以在单一实施方案的上下文中描述，但是特征也可以单独或以任何合适的组合提供。相反地，虽然为了清楚，本发明在本文中可以在分别的实施方案的上下文中描述，但是本发明也可以在单一实施方案中实施。
为了帮助本申请的读者，已将本说明书分为若干段落或节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些区分不应当认为是将段落或节或实施方案的内容与其他段落或节或实施方案的内容分开。相反地，本领域技术人员会理解本说明书具有宽泛的应用，并且涵盖可以考虑的各个节、段落和句子的所有组合。任何实施方案的讨论仅是示例性的，并不意图将包括权利要求书在内的本公开的范围限于这些实例。例如，虽然可以用于本文描述的可以用于本申请的HBV载体的实施方案(例如，质粒DNA或病毒载体)可以包含特定组分，包括但不限于以特定次序排列某些启动子序列、增强子或调节序列、信号肽、HBV抗原的编码序列、多腺苷酸化信号序列等，但是本领域技术人员会理解本文公开的概念可以等同地应用于本申请的HBV载体的以其他次序排列的其他组分。本申请考虑以任何组合使用具有任何序列的任何可用的组分，所述序列可以用于本申请的HBV载体，无论是否明确描述特定组合。
以下定义补充本领域那些，并且是针对本申请的，而不应归因于任何相关或无关情况，例如，任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可以在实践中用于测试本公开，但是描述了优选的材料和方法。因此，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的而不是为了限制。
在本申请中，除非另有说明，单数的使用包括复数。必须注意，当用于本说明书时，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指代。在本申请中，除非另有说明，“或者”的使用表示“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
在本说明书中提到“一些实施方案”、“一实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”表示结合实施方案描述的特定特性、结构或特征包括在本发明的至少一些实施方案中，尽管不必是所有实施方案。
如本说明书和权利要求所用，词语包含“(comprising)”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或开放性的，并且不排除额外的未列举的元件或方法步骤。预期本说明书中讨论的任何实施方案可以按照本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用来实现本发明的方法。
如本文所用，关于参考数值的术语“约”及其语法等价形式可以包括数值本身以及该数值正负10％的值范围。例如，量“约10”包括10以及9-11的任何量。例如，与参考数值相关的术语“约”还可以包括该值正负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值范围。
本公开提供改进的系统、试剂盒、方法和装置用于HBV疫苗的可重复、一致和有效的递送如编码HBV抗原的核酸，及其与电介导的治疗剂(例如，HBV疫苗)递送(EMTAD)的组合。
在一方面，本公开提供一种装置，其用于递送HBV疫苗至受试者的预定部位，所述装置包括药筒组件，所述药筒组件包括外部药筒、内部药筒、含有HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在外部药筒内并配置为接收所述储存器；施加器，其包含药筒组件接收空间、针头接口(needle hub)和插入检测器，其中插入检测器可感测储存器容纳空间中储存器的装载；至少一个联锁，其中联锁有助于HBV疫苗接种程序的正确执行；至少一个注射孔(orifice)，通过其给药HBV疫苗；相对于孔以预定空间关系排列的多个穿透电极；电场发生器，用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及受控能量源，其足以将预定量的HBV疫苗以预定速率从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。
在另一方面，本公开提供一种试剂盒用于递送HBV疫苗至受试者的预定部位，所述试剂盒包括HBV疫苗和一个装置，所述装置包括药筒组件，所述药筒组件包括外部药筒、内部药筒、HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在外部药筒内并配置为接收所述储存器；施加器，其包含药筒组件接收空间、针头接口和插入检测器，其中插入检测器可感测储存器容纳空间中储存器的装载；至少一个联锁，其中联锁有助于HBV疫苗接种程序的正确执行；至少一个注射孔，通过其给药HBV疫苗；相对于孔以预定空间关系排列的多个穿透电极；电场发生器，用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及受控能量源，其足以将预定量的HBV疫苗以预定速率从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。
本申请的装置或试剂盒中包括的HBV疫苗可以包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中。
在本公开的某些方面，EMTAD可以称作将HBV疫苗给药至所关注的生物组织，以及为了增强HBV疫苗在所述组织中的运动和/或吸收的目的向生物组织较早、同时或随后施加电信号。EMTAD程序包含两个元素：1)治疗剂(即，HBV疫苗)给药(TAA)，以及2)足以诱导期望的EMTAD效应的电信号应用(ESA)。在本公开中，TAA可以例如以可控方式完成，称作受控的治疗剂(例如，HBV疫苗)给药(CTAA)。本文中使用的术语CTAA可以指相对于诱导EMTAD效应，对HBV疫苗的给药提供空间和/或时间控制的方法或装置。可控的给药技术可以利用常规针头-注射器上的变化(例如自动化注射设备)和/或各种无针方法(例如喷射注射器、透皮/经皮贴剂、口服、凝胶、乳膏或吸入给药)。如本文所用的术语ESA可以指施加电信号以促进或增强活性物质如HBV疫苗的递送，通过提高药剂在组织内的运动和/或吸收，从而诱导EMTAD效应。当用来促进或增强HBV疫苗的递送时，ESA程序如电穿孔、离子导入、电渗透、电通透、电刺激、电迁移和电对流均代表EMTAD的各种模式，其中一种或多种可以包括在本文描述的方法中。
本文描述的装置、试剂盒和系统的具体应用包括但不限于递送包含一种或超过一种核酸分子的HBV疫苗。传统上在这类应用中，EMTAD是通过利用常规针头-注射器进行HBV疫苗注射开始的。在给予药剂之后，将适合ESA的设备在指定位置应用于受试者。最后，适当的ESA方案用来为HBV疫苗递送提供期望的促进或增强。但是，用传统的EMTAD，可能无法实现药剂给药和ESA之间期望的时空关系。
空间参数
在本文描述的系统、试剂盒、方法和装置的一些实施方案中，利用常规针头注射器进行HBV疫苗给药。需要用EMTAD递送某些药剂使TAA问题更加复杂。如图1所示，在任何常规针头-注射器注射中，由于将针头5插入组织，相对于组织3的表面的插入深度1和角度2可能难以控制。此外，在组织表面3处的针刺入点4可能不代表靶组织内孔6的位置和药剂给药区域7。作为说明性实例，经皮肌肉内注射可能不对应于皮肤上的插入部位，因为两种组织通常可以相对于彼此移动。
虽然这种常规方法一般足以递送不需要EMTAD的许多不同治疗剂，但是这些变量导致注射之后HBV疫苗的分布通常不一致和/或不确定，并且可能妨碍有效的EMTAD。在本文描述的某些实施方案中，EMTAD的最有效使用是利用受试者的HBV疫苗和ESA之间的预定义关系。结果，在靶组织中对TAA没有空间控制的情况下，利用常规针头注射器可以导致与提供时空控制的装置、方法或系统相比，EMTAD应用的有效性降低，这个概念的一个说明性实例是使用电穿孔以促进HBV疫苗的递送。当TAA和ESA共定位在组织的靶区域内时，电穿孔通常最有效地增强HBV疫苗递送。在许多情况下，如果待递送的药剂和诱导的电穿孔效应未共定位在组织的靶区域内，药剂的递送不理想。
EMTAD中需要TAA的适当空间控制的另一实例是离子导入。EMTAD的这种模式使用电场引起带电分子的运动。为了实现期望的药剂移动，必须实现电极和HBV疫苗之间的适当空间关系。如果将带负电荷的药剂放置在紧邻正极的位置，则几乎不会观察到该药剂通过组织的移动。相反，所述带负电荷的药剂靠近负极的定位会导致该药剂在正极方向上通过组织的显著移动。
如前述实例所示，控制TAA相对于ESA应用的精确位置非常重要，以实现期望的效应。因此，本文描述的装置和方法的实施方案提供对TAA相对于ESA应用的精确位置的控制，并且可用于实现一种或多种HBV疫苗的可重复性、一致和良好表征的分布。
时间参数
在常规针头-注射器注射的情况下，TAA的注射速度可能从一个操作员到另一个操作员不同，从而引起组织中不一致的药剂分布。当需要多个设备放置以完成EMTAD程序时，引入额外的时间变异性。例如，EMTAD的一个应用要求给药编码治疗性蛋白的质粒DNA，然后产生诱导电穿孔的电场。利用EMTAD的传统方法，用针头-注射器注射HBV疫苗，然后放置并激活电穿孔设备。由于需要两个单独的设备放置(初始的针头注射器，随后的ESA设备)，因此这个过程易受操作员对每个设备的不一致时间应用所引起的受试者间变异性的影响。此外，使用两个单独的设备放置会导致临床医生放置和激活每个设备之间不可避免的时间间隔。在需要多个应用部位以实现将药剂充分递送至靶组织内的指定区域的情况下，这变得更加复杂。
这些问题对于在细胞外环境中可以降解或失活的药剂(如核酸)尤其重要。HBV疫苗中核酸的降解可以导致治疗应用的效力和一致性下降。而且，HBV疫苗中核酸的受试者间降解速率不是恒定的，因此导致与ESA，更特别地与电穿孔疗法结合的常规针头-注射器注射的总体治疗不一致性。
由于与ESA结合使用的常规针头-注射器注射的空间和时间可变性的固有困难，TAA相对于ESA的精确位置和时机通常是未知的。结果，用EMTAD的HBV疫苗的有效给药和剂量给药可能是不一致和不可重复的。虽然常规针头-注射器注射有时足以用于HBV疫苗，但是通过控制HBV疫苗给药和期望的EMTAD效应的诱导之间的时空关系，显著增强HBV疫苗的可重复性和一致性递送。
因此，虽然传统EMTAD程序可能对于某些应用是足够的，但是对于通常需要高度一致性和可重复性的临床应用，时间和空间控制是非常期望的。与常规EMTAD方法相反，本文描述的方法、系统和装置的实施方案促进CTAA和ESA来为EMTAD的临床应用提供更有利的方法和装置。本公开利用CTAA的各方面结合ESA来提供可重复性、一致和有效的HBV疫苗递送。本公开描述了相对于电信号的应用对HBV疫苗的给药提供空间和时间控制的方法和装置，从而改善所述疫苗在靶组织中的移动和/或吸收。
在一些实施方案中提供方法和装置，其中相对于电信号的应用，HBV疫苗的给药存在可控的空间关系。在治疗之前，确定TAA相对于ESA的最佳位置。TAA和ESA之间的这种空间关系由治疗参数决定，包括给予的药剂的性质和给予药剂的靶组织的特性。在示例性实施方案中，优选将电信号施加至HBV疫苗给药部位的远端。在某些其他实施方案中，空间关系是将诱导EMTAD的电信号施加至药剂给药部位的近端。在某些情况下，优选TAA和ESA之间的共定位。当使用电穿孔和/或离子导入诱导期望的EMTAD效应时，通常会是这种情况。
在本公开的另一方面，本文描述的装置为TAA相对于ESA的顺序和时机提供可控的时间关系。在治疗之前，确定TAA和ESA组合的最佳顺序和时机。与空间关系一样，TAA和ESA之间期望的时间关系由参数决定，如给予的药剂的性质和给予药剂的靶组织的特性。在某些应用中，暴露于与ESA相关的电场可能对HBV疫苗产生不利影响。在这类应用的实践中，产生这样的电场之后是CTAA。但是，典型的时间关系是CTAA然后ESA。
本公开提供改进的方法和装置，其用于用EMTAD可重复性、一致和有效的递送包含基于核酸的构建体的HBV疫苗。通过控制相对于电信号应用的HBV疫苗的空间和时间给药实现这个目的。在某个实施方案中，EMTAD是通过利用常规针头-注射器进行HBV疫苗注射开始的。在给予药剂之后，将适合ESA的设备在指定位置应用于受试者。适当的ESA方案用来为HBV疫苗递送提供期望的促进或增强。已证实对几乎所有细胞类型有效的示例性ESA方法是电穿孔。电介导的递送的其他示例性方法包括但不限于离子导入、电渗透、电通透、电刺激、电迁移和电对流。这些术语仅用于说明目的，并且不应当理解为本公开中的限制。
电穿孔的技术利用电场的施加来诱导细胞膜通透性的瞬时增加并移动带电粒子。通过使靶组织内的细胞膜透化，电穿孔显著改善已给药至靶组织的外源物质的细胞内吸收。由于电穿孔，细胞膜通透性和分子运动增加，这提供了一种克服细胞膜的方法，细胞膜是HBV疫苗递送的屏障。电穿孔作为诱导EMTAD的技术的应用是有利的，因为该技术的物理性质使得电穿孔实际上可以应用于所有组织类型。因此，本公开的各个方面和实施方案讨论但不限于电穿孔作为诱导EMTAD的技术。
HBV疫苗
术语“HBV疫苗”在本文中以其最广泛的含义使用，包括能够针对活组织上的HBV提供期望或有益的免疫应答、治疗和/或预防作用的任何药剂。因此，该术语包括预防性和治疗性HBV疫苗，以及具有这类期望作用的任何其他类别的药剂。本公开的范围足够广泛以包括任何HBV疫苗的受控递送，无论如何分类。HBV疫苗包括但不限于药物和疫苗，以及核酸序列(如超螺旋、松弛和线性质粒DNA、RNA、反义构建体、人工染色体或任何其他基于核酸的治疗剂)及其任何制剂。这类制剂包括但不限于阳离子脂质、阳离子和/或非离子聚合物、脂质体、盐水、核酸酶抑制剂、麻醉剂、泊洛沙姆(poloxamer)、防腐剂、磷酸钠溶液或者可以改善HBV疫苗的给药、稳定性和/或效果的其他化合物。额外的制剂包括药剂和添加剂，所述药剂和添加剂具有控制给予的药剂的粘度和电阻抗的能力。
在本申请的一优选方面，本发明中使用的HBV疫苗可以包含：
第一核酸分子，优选第一质粒DNA载体，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，优选地，所述HBV聚合酶抗原具有与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，如与SEQID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，其中所述HBV聚合酶抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，优选第二质粒DNA载体，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，优选地，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，并且
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中，如相同质粒DNA载体，或者两种不同核酸分子中，如两种分别的质粒DNA载体。
如本文所用，术语“HBV核心抗原”、“HBcAg”和“核心抗原”的每个指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“核心”、“核心多肽”和“核心蛋白”的每个指HBV病毒核心蛋白。全长核心抗原通常长度为183个氨基酸，并且包括组装结构域(第1-149位氨基酸)和核酸结合结构域(第150-183位氨基酸)。34-残基核酸结合结构域对于前基因组RNA衣壳化是必需的。这个结构域还充当核输入信号。其包含17个精氨酸残基，并且是高度碱性的，与其功能一致。HBV核心蛋白在溶液中是二聚的，二聚体自组装为二十面体衣壳。核心蛋白的每个二聚体有4个α-螺旋束，两侧有α-螺旋结构域。缺少核酸结合结构域的截短的HBV核心蛋白也能够形成衣壳。
在本申请的一方面，本发明中使用的HBV抗原是截短的HBV核心抗原。如本文所用，“截短的HBV核心抗原”指HBV抗原，其不包含HBV核心蛋白的全长，但是能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答。例如，可以修饰HBV核心抗原以缺失核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的C末端的核酸结合结构域的一个或多个氨基酸，所述结构域通常包含17个精氨酸(R)残基。本申请的截短的HBV核心抗原优选为C末端截短的HBV核心蛋白(其不包含HBV核心核输入信号)和/或截短的HBV核心蛋白(C末端HBV核心核输入信号已经从其缺失)。在一实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，例如C末端核酸结合结构域的1-34个氨基酸残基的缺失，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基，优选缺失所有34个氨基酸残基。在一优选实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C末端核酸结合结构域中的缺失，优选缺失所有34个氨基酸残基。
可用于本申请的HBV核心抗原可以是共有序列，其源自多种HBV基因型(如，基因型A、B、C、D、E、F、G和H)。如本文所用，“共有序列”表示基于同源蛋白的氨基酸序列比对的人工氨基酸序列，例如通过同源蛋白的氨基酸序列比对(例如，使用Clustal Omega)确定的。其可以是基于至少100种天然HBV分离物的HBV抗原(如，核心、pol等)的序列，在序列比对的每个位置所发现的频率最高的氨基酸残基的计算排序(order)。共有序列可以是非天然存在的，并且可以与天然的病毒序列不同。共有序列可以这样设计，通过利用多种序列比对工具比对不同来源的多种HBV抗原序列，并且在可变的比对位置，选择频率最高的氨基酸。优选地，HBV抗原的共有序列源自HBV基因型B、C和D。术语“共有抗原”用来指具有共有序列的抗原。
可用于本申请的示例性截短的HBV核心抗原缺少核酸结合功能，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，截短的HBV核心抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
优选地，可用于本申请的HBV核心抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的截短的共有抗原。本申请的示例性截短的HBV核心共有抗原由氨基酸序列组成，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％相同，例如与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:14至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14为源自HBV基因型B、C和D的核心共有抗原。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:14含有天然核心抗原的高度带正电(富含精氨酸)的核酸结合结构域的34-氨基酸C末端缺失。
在本申请的一具体实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。在另一具体实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ IDNO:14的氨基酸序列组成。
编码截短的HBV核心抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同，优选与SEQ IDNO:1约98％、约99％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
编码截短的HBV核心抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ ID NO:15至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:15约98％、约99％或100％相同，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的。
在本申请的具体实施方案中，要用于本发明的HBV疫苗包含非天然存在的核酸分子，其编码截短的HBV核心抗原，并且所述非天然存在的核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQID NO:15的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“HBV聚合酶抗原”、“HBV Pol抗原”或“HBV pol抗原”指HBV抗原，其能够在受试者中诱导针对HBV聚合酶的免疫应答，例如体液和/或细胞介导的应答。术语“聚合酶”、“聚合酶多肽”、“Pol”和“pol”的每个指HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有4个结构域，从N末端至C末端包括，末端蛋白(TP)结构域，其充当负链DNA合成的引物；间隔子，其对聚合酶功能不关键；逆转录酶(RT)结构域，其用于转录；以及RNase H结构域。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原包括HBV Pol抗原，或者其任何免疫原性片段或组合。HBV Pol抗原可以含有进一步的修饰以改进抗原的免疫原性，例如通过向聚合酶和/或RNase H结构域的活性位点引入突变以降低或基本上消除某些酶促活性。
优选地，可用于本申请的HBV Pol抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，HBV Pol抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，HBV Pol抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
因此，在一些实施方案中，可用于本申请的HBV Pol抗原是灭活的Pol抗原。在一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含聚合酶结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在另一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原包含RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。在一优选实施方案中，灭活的HBV pol抗原包含聚合酶结构域和RNaseH结构域的活性位点中的一个或多个氨基酸突变。例如，核苷酸/金属离子结合所必需的HBV pol抗原的聚合酶结构域中的“YXDD”基序可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，消除或降低金属配位功能，从而降低或基本上消除逆转录酶功能。替代“YXDD”基序的突变，或除“YXDD”基序的突变之外，Mg2+配位所需的HBV pol抗原的RNaseH结构域中的“DEDD”可以进行突变，例如用天冬酰胺残基(N)代替一个或多个天冬氨酸残基(D)，和/或用谷氨酰胺(Q)代替谷氨酸残基(E)，从而降低或基本上消除RNaseH功能。在一具体实施方案中，HBV pol抗原通过以下进行修饰：(1)将聚合酶结构域的“YXDD”基序中的天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；以及(2)将RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)，并将第一个谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(N)，从而降低或基本上消除pol抗原的逆转录酶和RNaseH功能。
在本申请的一优选实施方案中，HBV pol抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，更优选源自HBV基因型B、C和D的灭活的共有抗原。本申请的示例性HBV pol共有抗原包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如与SEQ ID NO:4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:4至少98％相同，例如与SEQ ID NO:4至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:4是源自HBV基因型B、C和D的共有抗原，其包含位于聚合酶和RNaseH结构域的活性位点中的4个突变。具体地，所述4个突变包括聚合酶结构域的“YXDD”基序中天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；以及RNaseH结构域的“DEDD”基序中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)和谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(Q)。
在本申请的一具体实施方案中，可用于本申请的HBV pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的其他实施方案中，可用于本申请的HBV核心抗原由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
编码HBV pol抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 98％、99％或100％相同，所述HBV pol抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在本申请的具体实施方案中，可用于本申请的HBV疫苗包含非天然存在的核酸分子，其编码HBV pol抗原，并且所述非天然存在的核酸分子包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:16的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合”是指单一多肽链，其具有至少两个多肽结构域，所述至少两个多肽结构域通常不存在于单一的天然多肽中。
在本申请的一方面，要用于本发明的HBV抗原可以包含融合蛋白，其包含可操作地连接至HBV Pol抗原的截短的HBV核心抗原，或者可操作地连接至截短的HBV核心抗原的HBVPol抗原，优选通过接头连接。如本文所用，术语“接头”是指化合物或部分，其充当分子桥以可操作地连接两个不同的分子，其中接头的一部分可操作地连接至第一分子，并且其中接头的另一部分可操作地连接至第二分子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指连接或相邻，其中这样描述的组分处于允许它们以意图的方式发挥功能的关系中。例如，可操作地连接至所关注的核酸序列的调节序列能够指导所关注的核酸序列的转录，或者可操作地连接至所关注的氨基酸序列的信号序列能够分泌或跨膜转运所关注的氨基酸序列。
例如，在包含第一多肽和第二异源多肽的融合蛋白中，接头主要充当第一和第二多肽之间的间隔子。在一实施方案中，接头由通过肽键连接的氨基酸构成，优选由1-20个通过肽键连接的氨基酸构成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在一实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。优选地，接头由大多数空间上不受妨碍的氨基酸构成，例如甘氨酸和丙氨酸。示例性接头有聚甘氨酸，特别是(Gly)5、(Gly)8；聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。一种示例性合适的接头是(AlaGly)n，其中n为2-5的整数。
优选地，可用于本申请的融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的HBV核心和HBV Pol的免疫应答。优选地，融合蛋白能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答。更优选地，融合蛋白能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
在本申请的一方面，可用于本申请的融合蛋白可以包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或14至少90％相同，例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，所述HBV Pol抗原具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少90％相同，例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
优选地，可用于本申请的融合蛋白包含截短的HBV核心抗原、接头和HBV Pol抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或14的氨基酸序列组成，所述接头包含(AlaGly)n，其中n为2-5的整数，所述HBV Pol抗原具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。更优选地，可用于本申请的融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在本申请的一些实施方案中，可用于本申请的融合蛋白进一步包含信号序列。优选地，信号序列具有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。更优选地，融合蛋白包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
编码可用于本申请的融合蛋白的多核苷酸序列的实例包括但不限于这样的多核苷酸序列，其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15至少90％相同，例如与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:15至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15 98％、99％或100％相同，其可操作地连接至接头编码序列，所述接头编码序列与SEQ ID NO:22至少90％相同，例如与SEQ ID NO:22至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:22 98％、99％或100％相同，所述接头编码序列进一步可操作地连接至多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％相同，例如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16 98％、99％或100％相同。在本申请的具体实施方案中，可用于本申请的HBV疫苗包含非天然存在的核酸分子，其编码融合蛋白，并且所述非天然存在的核酸分子包含SEQ ID NO:1，可操作地连接至SEQ ID NO:22，其进一步可操作地连接至SEQ ID NO:3。
在本申请的一方面，在要用于本申请的HBV疫苗中，第一和第二核酸分子分别是第一和第二质粒DNA载体，并且第一和第二质粒DNA载体各自包含复制起点，抗生素抗性基因，以及从5’端至3’端，启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列和多腺苷酸化信号序列。在本申请的一优选实施方案中，DNA质粒是适合于哺乳动物宿主细胞中的蛋白表达的表达载体。适合于哺乳动物宿主细胞中的蛋白表达的表达载体包括但不限于pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1等。优选地，表达载体基于pVAX-1，可以将其进一步修饰以优化哺乳动物细胞中的蛋白表达。pVAX-1是DNA疫苗中常用的质粒，并且包含强的人立即早期巨细胞病毒(CMV-IE)启动子，随后是牛生长激素(bGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1进一步包含pUC复制起点和由小原核启动子驱动的卡那霉素抗性基因，其允许细菌质粒增殖。优选地，质粒DNA载体包含密码子优化的卡那霉素抗性基因，其具有与SEQ ID NO:12至少90％相同的多核苷酸序列，优选与SEQ ID NO:12 100％相同。
在一具体实施方案中，要用于本发明的HBV疫苗包含：
a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含：启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，增强子序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列，信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列，第一多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列，以及多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；
b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含：启动子序列，其包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列，增强子序列，其包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列，信号肽编码序列，其包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列，第二多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列，以及多腺苷酸化信号序列，其包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列；以及
c)药学上可接受的载剂，
其中第一质粒DNA载体和第二质粒DNA载体各自进一步包含卡那霉素抗性基因以及复制起点，所述卡那霉素抗性基因具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列，所述复制起点具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列，并且
其中第一质粒DNA载体和第二质粒DNA载体在相同组合物中或在两种不同组合物中。
在本申请的那些实施方案中，其中HBV疫苗包含第一载体，如第一DNA质粒，以及第二载体，如第二DNA质粒，第一和第二载体各自的量没有特别限制。例如，第一DNA质粒和第二DNA质粒可以以按重量10:1至1:10的比例存在，如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选地，第一和第二DNA质粒以按重量1:1的比例存在。
本申请的组合物和免疫原性组合可以包含额外的多核苷酸或载体，其编码额外的HBV抗原和/或额外的HBV抗原或其免疫原性片段。但是，在特定实施方案中，本申请的组合物和免疫原性组合不包含某些抗原。在优选的实施方案中，要用于本发明的HBV疫苗不包含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBVL蛋白抗原，也不包含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
可用于本申请的HBV疫苗还可以包含药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂是无毒的，并且不应当干扰活性成分的效力。药学上可接受的载剂可以包括一种或多种，如水、二醇、糖、油、氨基酸、醇、防腐剂、软化剂、稳定剂、着色剂等。
可用于本申请的HBV疫苗的其他实例描述于与本申请同一天提交的国际专利申请，题为“乙型肝炎病毒(HBV)疫苗及其用途”，代理人案号688097-403WO1，其内容整体援引加入本文。
试剂盒/系统
在一方面，本发明涉及一种试剂盒或系统，其用于将HBV疫苗受控递送至有需要的受试者的预定组织部位，所述试剂盒或系统包含HBV疫苗以及用于将HBV疫苗通过电穿孔给药至预定组织部位的装置。例如，所述试剂盒或系统可以具有预包装的容器，如注射器，含有预定量的HBV疫苗，可以将其装载至本文描述的装置用于随后的HBV疫苗给药。
诱导免疫应答的方法
在另一总的方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法，所述方法包括利用本申请的装置、试剂盒或系统向受试者给药免疫原性有效量的HBV疫苗。本文描述的本申请的任何装置、试剂盒或系统均可以用于本申请的方法。如本文所用，术语“感染”是指导致疾病的物质侵入宿主。如果导致疾病的物质能够侵入宿主，并在该宿主中复制或增殖，则认为其是“感染性”的。感染性物质的实例包括病毒，如HBV和某些腺病毒种、朊病毒、细菌、真菌、原生动物等。“HBV感染”具体地是指宿主生物体，例如宿主生物体的细胞和组织被HBV侵入。
如本文所用，当对于本文描述的方法使用时，“诱导免疫应答”涵盖在有需要的受试者中引起针对感染(例如HBV感染)的期望的免疫应答或效果。“诱导免疫应答”还涵盖提供用于针对病原性物质(例如HBV)进行治疗的治疗性免疫。如本文所用，术语“治疗性免疫”或“治疗性免疫应答”表示接种的受试者能够控制针对其进行了疫苗接种的病原性物质的感染，例如通过疫苗接种HBV疫苗而赋予针对HBV感染的免疫性。在一实施方案中，“诱导免疫应答”表示在有需要的受试者中产生免疫，例如以提供针对疾病(例如HBV感染)的治疗效果。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”是指引起或改善针对HBV的细胞免疫性，例如T细胞应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV的体液免疫应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”指引起或改善针对HBV的细胞和体液免疫应答。
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”表示接种疫苗的受试者能够控制针对其进行了疫苗接种的病原性物质的感染。通常，已经发展了“保护性免疫应答”的受试者仅发展轻度至中度的临床症状或完全没有症状。通常，针对某物质具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会因为该物质的感染而死亡。
通常，给药本申请的实施方案的HBV疫苗，在HBV感染或发展HBV感染的特征性症状后，会具有产生针对HBV的免疫应答的治疗目的，例如用于治疗性疫苗接种。
如本文所用，“免疫原性有效量”或“免疫学有效量”表示组合物、多核苷酸、载体或抗原的量足以在有需要的受试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答。在一实施方案中，免疫原性有效量表示足以在有需要的受试者中诱导免疫应答的量。在另一实施方案中，免疫原性有效量表示足以在有需要的受试者中产生免疫的量，例如以提供针对疾病(例如HBV感染)的治疗效果。免疫原性有效量可以取决于各种因素而变化，例如受试者的身体状况、年龄、体重、健康等；特定的应用，如提供保护性免疫或治疗性免疫；以及特定的疾病，如病毒感染，免疫对于其是期望的。免疫原性有效量可以由本领域技术人员根据本公开容易地确定。
在本申请的具体实施方案中，免疫原性有效量指组合物或免疫原性组合(如HBV疫苗)的量，其足以实现1、2、3、4种或更多种以下效果：(i)减少或改善HBV感染或与其相关的症状的严重性；(ii)减少HBV感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)防止HBV感染或与其相关的症状的进展；(iv)使得HBV感染或与其相关的症状消退；(v)防止HBV感染或与其相关的症状发展或发作；(vi)防止HBV感染或与其相关的症状复发；(vii)减少患有HBV感染的受试者的住院治疗；(viii)减少患有HBV感染的受试者的住院长度；(ix)提高患有HBV感染的个人的存活；(x)消除受试者中的HBV感染；(xi)抑制或减少受试者中的HBV复制；和/或(xii)增强或改进另一疗法的预防或治疗效果。
在其他具体实施方案中，免疫原性有效量是这样的量，其足以与临床血清学转换的演变一致地降低HBsAg水平；实现与受试者免疫系统的受感染肝细胞的减少相关的持续HBsAg清除；诱导HBV-抗原特异性的活化的T-细胞群体；和/或实现12个月内HBsAg的持续丧失。目标指数的示例包括将低于500个拷贝的HBsAg国际单位(IU)阈值的较低的HBsAg和/或较高的CD8计数。
作为一般性指导，当对于DNA质粒使用时，免疫原性有效量可以为约0.1mg/mL-10mg/mL的总DNA质粒，例如0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL或10mg/mL。优选地，免疫原性有效量的DNA质粒为8mg/mL以下，更优选6mg/mL以下，甚至更优选3-4mg/mL。免疫原性有效量可以来自一种载体或质粒，或者来自多种载体或质粒。免疫原性有效量可以在单一的组合物中给药，或者在多种组合物中给药，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种组合物(例如，片剂、胶囊剂或注射剂)，其中多种胶囊剂或注射剂的给药一起向受试者提供免疫原性有效量。在所谓的初免-加强方案中，还可以向受试者给药免疫原性有效量，然后向相同的受试者给药另一剂量的免疫原性有效量。初免-加强方案的一般概念是疫苗领域技术人员熟知的。按需要，还可以任选地向方案中加入进一步加强的给药。
根据本申请的实施方案，通过混合两种质粒并将混合物递送至单一的解剖学部位，可以向受试者给药免疫原性组合，其包含两种DNA质粒，例如编码HBV核心抗原的第一DNA质粒和编码HBV pol抗原的第二DNA质粒。或者，可以进行两种分别的免疫接种，其各自递送单一的表达质粒。在这类实施方案中，无论两种质粒在单一免疫接种中作为混合物或者在两个分别的免疫接种中给药，第一DNA质粒和第二DNA质粒可以以按重量10:1至1:10的比例给药，如按重量10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选地，第一和第二DNA质粒以按重量1:1的比例给药。
在一些实施方案中，要根据本申请的方法治疗的受试者是感染有HBV受试者，特别是患有慢性HBV感染的受试者。急性HBV感染的特征在于固有免疫系统的有效激活，补充有后续的广泛适应性反应(例如，HBV特异性T细胞，中和抗体)，其通常造成成功抑制受感染的肝细胞的复制或除去受感染的肝细胞。相比之下，这类反应由于高病毒和抗原负荷而受损或减少，例如HBV包膜蛋白大量产生并且可以在1,000倍过量于感染性病毒的亚病毒颗粒中释放。
慢性HBV感染描述为阶段(in phase)，特征在于病毒负荷、肝酶水平(坏死炎性(necroinflammatory)活性)、HBeAg或HBsAg负荷，或者这些抗原的抗体的存在。cccDNA水平保持相对恒定，约10-50个拷贝/细胞，虽然病毒血症可以变化很大。cccDNA物质的持续导致慢性。更具体地，慢性HBV感染的阶段包括：(i)免疫耐受阶段，其特征在于高病毒负荷以及正常的或最小提升的肝酶；(ii)免疫激活HBeAg阳性阶段，其中观察到较低或下降水平的病毒复制，伴随有明显升高水平的肝酶；(iii)无活性HBsAg载体(carrier)阶段，这是低复制状态，具有血清中的低病毒负荷和正常的肝酶水平，其可能伴随有HBeAg血清学转换；以及(iv)HBeAg阴性阶段，其中周期性地发生病毒复制(再激活)，伴有肝酶水平的波动，pre-core和/或基本核心(basal core)启动子中的突变是常见的，使得受感染的细胞不产生HBeAg。
如本文所用，“慢性HBV感染”是指受试者具有HBV可检测的存在超过6个月。患有慢性HBV感染的受试者可以处于慢性HBV感染的任何阶段。慢性HBV感染根据本领域中通常的含义理解。慢性HBV感染可以例如特征在于急性HBV感染后持续存在HBsAg达6个月或更长。例如，本文所指的慢性HBV感染遵循疾病预防控制中心(CDC)发布的定义，根据该定义，慢性HBV感染可以由实验室标准来表征，例如：(i)乙型肝炎核心抗原(IgM抗-HBc)的IgM抗体阴性，并且乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)或乙型肝炎病毒DNA的核酸测试阳性；或者(ii)HBsAg或HBV DNA的核酸测试阳性，或者HBeAg至少相隔6个月两次阳性。
根据特定实施方案，免疫原性有效量是指组合物或免疫原性组合的量，其足以治疗慢性HBV感染。
在一些实施方案中，患有慢性HBV感染的受试者正进行核苷类似物(NUC)治疗，并且是NUC抑制的。如本文所用，“NUC抑制”是指受试者具有不可检测的HBV病毒水平和稳定的丙氨酸转氨酶(ALT)水平达至少6个月。核苷/核苷酸类似物治疗的实例包括HBV聚合酶抑制剂，例如恩替卡韦(entacavir)和替诺福韦(tenofovir)。优选地，患有慢性HBV感染的受试者不患有晚期肝纤维化或肝硬化。这样的受试者通常会具有纤维化的3以下的METAVIR分数和9kPa以下的肝脏瞬时弹性硬度检查(fibroscan)结果。METAVIR分数为评分系统，其通常用于评价乙型肝炎患者的肝活检中的组织病理学评价的炎症和纤维化的程度。该评分系统指定两个标准化数字：一个反映炎症程度，而另一个反映纤维化程度。
据信慢性HBV的消除或减少可能实现包括病毒诱导的肝硬化和肝细胞癌在内的严重肝病的早期疾病阻断。因此，本申请的方法还可以用作治疗HBV诱导的疾病的疗法。HBV诱导的疾病的实例包括但不限于肝硬化、癌症(如，肝细胞癌)和纤维化，特别是特征在于纤维化的3或更高的METAVIR分数的晚期纤维化。在这类实施方案中，免疫原性有效量是这样的量，其足以实现12个月内HBsAg的持续丧失以及临床疾病(如肝硬化、肝细胞癌等)的明显减少。
本申请的实施方案的方法进一步包括向有需要的受试者给药另一免疫原性剂(如另一HBV抗原或其他抗原)或另一抗HBV剂(如核苷类似物或其他抗HBV剂)与本申请的组合物组合。
在动物或人生物体中给药后诱导或刺激抗HBV免疫应答的能力可以利用本领域中标准的各种测定在体外或体内评价。对于可用来评价免疫应答的发生和激活的可用技术的一般描述，参见例如Coligan et al.(1992and 1994,Current Protocols in Immunology；ed.J Wiley&Sons Inc.,National Institute of Health)。细胞免疫性的测量可以通过以下进行：测量活化的效应细胞分泌的细胞因子谱，包括源自CD4+和CD8+T-细胞的那些(例如通过ELISPOT定量产生IL-10或IFNγ的细胞)，确定免疫效应细胞的活化状态(例如，通过经典[3H]胸苷吸收的T细胞增殖测定)，测定敏化的受试者中的抗原特异性T淋巴细胞(例如细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)。
刺激细胞和/或体液应答的能力可以通过抗体结合和/或结合中的竞争确定(参加例如Harlow,1989,Antibodies,Cold Spring Harbor Press)。例如，可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量响应于给药提供免疫原的组合物而产生的抗体的效价。还可以通过中和抗体测定来测量免疫应答，其中病毒的中和定义为通过特异性抗体对病毒的反应/抑制/中和导致感染性的丧失。可以通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)测定进一步测量免疫应答。
靶组织
通过使用本文描述的方法、装置和系统非常适合EMTAD的靶组织包括位于例如表皮、真皮、皮下组织、结缔组织和肌肉组织中的健康和患病细胞。该技术还可以用于必须通过微创或其他手术方法进入的健康或患病器官中的应用。这类靶组织包括肝、肺、心脏、血管、淋巴、脑、肾、胰、胃、肠、结肠、膀胱和生殖器官。在一些实施方案中，可以通过使用本文描述的方法或装置将一定量的药剂递送至通常位于靶组织内的细胞类型以及在所述组织内异常发现的其他细胞类型(例如肿瘤的化疗)来获得期望的治疗效果。
如之前讨论的和图1中示出的，传统的EMTAD在HBV疫苗给药和电信号之间的时空关系上缺乏精确性和可重复性。与传统的EMTAD方法相反，本公开描述了用于组合的CTAA和ESA以提供EMTAD的更有利的临床应用的方法和装置。本公开利用CTAA的各方面结合ESA来提供可重复性、一致和有效的HBV疫苗递送。本文提供的方法和装置相对于电信号的应用，提供对HBV疫苗给药的空间和时间控制，从而改善药剂在靶组织中的移动和/或吸收。
方法
在一方面，本文描述的公开内容提供系统、试剂盒和装置，用于在ESA之后向有需要的受试者受控给药HBV疫苗的方法。如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其将会或已经通过本申请的实施方案的方法治疗。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类(NHP)如猴或猿、人等，更优选人。
在另一方面，本文描述的公开内容提供系统、试剂盒和装置，用于ESA之前的受控给药HBV疫苗的方法。在另一方面，本文描述的公开内容提供系统和装置，随同ESA受控给药HBV疫苗的方法。这些方法包括但不限于范围或顺序关系、治疗参数的确定、受试者准备程序、CTAA、ESA和额外措施。
治疗参数的确定
在一些实施方案中，治疗参数是基于HBV疫苗的剂量给药的期望量和/或持续时间。HBV疫苗剂量给药可以取决于例如特定适应症或治疗应用(如靶组织的类型和位置)，以及各种受试者参数(如年龄和体重)。HBV疫苗的剂量给药可以通过与HBV疫苗和ESA的给药有关的参数控制。与CTAA有关的示例性可控参数包括但不限于药剂体积、药剂粘度和注射速率。与ESA有关的示例性可控参数包括但不限于电信号的特征、暴露于电信号的组织体积和电极阵列格式。CTAA和ESA的相对时间和位置是对HBV疫苗剂量给药提供进一步控制的参数。
受试者准备
在本文描述的实施方案中，本文描述的方法可以包括受试者准备步骤。受试者准备可以包括但不限于消毒清洁和麻醉剂给药，包括局部或区域性、神经阻滞、脊髓阻滞、硬膜外阻滞或全身麻醉。在肌肉内(IM)ESA的示例情况下，本文描述的方法中可以包括使肌肉电刺激的影响最小化的方案，例如，包括热控制(例如冷却肌肉)、麻醉剂的给药和/或足以缓解不适的可选刺激模式。应当理解如果存在可接受的替代方案，则所选受试者准备技术不会不利地影响治疗效力。例如，已经显示在某些情况下，基于酰胺的麻醉剂的肌肉内给药可能对基于肌肉内递送质粒DNA的疗法有不良影响，这可能是由于这些药剂的轻微肌毒性，其可以抑制肌肉细胞能力以表达给药的DNA序列编码的蛋白。
CTAA和ESA
本文描述的一些实施方案是一种方法，其中组合CTAA和ESA，实现一致和可重复的HBV疫苗递送。在某些情况下，提供适合CTAA的装置或试剂盒，包括例如包含自动化注射设备和喷射注射器中至少一个的装置。
本公开提供方法、试剂盒和装置，其能够相对于具有异质性皮肤厚度和组成的受者中药剂分布的靶位点以安全和一致的方式将多个细长电极经皮展开至靶深度，以便支持在组织中施加电场以增强治疗剂或预防剂如核酸、药物、抗体、肽、蛋白或其组合的肌肉内、皮内、和/或皮下给药。
根据本申请原理的系统和方法使得能够将多个细长的组织穿透电极一致地经皮展开至预定的靶组织部位，以便在皮肤、皮下组织和/或骨骼肌中传播电场。本文提供的公开设计为即使将程序应用于具有变化的皮肤特征的部位时，也能够使用户进行最少的训练就能将电极一致地展开至靶深度，同时保持多个电极之间的适当空间关系。这种变化可以是由于受试者的不同部位或异种受者群体之间皮肤特征的变化。换句话说，根据本申请原理的系统和方法应当允许一致的特征谱(profile)，与施用者或受者无关。在某些实施方案中，电极的展开伴随着一个或多个注射针的插入，这些注射针配置用于将HBV疫苗给药至组织的靶区域，并且与用于ESA的电极以预定的空间关系排列。在一示例性实施方案中，排列电极，从而通过插入一个或多个注射针，将来自所述电极的任何电信号优先施加至HBV疫苗给药部位的远端。在另一实施方案中，排列电极，从而通过插入一个或多个注射针，将任何电信号优先施加至HBV疫苗给药部位的近端。
本公开的方面可以单独或组合使用以支持电极的经皮插入用于电场的体内应用，以便增强核酸、小分子药物、抗体、肽、蛋白和它们的组合的肌肉内、皮内和/或皮下给药。在一些实施方案中，电极展开和随后的电场传播与所关注的药剂分布至靶组织部位以协调方式进行。在一示例性实施方案中，以受控和监测的方式进行药剂的给药以及一个或多个电场的施加，从而使实现药剂分布与电场施加部位的空间和时间共定位的可能性最大化。
一般来说，本公开提供将电极经皮展开至受者的皮肤、皮下组织和/或骨骼肌内的预定部位的方法和装置，与所关注的药剂的给药和电场的局部施加结合以改善药剂的递送、吸收和/或生物学效应。在一些实施方案中，已实施本公开，从而用户可以进行最少的培训来有效且可靠地进行设备的设置和使用。在另一实施方案中，本公开还包括多个联锁、传感器和反馈回路的实施以减少设备的设置和使用期间犯下的潜在用户错误的频率和/或潜在影响。参考图2，本文描述的装置的一实施方案包括可拆卸地界面连接(interface with)至“施加器”400的“药筒组件”100，所述“施加器”400配置为连接至控制器700，所述控制器700用作电极激活和随后的电场产生的电能源，以及诊断和其他控制例程。控制器700进一步提供用户界面、托盘、施加器400的皮套，并且描述了各种其他特征。如图2所示，可以在使用方法中将合适的均匀大小和大致形状的储存器101插入药筒组件100中。
本文描述的装置的一些实施方案中的药筒组件100的细节例如在图3A-12中描述，连同施加器400的相应配合部分，在图13A-18C中，然后，控制器700的相关部分，在图19-20D中。接下来描述施加器400的剩余部分，随后是控制器700的剩余部分。
除了参考图3A-4，在本文描述的一些实施方案中，药筒组件100可以包括支撑结构，所述支撑结构配置为与施加器400界面连接，并且容纳安装在该结构上的两个或更多个细长电极122以形成阵列。为了避免电流在设备内不必要地传播，应当指定电极安装结构的设计和材料，从而设备内相反极性的电极之间有足够的电介质阻挡。利用适合电极安装结构和电极的材料组成的标准机械特征和/或粘合剂使细长电极的远端区域137与安装结构接合。
在一示例性实施方案中，药筒外壳结构102配置为与包含HBV疫苗的流体储存器101界面连接，其中储存器101和药筒壳体结构102配置为可操作地连接至至少一个注射孔(针头105)，通过该注射孔(针头105)将HBV疫苗给药至靶组织中。在一些实施方案中，这种配置促进所关注的药剂的分布与电场施加部位的共定位。在另一实施方案中，这种配置促进实现用于ESA和CTAA的设备之间的预定空间关系。在另一示例性实施方案中，将注射器101插入药筒100中，其中当药筒装载至施加器400中时，注射器101向前移动以与针头接口152配合并将药筒连接至针头。
本公开的某些实施方案可以包括使用注射器、小瓶、安瓿、药筒或等同结构来储存一种或多种HBV疫苗。在一些实施方案中，储存器可以包括玻璃和塑料中的至少一种，并且选择与所关注的药剂相容的材料。可以将涂层应用于储存器用来提供需要的润滑或保护性能。如上文讨论的，电极122可以是中空的，并且在某些情况下配置有可以可操作地连接至流体储存器的注射孔。或者，注射孔可以包括一个或多个相对于电极定位的皮下注射针和/或无针注射端口。注射孔的类型和大小的选择可以取决于期望的给药途径、组织分布和所关注的药剂的物理特征。在某些实施方案中，设计药筒结构以确保注射孔和电极在处于展开状态时之间预定的空间关系，从而所关注的药剂的分布基本上发生在多个电极的导电区域界定的组织中。为了使用户操作尖锐物的需求最小化，在某个实施方案中，将设计用于皮下注射针的药筒100配置为在制造时使皮下注射针与药筒配合而不是如更常见的惯例在使用时将针头与注射器配合。在某些实施方案中，本公开的一方面可以在药筒和/或针头中包含特征以确保在制造、分布、处理和使用期间保持针头，以及确保在使用之前将储存器与针头正确配合的特征。在一些实施方案中，这类功能部件可以使由于破损或不当配合而导致药剂从储存器(reservoir)或储存器孔口接口(reservoir orifice interface)泄漏的风险最小化。
在某些实施方案中，药筒可以包括位于子组件远端处的组织接触界面(tissuecontact interface)。在某些实施方案中，组织接触界面包括基本上平面的结构，其垂直于电极的细长方向，并且具有一个或多个孔，所述孔配置为允许电极通过组织接触界面。对于包含集成储存器和注射孔的实施方案，界面也具有孔以适应注射孔或无针注射。为了最小化电极和注射针的污染风险以及发生意外的尖锐物暴露于用户或受者的风险，在某个实施方案中，适应电极或注射针通过的孔的大小适合防止与电极和注射针意外接触。最常见地，组织接触界面包含一种或多种适合至少短期组织接触的塑料。
为了避免受者之间生物材料的潜在交叉污染，药筒组件100可以配置为一次性使用。在某些情况下，药筒包括一个或多个机械、电和/或识别元件，其将药筒的使用限制为单次给药。这种性质的机械元件的实例包括但不限于例如锁定和/或止动(detent)，其确保使用之后电极安装结构和/或棒护罩(见下文)处于展开的状态。电元件的实例包括例如与一个或多个电极串联配置的熔断器或链接，在药筒的首次使用结束时，其通过电能源关闭。识别元件的实例包括例如序列化的射频识别设备、条形码或配置为由施加器和/或电能源读取的快速响应编码。然后特定药筒的鉴定信息可以用来防止施加器和/或能源意外或有意地重复使用该药筒。在一实施方案中，包含一个或多个冗余功能部件(feature)来使重复使用药筒的可能性最小化。
在本文描述的装置的一实施方案中，如图2所示，施加器400包括：支撑结构，其配置为与药筒组件100界面连接；用户界面410-418(图13B)；导电电连接(electricallyconductive electrical connection)，其配置为将电极展开至受者的靶组织中时在位于细长电极的远端区域上的导电接触区域和电能源之间提供可操作的连接。在某些情况下，用户界面包括手柄，设计用于向用户传达信息的一个或多个显示功能部件，以及能够接收用户输入的一个或多个功能部件。在某些实施方案中，显示功能部件配置为在设备设置和使用期间传达设备的操作状态以及相关的警告/错误消息。这类显示器可以包括机械功能部件、灯、字母数字显示器和/或电子显示屏。在某些情况下，将能够接收用户输入的功能部件配置为在程序的适当阶段允许用户停用设备内的安全功能部件以防止意外放电，选择程序的特定参数(例如，注射的预期深度)，以及开始程序给药，并且可以包括按钮、触发器、机械滑片和/或操纵杆。
在某些实施方案中，施加器400还包括致动机构(actuation mechanism)，其与药筒组件界面连接并配置用于电极的经皮展开，相对于靶组织的注射孔的位置，将所关注的药剂通过孔从储存器排出并进入靶组织部位，和/或将电信号从电场发生器如控制器700传输至药筒100。施加器400可以这样配置，从而驱动该机构的能量由用户提供，或者更优选地，该装置可以包含一个或多个无生命的能量源，其可操作地连接至施加器内的致动机构。这类无生命的能量源包括例如机电设备(螺线管、发动机、丝杠)、机械组件(弹簧和相关设备)和压缩气体。
药筒组件100的示例性实施方式如图3A所述，药筒组件100包括储存器装载端口140和储存器容纳空间142以接受并容纳药物的储存器101。需要药筒组件100是因为对于要在其中产生电场并将其用作治疗的一部分的设备，需要电场发生器如控制器700以与包含电极的设备进行电连接，所述电极配置为接触靶组织。因为控制器可以配置为多种用途，并且储存器101可以一次性使用，所以可以提供药筒组件100来固定电极122和储存器101，以与可重复使用的设备界面连接，并且药筒组件100配置为一次性使用。因此，施加器400可以是可重复使用的部件，并且药筒组件100可以配置为一次性使用。如果在储存器101的插入中发生错误或篡改，或者如果存在缺陷，则药筒组件100还可以处于防止随后使用的状态。
术语储存器101可以指注射器、小瓶或者任何其他可以包含药物或HBV疫苗并且可以与具有孔(如针头)的设备界面连接的设备，在图4中示出为具有针头接口152的针头105。对于给定类型的药筒组件100，储存器101一般具有共同的形状和尺寸。药筒组件100内的各种部件允许在精确的尺寸和/或制造公差方面有余地，但是一般需要共同的形状和尺寸以减少未标记为与药筒100一起使用的药物随设备错误递送的风险。如果用户未提供适当尺寸的储存器101，则药筒组件100内的一个或多个联锁不能停用，并且系统可以在插入适当尺寸的储存器101之前无法使用。
如图3B中见到的，储存器101一般可以配有柱塞和用于药物排出的端口156。还可以提供可移除的盖158以保持药剂的无菌性和完整性直至将插入并使用储存器为止。在使用中用于药物排出的端口可以靠近针头接口152，并且柱塞可以与用于药物排出的这个端口相对。作为用于药物排出的开放端口的替代，在一些实施方案中，储存器可以配置有隔膜部件，所述隔膜部件覆盖并密封容器与柱塞相对的端部。隔膜可以由弹性体化合物如硅酮或丁基橡胶制成，可以考虑储存器中包含的药剂的稳定性和相容性而选择材料的特定配方和涂层。隔膜部件通常通过卷曲密封或其他紧固机构保持就位。这种隔膜密封配置消除了对可移除盖的需求，但是需要针头105配有合适的穿刺构件如针头、尖刺或其他功能部件以接触储存器中包含的流体。这种配置的具体实施包括双面针配置和尖刺小瓶适配器。
药筒组件100不仅配置为接收储存器101，而且还被施加器400在施加器药筒组件接收端口401中接收(图2)。因此，药筒组件100包括允许施加器400将其至少部分拉动并保持在内部空间内的设备。在某些实施方案中，该设备是药筒组件100表面上的一个或多个齿条，其与施加器400中的相应电动小齿轮接合。在其他实施方式中，施加器400可以与药筒组件100界面连接而不需要将其拉入内部空间。在其他实现方法中，可以采用其他技术来使药筒组件100接合施加器400，例如，采用电动轨道或支架等，药筒组件100可以界面连接至其上。
施加器400进一步设置有界面元件(interface element)，所述界面元件允许其控制药筒组件100内的某些动作。特别地，施加器400可以配置为利用各种子系统控制针头插入、药物递送、电极插入和电极激活。在某些情况下，连接这些步骤，从而施加器400的单个动作启动这些步骤中的多个。在一些实施方式中，除了药物递送和电极激活外，所有这些步骤都是由单个动作引发的，如下文示例性实施方式所述。
当适当激活时，如使用传送至药筒组件100的机械、电气或光学元件的电信号或光信号，可以使施加器400能够测试药筒组件100内的子系统，确保子系统正常运行并已正确配置为通过电场施加进行药物递送。例如，这类子系统包括施加器400可以测试以确保：先前未使用药筒组件100，储存器已正确地放置在药筒组件内，如通过对齐引导器/展开盾108施加的对受试者身体施加的适当的力，已由用户肯定选择深度的测试，以及已去除外部药筒盖110。此外，施加器400可以配置为在程序执行期间监测药筒功能的状态。例如，这类子系统包括施加器400可以测试以确保在开始药物给药之前将电极122在受试者内正确展开，在施加电场之前已恰当地驱动储存器中的柱塞，用户在给药程序中保持对受试者身体施加适当的力，等等。
除了由施加器400操作的子系统，药筒组件100可以包含适当的子系统，包括与施加器400相互作用的那些子系统和不与施加器400相互作用的那些子系统，以便完成药物递送和电场应用疗法的目的。这些包括引起针头和电极插入的子系统，治疗给药之后保护用户避免尖锐物的子系统，提供不同深度的针头/电极插入的子系统，确保在允许程序启动之前以及随后在给药程序的应用期间已对受者的组织施加足够的力的子系统等。虽然经常在可展开的针头和电极的背景下描述，但是在此应当注意，并非严格要求这样，并且具有不可展开或固定的针头和电极的系统也可受益于本申请原理的系统和方法，包括描述的子系统。
在一示例性实施方式中，如图4所示，药筒组件100包括外部药筒102，在某些情况下称作壳体。外部药筒102通过外部药筒盖106在远端处终止。外部药筒102包括内部药筒容纳空间150，用于接收内部药筒103，内部药筒103被接收并相对于外部药筒102以可滑动的方式移动。内部药筒103包括储存器容纳空间142，储存器101可以位于其中。内部药筒103在远端处与内部药筒盖104接合。内部药筒盖104具有许多功能，包括将电极122锁定就位(内部药筒103本身具有将电极122放置其中的缝)以及为棒护罩134提供支撑表面。内部药筒盖104锁定至内部药筒103上。
药筒后膛112被接收在内部药筒103中的储存器容纳空间142的一部分中，在与内部药筒盖104相对的一部分中。储存器检测盖118通过储存器检测弹簧116接合药筒后膛112。药筒锁环114将系统锁定就位，包括药筒后膛112至内部药筒103。储存器检测弹簧116还用来推动储存器101与针头接口152接合，并且还用来适应储存器101的尺寸公差。
储存器联锁120提供机械联锁以防止药筒功能的意外或不期望的致动。特别地，将储存器联锁120(也称作第一储存器插入触发器)放置在内部药筒103的下方，并且具有延伸穿过内部药筒103中限定的槽或孔的指状件(finger)(见图5B)。指状件防止药筒后膛112相对于内部药筒103滑动，特别是防止在将储存器插入至储存器容纳空间142中之前，在内部药筒103内朝向内部药筒盖104移动。
当将储存器101正确插入储存器容纳空间142中时，向下推动储存器联锁120并向下推动指状件，不再延伸至储存器容纳空间142中。储存器联锁120的这种向下推动或下压还可以配置为提供听觉、触觉感知或触觉的“咔哒”声，该“咔哒”声可以通知用户正确的插入。一旦下压，则允许不再被储存器联锁120的指状件阻挡的药筒后膛112移动，特别是允许其朝着内部药筒盖104的方向移动。
当以下述方式将药筒组件100插入施加器400中时，通过弹簧帽/药筒界面470的作用使药筒后膛112这样移动。当药筒后膛112向前移动足够远时，其锁定就位，将储存器101固定在储存器容纳空间142中，并且确保其相对于针头接口152正确定位以确保从储存器101至针头105的孔的完整流体通道。
对于其中药筒100内包含注射针的设备的实施方案，可以在设备内采用标准的“现成的”一次性皮下注射针。但是，可以通过包含定制的设计元件来改进设备的操作和可靠性特征，所述设计元件在用于常规肠胃外给药程序的皮下针头中不存在。针头接口152的特定方面可以包括构成针头接口152的材料，包括保持功能部件以防止在分布和使用期间针头接口152从内部药筒103中移出，以及针头中任何斜面功能部件相对于接口的方向。
常规的单次使用的一次性注射针通常由注塑成型的聚丙烯热塑性塑料组成。但是，对于许多应用，当受到针头展开和用这个设备注射的力特征时，聚丙烯的冲击强度、抗张强度和抗弯强度可能不足以确保接口(hub)的完整性。值得注意的具体故障包括由于冲击力或注射力引起的接口故障，以及由于冲击力或注射力引起的接口针头接点(hubneedle joint)的故障。虽然接口设计中的调整(包括其几何形状和壁厚)可以用来解决这些故障，但是通常不可能对设计进行足够的修改以防止接口故障，同时确保接口保留正确配合锥形公鲁尔滑动连接器(luer slip connector)所需的尺寸特征，如国际标准组织(ISO)发布的相关标准ISO 80369-7:2016Small-bore connectors for liquids andgases in healthcare applications--Part 7:Connectors for intravascular orhypodermic application所述。具体地，考虑到展开期间注射器针头和接口受到的力，在某些实施方案中，使用具有改善的冲击强度、抗张强度和抗弯强度的材料。一个实例是使用注塑成型的聚碳酸酯塑料(如
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GS、Makrolon或Lexan)或共聚酯(如EastmanTritanTMCopolyester MX731、MX711和MX 730)。当根据ISO 180:2000Plastics—Determination of Izod impact strength评价时，认为至少70kJ/m2的缺口冲击强度适合这个应用。当根据ISO527-1:2012Plastics--Determination of tensile properties--Part 1:General principles评价时，认为至少30MPa的抗张强度适合这个应用。当根据ISO178:2010Plastics--Determination of flexural properties评价时，认为至少50MPa的抗弯强度适合这个应用。在一些实施方案中，所选的特定树脂表现出与预期的灭菌方法(例如，γ辐射)的相容性，而没有表现出可以损害其功能的物理特性的有害变化。
对于利用定制注射针的实施方案，包括一个或多个机械功能部件，所述机械功能部件通常不存在于使该设备能够插入内部药筒103中的常规注射器针座(syringe hub)上。这类功能部件可以包括位于内部药筒103上的具有相应机械功能部件的突片、卡扣或脊。在某些情况下，所述功能部件的实施方式使得突片以一致的方向与内部药筒103配合。与能够一致地定位斜面或其他针孔功能部件(needle orifice feature)的针头制造工艺结合，这确保在设备的设计中考虑到由于孔的位置和设计而导致的注射位置或药物分布的偏差。例如，由于组织和针上的不对称穿透功能部件(penetration feature)之间的相互作用，具有不对称的穿透尖端功能部件(penetrating tip feature)(例如，斜切面)的针头可以在展开至组织期间表现出方向性偏差。如果电极具有对称的穿透尖端功能部件(例如，套管针尖端)，则电极在其展开特征上不会表现出相应偏差。因此，内部药筒103上的针头接口152的安装功能部件(mounting feature)可以包括在展开之前针头105上的注射孔相对于电极122的位置的偏移，以解决针头的非对称斜面的预期展开特征。偏移的精确尺寸可以取决于靶组织的性质和穿透深度的预期范围，但是在某些实施方案中，对于每10mm的穿透深度，针头偏移0.5-1mm。当使用具有不同尖端轮廓的电极和注射针或者尖端轮廓必须彼此朝向一致时，这类功能部件对于确保药物分布与施加电场的共定位是有利的。
包含安装至注射器检测弹簧116的注射器检测盖118确保药筒组件100可以接受并在注射器101预期的制造公差范围内相对于针头接口152正确放置注射器101。当施加器400内的弹簧帽/药筒界面470相对于药筒组件100向远端移动时，施加器400使药筒后膛112在装载过程中向前移动。当药筒组件100被装载至施加器400中并且药筒组件100被拉至施加器400中时，例如，通过装载机构(loading mechanism)的作用，例如下文描述的齿条-齿轮机构(rack-and-pinion mechanism)，这个动作发生。
药筒后膛112的移动可以充当第二联锁。特别地，在一实施方式中，如图5C-5D中见到的，通过适当配置的传感器，通过一组储存器锁定孔144’，可以在药筒组件接收空间403内看到并检测到视线(图5D)。当将药筒组件100装载至施加器400中时，此视线可见。可见光线或其遮挡可以作为第二联锁的一部分，必须将其停用以使得控制器700允许设备的激活和触发，包括针头和电极插入、药物递送和电极激活。
例如，在一实现方法中，为了操作设备，必须遮挡储存器锁定孔144’(图5D)。如果存在可见视线，例如，通过IR或者施加器的药筒组件接收空间403内配对的可见光发射器和检测器检测的，可以使设备无法使用，并且在施加器显示器404和/或控制器700(包括控制器显示器712)上产生并显示错误信息，以通知用户设备的状态以及为了解决错误而进行的推荐步骤。
因此，在这种实施方式中，一种错误状态可以是没有将储存器101装入药筒100，或者没有将注射器正确装入内部药筒103。在这种情况下，无法压下储存器联锁120，因为没有储存器101进行这个动作。在这种情况下，药筒后膛112不可以在远端方向朝内部药筒盖104向前移动。这些部件的构建可以是这样的，打开的后膛状态导致通过第一储存器锁定孔144’的开放的视线146(图5D)。辅助检查是不可以关闭药筒后膛112，并且这可以表现为药筒不能向后或向远端移动所需的距离进入药筒组件接收空间403。因为系统将这些状况定义为错误状态，所以可以识别这些状况并将其用于错误信息的生成，例如，在施加器显示器404和/或控制器700(包括控制器显示器712)上的用户界面上通过适当信息发送给用户。如果储存器101装载不正确，或者储存器联锁120损坏，则可能发生相似的错误状态。一般在这种情况下，适当的错误信息可以伴随有对用户的指示以卸下药筒，重新安装新的储存器，并且尝试将药筒组件100重新引入施加器400中。
另一错误状态可以是，在没有储存器101的情况下，用户手动将药筒后膛112向前移动，这是由于用户手动将储存器联锁120推出储存器容纳空间142。这种情况也可以定义为错误状态，并且由于另一(第二)组储存器锁定孔144(图5C)被放置在外部药筒102的一部分上而可以检测到该状态。如果没有储存器就位，但是通过按下储存器联锁120的动作使药筒后膛112向前移动，则储存器锁定孔144’(图5D)与储存器锁定孔144(图5C)对齐，再次产生开放的视线146和随后的错误状态。如果储存器联锁120损坏并且其指状件不再位于储存器容纳空间142内，也可能发生这种错误状态。在某个实施方案中，这种错误状态不必通过尝试重新安装储存器来补救，因为储存器可能无法在药筒后膛112锁定的情况下装入储存器容纳空间142中。在某个实施方案中，需要新的药筒组件100。
相反，如果将适当大小的储存器101放置在适当位置，则储存器检测盖118被推回靠上储存器检测弹簧116，并且储存器检测盖118的移动阻塞了储存器锁定孔144(图5C)和储存器锁定孔144’(图5D)。在这种情况下，没有错误状态，允许设备操作。在插入药筒组件100之后，阻塞和阻塞的检测发生在施加器400的主体内，并且因此对于用户试图消除这种联锁是不容许的，无论是有意的、意外的或由缺陷引起的。应当注意，即使用户自己在操纵药筒100期间有意或无意地关闭了药筒后膛112，这种“无错误状态”仍然会发生。
取决于发生哪种错误状态，药筒组件可以保持可用或不可用。如果药筒后膛112已被锁定到位，则药筒组件100变得无法使用。但是，如果未将药筒后膛112锁定到位，则可以将药筒组件100从施加器400上取下并插入新的储存器101。
虽然已发现上述两个联锁组(一个机械式使用储存器联锁120，一个使用光发射器和收集器以及储存器锁定孔144和144’)在一些实施方式中特别有用，但是应当理解也可以采用其他类型的联锁(图5C-5D)。例如，错误状态可以配置为在储存器锁定孔144阻塞时(通过储存器锁定孔位置和程序逻辑的变化)发生(并且清晰的视线146则对应于非错误状态)，而不是在储存器锁定孔144不阻塞时出现错误状态。储存器联锁120可以包含额外的机械标志功能部件(mechanical flag feature)，当联锁激活时，所述机械标志功能部件在药筒中凹入，但是当注射器101已正确插入并且将储存器联锁120压入其释放位置时，对适当配置的传感器变得可见。在其他变化中，可以采用其他方式来确定视线是否存在，例如，光学、声学、电气等，只要可以将合适的发射器和收集器放置在施加器400内。如本领域技术人员根据本申请教导理解的那样，还可以采用其他方式来确定储存器101是否正确装载，例如，机械技术。取决于实施方式，如果检测到错误状态，可以防止施加器400在药筒组件100就位的情况下进行操作，或者可以甚至在一开始防止施加器400接受药筒组件100。例如，药筒可以这样设计，使得储存器联锁120包含机械突片或锁定功能部件(locking feature)，其从一个或多个药筒表面延伸直至将注射器101正确插入药筒100。机械突片设计为与位于施加器400中的相应止动功能部件(detent feature)相互作用，从而除非释放储存器联锁120，否则药筒100至施加器400中的装载被物理阻断。这种机械相互作用会向用户或系统提供反馈，在将药筒100装入施加器400之前必须解决错误状况。在其他变化中，可以提供多于或少于两个联锁，但是多于或少于两个联锁可以相应地与不同安全特性相关联。
在某些实施方式中，其他功能部件也可以用于上述确定，或者增强上述确定。例如，当采用发动机将药筒组件100拉入施加器400时，可以如下文所述采用传感器以在插入过程中检测药筒组件100的空间位置。换句话说，施加器400可以检测药筒组件100在药筒组件接收空间403内的位置。在某些情况下，这样可以允许直接确定额外的错误状态，或者通过提示额外传感器的激活来评价设备的状态以确定额外的错误状态。例如，在用过的药筒中，药筒后膛112被锁定到位。如果尝试重新使用用过的药筒组件100，则光学检测器会在与未使用的药筒组件100不同的点检测到药筒组件100。将电动机用于一种或多种系统功能还提供监测其运行状态的机会，包括向发动机提供的电压和电流水平以及在特定操作期间发动机已进行的转数。系统操作期间这些数量的测量可以用作检测潜在或实际故障状况的主要或辅助方法。例如，设计为在药筒100配置不当时阻止装载程序的机械联锁可以耦合监测发动机的传感器和逻辑电路来使用，以便确保药筒100正确地装入施加器400中。例如，设计为在没有正确插入的储存器102的情况下防止药筒100装载的上述机械功能部件(mechanical feature)的相互作用会导致发动机驱动机构(motor drive mechanism)上的负载增加，从而导致更高的电流消耗。发动机检测到升高的电流消耗，会提示停止装载过程，并且向用户显示故障状况，例如在刺激器显示器712和/或施加器显示器404上。
因为有可能不打算通过这种方法给药的药物可以包含在与打算通过这种递送方法使用的相似大小和配置的储存器中。因此，所述系统的另一方面是包含一种或多种方法以确保用户插入药筒100的储存器101打算专门用于所述设备。这类功能部件的实施会减少将不正确的药物给药至给定受试者的风险。通常，用户说明书和药物标签中的具体信息包括给药途径和方法。但是，为了进一步减少用户错误的可能性，在储存器和设备中包含机械、光学和/或电气功能部件是期望的。在一实施方案中，注射器可以设计为包含其他储存器中不存在的一种或多种独特的机械功能部件，其可以与设计用于这种递送方法的那些相似。例如，可以指定储存器在储存器的凸缘(flange)或筒上包含罗纹(rib)或其他细长功能部件(elongate feature)。在这个实施方案中，在储存器联锁120上会包括相应的配合功能部件，从而只有在将具有适当配合功能部件的储存器正确地插入设备时才会停用储存器联锁。如果直接在储存器的设计中体现这样的功能部件是不可行的，则可选实施方案会包括将第二机械部件安置在储存器上，其对于打算用于设备的储存器是唯一的。例如，通过与外部药筒102、内部药筒103、储存器联锁120、储存器检测盖118中的相应功能部件或药筒100内的其他合适功能部件配合，设计为在储存器的筒上滑动的环或其他适当配置的功能部件可以用来“锁定(key)”储存器用于所述设备。在另一实施方案中，将合适大小、颜色和/或电导率的定制标签应用于打算用于所述设备的储存器外表面上的预定位置。将施加器400中的相应光学或电传感器配置为评估储存器表面上标签的存在或不存在，以便验证插入药筒的药物打算用于所述设备。检测方法包括使用应用于标签表面的光或电信号来评估其存在或不存在。以这种方式，可以检测包含不打算用于所述设备的药物的储存器(并且因此缺少相关标签)，并且将其排除在潜在的误用之外。
现在描述传感器的配置以进行上述药筒装载和注射器检测确定，这类传感器进一步形成施加器400内的药筒装载子组件的一部分。更详细地，并且此外参考图6、17B和18C，检测药筒组件100位于何处的示例性方式是通过使用药筒装载传感器436和药筒已装载传感器438，其形成装载驱动子组件454的一部分，子组件454进一步包括药筒导轨442和装载发动机444，所述装载发动机444与小齿轮组件448连接，所述小齿轮组件448通过外部药筒102基座上的齿条154将药筒组件100拉入药筒组件接收空间403。更详细地，当药筒装载传感器436检测到药筒组件100上的启动标志172时(见图6)，可以使发动机启动装载。当药筒已装载传感器438检测到相同标志时，可以使装载停止。可以采用继续标志174，继续装载需要其存在。
齿条154的第一“齿”可以配置为当它们将药筒组件100插入药筒组件接收空间403时为用户提供触觉感知(或听觉或触觉)。这样的配置可以包括齿条齿154的形状和/或大小以及它们在外部药筒中的定位所允许的弯曲量。通过调整齿条齿的实施方式，可以实现期望程度的触觉反馈，同时确保不会因接受和装载药筒组件100而对装载发动机444产生很大的作用力。
此外参考图17A，并且如上所述，将药筒组件100插入施加器400内的药筒组件接收空间403。虽然各种方式可以用来进行这种插入，但是已发现特别有用的一种方式是通过小齿轮组件448接合外部药筒102上的齿条154。使用一个以上齿条提供额外的稳定性，特别是装载阶段中的扭转稳定性。还参考图18A的插入/注射驱动组件456，除了将药筒组件100拉至药筒组件接收空间403内，插入动作还通过弹簧帽/药筒界面(spring cap/cartridgeinterface)470压缩电极/针头插入弹簧472。电极/针头插入弹簧472用作药物递送期间针头和电极插入的主要驱动力。
这种混合的发动机/弹簧作用提供许多益处。发动机驱动是有益的，因为其高度可控，并且允许以用户所需的最小的机械力输入以半自动方式将药筒100装载至施加器400中。如上所述，基于发动机驱动的机构的实施方式提供对系统运行状态的监测。例如，将电流消耗和转数传递至系统中的逻辑和控制电路为潜在故障状况的检测和诊断提供了补充方法。尽管有这些优点，但是在某些情况下，电动机可能无法很好地适应在足够短的时间范围内施加必要的线性力，这对于有效地经皮展开包含多个细长电极以及在选定实施方案中的皮下注射针头的阵列是最理想的。特别地，通过在短时间范围内施加较大的线性力可以最一致地实现真皮组织的渗透。在一些实施方案中，当穿透电极和注射针(如果存在)以较高速度接触皮肤时，实现最有利的插入特征。这是因为在皮肤接触点以增加的速度行进的尖锐物在切割或穿透组织时导致较少的组织变形。因此，在一些实施方案中，期望在与皮肤接触之前迅速加速尖锐物。在一些实施方案中，经常利用多个电极和注射针。在另一实施方案中，在与皮肤接触之前，电极的速度是至少50mm/秒。在另一实施方案中，在与皮肤接触之前，电极的速度是至少500mm/秒。这种展开方法使受试者在电极穿透期间感觉到的不适最小化，并且最有利于保持多个电极之间的一致的空间关系。与机电发动机相比，弹簧驱动机构(spring driven mechanism)表现出更有利的放电谱，其能够将快速脉冲力施加至经皮电极植入所期望的电极和注射针。特别地，压缩弹簧施加的力在初始释放时达到其峰值。这有利于在皮肤接触点的高速有利的经皮展开，并且由于皮肤组织的粘弹性，需要最大的力来穿透皮肤，特别是当皮肤与多个电极和/或注射针接触时。此外，基于弹簧的机构能够从简单、耐用和紧凑的外形因素产生这种力，所述外形因素可以容易地集成至手持设备形式中。但是，基于弹簧的机构的缺点是它们通常需要由用户输入大量的机械力，以便启动它们进行操作，特别是对于具有高力常数和/或大位移的弹簧。如本公开中描述的，混合发动机和弹簧机构的使用实现了期望的展开力特征，同时使用户易于操作。虽然混合发动机和弹簧机构是优选的实施方案，但是取决于实施方式，也可以使用包含两个或更多个驱动机构的其他混合机构，其中一个能够产生快速的脉冲力，而另一个能够启动脉冲力机构，例如，能够将气体压缩至腔室中然后排放压缩气体以便施加脉冲力用于电极展开的泵，以及，在适用的情况下，皮下注射针。
在任何情况下，一旦装载，医生或其他药物施用者就可以肯定地选择期望的深度电极展开和/或药剂给药并将其传输至施加器400。此外参考图13B，可以通过深度选择按钮409(或其他等同界面如切换开关或滑动开关)选择深度，并且结果显示在注射深度选择指示器408上(或者，再显示在其他等同界面上)。通过施加器400和/或药筒100的适当标签将可用的注射深度传达给用户。在一些实施方案中，与注射深度有关的任何标签均位于药筒100上，并且在安装至施加器400中后对用户仍然可见。例如，可以将可用的注射深度标记在对齐引导器/展开盾108的上表面上。为了避免用户忘记或忽略选择注射深度的情况，优选在做出这样的肯定选择之前，所述设备不允许用户继续给药程序。这可以通过在系统内实施适当的控制逻辑来实现，使得直至用户已输入有效的深度选择才能访问设备设置或使用的后续元件。在某些实施方案中，当提示用户肯定地选择注射深度时，控制器显示器可以向用户传达信息，所述信息是关于评价受试者并确定所选给药部位的适当注射深度的适当方法。
此外参考图18A-18B，在正确插入入药筒组件后，弹簧帽/药筒界面470接合并且还压在弹簧盖孔(spring cover hole)471和突片491上。当较大的弹簧力压在内部药筒103上时，通过一组保持柱488接合在外部药筒102的壁上，防止内部药筒103向前移动。但是，470施加的力使突片491张开(这防止在操作期间锁环的意外旋转)，从而允许通过发动机驱动机构使药筒锁环114旋转。药筒锁环114的旋转引起保持柱488的旋转。保持柱488可以旋转至第一深度的通道490或第二深度的通道492中。第一深度的通道490的长度对应于深度选择之一，而第二深度的通道492的长度对应于另一个，由用户使用按钮409选择的一个或另一个深度。例如，通道490的长度可以为20-30mm，而通道492的长度可以为12-20mm。用户肯定地选择深度的要求提供了另一个联锁。没有肯定的选择，施加器可能不允许激活/针插入。因此药筒锁环114的旋转是由施加器400根据用户的指示顺时针或逆时针旋转引起的。要求将一组柱旋转运动至这类通道中以实现电极的展开，并且注射针(如果存在)大大减少意外放电的机会，即使在剧烈震动或跌落时也是如此。
更详细地，药筒锁环114的旋转通过保持柱488传递至药筒组件100，药筒组件100正确插入后，保持柱488安置在插入机构齿轮驱动环478上的槽中。在图18A中，插入机构齿轮驱动环478上的槽设置在3点钟和9点钟位置。将插入机构齿轮驱动环478安装在部分插入齿轮环479上，所述部分插入齿轮环479由插入机构驱动发动机482驱动。驱动部分插入齿轮环479使插入机构齿轮驱动环478顺时针或逆时针旋转。环480上的标志481和伴随的插入机构位置传感器483用来确定插入机构齿轮驱动环478的位置，并且在施加器400将与另一药筒一起重复使用时进一步用来将其精确返回3点钟和9点钟位置。
上述实施方式提供各种优点。例如，用户必须在继续给药程序之前主动进行选择深度的步骤。这样做时，用户必须按照使用文件的指导和说明书中的说明评估所选注射部位的适当注射深度，并且准备部位。如前所述，需要旋转运动来展开的插入机构显著硬化，以防止由于掉落、摔落、震动等原因而意外展开。
本领域技术人员会理解变化。例如，虽然每个深度采用两个通道和两个保持柱，但是也可以使用一个通道和一个保持柱。各种类型的发动机和机构可以用于传递必需的旋转动作以将柱旋转至通道中。还应理解其他变化，包括使用螺线管等。代替使用通道，可以用发动机驱动的展开来提供可变深度，可以通过控制发电机驱动展开的程度简单地控制深度。优选地，在这种情况下，配置所述混合驱动机构，从而脉冲放电机构(例如，弹簧)用于通过真皮的初始展开，然后发动机驱动机构用来将电极推进至它们的期望深度。
可以设置一个或多个联锁，在使插入机构齿轮驱动环478旋转将保持柱488旋转至通道中之前，必须将其停用。
首先，可以设置力检测联锁子系统，其要求在允许开始给药程序之前以大于预定量的力将设备施加于受试者。可以通过适当的机械或机电系统测量这种力，并且将结果反馈至控制器700中并用作联锁以防止在没有提供足够的力时激活设备。在一些实施方案中，控制器700能够通过视觉、触觉或听觉信号将力检测联锁的状态传达给用户，从而可以纠正力不足的状态，并且用户可以继续给药。如果用户尝试在力接触不足的状态下继续给药(例如，通过按下触发器407或其他激活按钮)，施加器400或控制器700可以提供额外的视觉、触觉或听觉信号以通知用户在继续给药之前必须停用联锁。
施加至受试者的力的检测可以以许多方式完成。参考图4和8A-8B的特定实施方式，对齐引导器/展开盾108装有力接触拾取器128。可以利用一个或多个力接触弹簧126使对齐引导器/展开盾108机械地偏向远端方向(朝向受试者)，图4示出了其中4个。力接触拾取器128通过施加至对齐引导器/展开盾108的力改变其位置。这样做，它还改变了由力接触拾取器128、一组第一垫162、一组第二垫164和柔性电路160形成的电路的状态。特别地，通过测试一个或多个垫162与一个或多个相应的垫164之间的连续性，可以确定对齐引导器/展开盾108已通过施加的力向后或向近端移动多远，因此确定是否存在足够的力用于正确递送。施加器400利用传感器接触部434读取电路状态(见图16)。如果显示足够的力，则停用力接触联锁，允许用户操作设备。
在一实施方式中，在第一接触点，系统可能不会记录到已施加的任何特定力。在第二接触点，系统可能记录其处于部分(但是不足)的压力下。在第三接触点，系统可能记录已达到进行程序给药所需的规定压力水平，并且联锁可以停用。优选地，通过施加器显示器404向用户提供力接触电路的状态。
本领域技术人员会理解变化。例如，力接触联锁可以形成电锁，所述电锁在控制器700内或在施加器400本身内被停用。在另一变化中，力接触电路可以配置为在整个程序给药过程中提供关于设备状态的信息。特别地，系统可以包括在力接触电路和控制器700之间的反馈回路，其中用户施加的力的减少促使控制器700和/或施加器400产生视觉、触觉或听觉信号，从而可以纠正力减少的状态。在某个实施方案中，在力接触电路和控制器700之间存在反馈回路，从而对施加的力的变化的检测提示系统开始检查电极是否在受试者组织中保持正确展开，例如，通过电极之间的阻抗或电阻检查。如果检查通过，则程序正常继续。在电极的位置不再可接受的情况下，则可以中止程序并通过控制器700和/或施加器400产生视觉、触觉或听觉信号来向用户通知设备的状态。这个反馈回路在药物注射期间特别重要。通过监测设备的位置和电极的状态，力接触电路和电极电阻/阻抗监测器之间的反馈回路，系统可以检测电极(以及注射针)是否不再在受试者体内，允许系统停止注射驱动机构456的操作以停止按压储存器柱塞484，并终止药物的注射。虽然这个实施方案最容易用发动机驱动的注射驱动器456体现，但是在手动操作或弹簧驱动机构的情况下可以体现其他变化，其中在检测到故障状况之后，机械联锁的激活可以用来停止储存器柱塞的致动。当在完成药物递送之前从受试者的组织移除施加器400时，这种功能部件可以在阻止HBV疫苗无意地喷洒至环境中特别有用。对于暴露于用户或环境可能有害的药物或治疗剂，这样的设计可以避免意外的排放/暴露。
由于在部分剂量情况下递送至受试者的剂量的数量对于告知临床医生有关进一步治疗的决定可能至关重要，因此，优选的是，注射驱动机构456包括适当的传感器和控制功能部件，以便在由于检测到故障状况或其中必需停止注射冲程(stroke)的其他情况而停止注射冲程时确定注射驱动柱塞484的位置。优选地，这是通过监测用来驱动注射驱动柱塞484的发动机的转数来实现的，但是可以采用监测注射驱动柱塞484位置的其他方法，包括使用光学或电传感器。基于注射驱动柱塞484的已知尺寸、插入深度和储存器101，适当逻辑和控制电路的使用可以将注射驱动柱塞的位置转换为在终止注射冲程时注射器中剩余药物的估算体积。这样的信息可以通过显示器712传达给用户。
除了提供终止功能部件以在检测到故障状况时终止注射冲程，使用发动机注射驱动器456还可以提供辅助检测器用于检测故障状况或其他操作问题。具体地，包含适当的测量和逻辑电路以在注射冲程中监测发动机引起的电路可以用来证实注射已在定义的规格内进行。可以为注射冲程的各个阶段建立发动机引起的电流的预期范围，包括注射驱动柱塞(injection drive plunger)484在其与柱塞制动器(plunger stopper)159接触之前的初始加速，注射驱动柱塞484和柱塞制动器159之间的初始界面(interface)，柱塞制动器159在储存器101的筒中的向前驱动，以及在柱塞制动器159接触储存器101的筒的端部时注射冲程的结束。通过在药剂注射的每个阶段中将注射驱动柱塞484的位置与测量的发动机引起的电流比预期值相关联，系统能够鉴定潜在的故障状况并将它们传达给用户。例如，如果用户无意地将储存器101插入药筒100中，其中柱塞制动器159已部分驱动(因此不包含预期的完全剂量的药物)，则系统可以检测到当注射驱动柱塞484达到柱塞定位的外部公差时，发动机注射驱动器456引起的预期电流增加未发生。在这种情况下，系统可以终止给药程序并通知用户检测到的故障。通过这种方法可能可检测额外的故障状况，包括(但不限于)施加器400中有故障的部件，储存器101的破损和/或有缺陷的药筒100。
对齐引导器/展开盾108提供另一“联锁”以促进给药程序的正确执行，其如图9C所示。在这个图中，示出了对齐引导器/展开盾108，其具有展开功能部件168和限定在其中的孔170，其用于棒护罩134的可滑动移动。棒护罩134在图9B中示出，并且还示出了电极孔167。对于电极的经皮插入和相关的注射针，具有一致的皮肤界面促进电极展开至靶组织中，同时保持多个构件之间期望的空间关系。特别地，当皮肤置于垂直于展开方向时，最一致地实现正确展开。此外，当皮肤在垂直于展开方向的方向上处于张力状态时，电极和注射针未对齐情况减少。可以看到，展开盾108包括机械功能部件，所述机械功能部件包括凸缘和边缘以与皮肤接合并将其置于垂直于展开方向的张力下。结合上述确保施加至皮肤的一致的力的力接触电路拾取系统，对齐引导器/展开盾108确保皮肤在垂直于电极展开方向的方向上定向并置于张力下。虽然这个实施方案利用机械凸缘功能部件以在设备界面(device interface)处接合皮肤，但是许多其他设计和功能部件可以用于接合，包括使用与皮肤接触时具有高摩擦系数的可选材料(例如，橡胶内嵌、胶布等)或可选机械功能部件，包括能够使皮肤处于张力状态的成型纹理、切口和锯齿状功能部件(sawtooth feature)。
可以看到，对齐引导器/展开盾108具有限定的优先方向。如上所述，药物分布和电场施加的空间和时间共定位是期望的。值得注意的是，骨骼肌的固有结构特性导致肌肉内注射的特征性椭球分布模式，其中椭球的主轴与肌肉纤维的条纹对齐。因此，对于涉及肌肉内注射的应用，排列电极以产生椭球电场分布谱是有利的。为了确保电极阵列和所产生的电场分布谱相对于靶骨骼肌的条纹正确定向，对齐引导器功能部件的使用对于肌肉内给药特别有用。对齐引导器功能部件的目的是促进设备的放置，使得电极阵列的方向相对于肌肉条纹和注射后所得的药物分布是最有利的。对于手臂注射，对齐引导器/展开盾108会期望像臂带一样水平地缠绕在手臂上。对于腿，期望相似的方向，其中展开盾水平地缠绕在腿上。已发现具有以这种方式配置的对齐引导器/展开盾108即使在没有言语提示的情况下也导致>98％准确的药物递送。所示的优选方向和由此产生的皮肤放置对于肌肉内注射特别有用，因为电极的菱形阵列(参见图9A中电极137的远端阵列，其大致匹配棒护罩134及其相关孔167的形状)然后正确定向以递送药物并引起药物沿优选的肌肉条纹方向电穿孔。一个主要特征是，当正确对齐时，皮肤应当与孔所在位置(例如，针头出现的地方)的皮肤界面齐平。以这种方式，获得了皮肤的一致界面。
当相对于靶肌肉的对齐不正确时，弧一般导致在对齐引导器/展开盾108和皮肤之间出现视觉上明显的间隙，例如，2-5mm。视觉上明显的间隙可以用作提醒用户以重新定向施加器400。施加器400对受试者的皮肤可能较不稳定。为了促进正确放置，优选这样的对齐引导器功能部件：其中功能部件的“翼”边缘之间的距离是功能部件的垂直高度的至少1.3倍。此外，在某些情况下，功能部件的设计是这样的，组织界面可以在期望方向上与皮肤齐平放置，而相对于期望方向成90度角放置时则表现出至少2mm的空气间隙。
本领域技术人员应当理解对齐引导器的设计上的变化。例如，代替弧形对齐引导器/展开盾108，可以使用“V”形。还应当理解其他变化，关键特征是将设备以期望方向直接靠在皮肤上放置，而当设备相对于靶肌肉的条纹未对齐时，在组织界面和受者的皮肤之间存在2mm或更大的视觉上明显的间隙。
如上所述，在一些实施方式中，对齐引导器/展开盾108的方向与电极阵列的形状有关，因为电极阵列的菱形对称具有与其相关的某种分布，并且这种分布应当与对齐引导器/展开盾108的形状具有某种预定关系。参考图9A-9B，示出了电极，并且更特别地示出了远端部分137，其数量为4。将电极放置在菱形阵列中，这可以意味着它们具有二阶对称性，即，是双重对称的，因为它们可以旋转并且在两个不同位置看起来相同。电极在这个阵列中从棒护罩134中定义的孔167延伸。菱形阵列的使用特别有用，因为如上文讨论的，肌肉内注射一般期望菱形阵列。重申一下，二阶对称阵列导致二阶对称施加的电场。如果对齐引导器/展开盾108正确定向，则这种类型的施加的电场沿肌肉的条纹可以具有优选方向。因此对齐引导器/展开盾108和二阶电场方向以协同方式一起工作以实现药物沿肌肉条纹的方向传播。
从广义上讲，菱形或其他二阶对称形状一般具有主(长)轴和副(短)轴。这些轴可以与对齐引导器/展开盾108的优选轴具有预定关系。例如，如果考虑对齐引导器/展开盾108具有翼，且翼的弓形环绕手臂，则连接翼中心的线段可以垂直于菱形阵列的主轴。
本领域技术人员会理解变化。例如，虽然菱形是电极阵列的一种可能的形状，但是另一示例性形状是矩形，其也是二阶对称的。可以将电极放置在适当位置，但是可以将其移至预定或期望的公差内，例如，在5％、10％之内等。电极可以具有各种其他形状，只要它们产生二阶旋转对称电场即可。
在另一变化中，对于非肌肉内注射，可以使用其他阶的对称性。例如，对于皮肤，一般没有优选的药物传播方向，因此甚至圆形电极阵列也可以用于皮内注射。
电极阵列的其他注意事项如下。最简单的阵列配置包括连接至电源的相对极的两个电极。如美国专利5,873,549和6,041,252(它们整体援引加入本文)中公开的，排列在多元件阵列中的三个或更多个同时有源电极的利用可以用来增加组织的目标体积并改善靶组织内电场传播的均匀性。为了在组织中施加电场，已开发了各种各样的几何电极排列和激活模式。这些包括以线性、矩形、圆形或三角形构型排列的电极，这些电极能够在大致椭圆体、长方体、圆柱体或球体形状的组织体积中传播电场。最常见地，电极互相平行地排列，并且配置用于以基本上垂直于皮肤表面的方向经皮插入。为了确保组织的靶体积和形状受电场的施加影响，期望在经皮插入之后实现阵列内每个电极之间的预期空间关系。特别地，应当避免电极间间距的意外变化，因为它们可以引起靶组织内传播的电场大小的变化，可能对手术的安全性和/或效力造成负面影响。
另一联锁包括使用外部药筒盖110。特别地，当与外部药筒盖110一起储存时，对齐引导器/展开盾108被盖住。将外部药筒盖110配置为不仅一般保护设备的远端直至使用，而且还用作联锁功能部件本身。虽然保护药筒组件100的远端用于保护针头和电极不受环境影响的目的，但是普遍遇到的问题是用户经常忘记取下这类盖。一种解决方法是使盖具有与药筒100中其他部件的颜色不同的亮色，以便通知用户其存在，因此提醒用户将其取下。这种解决方法的另一部分包括延伸或提醒标签190，如与矩形部分相邻的弓形部分所示，即使当药筒组件100放置为背靠受试者时，弓形部分仍然可见。因为这种提醒标签190是可见的，所以即使当外部药筒盖110的其余部分不可见时，其仍可以用作提醒以移除外部药筒盖110。
更详细地参考图10A-10B，外部药筒盖110包括远侧朝向受试者的外表面和朝向对齐引导器/展开盾108的内表面。在内表面上提供许多钩176，其接合对齐引导器/展开盾108上限定的相应壁180。这些钩将外部药筒盖110固定就位。
但是，如果无意地将外部药筒盖110留在原位，并且施加器400用力压靠在插入部位，则对齐引导器/展开盾108对外部药筒盖110的力可能会导致外部药筒盖110通过对齐引导器/展开盾108推离其钩挂位置而“弹出”。但是，在钩176上提供倒角表面178，当施加力时，所述倒角表面倾向于作用在棒护罩134上，导致钩176向外张开，增加它们对对齐引导器/展开盾108的保持力，并且防止外部药筒盖110弹出。此外，倒角表面进一步作用于棒护罩，防止对齐引导器/展开盾108相对于棒护罩134移动。如果对齐引导器/展开盾108不可以相对于棒护罩134移动，则不可以停用力检测联锁，因为力接触拾取器128不可以移动至上文讨论的第三力接触点，在此检测到全压(或者对于这个问题，甚至不可以移动至第二力接触点)。当控制器发生这种情况时，控制器可以提供报告。例如，可以显示用户界面指示如“您需要卸下外部药筒盖。”，这是由于检测到在没有足够力的情况下进行触发器拉动而引起的。
虽然上文已描述了某些联锁，但是在任何给定实施方式中可以提供更多或更少的联锁。例如，可以采用其他方式用于力检测并用作联锁的触发信号。也可以采用其他类型的联锁，包括扳机锁、安全开关等。鉴于本教导，本领域技术人员会理解其他类型。
一旦用户肯定地选择插入深度，并且移除了外部药筒盖110，并且通过力联锁检测到适当的力，触发器的激活引起药筒锁环114的顺时针或逆时针旋转，旋转的方向取决于用户选择的插入深度。旋转导致保持柱488移动至所选深度的通道中，这继而导致针头和电极展开。特别地，内部药筒103、药筒后膛112、储存器101、内部药筒盖104、针头接口152、针头105、电极122和相关元件在电极/针头插入弹簧472的影响下向前移动。在本实施方案中，将这些元件互相刚性连接，因此作为一个单元向前移动。
为了进一步最小化对用户造成尖锐伤害的风险，优选药筒组件还包含一种在将电极和任何注射针从受者组织中取出之后将其套住的机构。这可以通过包含棒护罩功能部件来实现，所述棒护罩功能部件在使用之前容纳电极或注射针(如果存在)，然后在电极和注射针(如果存在)展开和从受试者组织取出之后沿其延伸。通常，组织接触界面包括护罩功能部件的远端表面。虽然可以考虑使用手动操作的护罩功能部件，但是优选地，所述设备包含一种机构以自动将护罩功能部件沿电极延伸，并且进一步接合锁定功能部件，以便一旦从受者组织取出，保持护罩功能部件处于延伸状态。实例包括用药筒外壳可滑动地接合并可操作地连接至储存的能源的护罩功能部件，如弹簧，当从受者组织抽出电极时其使护罩向前滑动。或者，该机构可以包含在施加器内，并且配置为反转电极展开步骤，从而使电极和任何相关注射针缩回在组织接触界面后面。这可以利用简单的线性运动的机电机构来实现，如发动机或螺线管。
在一特定实施方式中，并且返回参考图4以及图11A和11C，将棒护罩134配置为在药物递送发生时保持位置，但是在药物递送期间内部药筒103和其他相关部件的向前移动导致棒护罩弹簧138的压缩。然后当从受试者取下施加器时，这个压缩的棒护罩弹簧138放松，因为当从受试者取下施加器400时导致棒护罩134向前移动，覆盖针头和电极，并且保护受试者和其他人避免未盖上的尖锐物。值得注意的是，这种功能部件还防止收回期间尖锐物功能部件的可视化，这可以促进经历与针头相关的焦虑的受试者的接受度。
虽然松弛的弹簧有可能重新压缩，特别是当用户向近侧移动棒护罩134时，但是通过棒护罩支撑臂132的作用防止这种情况。所述棒护罩支撑臂132安装在外部药筒102的内部，并且在棒护罩134向前移动时具有棘轮功能。特别地，并且参考图11A和11C，棒护罩支撑臂132在各种顺序的保持壁上移动，并且在棒护罩134向远侧移动时可以容易地这样做。但是，在近端方向，因为棒护罩支撑臂132在这个方向上以棘轮方式邻接保持壁并且不允许通过，所以阻止了棒护罩134移动。
初始的一组保持壁188防止在使用药筒组件100之前棒护罩134向近侧移动。一组第一深度保持壁184防止在第一选定深度放电之后棒护罩134向近侧移动。一组第二深度保持壁186防止在第二选定深度放电之后棒护罩134向近侧移动。通过棒护罩保持钩182对内部药筒103的作用防止棒护罩134从药筒组件100中完全移除。
本领域技术人员会理解变化。例如，在一实施方式中，可以通过与外部药筒102界面连接的冲压金属支撑臂提供棒护罩支撑臂132。在一些实施方案中，将支撑臂功能部件作为注塑塑料功能部件直接整合在外部药筒盖106和/或对齐引导器/展开盾108中。应当选择特定材料以获得足够的刚度，以便为细长电极提供支撑，同时保持足够的弹性以防止部件在负载下破裂。材料选择还应当考虑电极阵列的预期灭菌方法(例如，γ辐射、蒸汽灭菌、环氧乙烷或电子束)以确保功能部件在灭菌之后保留足够的材料特性。在一示例性实施方案中，如实施的，当施加至少5N，但是更优选至少15N的力时，功能部件应当能够保持棒护罩134不向近侧运动。还可以采用提供棘轮功能以防止棒护罩向近侧运动的其他方式，包括在棒护罩134上实现的齿轮齿条以及在外部药筒盖106中实现的相应棘轮功能部件。
参考图4，阵列内的每个细长电极122包含导电通信的远端部分137和近端部分135。远端部分配置为用于组织穿透和组织中的电场传播，并且近端部分配置为具有导电接触区，所述导电接触区能够用合适的电能源可靠地实现与施加器内包含的电连接的导电通信。通过施加至各个电极的功率的时间变化，电能源可以在受试者体内引起空间和时间变化的电场，所述电场一般被限制在药物分布区域的周围，并且可以用于电穿孔治疗。
电极的相关特征包括形状、直径、尖端轮廓、长度、材料组成和导电性，其具体细节是基于预期应用进行选择的。最常见地，电极包括具有直径0.1-1.5mm的曲线横截面的导电细长杆。电极可以是实心的或空心的。最常见的空心电极包含一个或多个孔，并且可操作地连接至流体储存器，从而允许从电极本身给药所关注的药剂或其他相关药物，包括麻醉剂、表面活性剂、蛋白、佐剂或增强剂。取决于应用，适当的金属电极材料包括但不限于钛、金、银、铝、铜、钽、钨、钼、钨、不锈钢、MP35N和它们的合金。电极也可以由导电陶瓷或塑料构成。为了使在组织电极界面处的不期望的电化学反应最小化，通常期望将一个或多个电极以导电材料涂布，提供与电极材料本身相比改善的电化学稳定性。这类涂布材料包括但不限于铂、铱、钯、锇、金、银、钛和它们的合金。
如上所述，远端部分的尖端配置为用于组织穿透。常见的尖端轮廓包括但不限于套管针、斜面、圆锥体、刀片、长矛和锥形。对于经皮电极展开，优选具有一个或多个切边的尖端轮廓。对于可能不期望穿透尖端轮廓产生所需电场的某些应用，尖端可以由固定在电极远端的不导电材料构成，或者可以将穿透尖端覆盖在粘附的涂层或管道中，所述涂层或管道由生物相容性电绝缘材料构成，如聚(对二甲苯)聚合物、聚烯烃、聚氯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚酰亚胺、硅橡胶、热塑性弹性体/橡胶、乙烯四氟乙烯、氟化乙烯丙烯和/或全氟烷氧基塑料。
在穿透尖端附近是一个或多个导电区域，其配置为用于电场在组织中的传播。为了限制电场向组织的靶区域传播，特别是对于皮下和肌肉内给药，通常将至少一部分配置为用于组织中的穿透的电极长度覆盖在粘附的涂层或管道中，所述涂层或管道由生物相容性电绝缘材料组成，如聚(对二甲苯)聚合物、聚烯烃、聚氯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚酰亚胺、硅橡胶、热塑性弹性体/橡胶、乙烯四氟乙烯、氟化乙烯丙烯和/或全氟烷氧基塑料。以这种方式，可以将电极配置为仅在组织内的特定深度处激活。
总而言之，电极的数量和它们的电极间距离以及电极的穿透深度和它们的导电区域的深度定义了其中施加电场的组织的体积。这些参数是基于给药程序的特定目的进行选择的，包括靶组织部位以及待递送的药剂的体积、剂量和粘度，以及预期受者群体中皮肤和皮下组织厚度的变化。一般来说，对于人受者中的皮内给药，阵列包含直径0.2-0.7mm的2-16个电极、2-8mm的电极间距离、0.5-4mm的电极穿透深度和0.5-4mm的导电长度。一般来说，对于人受者中的皮下给药，阵列包含直径0.3-0.8mm的2-8个电极、4-10mm的电极间距离、5-15mm的电极穿透深度和2-8mm的导电长度。一般来说，对于人受者中的肌肉内给药，阵列包含直径0.3-1.2mm的2-8个电极、4-12mm的电极间距离、10-60mm的电极穿透深度和2-20mm的导电长度。
为了避免在使用设备期间发生不期望的可视化和暴露于电极，药筒组件100优选这样配置，使得电极122在插入受者的组织之前凹入设备内。最常见地，这是通过与电极安装支撑件可滑动地接合的外壳结构102来实现的，在一实施方式中，其包含看来形成在其中的内部药筒103，电极放置在其中。使用之前，将电极凹入外壳102内。使用期间，电极安装结构如内部药筒103与外壳的滑动接合允许电极122相对于外壳102的远端向前滑动，从而从外壳102展开电极122。电极安装结构和外壳之间的滑动接合的长度对应于给定应用的电极穿透的最大期望深度。
如图4中可以看到的，电极122具有近端部分135和远端部分137。近端部分通过肩部或弯曲部139与远端部分分开。肩部或弯曲部139由内部药筒盖104和内部药筒103固定在它们之间。肩部或弯曲部139提供许多功能。首先，虽然如上所述需要在药筒组件100远端的电极形成一定大小和形状的阵列，但是由于储存器101的存在，在药筒组件100的近端处放置期望阵列大小和形状的电极122是不切实际的。换句话说，电极122必须“偏向”弯曲以为储存器101提供空间。此外，具有弯曲部，特别是当弯曲部在内部药筒103和内部药筒盖104之间摩擦地锁定就位时，在其展开期间电极122与组织相互作用时，当针和电极插入的力沿远端方向回缩时，为电极122提供邻接表面。弯曲部可以抵抗轴性旋转，这是有益的，从而使得电极不会表现出明显的扭转运动并远离其电接触垫130旋转(如下所述)。此外，与其中多个电极与轴向分离的同轴环(axially separated coaxial ring)界面连接的现有技术相反，每个电极需要不同的配置，本系统允许将共同的电极类型用于所有四个电极。
根据本申请原理的系统和方法提供电场在受者的皮肤、皮下组织和/或骨骼肌中的传播，这促进HBV疫苗在所述受者组织内的细胞内递送。在这方面，所述装置包括两个或更多个细长电极122，其以预定的空间关系排列并配置为用于展开至其中已经或即将分布所关注的药剂的靶组织中。期望的药剂活性增强取决于实现药剂分布的部位与足够大的电场传播的共定位以诱导期望的生理效应。因此，理想的情况是，所述装置一致地实现电极展开至靶深度并具有指定的电极内间距。具体地，这确保电场在适当的组织部位传播，并且由于在组织内传播的电场大小是电极内间距的函数，因此确保安全有效的电场强度。但是，给定受者中和跨受者群体的部位之间皮肤和皮下组织的厚度、密度和组成的变化可以导致电极展开特征的显著变化。例如，皮肤厚度增加的受者对电极变形和/或穿透深度不足的敏感性增加，这可以影响与药剂分布部位的共定位。
根据本申请原理的系统和方法进一步促进电极阵列的一致经皮插入，所述电极阵列包含直径0.2-1.3mm的2-16个电极，电极间距离为2-12mm，以及具有不均匀的厚度、组成和状态的皮肤的受者中0.5-60mm的电极穿透深度。为了允许经皮插入，组织穿透电极最通常是细长的，并且配置为在远端部分具有组织穿透尖端和组织接触区，以及在近端部分具有电接触区。考虑到它们的细长外形，当它们受到经皮插入受者期间产生的压缩力时，它们很容易压弯、弯曲和/或屈曲(统称为变形)。电极插入期间的这类变形是不希望的，因为它们可以导致不适当的电极插入，其特征在于穿透深度不足和/或电极内间距的过度变化。值得注意的是，人和动物在皮肤的厚度、组成和状况方面表现出显著的种内和种间差异，其中任何一种都可以对经皮插入期间电极所承受的力产生重大影响。在一些实施方案中，用于细长电极的经皮插入的设备设计为能承受在目标受者群体中将要遇到的最严格的电极插入条件下出现的力。电极变形的出现可以通过电极材料选择以及减少阵列中电极的长度和增加直径来部分缓解。但是，材料选择可以受性能、成本、可制造性和生物相容性问题的限制。此外，长度减少的电极可能阻止具有异质组织厚度的靶群体的充分覆盖，而直径较大的电极会增加不适和组织创伤。因此，本公开设计为提供方法和装置以独立于这些变量促进电极的经皮插入。
在本公开的第一实施方案中，容纳电极阵列的子组件药筒包括一个或多个在组织插入期间与电极之一物理接触的支撑动态支撑构件(dynamic support member)，并且其配置为限制与插入方向垂直的电极的移动并保持电极之间期望的空间关系。例如，并且参考图12，示出了电极支撑功能部件(electrode support feature)124，其中为电极提供孔192，并且为针头的通过提供孔194。细长电极在负载下变形或弯曲的趋势因制造或组装期间引入的电极的任何弯曲、偏心或压弯而加剧。因此，有利的是采用设备如电极支撑功能部件124来限制电极，以便防止或校正它们在静止时可能表现出的任何弯曲、偏心或压弯，并且防止由于在展开至组织期间发生的负载造成的不希望的电极的垂直移动。
在本公开的上下文中，动态支撑构件定义为一种结构元件，其在插入受者组织期间提供与细长电极的滑动接合，并且其配置为在电极插入期间经历位置、大小和/或构象的变化，以便在将电极展开至靶组织深度时保持期望的电极空间关系。因为电极在于皮肤初始接触时承受最大的负载力，动态支撑构件与包含阵列的电极的接合优选在与受者组织的初始接触之前受到影响，并且在电极展开至穿透的完全深度时继续提供支撑。还有利的是，动态支撑构件设计为向电极和注射针提供支撑，同时使由于摩擦引起的电极穿透力的损失最小化。
虽然动态支撑构件的主要功能是保持阵列内的多个电极相对于彼此以及相对于注射针的期望空间关系，但是还希望动态支撑构件的设计包括能够稳定整个阵列的功能部件。这优选通过提供限制支撑构件的横向移动的附加结构支撑功能部件来完成。在某些实施方案中，将这些支撑功能部件整合至尖锐物保护罩中，所述保护罩还用来保护用户免于意外暴露于电极和/或注射针。以下公开的是与本公开一致的动态支撑构件的各种实施方案。
上文描述为电极支撑功能部件124的本公开的实施方案涉及使用位置相对于电极的细长方向垂直的平面支撑结构124。平面支撑结构配置有一个或多个孔192，其以它们的特定空间关系对应于所述电极的位置。孔的大小、形状和位置配置为允许支撑结构沿阵列内电极的细长长度平滑地滑动，同时限制与电极展开方向垂直的不希望的移动。通常，孔可以配置为在平面结构中对电极具有足够间隙的洞或槽192(比电极的最大横截面大至少10％，包括任何涂层或其他粘附材料)。但是，如果特定电极需要更大量的支撑，则一个或多个孔可以包含与平面支撑结构垂直排列的管状结构196。包含这类管状结构的孔增加与电极接触的表面积，从而增加为细长电极提供的支撑。平面支撑结构可以制备自具有适当结构特征的任何材料，包括金属、聚合物、陶瓷或复合材料，并且可以用其他方法成形、加工、成型或生产。为了避免不希望的与电极的电相互作用，优选电极和平面支撑结构之间的界面是不导电的。还应当选择材料和制造方法以使电极和动态支撑构件之间的界面处的摩擦力最小化。由于许多因素，包括它们的低成本、易于制造和良好的电特性，电极支撑结构通常由热塑性塑料制成，如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯酸或聚乙烯。应当选择特定材料以获得足够的刚度，以便为细长电极提供支撑，同时保持足够的弹性以防止部件在负载下破裂。材料选择还应当考虑电极阵列的预期灭菌方法(例如，γ辐射、蒸汽灭菌、环氧乙烷或电子束)以确保动态支撑构件是相容的。支撑结构的具体尺寸和设计取决于所选材料的特性。但是，使支撑结构的尺寸最小化是期望的，从而其不会过度限制电极可以展开的距离或干扰设备的其他功能特性。0.5mm–2mm厚度的刚性平面结构通常是足够的。
动态支撑构件的另一实施方案是使用具有孔的压缩弹簧，其容纳电极并限制它们的横向移动。压缩弹簧可以制备自金属、聚合物或弹性体材料，并且可以用其他方法成形、加工、成型或生产。静止时，弹簧未压缩或压缩程度最小，电极沿弹簧的长度插入孔中。当展开电极时，弹簧沿展开方向压缩，其中孔容纳电极与弹簧线圈垂直的滑动移动。当与用来从组织部位移除之后容纳穿透电极/针的护罩或护套结合时，这个实施方案特别有用。在这些实施方案中，当设备从组织移出时，通过电极的向前展开施加给弹簧的力可以用来在电极上展开护套或护罩。
在图4的实施方式中，棒护罩弹簧138可以用来部分支撑电极支撑件124，并且特别地，弹簧的半径可以配置为匹配(或略大于)电极支撑件124的壁198的半径。以这种方式，使用期间可以将电极支撑件124插入棒护罩弹簧138的中间。然后电极支撑件124可以在棒护罩134的内部滑动。通过放置在弹簧的中心，电极支撑件124自然地保持在弹簧的中心位置，这为电极的支撑提供期望的“中间点”，大约在它们在内部药筒盖104处的支撑点和它们在组织界面处的穿透点之间的中间。
考虑其他基于弹簧的电极支撑件。例如，将成形的压缩弹簧置于电极的区域中，以便提供自适应电极支撑件(adaptive electrode support)。成形的压缩弹簧的形状和比例可以使其紧贴电极的相对位置，以便限制它们的横向运动。可以将可选的偏压元件与成形的压缩弹簧结合放置，并且可以用来将电极向外偏压以抵靠成形的压缩弹簧。成形的压缩弹簧可以制备自金属、聚合物或弹性体材料，并且可以用其他方法成形、加工、成型或生产。偏压元件可以制备自金属、聚合物或弹性体材料，并且可以用其他方法成形、加工、成型或生产。
也可以考虑基于其他机构的电极支撑件，例如伸缩管。伸缩管用来在插入受试者期间支撑电极。伸缩管的大小可以设置为相对于彼此自由移动，或者伸缩管的大小可以设置为仅在施加轴向力时移动。
考虑其他支撑结构，例如基于可移动的、柔性的或枢转的支撑构件的支撑结构。横向支撑构件可以在任选的铰链功能部件处附接至电极。横向支撑构件可以与容纳电极的结构一体地成形，或者可以是通过常规方法(卡扣、焊接、粘合剂、紧固件等)附接的单独部件。
另一实施方案是使用其中嵌入电极的可压缩基质材料。当电极展开时，材料沿展开方向压缩，从而沿行进方向提供横向支撑。可压缩基质材料的实例包括纤维素、泡沫塑料或橡胶聚合物如微孔塑料、泡沫硅氧烷或泡沫聚氯丁二烯、或碳泡沫基质。因为材料设计为接触电极和/或注射针(如果适用)，所以应当选择与间接组织接触相容的材料。
因此，上述结构支撑多个细长电极在高达60mm的组织深度处的经皮展开，同时保持多个电极之间的期望空间关系，以及在特定实施方案中，皮下注射针的孔。这类支撑构件在经皮插入期间接合多个细长电极，并且限制电极在垂直于它们的细长方向的一个或多个方向上的偏转。本公开的另一方面提供方法和装置，所述方法和装置用于将生物相容性润滑化合物施加至多个电极的表面，以便减少实现多个细长电极一致的经皮展开至多达60mm的深度所需的施加力。在一示例性实施方案中，可以通过常规喷涂或浸涂将生物相容性硅酮化合物如Dow Corning 360Medical Fluid或Dow Corning MDX4-4159施加至包含阵列的多个电极上，以便改善电极的插入特征。涂层的具体选择和应用条件如涂层方法和厚度取决于电极的数量、大小、组成和尖端配置以及其中展开电极的靶组织。
参考图4和7A-7B，电极122的近端部分135可以定位在药筒组件100的内部药筒103的外部上(图7B)。这样，当将内部药筒103可滑动地安置在外部药筒102内时(图7A)，近端部分135接触相应的电极接触部130，特别是电极接触部130的外部药筒内部部分133，这些内部部分133配置为与近端部分135进行电力通信。由于近端部分135的长度和外部药筒内部部分133的长度，无论内部药筒相对于外部药筒的纵向位置，都可以沿其连续界面在多个位置进行电力通信。电极接触部130进一步包括外部药筒外部接触部131，配置为用于与施加器400上相应的连接496进行电力通信(见图18C)。电极接触部130由足以传达电信号的导电材料组成。在某些实施方案中，设计和材料选择确保接触部提供足够的接合，以便确保在电极和接触部位置中的预期制造变化范围内与相应电极的导电界面，同时不会抑制或干扰安装在内部药筒103上的电极122的向前移动。设计还必须允许这种接合在产品标记的保质期内在暴露于预期的储存条件时持续存在。在某个实施方案中，电接触部130由具有适当回火的冲压或成形金属制成，以便促进与电极的接合，并且可以包括涂层如金或铜以确保电接触部的完整性并避免腐蚀。除了确保沿电极的连续界面在许多位置上都可以保持电极的电接触，在这种配置下在外部药筒102中包含电极接触部确保由于电极122和电极接触部130之间的滑动相互作用而引起的任何磨损发生在设计为一次性使用的药筒100内，从而允许外部药筒接触部131和施加器电接触部496之间的静态界面，这使设计用于多次使用的施加器的电极连接496上的潜在机械磨损最小化。这种配置的好处是延长多用途施加器的可用功能寿命。
现在描述施加器400的剩余部分。这些部分一般是与药筒组件100的操作无关的那些部分。首先参考图13A，施加器400包括手柄402和多导体电缆406，其设计为承载功率和控制信号以及待施加至组织的电信号。电缆406一般终止于控制器700中具有相应连接器界面的连接器(connector)中。施加器400进一步包括用户界面404，其中用户可以查看程序的各个方面，并且其中用户可以指导施加器执行各种功能，特别是深度选择。施加器400进一步包括程序激活触发器407，受试者使用其启动程序。
此外参考图13B，施加器400包括程序倒数计时器410，其通知用户程序的剩余时间，并且进一步隐含地向用户指示他们不应当从受试者移除施加器400直至倒计时触发器已倒计时至零。提供功率指示器418以指示与控制器700的令人满意且通电的连接。提供程序故障指示器414以向用户指示是否已发生故障，例如，上述联锁之一尚未停用。提供应用放置指示器412以通知用户是否已获得对受试者组织的适当压力，允许程序开始。
图14示出施加器400的多个结构部件，包括用于连接至控制器700的连接器426(未按比例)、顶部壳420、侧面壳422和424以及内部保护壳432。提供前盖430，连同端盖428。还提供各种机电子组件450，上文已描述了其中几个。
图15说明施加器400的更详细的视图，指示与药筒装载、电极插入和注射功能以及相关传感器对应的药筒压力传感器接触部434和子组件452。
图16说明子组件组452的更详细的视图，包括装载驱动子组件454和药筒装载子组件456。上文已描述了子组件的操作。
图17A说明装载驱动子组件454的更详细的视图，其操作总体已在上文进行了描述。这里注意，通过药筒组件100上的标志触发装载，并且对所述标志的检测导致在开关464处触发系统。利用支架466和468将装载驱动子组件安装至施加器壳体。发动机444的动作通过发动机驱动轴462传递至小齿轮组件448。
图17B说明插入/注射驱动组件456的更详细的视图。上文已描述了许多这些组件。这里注意，通过安装支架476将操作部件安装至施加器壳体。在插入电极122和针头105之后，针头105的柱塞被注射驱动柱塞484压下，注射驱动柱塞484的作用从针头的孔喷射药物。注射驱动柱塞由注射驱动发动机和齿轮组件486驱动。
一般来说，由注射驱动组件486驱动的注射驱动柱塞向前移动，直至其不能再向前移动的点，即，向远侧，指示其已到达每个冲程的末端。这个指示一般由基本上升的注射驱动发动机486中使用的电流给出，表明储存器柱塞已到达储存器的端部并且注射已完成。但是，在某些情况下，可以采用发动机的匝数来确定已递送多少药物。这样的功能部件(feature)可以用来支持计量的药物剂量，或者以便在递送体积不在预期总量内的情况下通知用户，例如，预期注射储存器101的全部体积，但是基于柱塞杆的位置，其没有被清空。一些情况下，用户有可能不能将施加器400紧贴受试者的身体直至程序完成，例如，直至倒数计时器倒数至零时。如上所述，在程序中的时间范围内，当不再检测到针对受试者的力，可以进行阻抗检查以确定电极是否仍在受试者内。如果它们不在受试者内，则可以假定已过早地移除了施加器，并且可以将信号发送至注射驱动发动机486以停止注射，限制向受试者外喷射的药物量。
参考图19，可以看到控制器系统/组件700包括电场控制器/发生器750以及手柄702和施加器托架706。控制器可以配置为台式以及推车安装使用。在推车安装配置中包括存储箱704是有利的。推车安装配置中的控制器的详细信息在图20A-20D中示出，包括轮锁以确保控制器组件在运行环境中不会移动，用于放置物资的托盘710，包括受试者准备用品、储存器/小瓶/注射器等。据说明施加器连接器端口708连接施加器400至控制器组件700。显示器712显示给药程序的状态，特别是关于所附的IFU。
提供药筒弹出按钮714以使药筒组件100从施加器400弹出。菜单导航按钮716允许导航和操纵如在显示器712上看到的组件。如果期望，提供静音按钮718以使警报或其他声音指示器静音。提供电源按钮722以为单元供电，并且如果主电源开关726(图20D)已打开，则可激活该按钮。
显示器还包括电池指示器720，其在提供电源备用系统的地方提供电池水平的指示。这样的电池备用系统可以包括在控制器/发生器750中，以适应以下情况：其中功率损耗防止主电源为单元供电。当已在主电源下启动程序但遇到主电源丢失时，可以将其用作备份。在这种情况下，实施逻辑和控制电路以提供从主电源到电池电源的基本无缝过渡，从而可以利用备用电池来完成该程序。有利的是，控制器包括电池监测电路，其能够监测电池在主电源丢失之后是否具有足够的电荷来完成该过程。在一些实施方案中，控制器还包括显示器，以在主电源丢失的情况下，如果电池的当前充电状态不足以完成程序，则通知用户。
参考图20D，其中说明控制器750的后视图，可以看到控制器750包括USB端口724、主电源开关726和主电源输入728。
参考图21，在一种使用方法中，如流程图800所示，向控制器/发生器750供电并且其程序自动启动(步骤802)。连接施加器(步骤804)，并且如果尚未连接施加器，则可以在显示屏712上显示给用户的执行这个动作的指示或指令。系统可以进行自测试(步骤806)，自测试不仅确保控制器/发生器750的正确操作，而且还确保施加器400正确连接至控制器/发生器750。
该程序可以使显示屏向用户提供关于准备给药部位的指令(步骤808)。这个步骤可以包括确保递送正确的药剂，药剂没有过期，已审查禁忌症，并且已遵循警告/预防措施。
然后用户移除储存器盖并将储存器101插入药筒组件100中(步骤810)。在一些实施方案中，用户体验到听觉、触觉感知或触觉的喀哒声(步骤811)，指示储存器在药筒组件中正确放置。
然后用户将药筒组件100插入施加器400中(步骤816)。然后测试错误状态(步骤818)，例如，检测正确的储存器放置，并且如果检测到错误状态，则终止该过程，显示错误信息，并且指示用户采取补救措施。如果可以纠正错误状态，例如，用户未正确插入储存器，但是未接合或关闭药筒后膛，则可以指示用户卸下药筒并正确地重新插入储存器(状态820)。在某些情况下，药筒会自动弹出，而在其他情况下，用户可能必须按下“药筒弹出”按钮以完成操作。在其他错误状态下，例如，在以关闭药筒后膛时，可以指示用户使用新药筒。
在任何情况下，一旦完成设备设置并已达到“无错误状态”，用户就可以继续进行药物和电穿孔疗法的给药(步骤822)。
控制器的主要功能是产生实现期望的药物递送所需的电场，在设置和使用期间控制系统的运行，在设置和使用期间监测系统状态，以及在设置和使用期间向用户传达系统状态。在一些实施方案中，控制器能够在用户培训的背景下以及在解决常规使用期间的故障状况期间提供有关设备使用的建议和指导。
可以利用包括微处理器、微控制器、可编程逻辑控制器在内的任何数量的计算设备来完全实现控制器系统和控制器的操作方法。通常，在计算机可读介质上步骤指令，一般是非暂时性的，并且这些指令足以允许计算设备中的处理器实施本公开的方法。所述计算机可读介质可以是具有指令的硬盘驱动器或固态存储器，所述指令在运行时被加载至随机存取存储器中。例如，来自多个用户或来自任何一个用户的对应用程序的输入可以通过任何数量的适当计算机输入设备进行。例如，用户可以采用键盘小键盘(keypad)、键盘、鼠标、触摸屏、操纵杆、触控板、其他定点设备或任何其他此类计算机输入设备输入与计算相关的数据。还可以通过插入的存储芯片、硬盘驱动器、闪存驱动器、闪存、光学介质、磁性介质或任何其他类型的文件存储介质输入数据。可以通过与用户可以到达的显示器相连的视频图形卡或集成图形芯片组将输出递送至用户。或者，系统可以输出一种或多种形式的电子文档，或者可以采用打印机输出结果的硬拷贝。在给出这种教导的情况下，应当理解本公开也考虑任何数量的其他有形输出。例如，输出可以储存在内存芯片、硬盘驱动器、闪存驱动器、闪存、光学介质、磁性介质或任何其他类型的输出上。还应当注意，本公开可以在任何数量的不同类型的计算设备上实现，例如，个人计算机、膝上型计算机、笔记本计算机、上网本计算机、手持计算机、个人数字助理、移动电话、智能手机、平板电脑以及专门为这些目的设计的设备。在一实现方法中，智能手机或wi-fi连接设备的用户使用无线互联网连接将应用程序的副本从服务器下载至他们的设备。适当的认证程序和安全交易过程可以规定向卖方付款。应用程序可以通过移动连接下载，或者通过WiFi或其他无线网络连接下载。然后用户可以运行应用程序。这样的联网系统可以为这样的实现方法提供合适的计算环境，其中多个用户向系统和方法提供单独输入。在考虑施加器的控制的以下系统中，多个输入可以允许多个用户同时输入相关数据。
元件表
Figure BDA0002637888190000521
Figure BDA0002637888190000531
Figure BDA0002637888190000541
Figure BDA0002637888190000551
实施例
本发明的以下实施例进一步说明本发明的性质。应当理解以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
实施例1：HBV Core和Pol抗原序列的产生以及质粒优化
据认为肝炎核心蛋白上的T-细胞表位对于消除乙型肝炎感染很重要，并且乙型肝炎病毒蛋白如聚合酶可以用来改善应答的广度。因此，选择乙型肝炎核心和聚合酶蛋白作为抗原用于治疗性乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的设计。
HBV核心和聚合酶抗原共有序列的获得
基于HBV基因型B、C和D产生HBV pol和核心抗原共有序列。不同的HBV序列获得自不同来源，并且分别针对核心和聚合酶蛋白进行比对。随后将所有亚型(A至H)的原始序列比对限制为基因型B、C和D。分别为每种亚型和所有联合BCD序列中的每种蛋白比对定义共有序列。在可变的比对位置中，在共有序列中使用最常见的氨基酸。
HBV核心抗原的优化
通过天然病毒蛋白中的缺失来优化HBV核心抗原共有序列。特别地，制备对应于C-末端高度带正电荷的片段的34个氨基酸的缺失，这是前基因组RNA衣壳化所必需的。
HBV Pol抗原的优化
通过改变4个残基以去除逆转录酶和RNAseH酶促活性来优化HBV pol抗原共有序列。特别地，在逆转录酶结构域的“YXDD”基序中，将天冬氨酸残基(D)改变为天冬酰胺残基(N)以消除任何配位功能，因此消除核苷酸/金属离子结合。此外，在RNAseH结构域的“DEDD”基序中，将第一个天冬氨酸残基(D)改变为天冬酰胺残基(N)，并且将第一个谷氨酸残基(E)改变为谷氨酰胺残基(A)，以便消除Mg2+配位。此外，将HBV pol抗原的序列进行密码子优化以扰乱包膜蛋白的内部开放阅读框，包括S蛋白以及具有N-末端延伸pre-S1和pre-S2的S蛋白的形式。结果，去除包膜蛋白(pre-S1、pre-S2和S蛋白)和X蛋白的开放阅读框。
HBV Core和Pol抗原表达策略的优化
测试三种不同策略以从质粒载体获得核心和pol抗原的最大表达和相等表达：(1)将HBV核心和pol抗原与插入编码序列之间的小AGAG按框融合以产生单个Core-Pol融合蛋白(图25A)；(2)通过核糖体滑动位点，特别是来自口蹄疫(FMDV)的FA2滑动位点，从一个质粒表达核心和pol抗原，以便产生从单一mRNA表达单独的核心和pol蛋白的双顺反子表达载体(图25B)；以及(3)分别编码HBV核心和pol抗原的两个分别的质粒(图25C)。
体外表达分析
将根据以上三种表达策略中每一种的共有HBV核心和pol抗原的编码序列克隆至可商购的表达质粒pcDNA3.1中。用载体转染HEK-293T细胞，并且利用HBV核心特异性抗原通过蛋白印迹评价蛋白表达。
转录后调节元件的优化
通过稳定初级转录物，促进其核输出和/或改善转录-翻译偶联，对4种不同的转录后调节元件进行了蛋白表达增强评价：(1)土拨鼠HBV转录后调节元件(WPRE)(GenBank:J04514.1)；(2)源自人载脂蛋白A1前体的内含子/外显子序列(GenBank:X01038.1)；(3)人T-细胞白血病病毒1型(HTLV-1)长末端重复(LTR)的非翻译R-U5结构域(GenBank:KM023768.1)；以及(4)HTLV-1LTR、合成的兔β-珠蛋白内含子(GenBank:V00882.1)和剪接增强子的复合序列(三重复合序列)。将增强子序列引入质粒中的CMV启动子和HBV抗原编码序列之间。当在WPRE元件存在或不存在下从质粒表达时，通过蛋白印迹在核心抗原的表达中未观察到显著差异(图25D)。但是，当通过蛋白印迹评价来自具有其他三个转录后调节序列的质粒的HEK293T转染细胞中的核心抗原表达时，三重增强子序列导致最强的核心抗原表达(图25E)。
高效蛋白分泌的信号肽的选择
评价了在HBV核心抗原的N-末端符合读框地引入的三种不同的信号肽：(1)Ig重链γ信号肽SPIgG(BAA75024.1)；(2)Ig重链ε信号肽SPIgE(AAB59424.1)；以及(3)Cystatin S前体信号肽SPCS(NP_0018901.1)。利用Signal P预测程序在计算机上对核心融合物优化信号肽切割位点。通过分析上清中的核心蛋白水平来确定分泌效率。使用在N-末端融合的3种不同信号肽的核心抗原分泌的蛋白印迹分析证实Cystatin S信号肽导致最高效的蛋白分泌(图25F)。
DNA疫苗载体优化
将优化的表达盒克隆在DNA疫苗载体pVax-1(Life Technologies,Thermo FisherScientific,Waltham,MA)中，所述表达盒包含在HBV抗原编码序列上游的三重复合增强子序列和N-末端Cystatin S信号肽序列。pVax-1中的表达盒包含人CMV-IE启动子，随后是牛生长激素(BGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。细菌增殖由pUC ori复制子驱动，而卡那霉素抗性基因(Kan R)由小的真核启动子驱动。在质粒骨架内，pUC ori复制、KanR表达盒和CMV-IE启动子驱动的表达盒均处于相同方向。但是，与pcDNA3.1载体中观察到表达水平相比，在pVax-1载体中观察到核心抗原表达的明显减少。
采用几种策略来改善蛋白表达：(1)将整个pUCori-KanR盒逆转为逆时针方向(pVD-core)；以及(2)改变KanR基因的密码子使用，并且用来自pcDNA3.1的Amp启动子置换Kan启动子(pDK-core)。两种策略均恢复核心抗原表达，但是pDK载体的核心抗原表达最高，该载体包含密码子调整的Kan R基因、AmpR启动子(代替KanR启动子)和逆向的pUCori-KanR盒。
将如图25G所示的4个不同的HBV核心/pol抗原优化表达盒引入pDK质粒骨架中以测试图25A-25C中说明的3种表达策略中的每一种。利用核心和pol特异性抗体通过蛋白印迹分析在体外测试质粒的核心和pol抗原表达。当核心和pol抗原由分别的载体，即单独的DNA载体pDK-core和pDK-pol编码时，获得细胞和分泌的核心和pol抗原的最一致的表达谱。pDK-pol和pDK-core载体的示意图分别在图26A和26B中示出。
实施例2.使用TriGrid递送系统(TDS-IM)设备的基于核酸的生物药物的电穿孔介导的肌肉内给药
可以通过使用如本文提供的示例性设备，例如TriGrid递送系统(TDS-IM)模型II，增强受试者的上肢或下肢的骨骼肌中的核酸序列的细胞内递送。在一些实施方案中，TDS-IM设备与批准可与TDS-IM设备一起进行研究使用的药剂联用。在一示例性实施方案中，批准的药剂是核酸，即，DNA或RNA。在一些实施方案中，TDS-IM设备的使用仅限于有需要的受试者。在一些实施方案中，TDS-IM设备的使用仅限于参与电穿孔介导的肌肉内核酸递送的开放临床试验的受试者。
为了启动给药系统，将设备的主电源连接至刺激器，并且将系统电池充足电以供使用。打开主电源开关，并且按下前面板电源按钮。将施加器连接至施加器连接器。施加器电源指示灯亮起，确认施加器正确连接。一旦系统完成所有自检，将显示开始屏幕。按下OK按钮以继续程序给药。
为了将注射器插入TDS药筒，从注射器上取下注射器盖，并且将注射器凸缘与TDS药筒注射器装载口对齐。注射器应当卡入到位并且完全固定在TDS盒中。一旦装入注射器，在脉冲刺激器上按下OK按钮以继续。药筒盖应当保持固定在药筒上直至将药筒装入施加器中。
为了将装有注射器的药筒插入施加器中，将药筒与施加器对齐，并使药筒注射器装载口朝上。当将药筒插入施加器中时，药筒自动拉至施加器中的完全装载位置。刺激器中指示成功装载药筒。一旦装载药筒，将施加器放回其托架，并且选择受试者的适当注射部位。在一些实施方案中，肌肉内核酸递送的注射部位是距肩峰突边缘(肩骨)以下约三指宽度的内侧三角肌。在一示例性实施方案中，内侧三角肌的注射深度为约0.75”–1.25”(19–30mm)。在一些实施方案中，肌肉内核酸递送的注射部位是大约位于髋部和膝盖之间中点的股外侧肌肉(大腿外侧)。在一示例性实施方案中，股外侧肌的注射深度为约1.0”–1.5”(25–38mm)。一旦选择注射部位，按下施加器深度选择按钮，然后按下与注射部位/深度相对应的注射深度选择按钮。在一些实施方案中，注射深度选择指示器变为常亮，确认选择的注射深度。在一些实施方案中，右侧的深度选择按钮对应于更深的注射深度。在一实施方案中，其中要改变初始选择的注射部位，按下与另一注射深度对应的选择按钮，并且在选择注射深度屏幕返回时选择另一注射深度。
为了开始通过TDS-IM设备向受试者给药已批准的药剂，取下并丢弃药筒盖。将设备与目标注射部位对齐并用力按压。将设备牢牢按在目标注射部位上时，施加器放置指示器的所有4个条均点亮，并且程序倒数计时器点亮“8”秒，指示给药程序中剩余的时间。在持续保持压力的同时，按下施加器触发器以待给药。当程序倒数计时器到达“0”时，递送电刺激。一旦完成给药程序，程序完成指示器亮起，并且可以从注射部位取出设备。直到程序完成或程序故障指示器亮起，才可以从注射部位取出设备。在一些实施方案中，其中设备在给药程序中检测到问题，设备中止给药程序并点亮程序故障指示器。在一示例性实施方案中，其中设备中止给药程序并且迅速将设备从受试者移开，设备的刺激器显示器提供进一步的指示。
为了在完成向有需要的受试者给药之后从施加器弹出药筒，按下位于刺激器上的弹出按钮。施加器自动将药筒推进至可以手动从施加器取出的位置。一旦药筒停止移动，可以抓住如箭头所示的药筒侧面，将药筒从施加器拉出。去除药筒之后，可以通过检查注射器柱塞位置来验证完全注射的完成。要关闭设备，将施加器置于皮套中，并且按下前面板电源按钮5秒。
实施例3.对小鼠和非人灵长类的TDS-IM电穿孔
TriGrid递送系统肌肉内(TDS-IM)电穿孔技术用来增强基于DNA的构建体在肌肉组织中的递送。用于肌肉内(IM)递送的TriGrid电极包含4个以两个等边三角形排列的电极以形成围绕中心注射针的菱形(图22)。将药剂递送和电场传播整合至单个设备中可确保电穿孔效应的诱导发生在药剂分布的部位，并且允许在单个步骤中注射质粒构建体和施加电脉冲。以这种方式，以高效且可重复的方式实现质粒DNA的IM递送。
将每种动物模型的TriGrid电极阵列缩放至将DNA质粒(如实施例1中制备的那些)高效递送至所选肌肉，无论大小和上覆组织特征。缩放用于每种动物模型的主要电穿孔设备参数有TriGrid大小(即，电极间距)、施加的电压(250V/cm，其中cm是TriGrid大小)、电极直径和电极穿透深度。对设备的次要适应措施包括注射器体积、质粒DNA体积和皮下注射针规格/长度的变化。
利用TDS-IM v1.0设备进行小鼠研究，该设备使用电极之间有2.5mm间距的电极阵列。电极阵列大小的这种调整是为了适应小鼠肌肉的较小尺寸。图23A示出适用于小鼠模型的TDS-IM v1.0 TriGrid版本。非GLP猴研究也用TDS-IM v1.0设备进行，但是具有6mm的电极阵列间距。图23B示出适用于非人灵长类(NHP)模型的TDS-IM v1.0TriGrid版本。
GLP猴研究中使用的设备是TDS-IM v2.0设备，其也打算用于人临床研究。这个设备具有6mm的电极间距以及与TDS-IM v1.0设备相同的激活条件。TDS-IM v2.0设备的电极材料与上述NHP研究中使用的TDS-IM v1.0设备相同，但是用于给药的药筒支撑结构和注射器不同。而且，人和非人灵长类的插入深度不同。因此，TDS-IM v2.0设备配有垫片以便适合TDS-IM v2.0设备用于小得多的NHP肌肉。图24示出适用于非人灵长类(NHP)模型的TDS-IMv2.0 TriGrid版本。
在每个动物研究中，在电穿孔程序给药之前，将动物麻醉以固定它们。利用局部骨解剖标志作为参考点定位给药部位，并且用电动理发器，然后用无菌棉签，将所选部位的毛发去除。将TDS-IM阵列经皮插入所选肌肉，菱形构型的长轴方向与肌肉纤维平行。电极插入之后，开始注射以将DNA分布在肌肉中。完成IM注射之后，以10％占空比局部施加250V/cm的电场，持续400ms的总持续时间(即，在400ms的持续时间中总计施加40ms的电压)。一旦电穿孔程序完成，将TriGridTM阵列移走并使动物恢复。每个TDS-IM版本和/或动物模型的可变组件如下文表1和表2所示。
表1：TDS-IM版本和TriGrid详细信息
Figure BDA0002637888190000601
表2:TDS-IM版本和脉冲刺激器详细信息
Figure BDA0002637888190000611
实施例4.对人的TDS-IM电穿孔
将TDS-IM v2.0设备用于临床研究。该设备与用于GLP猴的设备基本上相同。人和非人灵长类的插入深度不同。因此，TDS-IM v2.0设备配有垫片以便适合TDS-IM v2.0设备用于小得多的NHP肌肉。刺激条件与用于GLP猴的刺激条件基本上相同，除了穿透深度为约19mm，而不是GLP猴中的9mm。
虽然本文示出和描述了本公开的优选实施方案，但是本领域技术人员会清楚这类实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员现在会想到许多变化、改变和取代而不背离本公开。应当理解本文所述实施方案的各种替代方案，或者本文所述这些实施方案或方面中的一个或多个的组合可以用于实施本公开。所附权利要求界定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物。
序列表
<110> 杨森科学爱尔兰无限公司
艾科医疗系统公司
<120> 乙型肝炎病毒(HBV)疫苗的递送方法和装置
<130> 688097-405WO1
<150> PCT/US2017/067269
<151> 2017-12-19
<150> US 62/607,430
<151> 2017-12-19
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV truncated core antigen gene
<400> 1
gacatcgacc cttacaagga gttcggcgcc agcgtggaac tgctgtcttt tctgcccagt 60
gatttctttc cttccattcg agacctgctg gataccgcct ctgctctgta tcgggaagcc 120
ctggagagcc cagaacactg ctccccacac cataccgctc tgcgacaggc aatcctgtgc 180
tggggggagc tgatgaacct ggccacatgg gtgggatcga atctggagga ccccgcttca 240
cgggaactgg tggtcagcta cgtgaacgtc aatatgggcc tgaaaatccg ccagctgctg 300
tggttccata ttagctgcct gacttttgga cgagagaccg tgctggaata cctggtgtcc 360
ttcggcgtct ggattcgcac tccccctgct tatcgaccac ccaacgcacc aattctgtcc 420
accctgcccg agaccacagt ggtc 444
<210> 2
<211> 148
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV truncated core antigen
<400> 2
Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser
35 40 45
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
50 55 60
Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser
65 70 75 80
Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile
85 90 95
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
100 105 110
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
115 120 125
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu
130 135 140
Thr Thr Val Val
145
<210> 3
<211> 2529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV pol antigen gene
<400> 3
atgcccctgt cttaccagca ctttagaaag cttctgctgc tggacgatga agccgggcct 60
ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120
ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180
gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240
aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300
gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360
aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420
tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480
gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540
catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600
tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660
agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720
ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780
ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840
gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900
gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960
ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020
catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080
aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140
cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200
agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260
agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320
ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380
ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440
agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500
ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560
ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620
ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680
cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740
ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800
ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860
aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920
ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980
atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040
tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100
gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160
gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220
ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280
ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340
ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400
ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460
agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520
cggcctcca 2529
<210> 4
<211> 843
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV pol antigen
<400> 4
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asn Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Glu Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His
180 185 190
Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser
195 200 205
Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln Ser Gln Leu Arg Lys Ser Arg Leu Gly
210 215 220
Leu Gln Pro Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Pro Phe Gly
245 250 255
Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn Thr Ala Ser Ser Ser
260 265 270
Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser His
275 280 285
Leu Ser Thr Ser Lys Arg His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu
290 295 300
His Asn Ile Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Val
305 310 315 320
Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp
325 330 335
Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys
340 345 350
Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg
355 360 365
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr
370 375 380
Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr
385 390 395 400
Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr
405 410 415
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
420 425 430
Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
435 440 445
Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn
450 455 460
Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp
465 470 475 480
Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr
485 490 495
Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe
500 505 510
Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln
515 520 525
Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys
530 535 540
Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asn Asn Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val
545 550 555 560
Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser
565 570 575
Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser
580 585 590
Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln
595 600 605
Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val
610 615 620
Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu
625 630 635 640
Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro
645 650 655
Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr
660 665 670
Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala
675 680 685
Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asn Ala Thr Pro Thr
690 695 700
Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val
705 710 715 720
Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Gln Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala
725 730 735
Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val
740 745 750
Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala
755 760 765
Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu
770 775 780
Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro
785 790 795 800
Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr
805 810 815
Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe
820 825 830
Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
835 840
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cystatin S signal peptide coding sequence
<400> 5
atggctcgac ctctgtgtac cctgctactc ctgatggcta ccctggctgg agctctggcc 60
agc 63
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cystatin S signal peptide sequence
<400> 6
Met Ala Arg Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Leu Met Ala Thr Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ala Leu Ala Ser
20
<210> 7
<211> 586
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hCMV promoter sequence
<400> 7
tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 60
ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 120
aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 180
actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 240
caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 300
tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 360
ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 420
cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 480
tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 540
atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctc 586
<210> 8
<211> 378
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> triple enhancer regulatory sequence
<400> 8
ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 60
gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 120
aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 180
actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctagt tctctcgtta 240
acttaatgag acagatagaa actggtcttg tagaaacaga gtagtcgcct gcttttctgc 300
caggtgctga cttctctccc ctgggctttt ttctttttct caggttgaaa agaagaagac 360
gaagaagacg aagaagac 378
<210> 9
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bla promoter sequence
<400> 9
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 60
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagt 99
<210> 10
<211> 671
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC ori sequence
<400> 10
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60
ttgcaaacaa aaaaaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120
ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 180
tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240
ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300
tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360
cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420
gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480
ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540
gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600
agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660
tttgctcaca t 671
<210> 11
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bGH polyadenylation signal sequence
<400> 11
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 12
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kan R gene
<400> 12
atgattgagc aagatggtct tcacgctggc tcgccagctg cgtgggtgga acgcctgttt 60
ggttatgatt gggcgcagca gactattgga tgttccgacg cggctgtatt tcggctgtct 120
gctcagggtc gccccgtgct gtttgtgaag acggatttgt ctggcgcatt aaatgagtta 180
caggacgagg cggctcgtct gagttggttg gccaccaccg gcgtgccctg cgccgcagtg 240
ctggatgtcg tgacagaagc aggccgcgat tggctccttc tcggcgaagt gccgggccag 300
gacctgctca gcagccactt ggcaccggca gaaaaagttt ctatcatggc cgacgccatg 360
cgtcgtcttc acactctcga tccggccacg tgcccctttg accaccaggc caagcatcgt 420
attgaacgtg cgcgtactcg gatggaagca ggtttagtag accaggacga tttggatgag 480
gaacatcaag gcctggcccc ggctgaactg tttgcgcgct taaaagcgtc gatgccagat 540
ggcgaagatt tggtagtcac ccatggagat gcgtgtttgc caaacatcat ggttgaaaat 600
ggccgcttct caggctttat tgactgtggg cgcctgggtg ttgccgaccg ctatcaagat 660
attgcgctcg caactcgtga catcgctgaa gagctgggcg gagaatgggc tgaccgtttc 720
ctggtactgt atggcattgc agcgcccgat tcccaacgca tcgcatttta tcgtctgctg 780
gatgagtttt tctaa 795
<210> 13
<211> 264
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kan R protein
<400> 13
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1 5 10 15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
20 25 30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
35 40 45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
50 55 60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
85 90 95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
100 105 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
115 120 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145 150 155 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
165 170 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
180 185 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
195 200 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
210 215 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
245 250 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
260
<210> 14
<211> 149
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV truncated core antigen
<400> 14
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val
145
<210> 15
<211> 447
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV truncated core antigen gene
<400> 15
atggacatcg acccttacaa ggagttcggc gccagcgtgg aactgctgtc ttttctgccc 60
agtgatttct ttccttccat tcgagacctg ctggataccg cctctgctct gtatcgggaa 120
gccctggaga gcccagaaca ctgctcccca caccataccg ctctgcgaca ggcaatcctg 180
tgctgggggg agctgatgaa cctggccaca tgggtgggat ccaatctgga ggaccccgct 240
tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300
ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360
tccttcggcg tctggatccg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420
tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447
<210> 16
<211> 2529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV pol antigen gene
<400> 16
atgcccctgt cttaccagca ctttagaaag ctgctgctgc tggacgatga agccgggcct 60
ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120
ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180
gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240
aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300
gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360
aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420
tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480
gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540
catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600
tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660
agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720
ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780
ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840
gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900
gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960
ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020
catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080
aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140
cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200
agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260
agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320
ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380
ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440
agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500
ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560
ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620
ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680
cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740
ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800
ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860
aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920
ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980
atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040
tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100
gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160
gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220
ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280
ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340
ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400
ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460
agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520
cggcctcca 2529
<210> 17
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hCMV promoter sequence
<400> 17
accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60
agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300
atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 600
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 660
ccgggaccga tccagcctcc gcgg 684
<210> 18
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunoglobulin secretion signal coding sequence
<400> 18
atggagttcg gcctgtcttg ggtctttctg gtggcaatcc tgaagggcgt gcagtgtgaa 60
gtgcagctgc tggagtctgg a 81
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunoglobulin secretion signal sequence
<400> 19
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
20 25
<210> 20
<211> 996
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV core-pol fusion antigen sequence
<400> 20
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Ala Gly Ala Gly Met Pro Leu Ser Tyr Gln His
145 150 155 160
Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu
165 170 175
Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu
180 185 190
Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys
195 200 205
Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn
210 215 220
Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro Asn Ile His Leu Gln Glu Asp
225 230 235 240
Ile Ile Asn Arg Cys Glu Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu
245 250 255
Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val
260 265 270
Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu
275 280 285
His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu
290 295 300
Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser
305 310 315 320
Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Arg
325 330 335
Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln
340 345 350
Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln
355 360 365
Ser Gln Leu Arg Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Pro Gln Gln Gly His
370 375 380
Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg Ser Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val
385 390 395 400
His Pro Thr Thr Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly
405 410 415
His Thr Thr Asn Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser
420 425 430
Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg His
435 440 445
Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Ile Pro Pro Asn Ser
450 455 460
Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Val Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln
465 470 475 480
Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val
485 490 495
Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His His
500 505 510
Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu
515 520 525
Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp
530 535 540
Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe
545 550 555 560
Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu
565 570 575
Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu
580 585 590
His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser
595 600 605
Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln
610 615 620
His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr
625 630 635 640
Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu
645 650 655
Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val
660 665 670
Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser
675 680 685
Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asn
690 695 700
Asn Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe
705 710 715 720
Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro
725 730 735
Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val
740 745 750
Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile
755 760 765
Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys
770 775 780
Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr
785 790 795 800
Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser
805 810 815
Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys
820 825 830
Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys
835 840 845
Gln Val Phe Ala Asn Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly
850 855 860
His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr
865 870 875 880
Ala Gln Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys
885 890 895
Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser
900 905 910
Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr
915 920 925
Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser
930 935 940
Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg
945 950 955 960
Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro
965 970 975
Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala
980 985 990
Trp Arg Pro Pro
995
<210> 21
<211> 1023
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBV core-pol fusion antigen sequence with Ig signal sequence
<400> 21
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Met Asp Ile Asp Pro
20 25 30
Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser
35 40 45
Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu
50 55 60
Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr
65 70 75 80
Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala
85 90 95
Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val
100 105 110
Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu
115 120 125
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu
130 135 140
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
145 150 155 160
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
165 170 175
Ala Gly Ala Gly Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu
180 185 190
Leu Leu Asp Asp Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Ala Asp Glu Gly Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly
210 215 220
Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr
225 230 235 240
Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr
245 250 255
Pro Ser Phe Pro Asn Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys
260 265 270
Glu Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys
275 280 285
Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro
290 295 300
Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His
305 310 315 320
Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile
325 330 335
Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro
340 345 350
Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr
355 360 365
Ser Thr Arg His Gly Asp Glu Ser Phe Cys Gln Gln Ser Ser Gly Ile
370 375 380
Leu Ser Arg Ser Pro Val Gly Pro Cys Leu Gln Ser Gln Leu Arg Lys
385 390 395 400
Ser Arg Leu Gly Leu Gln Pro Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg Gln
405 410 415
Gln Gly Arg Ser Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg
420 425 430
Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn Thr
435 440 445
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala
450 455 460
Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg His Ser Ser Ser Gly His
465 470 475 480
Ala Val Glu Leu His Asn Ile Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser
485 490 495
Glu Gly Pro Val Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys
500 505 510
Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp
515 520 525
Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg
530 535 540
Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro
545 550 555 560
His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser
565 570 575
Arg Gly Asn Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu
580 585 590
Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu
595 600 605
Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met
610 615 620
Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg
625 630 635 640
Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Met Gln
645 650 655
Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu
660 665 670
Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile
675 680 685
Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe
690 695 700
Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala
705 710 715 720
Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asn Asn Val Val Leu Gly
725 730 735
Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn
740 745 750
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg
755 760 765
Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly
770 775 780
Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg
785 790 795 800
Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile
805 810 815
Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro
820 825 830
Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr
835 840 845
Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu
850 855 860
Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asn
865 870 875 880
Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg
885 890 895
Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Gln Leu Leu Ala
900 905 910
Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp
915 920 925
Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
930 935 940
Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val
945 950 955 960
Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly
965 970 975
Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg
980 985 990
Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp
995 1000 1005
Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
1010 1015 1020
<210> 22
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker coding sequence
<400> 22
gccggagctg gc 12
<210> 23
<211> 248
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoAI gene fragment
<400> 23
ttggccgtgc tcttcctgac gggtaggtgt cccctaacct agggagccaa ccatcggggg 60
gccttctccc taaatccccg tggcccaccc tcctgggcag aggcagcagg tttctcactg 120
gccccctctc ccccacctcc aagcttggcc tttcggctca gatctcagcc cacagctggc 180
ctgatctggg tctcccctcc caccctcagg gagccaggct cggcatttcg tcgacaagct 240
tagccacc 248
<210> 24
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyadenylation signal sequence
<400> 24
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct 130

Claims (92)

1.一种装置，其用于将HBV疫苗受控递送至有需要的受试者的预定组织部位，所述装置包括：
药筒组件，其包括外部药筒、内部药筒、容纳HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在外部药筒内，并且配置为接收所述储存器；
施加器，其包括药筒组件接收空间、针头接口和插入检测器，其中所述插入检测器感测储存器在储存器容纳空间中的装载；
至少一个联锁，其中所述联锁促进HBV疫苗给药程序的正确执行；
至少一个注射孔，通过其给药HBV疫苗；
多个穿透电极，其以相对于孔的预定空间关系排列；
电场发生器，其用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及
受控能量源，其足以以预定速度将预定量的HBV疫苗从储存器通过孔转移至受试者的预定部位，
其中所述HBV疫苗包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，其中所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，并且其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中。
2.一种试剂盒，其用于将HBV疫苗受控递送至有需要的受试者的预定组织部位，所述试剂盒包括：
(i)HBV疫苗，其包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，其中所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，并且其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；以及
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中；
(ii)装置，其包括：
药筒组件，其包括外部药筒、内部药筒、HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在外部药筒内，并且配置为接收所述储存器；
施加器，其包括药筒组件接收空间、针头接口和插入检测器，其中所述插入检测器感测储存器在储存器容纳空间中的装载；
至少一个联锁，其中所述联锁促进HBV疫苗给药程序的正确执行；
至少一个注射孔，通过其给药HBV疫苗；
多个穿透电极，其以相对于孔的预定空间关系排列；
电场发生器，其用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及
受控能量源，其足以以预定速度将预定量的HBV疫苗从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。
3.权利要求1的装置或权利要求2的试剂盒，其中所述电极是多个细长电极。
4.权利要求1的装置或权利要求2的试剂盒，其中所述联锁防止药筒功能的意外致动。
5.权利要求1、3和4中任一项的装置或者权利要求2-4中任一项的试剂盒，其中至少一个联锁选自机械联锁、光发射器/收集器、药筒后膛、力联锁、对齐引导器和展开盾、扳机锁和安全开关。
6.权利要求1和3-5中任一项的装置或者权利要求2-5中任一项的试剂盒，其中所述装置包含至少两组联锁，其中第一联锁是机械联锁，并且第二联锁选自光发射器/收集器、药筒后膛、力联锁、对齐引导器和展开盾、扳机锁和安全开关。
7.权利要求5-6中任一项的装置或试剂盒，其中所述机械联锁是储存器联锁。
8.权利要求7的装置或试剂盒，其中所述储存器联锁进一步包括至少一个储存器锁定孔。
9.权利要求5-8中任一项的装置或试剂盒，其中所述药筒后膛通过至少一个储存器锁定孔提供光学视线。
10.权利要求7-9中任一项的装置或试剂盒，其中所述储存器联锁进一步包括从一个或多个药筒表面延伸的突片，其中所述突片确保将储存器正确插入药筒中。
11.权利要求6的装置或试剂盒，其中所述装置进一步包括第三联锁。
12.权利要求11的装置或试剂盒，其中所述第三联锁是力联锁。
13.权利要求12的装置或试剂盒，其中所述力联锁感测施加在受试者的预定组织部位上的力，并且在提供的力不足时防止向受试者给药HBV疫苗。
14.权利要求12-13中任一项的装置或试剂盒，其中所述力联锁进一步在施加器内形成电锁。
15.权利要求1和3-14中任一项的装置或者权利要求2-14中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括储存器的钥匙，其中所述钥匙在储存器的筒上滑动以确保药筒组件内的适当匹配。
16.权利要求5-6中任一项的装置或试剂盒，其中所述展开盾包括至少一个凸缘和至少一个边缘以与受试者的预定组织部位接合，并且将所述装置放置在垂直于针头展开方向的张力中以给药HBV疫苗。
17.权利要求1的装置或权利要求2的试剂盒，其中所述药筒组件进一步包括棒护罩。
18.权利要求5、6和16中任一项的装置或试剂盒，其中所述展开盾包括至少一个孔用于棒护罩的可滑动移动。
19.权利要求1和3-18中任一项的装置或者权利要求2-18中任一项的试剂盒，其中当将药筒组件装载至施加器中时，储存器向前移动以与针头接口配合，并且在给药HBV疫苗时使药筒与注射针接触。
20.权利要求1和3-19中任一项的装置或者权利要求2-19中任一项的试剂盒，其中内部药筒以可滑动的方式相对于外部药筒移动。
21.权利要求1和3-20中任一项的装置或者权利要求2-20中任一项的试剂盒，其中内部药筒在远端与内部药筒盖接合，其中内部药筒盖将电极锁定就位并为棒护罩提供支撑表面。
22.权利要求1的装置或权利要求2的试剂盒，其中所述装置进一步包括至少一个传感器。
23.权利要求22的装置或试剂盒，其中所述传感器选自药筒装载传感器、药筒已装载传感器、药筒力传感器、插入机构位置传感器、插入检测器、光学检测器和电传感器。
24.权利要求23的装置或试剂盒，其中所述药筒装载传感器和药筒已装载传感器形成装载驱动子组件的一部分。
25.权利要求24的装置或试剂盒，其中所述装载驱动子组件进一步包括至少一个药筒导轨和装载发动机。
26.权利要求24-25中任一项的装置或试剂盒，其中所述装载驱动子组件还具有与小齿轮组件的连接，所述小齿轮组件通过外部药筒基座上的至少一个齿条将药筒组件拉入药筒组件接收空间。
27.权利要求26的装置或试剂盒，其中所述小齿轮组件接合外部药筒上的齿条。
28.权利要求26-27中任一项的装置或试剂盒，其中所述齿条包括至少一个齿条齿。
29.权利要求26-28中任一项的装置或试剂盒，其中在将药筒组件插入药筒组件接收空间时，第一齿条齿提供触感。
30.权利要求26-29中任一项的装置或试剂盒，其中所述齿条齿提供扭转稳定性。
31.权利要求23-26中任一项的装置或试剂盒，其中所述药筒装载传感器检测药筒组件上的启动标志以启动装载。
32.权利要求23-26中任一项的装置或试剂盒，其中所述药筒已装载传感器检测药筒组件上的启动标志以停止装载。
33.权利要求1和3-32中任一项的装置或者权利要求2-32中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括用于继续药筒装载的继续标志。
34.权利要求23的装置或试剂盒，其中所述插入检测器是光发射器/收集器IR传感器。
35.权利要求22-34中任一项的装置或试剂盒，其中所述传感器检测储存器标签并验证HBV疫苗。
36.一种装置，其用于将HBV疫苗受控递送至受试者的预定组织部位，所述装置包括：
药筒组件，其包括壳体、容纳HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在壳体内，并且配置为接收所述储存器；
施加器，其包括药筒组件接收空间、针头接口和插入检测器，其中所述插入检测器感测储存器在储存器容纳空间中的装载；
至少一个注射孔，通过其给药HBV疫苗；
多个穿透电极，其以相对于孔的预定空间关系排列；
包含孔和壁的电极支撑结构，其中所述电极支撑结构防止电极的意外垂直移动；
电场发生器，其用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及
受控能量源，其足以以预定速度将预定量的HBV疫苗从储存器通过孔转移至受试者的预定部位，
其中所述HBV疫苗包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，其中所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，并且其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，并且
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中。
37.一种试剂盒，其包含：
(i)HBV疫苗，其包含：
第一核酸分子，其包含编码HBV聚合酶抗原的第一多核苷酸，其中所述HBV聚合酶抗原包含与SEQ ID NO:4至少98％相同的氨基酸序列，并且其中所述HBV聚合酶抗原没有逆转录酶活性和RNase H活性；
第二核酸分子，其包含编码截短的HBV核心抗原的第二多核苷酸，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；以及
药学上可接受的载剂，并且
其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子存在于相同核酸分子中或两种不同的核酸分子中；以及
(ii)装置，其包括：
药筒组件，其包括壳体、HBV疫苗的储存器，其中储存器容纳空间包含在壳体内，并且配置为接收所述储存器；
施加器，其包括药筒组件接收空间、针头接口和插入检测器，其中所述插入检测器感测储存器在储存器容纳空间中的装载；
至少一个注射孔，通过其给药HBV疫苗；
多个穿透电极，其以相对于孔的预定空间关系排列；
包含孔和壁的电极支撑结构，其中所述电极支撑结构防止电极的意外垂直移动；
电场发生器，其用于产生可操作地连接至电极的电信号；以及
受控能量源，其足以以预定速度将预定量的HBV疫苗从储存器通过孔转移至受试者的预定部位。
38.权利要求36的装置或权利要求37的试剂盒，其中当电极展开至受试者的预定组织部位时，所述电极支撑结构在位于电极远端区域上的导电接触区域和受控能量源之间提供可操作的连接。
39.权利要求36或38的装置或者权利要求37或38的试剂盒，其中所述电极支撑结构包括至少一个用于电极通过的孔和用于注射针通过的孔。
40.权利要求36和38-39中任一项的装置或者权利要求37-39中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构是位置相对于电极的细长方向垂直的平面支撑结构。
41.权利要求40的装置或试剂盒，其中所述平面支撑结构包括至少一个孔，所述孔配置为允许电极通过预定组织部位。
42.权利要求40-41中任一项的装置或试剂盒，其中所述孔包括至少一个与平面支撑结构垂直排列的管状结构。
43.权利要求40-42中任一项的装置或试剂盒，其中所述平面支撑结构方向与电极垂直。
44.权利要求36和38-43中任一项的装置或者权利要求37-43中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构是自适应电极支撑件。
45.权利要求44的装置或试剂盒，其中所述自适应电极支撑件是压缩弹簧。
46.权利要求45的装置或试剂盒，其中所述压缩弹簧由金属、聚合物或弹性体材料制成。
47.权利要求36和38-46中任一项的装置或者权利要求37-46中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构包括至少一个伸缩管。
48.权利要求36和38-47中任一项的装置或者权利要求37-47中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构还包括棒护罩弹簧。
49.权利要求36的装置或权利要求37的试剂盒，其中所述电极支撑结构还包括至少一个横向支撑构件，所述横向支撑构件通过至少一个任选存在的铰链功能部件连接至电极。
50.权利要求36和38-49中任一项的装置或者权利要求37-49中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构由金属、聚合物、陶瓷、复合材料或可压缩基质材料制成。
51.权利要求50的装置或试剂盒，其中所述可压缩基质材料选自纤维素、泡沫塑料、橡胶聚合物、微孔塑料、泡沫硅氧烷、泡沫聚氯丁二烯和碳泡沫基质。
52.权利要求36和38-51中任一项的装置或者权利要求37-51中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构由不导电材料制成。
53.权利要求36和38-52中任一项的装置或者权利要求37-52中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构由热塑性材料制成。
54.权利要求53的装置或试剂盒，其中所述热塑性材料选自聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、丙烯酸和聚乙烯。
55.权利要求36和38-54中任一项的装置或者权利要求37-54中任一项的试剂盒，其中所述电极支撑结构支撑电极的经皮展开并保持在最多60mm的组织深度。
56.权利要求36和38-55中任一项的装置或者权利要求37-55中任一项的试剂盒，其中所述电极的近端部分是电极接触部，并且位于药筒组件的内部药筒的外部，其中所述电极接触部配置为与施加器上的相应连接电力通信。
57.权利要求56的装置或试剂盒，其中所述电极接触部还包括外部药筒外部接触部。
58.权利要求56-57中任一项的装置或试剂盒，其中所述电极接触部提供与相应电极的导电界面，同时不干扰安装在内部药筒上的电极向前移动。
59.权利要求1、3-36和38-58中任一项的装置或者权利要求2-35和37-58中任一项的试剂盒，其中所述施加器还包括注射驱动组件，其中所述注射驱动组件与药筒组件配合。
60.权利要求1、3-36和38-58中任一项的装置或者权利要求2-35和37-58中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括深度选择按钮。
61.权利要求60的装置或试剂盒，其中所述深度选择按钮选自切换键、开关和滑动开关。
62.权利要求1、3-36和38-58中任一项的装置或者权利要求2-35和37-58中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括多个通道和多个保持柱。
63.权利要求1、3-36和38-58中任一项的装置或者权利要求2-35和37-58中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括插入机构齿轮驱动环。
64.权利要求63的装置或试剂盒，其中所述插入机构齿轮驱动环的旋转将保持柱旋转至通道中。
65.权利要求1、3-36和38-64中任一项的装置或者权利要求2-35和37-64中任一项的试剂盒，其中所述药筒组件是一次性使用的。
66.权利要求1、3-36和38-64中任一项的装置或者权利要求2-35和37-64中任一项的试剂盒，其中所述施加器是多次使用的。
67.权利要求1、3-36和38-66中任一项的装置或者权利要求2-35和37-66中任一项的试剂盒，其中所述施加器进一步包括顶部壳、侧面壳、内部保护壳、前盖和端盖。
68.权利要求1、3-36和38-67中任一项的装置或者权利要求2-35和37-67中任一项的试剂盒，其中所述施加器进一步包括用户界面、程序激活触发器、程序倒数计时器、程序故障指示器或应用放置指示器。
69.权利要求1、3-36和38-68中任一项的装置或者权利要求2-35和37-68中任一项的试剂盒，其中所述装置进一步包括控制器。
70.权利要求1、3-36和38-69中任一项的装置或者权利要求2-35和37-69中任一项的试剂盒，其中所述施加器进一步包括用于连接至控制器的连接器。
71.权利要求69-70中任一项的装置或试剂盒，其中所述控制器进一步包括电场控制器。
72.权利要求1、3-36和38-71中任一项的装置或者权利要求2-35和37-71中任一项的试剂盒，其中所述穿透电极和/或注射孔以至少50mm/秒的速度与预定组织部位接触。
73.权利要求1、3-36和38-71中任一项的装置或者权利要求2-35和37-71中任一项的试剂盒，其中所述穿透电极和/或注射孔以至少500mm/秒的速度与预定组织部位接触。
74.权利要求1、3-36和38-73中任一项的装置或者权利要求2-35和37-73中任一项的试剂盒，其中所述HBV疫苗能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答；优选地，所述HBV疫苗能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型B、C和D的T细胞应答；并且更优选地，所述HBV疫苗能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8 T细胞应答。
75.权利要求74的装置或试剂盒，其中所述第一非天然存在的核酸分子存在于第一质粒DNA载体中，并且所述第二非天然存在的核酸分子存在于第二质粒DNA载体中。
76.权利要求75的装置或试剂盒，其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自包含复制起点，抗生素抗性基因，并且从5’端至3’端，各自包含启动子序列、增强子序列、信号肽编码序列、第一多核苷酸序列或第二多核苷酸序列、以及多腺苷酸化信号序列。
77.权利要求76的装置或试剂盒，其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因，其具有多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:12至少90％相同，优选与SEQ ID NO:12100％相同。
78.权利要求77的装置或试剂盒，其中所述HBV疫苗包含：
a)第一质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含：
包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列的启动子序列，包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列的增强子序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的信号肽编码序列，包含SEQ ID NO:3的多核苷酸序列的第一多核苷酸序列，以及包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列的多腺苷酸化信号序列；
b)第二质粒DNA载体，其从3’-端至5’-端包含：
包含SEQ ID NO:7的多核苷酸序列的启动子序列，包含SEQ ID NO:8的多核苷酸序列的调节序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的信号肽编码序列，包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第二多核苷酸序列，以及包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列的多腺苷酸化信号序列；以及
c)药学上可接受的载剂，
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体各自进一步包含具有SEQ ID NO:12的多核苷酸序列的卡那霉素抗性基因，以及具有SEQ ID NO:10的多核苷酸序列的复制起点，并且
其中所述第一质粒DNA载体和所述第二质粒DNA载体在相同组合物中或在两种不同的组合物中。
79.权利要求78的装置或试剂盒，其中所述HBV疫苗不含编码选自以下的HBV抗原的核酸分子：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原，也不含选自以下的HBV抗原：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、HBV包膜(Env)抗原和HBV L蛋白抗原。
80.一种在有需要的受试者中诱导针对HBV感染的免疫应答的方法，所述方法包括利用权利要求1、3-36和38-79中任一项的装置，或者权利要求2-35和37-79中任一项的试剂盒，将HBV疫苗递送至所述受试者的预定组织部位，其中所述受试者优选是患有慢性HBV感染的人。
81.一种治疗有需要的受试者的HBV诱导的疾病的方法，所述方法包括利用权利要求1、3-36和38-79中任一项的装置，或者权利要求2-35和37-79中任一项的试剂盒，将HBV疫苗递送至所述受试者的预定组织部位，优选地其中所述受试者是人受试者，并且其中所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
82.权利要求80或81的方法，其中所述预定组织部位位于所述受试者的骨骼肌中。
83.权利要求82的方法，其中所述受试者的骨骼肌是内侧三角肌。
84.权利要求83的方法，其中在内侧三角肌处的注射深度是约3–30mm。
85.权利要求82的方法，其中所述受试者的骨骼肌是股外侧肌肉。
86.权利要求85的方法，其中在股外侧肌肉处的注射深度是约3–38mm。
87.权利要求80-86中任一项的方法，其中可操作地连接至电极的电信号包括100V/cm-400V/cm，优选250V/cm的电场强度。
88.权利要求87的方法，其中可操作地连接至电极的电信号具有50-200V，优选约150V的电压。
89.权利要求88的方法，其中可操作地连接至电极的电信号具有0.5-5A/sec，优选0.6-4A/sec，更优选0.16A/sec的电流。
90.权利要求89的方法，其中可操作地连接至电极的电信号具有约1-10个电脉冲，优选6个脉冲。
91.权利要求90的方法，其中可操作地连接至电极的电信号具有30-50毫秒，优选40.8毫秒的有效持续时间，并且在200-500毫秒，优选约370毫秒的总持续时间内施加所述有效持续时间。
92.权利要求1、3-36和38-79中任一项的装置或者权利要求2-35和37-79中任一项的试剂盒，用于诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答，更具体地用于治疗HBV诱导的疾病，其中所述装置适用于有需要的受试者中，优选人中HBV疫苗的电穿孔。
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