CN111867596A

CN111867596A - 用于治疗IgE驱动的B细胞疾病的氯氮平

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Publication number: CN111867596A
Application number: CN201980011247.4A
Authority: CN
Inventors: S·乔利斯; H·阿什拉菲安; D·麦克黑尔
Original assignee: Zarodex Treatment Co ltd
Current assignee: Zarodex Treatment Co ltd
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2020-10-30
Also published as: WO2019149863A1; JP2021513523A; US20210137941A1; EP3746084A1

Abstract

本发明涉及化合物氯氮平及其主要代谢物去甲氯氮平和其前药以及药学上可接受的盐和溶剂化物，用于治疗或预防致病性的IgE驱动的B细胞疾病。本发明还提供了包含所述化合物的药物组合物。

Description

用于治疗IgE驱动的B细胞疾病的氯氮平

技术领域

本发明涉及化合物和含有这种化合物的药物组合物，其用于治疗或预防致病性的IgE驱动的B细胞疾病。

发明背景

与本发明相关的化合物被称为氯氮平，即，具有以下结构的化合物：

氯氮平有一种主要的活性代谢物，称为去甲氯氮平(norclozapine)(Guitton等人,1999)，其具有如下的结构：

氯氮平已知用于治疗难治性精神分裂症。精神分裂症是一种持久的主要精神疾病，影响了大约1％的人口。除了衰弱性精神症状外，它还具有严重的社会心理后果，失业率高达80-90％，预期寿命减少10-20年。精神分裂症患者之中的自杀率远高于普通人群，约有5％的被诊断为精神分裂症的患者自杀。

氯氮平是一种重要的治疗药物，并已列入WHO的基本药物清单。它是一种二苯并二氮杂

类非典型抗精神病药，并且是在英国自1990年以来对30％的难治性精神分裂症(TRS)患者的仅有的许可疗法。它在减轻精神分裂症患者中阳性和阴性症状方面均显示卓越的功效，并对约60％的既往治疗顽固性患者有效，显著降低了自杀风险。英国国家健康与临床优化研究所(NICE)指南建议，患有精神分裂症且对至少2种抗精神病药物(其中至少一种应为非氯氮平的第二代抗精神病药物)治疗无足够响应的成人应给予氯氮平治疗。

氯氮平与严重的不良反应有关，包括癫痫发作、肠梗阻、糖尿病、血栓栓塞、心肌病和心源性猝死。它还可引起粒细胞缺乏症(累计发生率为0.8％)；因此需要强化的基于集中注册的监测系统，以支持其安全使用。在英国，有三个电子注册处(www.clozaril.co.uk、www.denzapine.co.uk和www.ztas.co.uk)，对每个氯氮平供应商都有一个。最初18周每周必须进行强制性的血液检测，然后在19-52周每两周检测一次，并且此后每月检测一次，以绝对中性粒细胞数(ANC)低于1500/μL作为治疗中断的“红旗”截断值。

2015年，美国食品和药物管理局(FDA)合并和替换了美国现有的6个氯氮平注册处，将来自超过50,000名处方医生、28,000家药店和90,000份患者记录的数据合并为一个所有氯氮平产品的共享注册处，即氯氮平风险评估和缓解策略(REMS)程序(www.clozapinerems.com)。引入了一些变化，将中断氯氮平治疗的绝对中性粒细胞数(ANC)阈值降低至一般情况下低于1000/μL，在良性种族性中性粒细胞减少症(BEN)中为低于500/μL。对于出现中度至重度中性粒细胞减少症的患者，处方者有更大的灵活性来根据患者的具体情况做出继续或恢复治疗的决定，从而使患者从使用氯氮平中获得最大的益处。

与普通人群相比，精神分裂症与增加3.5倍的早死几率相关联。这往往是由于身体疾病，特别是慢性阻塞性肺病(COPD)(标准死亡比(SMR)9.9)、流感和肺炎(SMR 7.0)。尽管氯氮平可降低严重精神分裂症的总体死亡率，但越来越多的证据将氯氮平与升高的肺炎相关入院率和死亡率联系在一起。在对33,024名精神分裂症患者的分析中，第二代抗精神病药物与需要住院治疗的肺炎风险之间的关联度最高的是氯氮平，调整后的风险比为3.18，与双重抗精神病药物使用相关的风险进一步显著增加(Kuo等人,2013)。尽管喹硫平、奥氮平、佐替平和利培酮与轻微增加的风险相关，但没有明确的剂量依赖关系，而且在30天以上的时间点风险不显著(Leung等人,2017；Stoecker等人,2017)。

在一项对施用氯氮平的患者进行的为期12年的研究中，104名患者在研究期间有248次入院治疗。最主要的入院类型是治疗肺部(32.2％)或胃肠道(19.8％)疾病。最常见的肺部诊断是肺炎(占肺部相关入院病例的58％)，且这些入院病例与黑框警告(boxedwarnings)无关(Leung等人,2017)。

在进一步的嵌套病例对照研究中，发现氯氮平是仅有的对于复发性肺炎具有明确的剂量依赖性风险的抗精神病药物，这种风险在再次接触氯氮平时增加(Hung等人,2016)。

虽然这些研究强调了在施用氯氮平的患者中因肺炎和败血症而入院或死亡的人数多于其他抗精神病药物，但对极端结局(死亡和肺炎)的关注可能低估了更不严重但更频繁的感染的负担，诸如鼻窦炎、皮肤、眼睛、耳朵或喉咙的感染，以及社区获得的和治疗的肺炎。感染可能是导致精神分裂症控制和氯氮平水平不稳定的重要额外因素。

已经提出了肺炎增加的各种机制，包括吸入、流涎和吞咽功能受损并伴有食管扩张、运动不足和粒细胞缺乏症。此外，吸烟在整个精神分裂症患者群体中非常普遍，并且是肺炎发病率和严重程度的独立危险因素(Bello等人,2014)。

已经进行了少量关于氯氮平免疫调节性质的研究：

Hinze-Selch等人(Hinze-Selch等人,1998)将氯氮平描述为一种具有免疫调节性质的非典型抗精神病药物。该文报道，接受氯氮平治疗6周的患者，血清中IgG的浓度显著增加，但没有发现对IgA、IgM的浓度和自身抗体的模式的显著影响。

Jolles等人(Jolles等人,2014)报道了作为抗体缺乏的筛查试验的“计算的球蛋白(CG)”这一参数的研究。从威尔士的13个实验室选取了具有许多各种不同背景的患者。在初级保健的CG筛查中确定的具有显著抗体缺乏(IgG<4g/L，参考范围6-16g/L)的患者中，有13％的样本在申请单上提到使用氯氮平。然而，抗体缺乏并不是英国国家药品集(BNF)中列出的氯氮平的副作用，抗体测试也不构成目前氯氮平监测方案的一部分。

Lozano等人的另一项研究(Lozano等人,2016)报道了与对照组相比，研究组(由施用氯氮平至少5年的精神科门诊患者组成)的平均血浆IgM水平总体下降，也报道了两组之间在IgA、IgG、绝对中性粒细胞数和白细胞计数方面没有发现差异。

因此，鉴于已报道的这些喜忧参半的结果，氯氮平的免疫调节性质及其对免疫球蛋白水平、特别是IgE的影响既不明确，也不为本领域所理解。

致病性的IgE免疫球蛋白驱动的疾病是由抗体分泌细胞(“ASC”，浆母细胞和浆细胞全体，这些是成熟B细胞的类型)分泌的自身抗体(包括IgE)引起的。这些抗体靶向于在许多这些疾病中已被鉴定的引起过激响应的各种外源性抗原。由于病理过程是由特异性免疫球蛋白(其只占总免疫球蛋白的一小部分)的分泌所驱动的，因此很少出现总免疫球蛋白的增加。IgE抗体的分泌来自ASC，ASC的产生继发于类别转换和非转换的记忆B细胞(这些是成熟B细胞的进一步的类型)的分化。各种不同的证据表明，这是一个高度动态的过程，几乎不断地发生分化。

类别转换记忆B细胞是指这类成熟B细胞，其对重复的抗原识别作出响应，用IgG、IgA或IgE取代了其最初的编码膜受体[IgM]。这种类别转换过程是正常体液免疫记忆的一个重要特征，既有“组成性”的(其通过由长寿命浆细胞(long-lived plasma cell)分泌预先存在的保护性抗体而实现)，也有“反应性”的，反映了再次暴露于抗原和重新激活记忆B细胞，其要么分化为浆细胞以产生抗体，要么分化为生发中心B细胞，使抗体应答进一步多样化和亲和力成熟。在免疫应答早期，浆细胞衍生自未转换的活化B细胞，并分泌IgM。在免疫应答的后期，浆细胞来源于参与生发中心(响应于抗原激发而在次级淋巴滤泡组织中形成的区域)的活化B细胞，其经过免疫球蛋白体细胞高频突变，发生了类别转换(保留抗原特异性但转换免疫球蛋白亚型)和B细胞受体(BCR)多样化。这一成熟过程使得对抗原具有高亲和力的BCR生成，并产生不同的免疫球蛋白亚型(即，把原来表达的IgM和IgD转换为IgG、IgA或IgE亚型)(Budeus等人,2015；Kracker和Durandy,2011)。

在次级淋巴器官中的生发中心反应之后的类别转换重组(CSR)提供了抗原致敏/接触的自身反应性记忆B细胞，和自身免疫的发展和/或维持的核心途径。类别转换为IgG或IgA的后生发中心B细胞在外周可进入其他解剖区室，诸如中枢神经系统，以经历进一步的亲和力成熟(例如在多发性硬化症的三级淋巴结构中)并促进免疫病理(Palanichamy等人,2014)。CSR可在病理组织内局部出现，诸如在例如类风湿关节炎的滑膜的慢性炎症组织中的异位淋巴样结构内(Alsaleh等人,2011；Humby等人,2009)。

值得注意的是，浆细胞(加上浆母细胞)越来越被理解为除了产生免疫球蛋白外，还能发挥重要的效应器免疫功能，包括产生细胞因子(Shen和Fillatreau,2015)和免疫调节物，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(Fritz等人,2011)、IL-10(Matsumoto等人,2014；Rojas等人,2019)、IL-35(Shen等人,2014)、IL-17a(Bermejo等人,2013)和ISG15(Care等人,2016)。

浆母细胞是具有迁移能力的B细胞系中短寿命的快速循环的抗体分泌细胞，也是长寿命(有丝分裂后)浆细胞的前体，包括那些归巢至骨髓微环境的(Nutt等人,2015)。除了作为自身反应性长寿命浆细胞的前体之外，浆母细胞本身还是一个重要的潜在治疗靶点，因为它们具有产生致病性免疫球蛋白/自身抗体的能力(Hoyer等人,2004)。除了直接分泌抗体的功能外，循环浆母细胞还经由Il-6诱导的促进T滤泡辅助细胞(Tfh)分化和扩增相关的前馈机制，发挥增强源自生发中心的免疫应答并从而促进抗体产生的活性(Chavele等人,2015)。

长寿命浆细胞主要定居的微环境是骨髓中(Benner等人,1981)，被认为是在(生理和)致病状态下稳定的自身抗体生成的主要来源，并且对糖皮质激素、常规的免疫抑制和B细胞耗竭疗法具有抗性(Hiepe等人,2011)。在非人灵长类动物中，为了证明这一B细胞群体对长期的抗体产生的关键重要性，已经证实了具有对先前的抗原的持久(免疫后长达10年)抗体响应的骨髓衍生的浆细胞在特定区域的存活，尽管记忆B细胞持续耗竭(Hammarlund等人,2017)。鉴于自身反应性长寿命浆细胞在维持自身免疫中的关键作用(Mumtaz等人,2012)以及这些细胞形成的自身反应性记忆对常规免疫抑制剂(如抗TNF或B细胞耗竭生物剂)的实质耐药性(Hiepe等人,2011)。

CD19(+)B细胞和CD19(-)B浆细胞是致病性IgE驱动的B细胞疾病的驱动因素。致病性IgE驱动的B细胞疾病在所有自身免疫性疾病和炎症性疾病中占相当大的比例。致病性免疫球蛋白驱动的B细胞导致疾病的最突出但非唯一的机制是通过自身抗体的产生。

致病性IgE驱动的B细胞疾病难以治疗，因此即使是“良性”疾病，也有相当高的死亡率和患病率。目前某些先进的疗法是针对成熟B细胞的。例如，贝利木单抗(belimumab)是一种抑制B细胞活化因子的人单克隆抗体。阿塞西普(Atacicept)是一种重组融合蛋白，其也能抑制B细胞活化因子。然而，记忆B细胞可能对靶向于生存信号例如B细胞活化因子的疗法，例如贝利木单抗或阿塞西普产生耐受性(Stohl等人,2012)。记忆B细胞在自身免疫性病症发病机制中的重要性也被阿塞西普治疗类风湿关节炎和多发性硬化症的低疗效所证明(Kappos等人,2014；Richez等人,2014)。血浆置换疗法和免疫吸附疗法涉及从患者血液中去除引起疾病的自身抗体。然而，这些治疗方法的疗效有限，或者使用时复杂且昂贵。针对CD19(+)B细胞的CAR-T方法会使CD19(-)B浆细胞依然保持完好，因此效果不佳。利妥昔单抗对IgE水平的影响不大，没有观察到持续的临床益处(van Vollenhoven等人,2013)。

奥马珠单抗(抗IgE抗体)目前用于治疗哮喘。然而，这是一种昂贵的药物。

因此，存在对治疗致病性IgE驱动的B细胞疾病的新方法的重大的未满足的医学需求。

发明概述

对类别转换的记忆B细胞和抗体生成的影响

发明人已经发现，氯氮平具有潜在的重要治疗效果，因为它能显著减少类别转换的记忆B细胞(“CSMB”)，这是成熟B细胞的一种类型。

通过氯氮平减少CSMB将由此减少ASC的数量，并因此减少包括致病性免疫球蛋白在内的特异性免疫球蛋白的分泌。氯氮平还观察到会导致另一种成熟B细胞，即浆母细胞水平的降低。对持久和长寿命的适应性B细胞和浆细胞的这种功能性效应可能改善由致病性免疫球蛋白的持续生成(其驱动致病性IgE驱动的B细胞疾病的病理)所驱动的疾病。这将由此减少ASC的数量，并因此减少包括致病性免疫球蛋白在内的特异性免疫球蛋白的分泌。氯氮平还观察到会导致另一种成熟B细胞，即浆母细胞水平的降低。对持久和长寿命的适应性B细胞和浆细胞的这种功能性效应可能改善由致病性免疫球蛋白的持续生成(其驱动致病性IgE驱动的B细胞疾病的病理)所驱动的疾病。此外，发明人的新数据表明对循环中的类别转换记忆B细胞的数量有非常显著的影响，对浆母细胞的数量有实质性的影响，重要的是，通过缺乏对普通疫苗的记忆应答，对类别转换记忆B细胞和浆母细胞的功能产生了影响，导致针对先前暴露的抗原的抗体的特异性地减少。发明人的新数据还证明了该药物在给药后降低总免疫球蛋白水平的效果。由于对其它B细胞没有影响，表现为不消耗其它亚型和总B细胞数量，但CSMB和浆母细胞特别地减少，这一观察结果有力地支持了对CSMB和浆母细胞的功能效果，而它们是致病性IgE驱动的B细胞疾病中长期产生致病性抗体的核心因素。

发明人发现用氯氮平治疗的患者中类别转换记忆B细胞明显减少，这表明对免疫球蛋白类别转换过程产生了稳定的影响。这在致病性免疫球蛋白驱动的B细胞疾病中具有特别的治疗相关性，其中在次级淋巴器官中的生发中心反应之后的类别转换重组(CSR)提供了抗原致敏/接触的自身反应性记忆B细胞，和自身免疫的发展和/或维持的核心途径。在致病性免疫球蛋白驱动的B细胞疾病需要对自身免疫记忆库和致病性免疫球蛋白二者的影响的情况下，氯氮平对CSR和降低免疫球蛋白的影响具有特别的治疗潜力。

发明人确认了氯氮平对浆细胞群的显著影响，说明对于调节与(自身)免疫介导的疾病相关的B细胞的多种抗体非依赖性的效应器功能也有明显的潜力。

对浆母细胞抗体分泌细胞的影响

发明人发现，氯氮平对降低患者体内循环浆母细胞水平表现出显著的影响。因此，发明人观察到的氯氮平的使用对循环浆母细胞数目的显著影响，显示了氯氮平通过对循环浆母细胞分泌免疫球蛋白以及干扰浆母细胞的强效作用以促进Tfh(T滤泡辅助细胞)功能的这两种影响来调节致病性免疫球蛋白驱动的B细胞疾病的潜力。

对长寿命浆细胞的影响

发明人利用野生型小鼠模型发现，小鼠定期施用氯氮平可显著降低骨髓中长寿命浆细胞的比例，而使用对比的抗精神病药物(氟哌啶醇)则看不到这种效果。值得注意的是，人类骨髓中定居的长寿命PC长期以来被认为是人类循环Ig的主要来源，因此为发明人观察到用氯氮平治疗的患者中Ig的减少提供了明确的支持。发明人观察到的氯氮平具有消耗骨髓长寿命浆细胞的特定作用，其通过对长寿命浆细胞(自身反应性)记忆的影响，在致病性免疫球蛋白驱动的B细胞疾病中消除炎症并获得缓解方面具有巨大的治疗潜力。

发明人发现了氯氮平对浆细胞群体的显著影响，也表明其调控与(自身)免疫介导的疾病相关的B细胞的多种非抗体依赖性的效应子功能的明确潜能。

对骨髓中的B细胞前体和脾脏的未成熟/过渡细胞的影响

发明人发现，野生型小鼠用药后，氯氮平对骨髓B细胞前体有明显影响。具体而言，在骨髓中前祖B细胞比例上升，同时前B细胞、增殖的前B细胞和未成熟的B细胞减少。这些研究结果共同表明，氯氮平对早期B细胞发育有特殊影响，在没有特定的免疫学激发的情况下，在前祖B细胞和前B细胞阶段之间有部分停滞。发明人已经发现，氯氮平降低野生型小鼠的脾脏T1细胞比例的影响。对应于鼠类研究结果，发明人正在进行的对使用氯氮平的患者观察研究的中期结果揭示出循环中过渡性B细胞的显著减少。人体循环中过渡性B细胞亚群表现出与鼠类T1 B细胞最相似的表型，并且在自身免疫病中扩增。

因此，发明人观察到氯氮平减少骨髓B细胞祖细胞和未成熟的(T1)脾脏B细胞比例的影响，这为他们发现用氯氮平治疗的患者中循环的类别转换记忆B细胞和免疫球蛋白的减少提供了在生发中心以外的额外的解剖区室来源。考虑到早期未成熟B细胞表达的大部分抗体是自身反应性的，这进一步强调了其治疗潜力(Wardemann等人,2003)。

在体外没有直接的B细胞毒性

发明人利用体外B细胞分化系统评估氯氮平、其代谢物(N-去甲基氯氮平)和对照的抗精神病药物(氟哌啶醇)的具体影响的新数据进一步证明：在已建立的体外测定法的背景下，氯氮平或其代谢物对分化的B细胞没有直接的毒性作用，对分化的ASC分泌抗体的能力没有一致的影响，并且对活化的B细胞的功能或表型成熟到早期PC状态没有一致的抑制作用。

限于这些体外实验的背景内，这些数据表明，氯氮平不太可能以直接毒性的方式作用于浆细胞或其前体(例如通过细胞内在的效应)以诱导在免疫球蛋白水平上观察到的影响。观察结果表明，氯氮平对B细胞的作用比现有的用于自身免疫性疾病的B细胞靶向疗法更为细腻，现有的B细胞靶向疗法导致多种B细胞亚群的大量消耗(例如利妥昔单抗和其他抗CD20生物类似物)，它们的疗效是经由对B细胞的直接作用例如信号通路诱导的凋亡、补体介导的细胞毒作用或抗体依赖的细胞毒作用来介导的。

氯氮平这种没有明显的实质性直接毒性对于氯氮平来说有许多潜在的治疗优势，包括减少与不加区别的B细胞耗竭(包括清除保护性B细胞)相关的广泛的免疫抑制的风险，以及避免使用常规B细胞耗竭疗法所观察到的不适合的改变的潜力。

在胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)小鼠模型中的效力，以及CIA作为涉及致病性免疫球蛋白的B细胞驱动疾病模型的相关性。

CIA是一种早已确立的自身免疫性疾病实验模型，其是由使用完全弗氏佐剂乳化的II型胶原蛋白(CII)(软骨的主要蛋白成分)在啮齿类动物和非人灵长类动物的基因易感种系中进行免疫而产生的(Brand等人,2004)。这导致了自身免疫应答并伴随严重的多关节炎，通常在免疫后18-28天并且是单相的，在小鼠中约60天后解除(Bessis等人,2017；Brand等人,2007)。CIA模型的病理学类似于类风湿关节炎，包括滑膜炎、滑膜增生/血管翳形成、软骨退化、骨质侵蚀和关节僵硬(Williams,2012)。

CIA的免疫发病机制依赖于B细胞特异性应答，产生对CII的致病性自身抗体，此外还涉及T细胞对CII、FcγR(即IgG的Fc受体)和补体的特异性应答。B细胞在CIA发生中的关键作用由B细胞缺陷(IgM缺失)的小鼠完全避免CIA发生而得到证实，虽然存在完整的抗CII的T细胞应答(Svensson等人,1998)。此外，CIA的发生已被证明是绝对依赖于B细胞的生发中心形成，抗CII免疫球蛋白应答本身很大程度依赖于正常的生发中心形成(Dahdah等人,2018；Endo等人,2015)。B细胞还参与CIA病理学的其他方面，包括通过抑制成骨细胞而导致的骨质侵蚀(Sun等人,2018)。作为一个推论，在CII免疫前使用抗CD20单克隆抗体耗竭B细胞会延迟CIA的发生和严重程度，同时延迟自身抗体的产生(Yanaba等人,2007)。在这个模型中，B细胞的恢复足以导致胶原蛋白免疫后的致病性免疫球蛋白的产生和相关的疾病发展。

将抗CII血清或多克隆IgG免疫球蛋白被动转移到未免疫的动物身上导致关节炎(Stuart和Dixon,1983)，而FcγR链的缺乏几乎完全阻止了小鼠CIA的发生(Kleinau等人,2000)，通过这一观察结果强调了胶原蛋白特异性的自身抗体在CIA发病过程中所发挥的基础作用。此外，将致病性抗体(即胶原抗体诱导的关节炎，CAIA)引入生发中心缺失的小鼠体内会引起关节炎，表明了致病性抗体很大程度上绕过需要生发中心反应的能力(Dahdah等人,2018)。此外，即使是缺乏适应性免疫(即B和T细胞)的小鼠，也容易诱导CIA(Nandakumar等人,2004)。

因此，发明人采用了CIA模型作为一个与临床高度相关的实验系统，其中响应于样品抗原的源自B细胞的致病性免疫球蛋白驱动了自身免疫病，以探索氯氮平的潜在功效及其相关细胞机制。发明人证明，氯氮平延缓小鼠CIA的发生并降低其发病率，这种效果在CII免疫后马上给药时最为明显。此外，发明人的数据表明，通过受影响的脚爪数量和临床严重程度评分判断，氯氮平降低了CIA的严重程度。发明人确定了氯氮平对牵涉到CIA发病机制的关键细胞类型的重要影响，包括脾脏浆细胞比例的降低和局部引流淋巴结中的生发中心B细胞非常显著的降低。此外，发明人的发现表明，在CII免疫的小鼠中，响应于氯氮平的使用，淋巴结生发中心B细胞上的抗体产生和抗原提呈的功能活性标志物减少。在单个时间点测量，还观察到抗胶原的抗体水平显著降低。综合以上，发明人在CIA模型中的发现指出了氯氮平对致病性免疫球蛋白B细胞驱动的疾病、并进而对B细胞介导的疾病(其中自身抗体的形成是关键的组成部分)产生有利影响的特定能力。

重要的是，IgE记忆B细胞和IgE浆细胞也已被证明通过生发中心途径产生(Talay等人,2012)。值得注意的是，IgE转换记忆B细胞是细胞IgE记忆的主要来源(Talay等人,2012)。此外，IgE⁺B细胞和浆细胞的发生过程遵循与IgG(1)的表型阶段类似的表型阶段，包括IgE⁺生发中心样B细胞、IgE⁺浆母细胞和IgE⁺浆细胞，其通过IgG的连续转换过程发生(Ramadani等人,2017)。值得注意的是，B细胞的内在成熟状态决定了它们进行类型转换到IgE的能力，相应地，最高比例的IgE⁺细胞来源于生发中心B细胞(Ramadani等人,2017)。此外，亚型转换取决于细胞分裂的次数，并且对于IgE比IgG更大(Tangye等人,2002)，这与IgE应答通常需要更长时间的抗原刺激这一事实相符(Hasbold等人,1998)。因此，发明人关于氯氮平对类型转换、生发中心形成和长寿命浆细胞的特定影响的发现预计将显著影响在致病性IgE驱动的B细胞疾病中建立和维持IgE介导的免疫球蛋白应答的能力。事实上，更多数量的B细胞分裂和要求生发中心B细胞有效地产生IgE⁺表明，这些病症可能对氯氮平的作用特别敏感。

因此，本发明提供了化合物，其选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物，用于治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病，特别是，其中所述化合物使所述个体中的成熟B细胞受到抑制。

附图简述

图1A-C显示了IgG、IgA和IgM的每个血清浓度值的患者数量的相对频率，分别是用氯氮平治疗的患者(黑色)和未使用氯氮平的患者(灰色)(见实施例1)。

图1D显示了密度图，显示在移除4名患者(n＝2个血液恶性肿瘤患者和n＝2个先前包括在发明人最近的病例对照研究内的患者(Ponsford等人,2018b))后，接受氯氮平治疗以进行免疫学评估的患者(浅灰色最左侧曲线，n＝13)的血清免疫球蛋白水平的分布。还显示了经氯氮平治疗(中灰色的中间曲线，n＝94)和未使用氯氮平(深灰色最右侧曲线，n＝98)的血清免疫球蛋白分布[改编自(Ponsford等人,2018b)]。虚线代表健康成人的第5和第95位百分位数(见实施例1)。在使用氯氮平的患者中观察到，对IgG、IgA和IgM中的每一个，与未使用氯氮平的患者相比，总免疫球蛋白的分布曲线向左移动；这一发现对于使用氯氮平的转诊患者特别明显。

图2显示了使用氯氮平的持续时间对血清IgG水平的影响(见实施例1)。

图3A显示了健康对照组、施用氯氮平的临床就诊患者和普通可变型免疫缺陷病(CVID)患者中的类别转换记忆B细胞(CSMB)数量(CD27+/IgM-/IgD-，以占总CD19+细胞数的百分比表示)(见实施例1)。

图3B显示了在有氯氮平治疗史的临床就诊精神分裂症患者(数目如图所示)、普通可变型免疫缺陷病(CVID，n＝26)患者和健康对照(n＝17)中的B细胞亚群，以占CD19+细胞总数的百分比表示。B细胞亚群以CD19+细胞为门控，定义如下：初始B细胞(CD27^-IgD⁺IgM⁺)，边缘区样B细胞(CD27⁺IgD⁺IgM⁺)，类别转换记忆B细胞(CD27⁺IgD^-IgM^-)，浆母细胞(CD19⁺CD27^HiIgD^-)。对非正态分布的数据进行非参数Mann-Whitney检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001(见实施例1)。

图4A显示了健康对照组、施用氯氮平的临床就诊患者和普通可变型免疫缺陷病(CVID)患者中的浆母细胞数量(CD38+++/IgM-，以占CD19+细胞总数的百分比表示)(见实施例1)。

图4B说明疫苗特异性的IgG应答评估(见实施例1)。

图5显示了氯氮平中止用药后历经三年血清IgG逐渐从3.5恢复到5.95g/L。LLN＝正常值下限(见实施例1)。

图6A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)相比于氯氮平(右)的患者的循环中IgG、IgA和IgM水平的中期数据结果。平均值±SEM(见实施例2)。

图7显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)相比于氯氮平(右)的患者的外周血中肺炎球菌特异性IgG水平的中期数据结果。平均值±SEM(见实施例2)。

图8A-B显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血B细胞(CD19⁺)水平的中期数据结果，以绝对水平和占淋巴细胞的百分比(％，即占T+B+NK细胞的百分比)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图9A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血初始B细胞(CD19⁺/CD27^-)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图10A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血记忆B细胞(CD19⁺/CD27⁺)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图11A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血类别转换(CS)记忆B细胞(CD27⁺/IgM^-/IgD^-)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图12A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血高IgM低IgD(CD27⁺/IgM⁺⁺/IgD^-)记忆B细胞(即生发中心后仅表达IgM的B细胞)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图13A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血过渡性B细胞(IgM⁺⁺/CD38⁺⁺)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图14A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血边缘区(MZ)B细胞(CD27⁺/IgD⁺/IgM⁺)水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图15A-C显示了关于使用非氯氮平的抗精神病药物('对照'，左)与氯氮平(右)的患者的外周血浆母细胞水平的中期数据结果，分别以占总B细胞(CD19⁺细胞,％B)、淋巴细胞(％L)的百分比、或绝对值(abs)表示。平均值±SEM(见实施例2)。

图16显示了WT小鼠响应于不同剂量的氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比的体重增长曲线。平均值±SEM(见实施例3)。

图17显示了WT小鼠在治疗第3、12和21天的体重比较。平均值±SEM(见例3)。

图18显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠骨髓中总B细胞含量和前祖B细胞和祖B细胞前体的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图19显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠骨髓中前B细胞、增殖性B细胞和未成熟B细胞前体的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图20显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠骨髓中类别转换记忆B细胞、浆母细胞和长寿命浆细胞的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图21显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠脾脏中总B细胞、T细胞、其他细胞群体(TCR-β^-/B220^-)和活化T细胞的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图22显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠脾脏中过渡性(T1和T2)、滤泡、边缘区(MZ)和生发中心(GC)B细胞的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图23显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠肠系膜淋巴结(MLN)中的B细胞亚群和T细胞的影响。平均值±SEM。T1和T2分别为过渡性1型和2型B细胞。MZ是边缘区。GC是生发中心(见实施例3)。

图24显示了氯氮平与氟哌啶醇和溶媒对照相比，对WT小鼠循环中免疫球蛋白的影响。平均值±SEM(见实施例3)。

图25显示了氯氮平对CIA临床发病日的影响。平均值±SEM(见实施例4)。

图26显示了氯氮平对CIA发病率的影响(见实施例4)。

图27显示了氯氮平对CIA的严重程度的影响，通过临床评分和首先受累的脚爪的厚度来判断，所用的小鼠从免疫后第1天开始给药。平均值±SEM(见实施例4)。

图28显示了氯氮平对CIA的严重程度的影响，通过受累的脚爪的数量来判断，按照免疫后用氯氮平治疗的日子(第15天，D15或第1天，D1)。平均值±SEM(见实施例4)。

图29显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中B220⁺(即CD45⁺)细胞的影响。平均值±SEM(见实施例4)。

图30显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的浆细胞(PC)的影响。平均值±SEM(见实施例4)。

图31显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心(GC)B细胞(B220⁺/IgD^-/Fas⁺/GL7⁺)的影响。平均值±SEM(见实施例4)。

图32显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心(GC)B细胞(B220⁺/IgD^-/Fas⁺/GL7⁺)上的GL7表达的影响。MFI是指平均荧光强度。平均值±SEM(见实施例4)。

图33显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠外周血的抗胶原的IgG1和IgG2a抗体水平的影响(见实施例4)。

图34显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心定居的T滤泡辅助细胞(CD4⁺PD1⁺)的影响。平均值±SEM(见实施例4)。

图35显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心定居的T滤泡辅助细胞(CD4⁺PD1⁺)上的PD1表达的影响。MFI，平均荧光强度。平均值±SEM(见实施例4)。

图36显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心定居的T滤泡辅助细胞(CD4⁺PD1⁺)上的CXCR5表达的影响。MFI，平均荧光强度。平均值±SEM(见实施例4)。

图37显示了氯氮平与对照组相比，对CIA小鼠脾脏和局部淋巴结中的生发中心定居的T滤泡辅助细胞(CD4⁺PD1⁺)上的CCR7表达的影响。MFI，平均荧光强度。平均值±SEM(见实施例4)。

图38显示了人浆细胞的体外产生/分化的方案示意图(见实施例5)。

图39显示了试验的示意图，说明了氯氮平的剂量逐级上升(uptitration)期，随后注射施用伤寒疫苗(Typhim Vi)(箭头)，然后用氯氮平持续给药。对照队列(仅用疫苗，无氯氮平)和任选的队列(根据剂量1和剂量3的结果指导选择的剂量)(见实施例6)。

发明详述

本发明还提供了一种治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病的方法，该方法通过向所述个体施用有效量的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，特别是，其中所述化合物使所述个体的成熟B细胞受到抑制。

本发明还提供了选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物在制备用于治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病的药物中的用途，特别是，其中所述化合物使成熟B细胞在所述个体中受到抑制。

氯氮平或去甲氯氮平可以任选地以药学上可接受的盐和/或溶剂化物和/或前药的形式使用。在本发明的一个实施方案中，氯氮平或去甲氯氮平以药学上可接受的盐的形式使用。在本发明的另一个实施方案中，氯氮平或去甲氯氮平是以药学上可接受的溶剂化物的形式使用。在本发明的又一实施方案中，氯氮平或去甲氯氮平不是以盐或溶剂化物的形式。在本发明的又一实施方案中，氯氮平或去氯氮平以前药的形式使用。在本发明的另一个实施方案中，氯氮平或去氯氮平不是以前药的形式使用。

术语“致病性IgE驱动的B细胞疾病”包括B细胞介导的疾病，特别是炎症性疾病，所述疾病涉及外源性抗原，其引起异常高的和致病性的IgE水平作为主要机制。

致病性IgE驱动的B细胞疾病的外源性抗原的范围包括：中性粒细胞(变应性肉芽肿性血管炎)和花粉抗原(变应性鼻炎、变应性眼病和特应性哮喘，但可以有其他病因)。

示例性的致病性IgE驱动的B细胞疾病可以是肺部相关疾病特应性哮喘。或者，该疾病可以是皮肤相关疾病特应性皮炎和慢性非自身免疫性荨麻疹。或者，疾病可以是神经性相关疾病变应性肉芽肿性血管炎。或者，疾病可以是鼻相关疾病变应性鼻炎。或者，疾病可以是眼相关的疾病变应性眼病。或者，疾病可以是食道相关疾病嗜酸细胞性食管炎。

强调B细胞和致病性IgE抗体在上述疾病中作用的参考文献包括：

嗜酸细胞性食管炎(EO)

EO是一种慢性的变应原驱动的免疫介导的病症，病理学特征为显著的嗜酸细胞性浸润(Chen和Kao,2017)。2型辅助T细胞(Th2)的重要作用已被鉴定为响应于变应原和相关的IL-4、IL-5和IL-13的产生，发病机制被认为是由IgE介导和非IgE介导的机制联合驱动(Weinbrand-Goichberg等人,2013)。嗜酸性粒细胞促进炎症，激活平滑肌并诱导肥大和嗜碱性细胞脱颗粒(Chen和Kao,2017)。

EO患者的食管活检显示B细胞和结合IgE的肥大细胞密度相比对照组有增加，且CD20+B细胞密度和肥大细胞之间呈正相关(Vicario等人,2010)。值得注意的是，通过检测ε、μ和γ4的种系转录物，以及催化CSR初始步骤的AID的表达(Vicario等人,2010)，提供了向IgE的局部类别转换重组(CSR)的证据，从而确认了IgE重链和成熟IgE mRNA的表达上调。这些发现表明在EO中有活跃的B细胞招募，以及在“特应性”和“非特应性”个体中局部CSR和成熟IgE的产生，表明在EO中存在明确的局部抗体应答(Vicario等人,2010)。其他研究也发现EO中IgG亚类、IgA和IgM，尤其是IgG4的增多，后者与食管嗜酸性粒细胞数量、组织学和疾病阶段相关(Rosenberg等人,2018)。在深部固有层中已注意到免疫复合物的形成和IgG4⁺浆细胞(Clayton等人,2014)。重要的是，IgG4转换的B细胞可以转换到IgE，但由于在CSR到IgE的过程中的基因删除，反向事件不会发生。值得注意的是，IgE B细胞向浆细胞表型的转变发生在早期，而且比IgG转换的B细胞显著更早(Aalberse等人,2016)。

通过观察EO中包括肥大细胞在内的携带IgE的细胞，进一步提示了IgE的作用(Straumann等人,2001)。值得注意的是，表达IgE的高亲和力受体FcεRI的细胞大量存在于EO患者的食管上皮中，表明在EO中该受体对于IgE介导的免疫细胞活化是很重要的(Yen等人,2010)。

EO常与儿童中对食物中的变应原和成人中对植物/空气中的变应原的IgE致敏有关。EO患者的血清IgE水平也常常显著升高，这与产生IgE的长寿命浆细胞的存在相一致(Aalberse等人,2016)，其与特异性IgE抗体一起表明了IgE对发病机制的贡献(Straumann等人,2001)。值得注意的是在儿童中食物特异性IgE抗体可预测食管嗜酸粒细胞增多(Erwin等人,2017)。EO中活动性食管炎与食管的浆细胞水平升高相关(Mohammad等人,2018)。

值得注意的是，除了靶向外源性抗原的免疫球蛋白之外，最近的数据表明了EO中自身抗体的存在，特别是抗NC16A，其似乎与组织学响应相关(Dellon等人,2018)。

支持IgE在EO中的致病作用的是，一项使用奥马珠单抗进行抗IgE治疗的试验性研究表明，部分患者得到临床改善，并伴随着更低的组织IgE水平、类胰蛋白酶阳性细胞和嗜酸性粒细胞(Loizou等人,2015)。

特应性哮喘(外源性、早发性或变应性哮喘)。

特应性哮喘I与特应性(过敏性鼻炎和特应性湿疹)相关，并被认为实质上是由2型辅助T细胞(T_H2)应答驱动，以促进早期IgE介导的(即1型)超敏反应，以及IL-5促进的嗜酸性粒细胞的活化。

值得注意的是T_H2细胞分泌高水平的IL-4和IL-13，它们促进B细胞的IgE类别转换。随后，IgE记忆B细胞可分化为浆细胞以产生特异性IgE，其可与靶细胞如肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力受体FcεRI结合(Palomares等人,2017)。抗原特异性IgE与肥大细胞上的FcεRI结合是使这些细胞致敏以便以特定方式释放肥大细胞介质的关键。此外，由抗原与IgE形成的免疫复合物可与B细胞上的CD23或FcεRI结合以进一步放大IgE相关的免疫应答(Galli和Tsai,2012)。重要的是，来自一些哮喘患者而非健康对照者的支气管上皮细胞，表达FcεRI，能够固定IgE并在类花生酸释放方面有功能(Campbell等人,1998)。

重要的是，从IgM/IgG/IgA到IgE的类别转换重组可以在哮喘的支气管组织中局部发生，导致产IgE的B细胞的克隆选择和亲和力成熟，以局部释放IgE(Takhar等人,2007)。与健康对照组和“过敏”对照组相比，变应性哮喘患者在气道中表现出高度升高的IgE⁺CD19⁺B细胞水平，以及增加的IgE⁺记忆B细胞和IgE⁺浆细胞(Oliveria等人,2017)。值得注意的是，IgE⁺B细胞的频率与气道中嗜酸性粒细胞、IgE和BAFF的水平呈正相关，这些发现与变应性哮喘患者气道中IgE⁺B细胞的局部成熟和增殖相一致(Oliveria等人,2017)，以便通过它们产生IgE和有效的抗原提呈功能来推动疾病进程(Wypych等人,2018)。此外,组织中定居的记忆B细胞也已在变应性哮喘的小鼠模型的气道中被确认,其提供了一个定居B细胞群体,可以响应于变应原/抗原的再暴露而迅速地局部激活(Turner等人,2017)。

患哮喘和/或变应性的儿童除了IgE⁺记忆细胞和T_H2细胞外，还显示出扩增的IgE⁺浆母细胞的证据；值得注意的是，浆母细胞的数量与循环中T_H2细胞的频率呈正相关(Heeringa等人,2018)。

证实B细胞在特应性哮喘发病机制中的关键作用的是，在HDM致敏小鼠中，屋尘螨(HDM)激发前使用抗CD20抗体耗竭B细胞，显著降低了过敏反应，减少了肺部免疫浸润物中的CD4⁺CD44⁺T细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，这与更低的T_H2应答相符合(Wypych等人,2018)。因此，B细胞在放大体内T_H2应答而促进过敏反应中起着关键作用，这可能部分地反映了它们高效提呈抗原的能力(Wypych等人,2018)。

证实IgE在特应性/变应性哮喘中的作用的是，向变应性哮喘患者施用靶向FcεRI的单克隆抗体疗法(从而抑制内源性IgE与肥大细胞和其他效应细胞的结合，而不刺激肥大细胞活化)抑制了对吸入的变应原的早期和晚期应答，这与血清IgE的降低、对吸入变应原的敏感性钝化和减轻与吸入变应原相关的呼吸能力下降相关(Fahy等人,1997)。证明IgE在持续性哮喘中的关键致病作用的进一步的证据来自于奥马珠单抗(一种人源化单克隆抗IgE抗体)在城市内的儿童和年轻成人中的试验。其表明，尽管对吸入的糖皮质激素和β-受体激动性支气管扩张剂治疗的需求更低了，但哮喘症状的负担、恶化频率、特别是季节性高峰显著减弱(Busse等人,2011)。对IgE的特异性体外免疫吸附也已证明了在花粉季节期间在变应性哮喘患者中减轻变应原特异性嗜碱性粒细胞敏感性和临床症状的疗效(Lupinek等人,2017)。与施用奥马珠单抗不同,这种方法虽然是侵入性的,但不受IgE的阈值水平限制(Lupinek等人,2017)。

特应性皮炎(AD；特应性湿疹)

AD是一种以瘙痒性湿疹状皮损为特征的慢性炎症性皮肤病症。它与其他特应性疾病(哮喘和变应性鼻炎)相关，具有共同的病理生理学方面，特别是形成IgE抗体的倾向和对外源性触发因素的敏感性(Zheng等人,2011)。AD被认为是一种双相T细胞介导的病症，除了由源自B细胞的IgE驱动的重要疾病成分外，T_H2到T_H1的转换也促进了慢性化(Furue等人,2017)。

值得注意的是，约80-90％的AD患者血清IgE升高，升高的水平与IgE对多种抗原的自身反应性相关(Furue等人,2017)。增强的IgE水平被认为主要反映了更大的IgE抗体生成细胞的数量(Thomas等人,1995)。

AD患者表现出针对角质细胞蛋白的IgE自身抗体，特别是在严重病例中(Altrichter等人,2008)。AD中的自身反应性IgE与临床严重性的相关性，以及在其他皮肤病症中的缺失，支持IgE介导的自体反应性在疾病发病机制中的作用(Navarrete-Dechent等人,2016)。值得注意的是，AD也与其他自身免疫病关联发生，例如白癜风(Mohan和Silverberg,2015)，并有一部分具有严重面部皮疹的患者表现出ANA阳性(Higashi等人,2009)，提示AD中更普遍的体液免疫失调。所描述的自身抗体包括那些靶向SART-1、细胞角蛋白II型、hMnSOD和BCL7B等的抗体(Navarrete-Dechent等人,2016)。临床严重程度评分与此类特异性IgE自身抗体中的一些高度相关(Schmid-Grendelmeier等人,2005)。这种抗原的变应原性得到其诱导T细胞增殖和对皮肤激发的阳性即时反应的能力的进一步支持(Schmid-Grendelmeier等人,2005)。

进一步支持B细胞在AD中的作用的是，外周淋巴细胞亚群的分析显示B细胞的改变，特别是在患AD的儿童中，活化B细胞和记忆T细胞水平之间呈正相关(Czarnowicki等人,2017)。此外，外周血分析表明，早期AD的特征是B细胞成熟异常，并揭示了AD中记忆B细胞与T_H1和T_H2细胞之间的正相关关系(Czarnowicki等人,2017)。重要的是，在患AD的儿童中，IgE致敏可见与总IgE水平、转换的记忆B细胞和T_H1/T_H2细胞聚类，证据表明B细胞发育加速，这将支持IgE类别转换(Czarnowicki等人,2017)。

在成人中，AD与循环中过渡性B细胞、长期活化的记忆B细胞、浆母细胞和IgE记忆B细胞的增加有关(Czarnowicki等人,2016)。值得注意的是，在AD中，循环中细胞表达CD23(IgE的Fc区的低亲和力受体(FcεRII))增加，并与AD的临床严重程度相关(Czarnowicki等人,2016)；鉴于CD23在促进IgE合成/应答方面的作用(Pene,1989)，这一观察结果值得注意。

支持B细胞在AD发病机制中的主要作用的是，使用利妥昔单抗耗竭B细胞会带来实质性的临床改善(严重程度/累及区域)，以及组织学的改善(减少的B细胞和T细胞浸润)、IL-5/IL-13和总IgE的一些减少(Simon等人,2008)。值得注意的是，尽管循环B细胞几乎完全耗尽，但皮肤中的B细胞却没有那么大幅度地减少(减少～50％)，在治疗前后的皮肤样品中的浆细胞也都很明显(Simon等人,2008)。此外，使用抗IgE(奥马珠单抗)和B细胞耗竭(利妥昔单抗)序贯治疗严重的难治性AD，被报道有显著的临床响应以及降低血清IgE和外周血B细胞水平(Sanchez-Ramon等人,2013)。进一步支持致病性IgE免疫球蛋白在驱动AD中的作用的是，血清IgE升高的AD患者重复进行IgE免疫吸附，带来显著的临床改善，以及IgE的降低(Daeschlein等人,2015)。

变应性肉芽肿性血管炎(丘-施二氏血管炎；嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎；CSS/EGPA)

变应性肉芽肿性血管炎，又称嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎(EGPA)，是一种中小血管系统性坏死性血管炎，是ANCA相关血管炎(ANCA，抗中性粒细胞胞浆抗体阳性为约～40)临床谱系的一部分，与严重的成人发病的哮喘、鼻窦炎和血液/组织嗜酸性粒细胞增多症有关(Groh等人,2015)。

CSS的发病机制涉及T细胞(特别是过度的T_H2应答，但也涉及T_H1和减少的调节性T细胞)，活化的组织嗜酸性粒细胞和具有体液反应的B细胞(Greco等人,2015)。ANCA具有直接致病性，主要靶向髓过氧化物酶(MPO)和蛋白酶3，前者是CCS的特征。ANCA通过结合ANCA特异性抗原，以及经由其Fc区结合中性粒细胞上的Fcγ受体，引起中性粒细胞活化和脱颗粒，导致释放细胞因子、细胞裂解酶和ROS(Nakazawa等人,2019)。

支持IgE在CSS的发病机制中的作用的是，小鼠经受皮肤的反向被动阿图斯反应(使用IgE)以提供IgE-免疫复合物挑战，发生联想到CSS的皮肤嗜酸粒细胞血管炎(Ishii等人,2009)。值得注意的是，在这个模型中嗜酸性粒细胞浸润对于IgE介导的免疫复合物挑战是惊人的特异性的，在IgG抗体注射中几乎没有看到过(Ishii等人,2009)。也存在证据支持IgE在CSS中通过免疫复合物的形成和补体的激活而致病(Manger等人,1985)。

表现为活动性疾病和频繁复发的CSS患者显示活化B细胞水平升高，循环T调节细胞水平降低(Tsurikisawa等人,2013)。CSS患者还表现出有利于浆细胞分化和抗体介导的应答的细胞环境，其通过增加分泌IL-21的T辅助细胞，特别是在ANCA阳性患者中(Abdulahad等人,2013)。

支持B细胞及其自身抗体在CCS发病机制中的关键作用的是，使用利妥昔单抗耗竭B细胞在临床上能有效地诱导缓解或部分反应，并降低对皮质激素治疗的需求；值得注意的是，基线ANCA水平与更高的缓解水平相关(Mohammad等人,2016)。这些研究结果在另一项关于难治性CSS患者的临床研究中得到了证实，利妥昔单抗降低了IgE、CRP和嗜酸性粒细胞的水平，以及诱导缓解(Thiel等人,2017)。也有证据表明，在难治性/复发性CCS中使用奥马珠单抗靶向IgE具有节省皮质类固醇的作用(Jachiet等人,2016)。

变应性鼻炎(AR)

AR是一种常见的慢性的IgE介导的炎症性鼻部病症，经常与其他特应性特征(哮喘和特应性皮炎)结合。暴露于特定的变应原会促进变应原特异性IgE的产生，然后经由高亲和力受体FcεRI结合到靶细胞(例如肥大细胞和嗜碱性粒细胞)(Wise等人,2018)。继而，AR患者的鼻肥大细胞表现出与血清IgE水平相关的FcεRI表达的上调和细胞结合的IgE的增加；这些细胞也可诱导B细胞产生IgE，表明前馈的IgE-FcεRI-肥大细胞轴关键是依赖于致病性IGE，其可以使AR持续存在(Pawankar和Ra,1998)。

鼻粘膜B细胞在AR中比外周血中的频率高1000多倍，并且在变应原暴露后产生IgE(Coker等人,2003；Takhar等人,2005)。有证据支持AR患者鼻粘膜中的局部类别转换重组(Cameron等人,2000)，表明组织中定居/局部的B细胞在对变应原的局部免疫应答的情况下经历了Ig亚型转换为IgE(Cameron等人,2003)。在AR患者的鼻粘膜中IgE+B细胞和IgE+浆细胞都被富集(KleinJan等人,2000)。

证实了IgE在AR中的核心作用的是，使用奥马珠单抗的抗IgE治疗在AR患者中是临床有效的，还能抑制季节相关性变应原诱导的组织/血液嗜酸性粒细胞的增多(Holgate等人,2005；Tsabouri等人,2014)。

变应性眼病

季节性和常年性变应性结膜炎是最常见的变应性眼病形式，并与其他特应性疾病相关，其机制与那些已概述的相似，包括源自B细胞的IgE的重要作用。支持这一点的是，使用奥马珠单抗的抗IgE疗法已经在同时存在眼病的特应性个体中显示出疗效(Kopp等人,2009)。

慢性非自身免疫性荨麻疹(慢性自发性荨麻疹，CSU)

荨麻疹是一种常见的由肥大细胞驱动的疾病，可分类为急性和慢性；慢性非自身免疫性荨麻疹自身可分为慢性自发性荨麻疹(CSU)和慢性诱发性荨麻疹(Radonjic-Hoesli等人,2018)。虽然CSU没有明显的外部触发因素且大多数患者有自身免疫性原因，但患者中也有显著的比例没有自身免疫病。在这些患者中，IgE与肥大细胞上的FcεRI结合而无交联被认为可以促进肥大细胞的存活和增殖，降低肥大细胞介质释放的阈值(Chang等人,2015)。与此相一致，以及源自B细胞的IgE在这种情况下的致病作用，迄今为止，已经有2项II期和4项III期随机、安慰剂对照的临床试验令人信服地证实，使用奥马珠单抗的抗IgE疗法消耗IgE对于治疗对当前标准治疗抵抗的CSU是有效和安全的(Chang等人,2015)。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了(i)选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，用于治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病，以及(ii)治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病的方法，通过向所述个体施用有效量的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，其中在(i)和(ii)的情况下，致病性IgE驱动的B细胞疾病是选自下述的疾病：特应性哮喘、特应性皮炎、慢性非自身免疫性荨麻疹、变应性肉芽肿性血管炎、变应性鼻炎和变应性眼病，优选特应性皮炎、特应性哮喘、变应性鼻炎和嗜酸细胞性食管炎。

优选地，所述疾病选自特应性皮炎、特应性哮喘和变应性鼻炎。

氯氮平与高水平的中枢神经系统渗透相关，这可以证明在治疗某些这类疾病中的有价值的属性(Michel等人,2015)。

在某些疾病中，例如特应性皮炎，可能也存在促进疾病病变的T细胞组分。这种情形出现是因为B细胞担当T细胞的专职抗原提呈细胞(由于其数量庞大，其重要性也增加了)。B细胞分泌大量的细胞因子影响T细胞。B-T相互作用参与了对T依赖性蛋白抗原和类别转换的响应。因此，由于氯氮平和去甲氯氮平对减少B细胞数量的作用，预期它们对T细胞具有作用。

适合地，选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药的化合物抑制成熟B细胞，尤其是CSMB和浆母细胞，特别是CSMB。“抑制”是指减少所述细胞的数量和/或活性。因此，适合地，氯氮平或去甲氯氮平减少CSMB和浆母细胞、特别是CSMB的数量。

在一个实施方案中，选自氯氮平、去氯氮平及其前药的化合物具有减少CD19(+)B细胞和/或CD19(-)B浆细胞的作用。

术语“治疗”是指疾病或疾病症状的缓解。术语“预防”是指疾病或疾病症状的预防。治疗包括单独的治疗或与其它疗法联合。治疗包含导致疾病或其症状的改善或减缓疾病或其症状进展速度的治疗。治疗包括预防复发。

术语“有效量”是指在达到期望的治疗效果所必需的剂量和持续时间下有效的量，其中药理学活性剂的任何毒性或有害作用被治疗的有益效果所超过。应当了解，有效剂量将取决于受者的年龄、性别、健康状况和体重、共同治疗的种类(如果存在的话)、治疗的频率和所需效果的性质。最优选的剂量将根据受试者个体定制，正如本领域的技术人员所理解和确定的那样，而无需过度的实验。实例剂量将在以下讨论。

如本文所用，“个体”或“受试者”是指任何哺乳动物，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、农场动物诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养动物诸如猫、狗、兔；实验室动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠，其表现出至少一种与疾病相关的症状、已被诊断出患有疾病、或处于发生疾病的风险中。该术语不表示特定的年龄或性别。适合地，所述个体是人类个体。

可以理解，对于药用，氯氮平和去甲氯氮平的盐应该是药学上可接受的。适合的药学上可接受的盐类对于本领域技术人员来说是显而易见的。药学上可接受的盐类包括那些由Berge,Bighley和Monkhouse J.Pharm.Sci.(1977)66,pp 1-19描述的。这类药学上可接受的盐包括用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸以及有机酸例如琥珀酸、马来酸、乙酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、甲烷磺酸或萘磺酸形成的酸加成盐。其他盐类例如草酸盐或甲酸盐，可用于例如氯氮平的分离，并包括在本发明的范围内。

氯氮平或去甲氯氮平可以结晶或非结晶形式制备，并且如果是结晶形式，可以任选地发生溶剂化，例如作为水合物。本发明在其范围内包括化学计量的溶剂化物(例如水合物)以及含有可变数量的溶剂(例如水)的化合物。

“前药”，例如N-乙酰化衍生物(酰胺)(例如去甲氯氮平的N-乙酰化衍生物)是一种化合物，其在施用给受者时能够(直接或间接地)提供氯氮平或其活性代谢物或残留物。适合的前药的其它此类例子包括除了氯氮平本身之外的去甲氯氮平的烷基化衍生物。

同位素标记的化合物，其与氯氮平或去甲氯氮平相同，但事实上一个或多个原子被具有与自然界中最常见的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所替换，或其中具有自然界中更不常见的原子质量或质量数的原子的比例增加(后一概念称为"同位素富集")，也涵盖于本发明的用途和方法。可掺入氯氮平或去氯氮平的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟、碘和氯的同位素如²H(氘)、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁸F、¹²³I或¹²⁵I，它们可以是天然存在的或非天然存在的同位素。

含有前述同位素和/或其他原子的同位素的氯氮平或去甲氯氮平以及氯氮平或去甲氯氮平的药学上可接受的盐，可用于本发明的用途和方法。同位素标记的氯氮平或去甲氯氮平，例如已掺入放射性同位素诸如³H或¹⁴C的氯氮平或去甲氯氮平，在药物和/或底物组织分布测定中是有用的。氚化的，即³H，和碳-14，即¹⁴C同位素因其易于制备和可检测性而特别优选。¹¹C和¹⁸F同位素在PET(正电子发射断层成像)中特别有用。

由于氯氮平或去甲氯氮平旨在用于药物组合物中，容易理解的是，它优选以基本上纯的形式提供，例如至少60％的纯度，更适合地至少75％的纯度和优选至少85％，尤其是至少98％的纯度(％基于重量/重量比)。化合物的不纯的制品可用于制备药物组合物中使用的更纯净形式。

一般来说，氯氮平或去甲氯氮平可根据本领域技术人员已知的有机合成技术制备(如描述在例如US3539573之中的)。

选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的用于治疗的化合物通常作为药物组合物施用。还提供了药物组合物，所述组合物包含氯氮平或去甲氯氮平或其药学上可接受的盐和/或溶剂化物和/或其前药，以及药学上可接受的稀释剂或载体。提供所述组合物用于治疗或预防个体中的致病性IgE驱动的B细胞疾病，其中所述化合物使所述个体体内的成熟B细胞受到抑制。

选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物可通过任何方便的方法施用，例如通过口服、胃肠外、颊部、舌下、鼻、直肠或透皮给药，以及相应调整的药物组合物。其他可能的施用途径包括鼓室内和耳蜗内给药。适合地，选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物是口服施用的。

口服施用时具有活性的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物可以配制成液体或固体，例如作为糖浆剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂或锭剂。

液体制剂一般由在合适的液体载体例如水性溶剂如水、乙醇或甘油或非水性溶剂如聚乙二醇或油中的活性成分的悬浮液或溶液组成。该制剂还可含有助悬剂、防腐剂、调味剂和/或着色剂。

片剂形式的组合物可以使用任何合适的常规用于制备固体制剂的药物载体，诸如硬脂酸镁、淀粉、乳糖、蔗糖和纤维素来制备。

可以使用常规封装程序制备胶囊形式的组合物，例如可以使用标准载体制备含有活性成分的颗粒，然后将其填充到硬明胶胶囊中；或者可以使用任何合适的药物载体例如水性胶、纤维素、硅酸盐或油制备分散液或悬浮液，然后将分散液或悬浮液填充到软明胶胶囊中。

典型的胃肠外组合物由活性成分在无菌水载体或胃肠外可接受的油例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油中的溶液或悬浮液组成。或者，该溶液可以冻干，然后在施用前用合适的溶剂复原。

用于鼻腔或肺部施用的组合物可方便地配制成气雾剂、喷雾剂、滴剂、凝胶剂和粉剂。气雾剂制剂通常包含活性成分在药学上可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细悬浮液，并通常以无菌形式在密封容器中以单剂量或多剂量呈现，密封容器可采用筒状或再充填物形式，供雾化装置使用。或者，密封容器可以是一次性分配装置，诸如单剂量鼻腔或肺部吸入器或装有计量阀的气雾剂喷罐。当剂型包含气雾剂喷罐时，它将含有一种推进剂，该推进剂可以是压缩气体，例如空气，或有机推进剂，诸如氟氯烃或氢氟烃。气雾剂剂型也可采用泵雾化器的形式。

适用于颊部或舌下施用的组合物包括片剂、锭剂和软锭剂(pastille)，其中活性成分与载体如糖和阿拉伯胶、西黄蓍胶或明胶和甘油一同配制。

用于直肠施用的组合物方便地采用含有常规栓剂基质例如可可脂的栓剂形式。

适用于皮肤局部施用的组合物包括软膏、凝胶和贴剂。

在一个实施方案中，组合物为单位剂量形式，诸如片剂、胶囊或安瓿。

组合物可以被制备为施用后具有即刻释放曲线(即在口服组合物的情况下通过摄入后)，或施用后具有持续或延迟释放曲线。

例如，WO2006/059194中描述了一种旨在提供24小时内恒定释放氯氮平的组合物，其内容以其整体全部并入本文。

根据给药方法，组合物可以含有按重量计从0.1％至100％，例如按重量计从10％至60％的活性物质。根据给药方法，该组合物可含有按重量计从0％至99％，例如按重量计从40％至90％(重量)的载体。根据给药方法，该组合物可含有从0.05mg至1000mg，例如从1.0mg至500mg的活性物质(即氯氮平或去甲氯氮平)。根据给药方法，该组合物可含有从50mg至1000mg，例如从100mg至400mg的载体。用于治疗或预防前述疾病的氯氮平或去甲氯氮平的剂量将以通常的方式随着疾病的严重程度、患者的体重和其它类似因素而变化。然而，作为一般指导，以游离碱形式的氯氮平的适合的单位剂量可以是0.05至1000mg，更适合的是1.0至500mg，并且此类单位剂量可以每天施用一次以上，例如每天两或三次。这样的治疗可以延续数周或数月。

选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物可与另一种治疗剂组合施用，所述另一种治疗剂用于治疗致病性IgE驱动的B细胞疾病，诸如那些抑制B细胞或B细胞-T细胞相互作用的药物。其他治疗剂包括例如：抗TNFα药物(诸如抗TNFα抗体例如英利昔单抗或阿达木单抗(adalumumab))、神经钙蛋白抑制剂(诸如他克莫司或环孢素)、抗增殖剂(诸如麦考酚酸例如麦考酚酸吗乙酯或钠，或硫唑嘌呤)、一般抗炎药(诸如羟氯喹或NSAIDS如酮洛芬和秋水仙碱)、mTOR抑制剂(诸如西罗莫司)、类固醇(诸如泼尼松)、抗CD80/CD86药物(诸如阿巴西普)、抗CD-20药物(诸如抗CD-20抗体例如利妥昔单抗)、抗BAFF剂(诸如抗BAFF抗体，例如tabalumab或贝利木单抗，或阿塞西普)、免疫抑制剂(诸如甲氨蝶呤或环磷酰胺)、抗FcRn剂(例如抗FcRn抗体)、抗IgE抗体(例如奥马珠单抗)和其他抗体(例如ARGX-113、PRN-1008、SYNT-001、维妥珠单抗(veltuzumab)、ocrelizumab、奥法木单抗(ofatumumab)、obinutuzumab、ublituximab、阿仑珠单抗、milatuzumab、依帕珠单抗和blinatumomab)。

可与本发明联合使用的其它疗法包括非药物疗法，诸如静脉免疫球蛋白疗法(IVIg)、皮下免疫球蛋白疗法(SCIg)例如易化的皮下免疫球蛋白疗法、血浆去除术和免疫吸附。

因此，本发明提供了用于治疗或预防致病性IgE驱动的B细胞疾病的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，该化合物与第二或其他治疗剂组合使用，所述第二或其他治疗剂用于治疗或预防致病性IgE驱动的B细胞疾病，例如选自下述的物质：抗TNFα药物(诸如抗TNFα抗体例如英利昔单抗或阿达木单抗)、神经钙蛋白抑制剂(诸如他克莫司或环孢素)、抗增殖剂(诸如麦考酚酸例如麦考酚酸吗乙酯或钠，或硫唑嘌呤)、一般抗炎药(诸如羟氯喹或NSAIDS如酮洛芬和秋水仙碱)、mTOR抑制剂(诸如西罗莫司)、类固醇(诸如泼尼松)、抗CD80/CD86药物(诸如阿巴西普)、抗CD-20药物(诸如抗CD-20抗体例如利妥昔单抗).抗BAFF药物(诸如抗BAFF抗体，例如tabalumab或贝利木单抗，或阿塞西普)、免疫抑制剂(诸如甲氨蝶呤或环磷酰胺)、抗FcRn剂(例如抗FcRn抗体)和其他抗体(例如ARGX-113、PRN-1008、SYNT-001、维妥珠单抗、ocrelizumab、奥法木单抗、obinutuzumab、ublituximab、阿仑珠单抗、milatuzumab、依帕珠单抗和blinatumomab)。

当选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物与其它治疗剂组合使用时，这些化合物可通过任何方便的途径单独、顺序或同时施用。

上述组合可方便地以药物制剂的形式呈现以使用，因此包含如上定义的组合以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物制剂构成了本发明的另一个方面。此类组合的各个独立成分可以顺序或同时以分开的或组合的药物制剂的形式施用。此类组合的各个独立成分也可以通过相同或不同的途径分别使用。例如，选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物和所述其它治疗剂可以都通过口服给药。或者，选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物可以口服给药，而所述其他治疗剂可以经由静脉或皮下给药。

通常，将选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物向人施用。

实施例

实施例1

对人类患者进行抗精神病药物治疗的首次观察性研究

为了评估抗体缺乏与氯氮平使用之间可能存在的关联，发明人进行了一项横断面病例对照研究，以比较施用氯氮平或替代性抗精神病药物的患者中免疫球蛋白水平和特异性抗体(针对嗜血杆菌B(Hib)、破伤风和肺炎球菌)的水平。

实验方法：

在2013年11月至2016年12月期间，接受氯氮平或非氯氮平的抗精神病药物的成人(>18岁)在到Cardiff&Vale和Cwm Taf Health Boards中的10个社区精神卫生信托(CMHT)门诊诊所进行常规门诊服务期间被专家研究人员招募(表1)。经同意后，参与者完成了一份简短的生活方式、药物史和感染问卷，然后进行血液采样。在需要的情况下，药物史用患者的普通医疗记录进行确认。正式的精神病学诊断和抗精神病用药通过医疗记录确认，与其他研究一致。患者的住院率通过对招募前12个月的电子回顾确认。排除了已知可能导致低丙种球蛋白血症的患者，包括既往的化疗、卡马西平、苯妥英、抗疟疾药、卡托普利、大剂量糖皮质激素、血液学恶性肿瘤和22q11缺失综合征。

表3列出了13名施用氯氮平的患者的临床和免疫学数据，其中11名患者是研究之外转诊到免疫学诊所进行评估的。这些、健康对照和普通可变型免疫缺陷病(CVID)患者的实验室数据见图3。11名独立转诊的患者被排除在总体研究分析之外。

免疫球蛋白水平(IgG、IgA和IgM)的检测方法有：比浊法(Siemens BN2Nephelometer；Siemens)、血清电泳(Sebia Capillarys 2；Sebia,Norcross,GA,USA)以及在适当的情况下，血清免疫固定(Sebia Hydrasys；Sebia,Norcross,GA,USA)。对流感嗜血杆菌、破伤风和肺炎球菌荚膜多糖的特异性抗体滴度用ELISA(The Binding Site,Birmingham,UK)测定。使用Beckman Coulter FC500(Beckman Coulter,California,USA)流式细胞仪对淋巴细胞亚群、初始T细胞和EUROclass B细胞表型分型进行枚举。所有测试均在威尔士大学医院的英国聘任鉴定服务处(UKAS)认可的免疫学实验室进行。实验室采用的成人免疫球蛋白水平参考范围为，IgG 6-16g/L，IgA 0.8-4g/L，IgM 0.5-2g/L。

使用Microsoft Excel和Graphpad Prism 6.07版(Graphpad,San Diego,California,USA)对实验室和临床数据进行统计分析。进行独立样本t检验，除非D'Agoustino&Pearson检验显示与高斯分布有显著偏差，在这种情况下，使用非参数Mann-Whitney检验。所有检验均为双尾，使用P<0.05的显著性水平。

结果

研究参与者

共接触了291名施用氯氮平的患者和280名未使用氯氮平患者，123名氯氮平患者和111名未使用氯氮平患者同意进入研究(表1)。按照协议当每组达到100名患者的目标后，停止招募。在性别上存在小的差异，氯氮平治疗组男性较多(53％对50％)，氯氮平组平均年龄更低(45岁对50岁)。这些差异不太可能是相关的，因为血清免疫球蛋白的成人参考范围没有性别差异，而且精神分裂症中男性居多。各组之间的吸烟、糖尿病、COPD/哮喘和酒精摄入水平相似。与对照组相比，氯氮平组更多患者因感染住院(0.12对0.06每患者年)并且更多患者每年施用>5个疗程抗生素(5.3％对2％)。在亚组分析中评估了诊断为精神分裂症、用药和吸烟作为抗体缺乏的危险因素的可能影响(表2)。

表1.氯氮平治疗和未使用氯氮平的患者特征

氯氮平对抗体水平的影响

图1A-C显示，在接受氯氮平治疗的患者中，与未使用氯氮平的对照组相比，所有三类免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)的浓度均显著降低，对于IgG、IgA和IgM的每一种，整体分布均向更低免疫球蛋白的水平转变。123例患者中免疫球蛋白水平低于参考范围的比例为IgG9.8％(p<0.0001)、IgA 13.0％(p<0.0001)和IgM 38.2％(p<0.0001)，相比之下111例未使用氯氮平者IgG 1.8％、IgA 0.0％和IgM 14.4％。氯氮平治疗和未使用氯氮平患者都有很大比例特异性抗体水平低于HiB(51％和56％低于1mcg/ml(Orange等人,2012))、肺炎球菌(54％和56％低于50mg/L(Chua等人,2011))和破伤风(12％和14％低于0.1IU/ml)的保护水平。肺炎球菌IgA(31U/ml对58.4U/ml p<0.001)和IgM(58.5U/ml对85.0U/ml p<0.001)水平在氯氮平治疗患者中与未使用氯氮平患者相比显著更低。

进行了亚组分析(表2)，以确定免疫球蛋白的减少是否潜在地解释为由于混杂因素，包括任何其他药物、精神分裂症的诊断和吸烟。B栏显示了排除其他继发性原因导致抗体缺乏的效果评估(加上发现了额外诊断的少量患者，见表1)。基于使用抗癫痫药物而排除的患者数量在氯氮平治疗组更多，可能反映了为其情绪稳定特性而使用这些药物，而非作为癫痫的治疗。

表2. A到D亚组的免疫球蛋白水平和特异性抗体水平。

除非另有说明，否则数据显示为平均值±1SEM。*独立T检验(正态分布)或

Mann-Whitney(非正态分布)。

显著性水平：

氯氮平与IgG、IgA、IgM和肺炎球菌IgA和IgM降低的关联性在所有亚组中以95％的置信区间保持统计学显著，包括当精神病学诊断仅限于精神分裂症时(C栏)，以及当排除非吸烟者时(D栏)。当排除抗体缺乏的继发性原因时(B列)，免疫球蛋白降低的比值比(以95％置信区间)为IgG 9.02(1.11–73.7)、IgA:32.6(1.91–558)和IgM:2.86(1.42–5.73)。此外，如图2所示，较长的氯氮平治疗的持续时间与较低的血清IgG水平相关(P 0.014)。在用替代性抗精神病药物治疗的未使用氯氮平患者中没有观察到这种情况，尽管治疗时间比氯氮平治疗组长。

施用氯氮平的转诊患者的免疫学评估

13名施用氯氮平的患者被独立转诊到免疫学诊所评估抗体缺乏。两名患者此前已被招募到研究中，其他11名患者未被纳入研究以避免偏倚。13名患者中有5名是通过全威尔士计算球蛋白筛查计划鉴定的。因此，其可能在这13名“真实生活”的患者组中进行更详细的免疫学评估，以提供额外的背景信息(表3)。

表3. 13名转诊的施用氯氮平患者的免疫学特征

图1D、3B、4B和5所示的某些额外分析是对一组稍有不同的转诊氯氮平患者进行的，其包含表3中提到的13名患者，加上4名额外招募的患者。就图1D而言，17名患者中的4名因各种原因被删除，因此呈现数据的患者数量为13名。关于图3B，呈现数据的患者数量为图中所示。关于图4B，呈现数据的患者数量如下所述。关于图5，呈现数据的患者数量为15名。

所有患者的免疫球蛋白均降低(平均IgG 3.6g/L，IgA 0.34g/L和IgM 0.21g/L)。没有严重的总体淋巴细胞减少或B细胞淋巴细胞减少，然而，所有患者的CSMB百分比都有很大的下降(平均1.87％，参考范围6.5-29.1％)。CSMB的大幅减少是普通可变型免疫缺陷病(CVID)患者的特征，CVID是成人中最常见的严重原发性免疫缺陷。与健康对照组相比，这些氯氮平治疗的和CVID患者中CSMB的百分比如图3A所示(P<0.0001)。6名使用氯氮平患者的浆母细胞水平与CVID患者和健康对照组的比较见图4A(p＝0.04)，以及与年龄匹配的CVID和健康对照组的比较见图3B。浆母细胞的减少也是普通可变型免疫缺陷病(CVID)患者的特征，这在氯氮平治疗的患者中也观察到了。评估的10/11名患者对疫苗接种的应答受损，管理包括2/13名患者的紧急后备抗生素，9/13名患者的预防性抗生素，6/13名患者用免疫球蛋白替代疗法(IGRT)治疗。没有患者因抗体缺乏而停用氯氮平。没有观察到发生在CVID患者的亚群中的炎症或肉芽肿性并发症。

疫苗特异性-IgG应答作为临床评估的一部分进行常规评估，并在图4B中进行了总结。在初始评估时，低于推定保护阈值的水平很常见，12/16名患者(75％)中的乙型流感嗜血杆菌(HiB)IgG<1mcg/ml；15/16名患者(94％)中的肺炎球菌IgG<50mg/L；6/16名测试的患者个体(38％)中的破伤风IgG<0.1IU/mL。4周后评估Menitorix(HiB/MenC)疫苗接种后的血清学，5/12(42％)人未能建立≥1mcg/ml的嗜血杆菌-IgG应答，1/12人未能超过世界卫生组织规定的≥0.1IU/mL的接种后破伤风-IgG水平。纽莫法(Pneumovax II)接种后，8/11(73％)人未能产生超过≥50mg/L的阈值的IgG应答。

图5显示了血清IgG水平方面的逐渐恢复，3年从3.5g/L到5.95g/L，但停止使用氯氮平后IgA或IgM没有明确的改善。

有一位患者因中性粒细胞减少症而随之停用氯氮平，停用氯氮平后恢复正常。在随后的24个月，血清IgG水平从3.3g/L逐渐增加到4.8g/L，然后是5.95g/L，而IgA和IgM仍然很低。IgG的增加伴有类别转换记忆B细胞的同时增加，从1.58％到2.77％，表明停用氯氮平后的逐渐恢复。

图1D示出了密度图，显示接受氯氮平治疗转诊以获得免疫学评估的患者的血清免疫球蛋白水平的分布。还对比显示了经氯氮平治疗(n＝94)和未使用氯氮平(n＝98)的血清免疫球蛋白分布——改自(Ponsford等人,2018a)。虚线代表健康成人的第5和第95位百分位数。与未使用氯氮平患者相比，在氯氮平患者中观察到IgG、IgA和IgM中每一项在总免疫球蛋白的分布曲线向左移动(减少)；这一发现对于额外招募的使用氯氮平的转诊患者特别明显。

结果总结

患者中的氯氮平治疗带来所有类型的免疫球蛋白的显著下降。氯氮平治疗的患者(n＝123)中低于免疫球蛋白参考范围的患者百分比更高，相比于未使用氯氮平的患者(n＝111)(IgG<6g/L:9.8％对1.8％；IgA<0.8g/L:13.1％对0..0％；IgM<0.5g/L:38.2％对14.2％)(P<0.0001)(见图1A-C)。

延长氯氮平治疗时间与接受氯氮平治疗的患者IgG水平渐进性降低有关，但在使用其他抗精神病药物的未使用氯氮平的患者中不相关(见图2)。

值得注意的是，氯氮平对IgG水平的影响可见到是可逆的，尽管缓慢(年)，但这与氯氮平对特别是长寿命IgG+浆细胞的影响相符合。

特异性IgG抗体在氯氮平治疗组和未使用氯氮平组均低于保护性水平(HiB51.2％对55.9％；肺炎球菌53.7％对55.9％；破伤风12.2％对13.5％))。然而，在氯氮平治疗的患者中肺炎球菌IgA和IgM水平相比于未使用氯氮平患者显著更低(IgA 31.0U/L对58.4U/L；IgM 58.5U/L对85U/L)(P<0.001)(见表2)。

与健康对照组(n＝36)和参考范围6.5-29.1％相比，在独立转诊且未纳入总体研究的氯氮平治疗患者(n＝12)和CVID患者(n＝54)中的CSMB平均水平显著降低在1.87％(p<0.0001)(见图3A)。氯氮平治疗的患者中浆母细胞的平均水平也降低了(p＝0.04)。

图3B显示了图3A中数据的扩展，其中将转诊的使用氯氮平患者与年龄匹配的CVID和健康对照受试者进行比较。第一张图显示，使用氯氮平、CVID和健康对照之间的B细胞总数相似，第二张图显示氯氮平治疗和健康对照之间边缘区B细胞数量没有显著差异，而在CVID患者中观察到数量增加。下面两图显示在氯氮平治疗和CVID患者中都存在CSMB和浆母细胞比健康对照显著减少。

实施例2

对进行抗精神病药物治疗的人类患者的第二次观察性研究

本研究在接受抗精神病治疗的患者中采用横断面观察设计，旨在测试与其他抗精神病药物相比，氯氮平的使用、免疫表型(特别是循环B细胞亚类和免疫球蛋白水平)和记录的感染之间的关联。该研究正在招募来自Ashworth医院的已确定使用氯氮平和其他抗精神病药物的患者，以及来自Mersey Care NHS Foundation Trust中的社区精神卫生服务处的门诊患者。该研究结果将部分地提供验证在正交人群中进行的最初的观察性研究的结果，此外还会通过更详细的免疫表型分析将观察结果扩展到对氯氮平对B细胞群的影响。

该研究需要进行单次血液检测以获得详细的免疫学分析，并完成一份基于临床研究表格的问卷，详细说明重要的临床参数，包括记录的感染史、既往病史和同时使用的药物。研究结果将进行分析，以确定氯氮平、循环中B细胞水平/功能和免疫球蛋白水平、其频次和严重性、以及与其他抗精神病药物相关的特异性之间的任何关联。

研究目的和目标

本研究寻求回答的具体研究问题是：

主要结果：

i)相比于对照中观察到的低于参考范围的患者比例，使用氯氮平长期治疗是否与(a)特定B细胞亚类(即类别转换记忆B细胞和浆细胞)低于参考范围的患者比例更高和(b)循环中免疫球蛋白水平(IgG、IgA和IgM)低于参考值的患者比例更高相关？

次要结果：

ii)与对照相比，氯氮平是否与特异性抗体(如肺炎球菌、破伤风和Hib)的减少有关？

iii)与对照相比，使用氯氮平是否与对循环T细胞(数量/功能)的影响相关？

iv)与对照相比，氯氮平是否与更高频率的感染和抗生素使用相关？

v)主要结果是否与氯氮平治疗的持续时间有关？

免疫生物标志物

检测以下免疫生物标志物。

1.总IgG、IgM、IgA和血清电泳(在适当时进行免疫固定)。

2.特异性IgG水平：破伤风类毒素、肺炎球菌、Hib(±肺炎球菌的IgA和IgM)。

3.通过FACS分析详细的免疫细胞表型分型，包括：

a.淋巴细胞表型-(包括CD3、CD4、CD8、CD19、CD56)

b.B细胞组(基于EUROClass分类的B细胞表型(Wehr等人,2008))，包括CSMB细胞和浆母细胞。

c.初始T细胞组

4.从PBMC中提取RNA(全血储存在RNA保存液中，例如通用容器中含有约4-5mLRNALater或在PAXgene管中以保持RNA的完整性)，用于后续的RNA转录分析。

所有的免疫生物标志物样本都在被UKAS认可验证的NHS实验室进行处理和分析。

分析结果

在撰写本研究时，仍在招募中，但已对收集到的现有免疫表型数据进行了中期分析(招募工作已进行了约2/3)，但要注意，这只代表了最终计划的样本量(n～100)的一部分。

迄今为止的主要发现详述如下。

a.使用氯氮平的患者与从未使用氯氮平的患者(即对照、未使用氯氮平)相比，循环中总IgG、IgA和IgM水平显著降低(见图6A-C)。这些降低对于A和M亚类的Ig来说相对更大。此外，在接受氯氮平治疗的人群中，针对肺炎球菌的IgG抗体存在更低的趋势(见图7)。

b.各组间CD19⁺B细胞总体数量无明显差异(见图8A-B)。

c.以占总CD19⁺B细胞的比例表示，初始(CD19⁺CD27^-)B细胞数量小幅增加(见图9A-C)。

d.在用氯氮平治疗的患者中，类别转换记忆B细胞(CD27⁺IgM^-IgD^-)特异性下降的趋势强烈(与对照相比P＝0.06，按％B)(见图11A-C)，而总记忆B细胞池(见图10A-C)或IgM^hiIgD^lo记忆B细胞亚群(见图12A-C)没有波动。

e.循环中过渡性B细胞或边缘区B细胞的水平在各组间无显著差异(见图13A-C和14A-C)。

f.用氯氮平治疗的患者的浆母细胞水平有强烈的下降趋势(与对照未使用氯氮平的相比P＝0.07)(见图15A-C)。

实施例3

野生型小鼠体内研究-氯氮平与氟哌啶醇对比的效果。

评估了在稳定状态下(即没有特定的免疫性挑战)的野生型小鼠中，氯氮平对初级(骨髓)和次级(脾脏和肠系膜淋巴结)淋巴组织中B细胞发育、分化和功能的影响(从循环中免疫球蛋白水平推断)。

具体目标是：

a)确定氯氮平对健康小鼠骨髓和主要次级淋巴器官(脾脏和肠系膜淋巴结)中主要B细胞亚群的影响。

b)确定氯氮平对B细胞免疫表型的影响是否存在剂量效应关系。

c)评估施用氯氮平对健康小鼠的循环免疫球蛋白谱的影响。

d)通过与另一种抗精神病药物比较，确定氯氮平对上述读数影响的特异性。

实验方法

动物：

研究使用了年轻的成年(年龄7-8周)C57BL/6成熟雌性小鼠。小鼠被安置在22℃的独立通风笼中，可自由获得食物和水，12小时的明亮/黑暗周期(早8点/晚8点)。小鼠到达后适应1周后开始实验。

实验组和剂量选择：

小鼠被分配到如下五个实验组之一：

1.对照组盐水

2.氯氮平低剂量 2.5mg/kg

3.氯氮平中间剂量 5mg/kg

4.氯氮平大剂量 10mg/kg

5.氟哌啶醇 1mg/kg(中间剂量)

剂量以交错的批次给予，每批包含分配到每个实验臂的小鼠，以减少偏倚。

剂量的选择最初是基于对长期给小鼠施用这些药物的研究的文献回顾(Ishisaka等人,2015；Li等人,2016；Mutlu等人,2012；Sacchi等人,2017；Simon等人,2000；Tanyeri等人,2017)，其中绝大多数采用腹腔内(IP)给药途径：氯氮平(1.5、5、10、25mg/kg/天)(Gray等人,2009；Moreno等人,2013)；氟哌啶醇(0.25mg/kg、1mg/kg/天)(Gray等人,2009)，并考虑两种药物的LD50(氯氮平200mg/kg、氟哌啶醇30mg/kg)。

随后，进行了试点研究，以评估这些药物的影响，特别是较大剂量的氯氮平的影响，以完善剂量选择并最大限度地提高治疗小鼠的福利。从5mg/kg开始的氯氮平剂量中可以明显看出明确的剂量相关的镇静作用，在评估的最高剂量(20mg/kg和25mg/kg)中观察到明显的精神运动抑制(在深度和持续时间方面)。此外，对体温调节的影响也很明显，因此需要使用暖箱和一般支持性措施来保护热稳态。这些不良反应与氯氮平在临床前(Joshi等人,2017；McOmish等人,2012；Millan等人,1995；Williams等人,2012)和临床(Marinkovic等人,1994)环境中的已知(在靶)资料一致，并在最初几天的给药后出现耐受性，正如在人类中已描述的那样(Marinkovic等人,1994)。

小鼠(n＝12/组)通过每天一次IP注射各自的对照溶液/氯氮平/氟哌啶醇进行连续21天的治疗。

用于免疫表型分型的生物样本：

实验结束后，对小鼠实施人道安乐死并获取血液样本进行血清分离，在-80℃下保存，随后通过ELISA测量免疫球蛋白谱(包括主要免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM以及两种轻链κ和λ)。

同时，从骨髓(来自股骨)、脾脏和肠系膜淋巴结迅速收集组织样本，使用多激光流式细胞仪检测和分析来评价这些区室的细胞组成。

通过流式细胞术进行B细胞免疫表型分型：

分别为初级(骨髓)和次级(脾脏/淋巴结)淋巴组织制备聚焦的B细胞FACS(荧光激活细胞分选)组，以评估药物对整个B细胞发育的抗原非依赖和依赖阶段的B细胞亚群的相对组成的影响。

在相关组织(即骨髓、脾脏和肠系膜淋巴结)中对流式细胞术组所采用的单个抗体进行了试点测试，并确定了每个抗体的最佳稀释度，以便能够清楚识别亚群。用BDFACSymphony提取FACS数据，并用FlowJo软件进行分析。

实验结果

体重：

氯氮平(CLZ)在5mg/kg和10mg/kg的剂量下都会引起体重的短暂下降，在3天内达到最大，但到第9天时完全恢复到基线，之后体重逐渐增加(见图16和17)。这一发现很可能反映了氯氮平在用药最初几天对流体/食物摄取的镇静作用，并有证据显示在实验过程中产生对此新情况的耐受。

骨髓中B细胞的早期发育：

B细胞起源于造血干细胞(HSC)，其是位于骨髓中的具有自我更新能力的多能性细胞。依赖于与使用细胞表面标志物定义的骨髓基质细胞的物理的和可溶性趋化因子/细胞因子的相互作用，这种早期的B细胞发育从定型的普通淋巴祖细胞发生，并经过一组阶段后继续进行。

最早的B细胞祖先是前祖B细胞，它表达B220并具有种系Ig基因。接下来，祖B细胞重新排列其H(重)链Igμ基因，并在转录因子Pax5的控制下表达CD19。在前B细胞阶段，细胞下调CD43，表达细胞内Igμ，然后以Irf4依赖的方式重新排列L(轻)链并上调CD25。成功选择的细胞成为未成熟(表明IgM⁺IgD^-)B细胞。通过中枢耐受过程测试未成熟B细胞的自身反应性，那些对自身抗原没有强烈反应性的B细胞经由窦道离开骨髓，在脾脏中继续成熟。

任何剂量的氯氮平都没有观察到骨髓(BM)中B细胞的总体减少(见图18)。然而，以10mg/kg氯氮平观察到极早期的B细胞前体，前祖B细胞(即B220⁺CD19^-CD43⁺CD24^loBP-1^-IgM^-IgD^-)的比例显著增加，而随后的祖B细胞部分没有任何明显变化(见图18)。相反，氟哌啶醇对这些早期发育的B细胞亚群都没有可见的显著影响。

检查骨髓中B细胞发育的后续阶段，发现用氯氮平治疗的小鼠中，前B细胞(即B220⁺CD19⁺CD43^-CD24⁺BP-1^-IgM^-IgD^-)减少(见图19)。值得注意的是，这种效果表现出剂量依赖性，与对照小鼠观察到的有显著差异，即使是采用最低剂量的氯氮平(2.5mg/kg)。此外，使用氯氮平减少了增殖的前B细胞(即B220⁺CD19⁺CD43^-CD24^hiBP-1⁺IgM^-IgD^-)的百分比，5mg/kg剂量达到显著性(见图19)。相应地，确认骨髓中未成熟B细胞(即B220⁺CD19⁺CD43^-CD24⁺IgM⁺IgD^-)的百分比减少(见图19)。

这些发现共同表明，氯氮平对早期B细胞发育有特别影响，在没有特定的免疫性挑战的情况下，前祖B细胞和前B细胞阶段之间有轻度的停滞。

外周B细胞发育——总脾脏B细胞。

从骨髓移居后，功能上不成熟的B细胞在次级淋巴器官中经历进一步发育，使得进一步暴露于(外周)自身抗原和外周耐受(通过凋亡、失能或存活引起细胞消除)。大多数离开骨髓的未成熟B细胞不能存活以成为完全成熟的B细胞，这一过程受淋巴滤泡中接收到的成熟和存活信号调节，包括滤泡树突细胞分泌的BAFF(B细胞活化因子)。

用5mg/kg和10mg/kg的氯氮平治疗的小鼠，可见到表示为占总存活脾细胞比例的脾脏B细胞(即B220⁺TCR-β^-)的百分比显著更低(见图21)。没有发现影响到其他细胞群(即B220^-TCR-β^-)，其可能包括γδT细胞(不表达αβT细胞受体，TCR)、自然杀伤(NK)细胞或其他罕见的淋巴细胞群体(见图21)。这伴随着脾脏T细胞(即B220-TCR-β+)百分比的对应的增加(见图21)。相反，与对照组相比，反映总存活脾细胞的一小部分比例的活化T细胞(即B220⁺TCR-β⁺)，被氯氮平以剂量依赖性的方式所降低，氟哌啶醇也轻度显现出这种效应(见图21)。

这些研究结果表明，氯氮平，而非氟哌啶醇，除了在骨髓B细胞前体中观察到的改变外，还能影响外周(脾)B细胞。

脾脏B细胞亚群：

离开骨髓出来并进入循环中的未成熟B细胞被称为过渡性B细胞。这些未成熟的细胞进入脾脏，竞争性地到达脾脏滤泡，经由过渡阶段分化为有免疫功能的初始成熟B细胞。这种情况在滤泡中依次发生，从过渡期1型(T1)细胞(类似于骨髓中的未成熟B细胞)到2型(T2)前体。后者被认为是成熟初始B细胞的直接前体。T2 B细胞在对B细胞受体刺激的响应中显示出比T1 B细胞更大的效力，表明T2亚类可能优先经历阳性选择，并进展为长寿命的成熟B细胞池(Petro等人,2002)。

过渡期细胞可分化为代表定居于次级淋巴器官中的大部分外周B细胞的滤泡B细胞，或一种数量更少的群体，居于白/红髓交界的边缘区(MZ)B细胞，其能够对血源性抗原/病原体作出快速响应。

发现用氯氮平治疗的小鼠在脾脏中新移居的过渡期1型(T1)B细胞比例轻度降低，包括在2.5mg/kg剂量下，这可能部分反映了骨髓未成熟B细胞比例的降低(见图22)。相反，在所有剂量的氯氮平中都发现T2 B细胞比例的小幅增加(见图22)，这与T1 B细胞亚类的阳性选择增强以便潜在地进展为长寿命的成熟B细胞池相一致。

虽然施用氯氮平降低了存活脾细胞中脾脏B细胞所占的部分(见图21)，但在脾脏滤泡B细胞亚群(即B220⁺CD19⁺CD21^midCD23⁺)或边缘区B细胞亚群(即B220⁺CD19⁺CD21⁺CD23^Lo/-)中均未发现特异性的减少(见图22)，这表明在免疫上未受到挑战的状态下，小鼠中施用氯氮平导致脾脏B细胞群体的总体减少。

生发中心(GC)是二级淋巴组织的B细胞滤泡响应于T细胞依赖性抗原的(例如由于感染或免疫)激发而在数天内形成的微解剖结构(Meyer-Hermann等人,2012)。在GC内，B细胞的抗体可变区发生体细胞高频突变，随后测试突变的B细胞受体针对GC定居的滤泡树突细胞展示的抗原。通过抗体亲和力成熟的过程，确认并扩增与抗原亲和力更高的突变B细胞。此外，在GC反应前和反应过程中，成熟初始(IgM⁺IgD⁺)B细胞的免疫球蛋白重链位点发生类别转换重组，改变了抗体的效应子功能，但没有改变其对抗原的特异性或亲和力。这导致响应于抗原刺激，IgM向其他免疫球蛋白类别(IgG、IgA或IgE)的亚型转换。

因此，GC是高强度B细胞增殖和细胞死亡的场所，其结果包括细胞凋亡、对新一轮体细胞高频突变的阳性选择(即循环再入)、或B细胞分化成为分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞(Suan等人,2017)。在稳定状态下，GC细胞(即B220+CD19+IgD-CD95+GL-7+)在脾脏总活B细胞中构成非常小的比例，而对氯氮平给药的响应与对照或氟哌啶醇相比没有观察到差异(见图22)。

骨髓抗体分泌细胞群：

抗体分泌细胞代表B细胞系的终末分化，在健康者中广泛分布于初级和次级淋巴器官、胃肠道和粘膜(Tellier和Nutt,2018)。这些细胞都衍生自活化B细胞(滤泡、MZ或B1)。浆母细胞，代表着短命的循环细胞，可以来自初次应答(产生亲和力相对较低的抗体)中的滤泡外的分化途径，也可以来自在GC中经历过亲和力成熟的记忆B细胞(Tellier和Nutt,2018)。

在GC中发育的浆母细胞可以离开次级淋巴器官并归巢至骨髓。在这里，只有一小部分被认为被保留下来，并在专门的微环境生存龛中建立自己的位置，成熟为长寿命浆细胞(Chu和Berek,2013)，这一过程被认为是通过停靠到间质网状基质细胞上(Zehentmeier等人,2014)以及需要造血细胞(例如嗜酸性粒细胞)(Chu等人,2011)、B细胞生存因子(例如APRIL和IL-6)(Belnoue等人,2008)的存在和低氧条件(Nguyen等人,2018)而受到调控的。

在健康状态下，骨髓中容纳了大部分长寿命浆细胞。与对照组相比，5和10mg/kg的氯氮平可诱导骨髓中长寿命浆细胞(即B220^loCD19^-IgD^-IgM^-CD20^-CD38⁺⁺CD138⁺)的百分比显著降低约30％(见图20)。相反，氟哌啶醇对该特定B细胞群没有影响(见图20)。采用任何治疗，骨髓中的类别转换记忆B细胞(即B220⁺CD19⁺CD27⁺IgD^-IgM^-CD20⁺CD38^+/-)或浆母细胞(即B220^loCD19⁺CD27⁺IgD^-IgM^-CD20^-CD38⁺⁺)均未检测到显著改变，但这两种细胞在无免疫挑战的稳定状态下占骨髓中总B细胞的比例都非常小(见图20)。

这些研究结果表明，氯氮平可以发挥降低骨髓中长寿命浆细胞的比例的特异性作用，该细胞群体被认为是血浆中稳定的抗原特异性抗体滴度的主要来源，参与体液免疫保护和在致病状态下稳定的自身抗体生成。

循环中免疫球蛋白水平：

氯氮平以5和10mg/kg的剂量施用，导致循环IgA水平相对于对照下降，这种效果在氟哌啶醇中没有观察到(见图24；P，阳性对照；N，阴性对照)。在所使用的实验条件下，其他亚型类别没有受到影响(见图24)。

肠系膜淋巴结：

在目前的实验条件下，在肠系膜淋巴结(MLN)中评估的淋巴细胞亚群中，没有在任何组之间鉴定到显著差异(见图23)。

实验结论

本研究调查了氯氮平影响在稳定状态下的野生型小鼠免疫表型的潜能，特别是B细胞亚群，通过循环中免疫球蛋白水平推断其功能影响。本研究的主要发现是：3周的胃肠外(I.P.)施用氯氮平：

a)增加了前祖B细胞的比例，同时降低了骨髓中的晚期前B细胞和未成熟B细胞的比例。

b)降低了活脾细胞中B细胞的比例。

c)对脾脏中发育中的B细胞，特别是过渡性B细胞群产生微妙的影响，有利于提高T2型细胞的比例。

d)显著降低骨髓中长寿命浆细胞的比例。

e)影响循环中免疫球蛋白水平，特别是降低IgA。

f)剂量依赖性地引起脾脏中活化T细胞的比例降低，与上述所有发现相反的是，在氟哌啶醇所用剂量下也观察到了该现象。

综上所述，这些观察结果表明，氯氮平对体内B细胞成熟产生复杂的影响，不限于B细胞分化或活化的晚期阶段。具体而言，研究结果表明，氯氮平可影响早期B细胞前体的成熟，并部分阻滞骨髓中非抗原依赖性的B细胞发育。

同时，鉴定到氯氮平对外周B细胞亚群有明确的影响，对降低存活脾细胞中的总B细胞比例和对骨髓中长寿命的抗体分泌浆细胞有明显影响。对抗体分泌细胞的影响很可能是所观察到的循环IgA显著减少的基础，考虑到小鼠的免疫未挑战的状态，这种影响尤其引人注目。

值得注意的是，使用对比的抗精神病药物氟哌啶醇时，没有观察到对B细胞亚群的影响，这与氯氮平对B细胞成熟的作用的特异性相符合。虽然目前的实验无法区分氯氮平对骨髓、外周和晚期B细胞群的直接或间接影响，但结合单独的体外B细胞增殖试验的结果，间接影响被认为更有可能。这可能涉及各种其它髓细胞、淋巴细胞(如T滤泡辅助细胞)和/或(间质)基质支持细胞。

实施例4

小鼠胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型研究--氯氮平的作用

CIA模型是一种构建完善的自身免疫性疾病实验模型。发明人采用CIA模型作为一个与临床高度相关的实验系统，其中响应于样本特异性抗原而产生的源自B细胞的致病性免疫球蛋白驱动了自身免疫疾病，以探索氯氮平及其相关细胞机制的潜在功效。

方法：

动物：

成年(年龄13-15周)DBA/1雄性小鼠购自Envigo(Horst,Netherlands)。小鼠被安置在21℃±2℃的独立通风笼中，可自由获得食物和水，并采用12小时的明亮/黑暗周期(早7点/晚7点)。小鼠到达后，在开始实验前适应1周。

实验组和剂量选择：

小鼠被分配到如下五个实验组之一：

1.对照组：盐水

2.免疫后第15天起，氯氮平5mg/kg治疗。

3.免疫后第15天起，氯氮平10mg/kg治疗。

4.免疫后第1天起，氯氮平5mg/kg治疗。

5.免疫后第1天起，氯氮平10mg/kg治疗。

小鼠(n＝10/组)通过每天一次IP注射各自的对照溶液/氯氮平进行治疗，直到关节炎临床特征出现后的第10天。所有实验均得到临床医学动物福利和伦理审查部(AWERB)和UK总部的批准。

氯氮平在体内的抗关节炎作用：

DBA/1小鼠用牛II型胶原蛋白在CFA中免疫，每天监测关节炎的发生。氯氮平每天通过腹腔内注射施用，剂量为5mg/kg或10mg/kg。对照单独接受溶媒(生理盐水)。小鼠的治疗在一个实验中从免疫后第1天开始进行，在第二个实验中从免疫后第15天开始。关节炎发病后监测临床评分和脚爪肿胀10天。使用临床评分系统如下文。关节炎的严重程度由一位有经验的、非盲的研究者如下打分：0＝正常，1＝轻微肿胀和/或红斑，2＝明显肿胀，3＝关节僵硬。所有四肢都被打分，使每只动物的最大可能得分为12分。

在实验期结束时，小鼠被人道地安乐死，并通过心脏穿刺放血，以获得血液样本进行血清分离，在-80℃下保存，随后通过ELISA测量特异性的抗胶原免疫球蛋白(IgG1和IgG2a亚型)。同时，收获脾脏和腹股沟淋巴结，使用多激光流式细胞仪检测和分析来评价这些区室的细胞组成。通过FACS确定脾脏和淋巴结中B细胞亚群的数量。

统计学分析：

数据通过单因素方差分析使用Tukey或Dunnett多重比较检验，或在适宜时通过双因素方差分析使用Tukey多重比较检验进行分析。所有计算均采用GraphPad Prism软件进行。P值小于0.05被认为显著。

实验结果

氯氮平对发病、临床评分和脚爪肿胀的影响：

用氯氮平治疗小鼠，对延缓免疫后关节炎的发生有显著的效果(见图25和26)。特别是，从第1天开始的两种剂量的氯氮平治疗对延迟关节炎的发病都极为有效(见图25和26)。

此外，在第1天给药时，用这两种剂量的氯氮平治疗都可降低总体临床评分，并且在10mg/kg氯氮平的情况下，还减轻了第一只患爪的肿胀(见图27)。与溶媒对照相比，施用氯氮平也减少了患爪的总数，在D1给药时效果是显著的(见图28)。

氯氮平对外周B细胞亚群的影响：

在所有剂量和时间点(即5mg/kg或10mg/kg，从第1天或第15天开始)用氯氮平治疗的小鼠，可见淋巴结中B220⁺B细胞的百分比显著更低(见图29)。此外，从第1天开始以10mg/kg施用氯氮平也显著降低了脾脏中B220⁺B细胞的比例。

在所采用的实验条件下，没有观察到氯氮平对淋巴结中浆细胞数量的显著影响，然而，与对照相比进行评估，在从第1天给予10mg/kg氯氮平的剂量中，发现脾脏中浆细胞的比例显著降低，同时，每个其他剂量/时间中的浆细胞占存活细胞比例的值名义上更低(见图30)。

在使用氯氮平治疗的小鼠中，在所有剂量/两个时间点都观察到淋巴结滤泡B细胞(B220⁺IgD^-Fas⁺GL7^hi)的引人注目地显著的减少(见图31)。此外，与溶媒治疗的对照组相比，所有氯氮平治疗组的淋巴结中滤泡B细胞的GL7表达水平均显著下降(见图32)。有证据表明，从第1天开始氯氮平治疗的小鼠中，GL7表达特别大幅地下降的效果具有剂量和时间依赖性(见图32)。

氯氮平对抗II型胶原IgG亚型的影响：

从第1天或第15天开始以5或10mg/kg施用氯氮平对单个时间点测得的血清IgG2a没有显著影响。然而，在所有测试剂量中，施用氯氮平导致IgG1水平的名义上降低，从第15天开始以10mg/kg治疗的组达到了统计学显著性(见图33)。

氯氮平对T滤泡辅助细胞的影响。

从第1天或第15天开始用5mg/kg或10mg/kg氯氮平治疗小鼠，不会显著影响淋巴结或脾脏中CD4⁺PD1⁺CXCR5⁺T滤泡辅助细胞的比例(见图34)。然而，平均荧光强度(MFI)的分析显示，在用氯氮平治疗的小鼠中，T滤泡辅助细胞上PD-1和CXCR5的表达稳定减少(见图35和36)。对于评估的所有剂量和时间点的氯氮平使用，在淋巴结T滤泡辅助细胞中的PD-1的表达减少是明显的(见图35)。在CXCR5表达的情况下，在从第1天开始氯氮平用药的小鼠中观察到显著的减少，并且在淋巴结(最强的减少的信号)和脾脏中都很明显(见图36)。此外，在用氯氮平治疗的小鼠的淋巴结和脾脏中的生发中心定居的T滤泡辅助细胞上观察到CCR7的表达减少(见图37)。

结论

本研究探讨了氯氮平改善CIA的潜能及其对主要B细胞亚群的影响。本研究的主要发现如下：

a)氯氮平在CIA模型中极有效地延缓疾病的发生。

b)氯氮平改善CIA的严重程度。

c)在脾脏和淋巴结中，氯氮平都可降低B220⁺B细胞的比例。

d)氯氮平降低脾脏浆细胞的比例。

e)氯氮平导致B220⁺B细胞中淋巴结滤泡B细胞(IgD^-Fas⁺GL7^hi)的比例大幅度下降，并降低其GL-7的表达。

f)在评估的实验条件下(单个时间点免疫球蛋白测定)，氯氮平表现出减少致病性免疫球蛋白，特别是抗胶原蛋白IgG1的一定能力(以10mg/kg的剂量从免疫后D15开始给药)。

g)氯氮平除了CCR7外，还明显降低淋巴结T滤泡辅助细胞(PD1⁺CXCR5⁺)上的PD1和CXCR5的表达，但不影响细胞的比例。

综上所述，这些观察结果表明，氯氮平延缓了疾病的发生，可能是通过多种机制，可能涉及其对(次级)淋巴组织及其形成功能性生发中心的能力的影响，以及随后对产生抗体的B细胞的影响。

具体来说，发现氯氮平可减少在免疫后的局部淋巴结中的生发中心B细胞[以免疫的脾脏/淋巴结中GL7的表达为标志(Naito等人,2007)]。GL7^hi B细胞除了具有更高的抗原提呈能力外(Cervenak等人,2001)，还表现出更高的特异性和总免疫球蛋白的产生。因此，观察到使用氯氮平降低了GL7表位的表面表达，表明了降低这些B细胞产生抗体和提呈抗原的功能活性的影响。

同时，发现氯氮平影响T滤泡辅助细胞，这是一个关键的T细胞亚群，它控制生发中心内发生的细胞反应的形成和协调，这对于体细胞高频突变、亚型类别转换和抗体亲和力成熟是必要的，将B细胞分化成为记忆B细胞或浆细胞。因此，T滤泡辅助细胞专门促进T细胞依赖的B细胞应答(Shi等人,2018)。特别是，虽然不影响T滤泡辅助细胞的总体比例，但氯氮平可降低PD1(程序性细胞死亡-1)的表达，而PD1是T滤泡辅助细胞正确定位所必需的，所述定位促进它们从滤泡富集到生发中心。PD1也是T滤泡辅助细胞产生IL-21的最佳条件所需要的，T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞之间的PD1与PD-L1(即PD1的同源配体)相互作用有助于基于亲和力的选择的严格性。

此外，发现氯氮平降低T滤泡辅助细胞上CXCR5的表达。CXCR5(CXC趋化因子受体5)被认为是这些细胞的典型标志物；CXCR5的上调使其能够重定位到T/B边界和(通过被CXCL-13吸引)淋巴组织的B细胞区域，使T滤泡辅助细胞进入B细胞滤泡(Chen等人,2015)。因此，CXCR5在T滤泡辅助细胞上的表达减少将阻碍它们迁移到B细胞滤泡，从而降低它们定位和与生发中心B细胞相互作用的能力。与此相一致的是，缺乏CXCR5或选择性地缺乏T细胞上的CXCR5的小鼠对CIA的诱导表现出完全的抵抗力，并且次级淋巴生发中心的形成减少，抗胶原抗体的产生下降(Moschovakis等人,2017)。

氯氮平也被发现降低T滤泡辅助细胞上CCR7的表达。CCR7下调被认为是活化的CD4+T细胞通过其克服T区趋化因子(其促进在T区中的滞留)的一个重要机制(Haynes等人,2007)。重要的是，T滤泡辅助细胞促进正常的生发中心应答需要协调的CXCR5上调与CCR7下调(Haynes等人,2007)。因此，CXCR5和CCR7的平衡表达对微调T滤泡辅助细胞的定位和有效提供B细胞辅助至关重要(Hardtke等人,2005)。因此，观察到氯氮平可以影响T滤泡辅助细胞上CXCR5和CCR7的表达，与氯氮平扰乱这些细胞的定位和适当功能(对于T细胞支持响应于T依赖性抗原而产生高亲和力抗体至关重要)的能力是一致的。

进一步强调了生发中心的形成对于CIA发病机制的重要性，发现多配体蛋白聚糖-4缺失小鼠对CIA有抵抗力，该小鼠表现出较低数量的B细胞和引流淋巴结中生发中心形成缺陷(Endo等人,2015)。鉴于生发中心的严格调控对于自身免疫中维持自身耐受性和预防致病性自身抗体产生极其重要，如CIA模型中所证明的氯氮平的作用强烈地支持其减轻致病性自身抗体产生的潜能。

实施例5

使用体外B细胞分化系统研究氯氮平和去甲氯氮平对人浆细胞生成的影响

使用已建立的体外平台(Cocco等人,2012)评价氯氮平、其主要代谢物去甲氯氮平和对比的抗精神病药物氟哌啶醇对人浆细胞的生成、分化和活力的影响。

方法：

一般情况：

所采用的系统是基于已公开的模型(Cocco等人,2012)，其使用基于CD40L/IL-2/IL-21的刺激物，在一个三步骤过程中驱动B细胞活化和分化，以产生浆母细胞和功能性多克隆成熟浆细胞(见图38)。培养的最后一步(第6-9天)是在由IFN-α驱动的生存信号和没有基质细胞的背景下进行。

实验使用从健康供者分离的总外周血B细胞而实施。实验从四个独立的供者进行。

药物的添加：

化合物来源是Tocris，并以如下浓度溶解在DMSO中：

氯氮平：

·350ng/ml氯氮平(约相当于500mg成人剂量)。

·100ng/ml氯氮平

·25ng/ml氯氮平(约相当于55mg成人剂量)。

去甲氯氮平：

·200ng/ml去甲氯氮平

·70ng/ml去甲氯氮平

·15ng/ml去甲氯氮平

氟哌啶醇：

·25ng/ml氟哌啶醇

·8ng/ml氟哌啶醇

·2ng/ml氟哌啶醇

DMSO以0.1％作为稀释剂对照。所有药物处理的样品的DMSO浓度都调整为0.1％。

药物在两个时间点加入。

·培养的第3天(活化B细胞/前-浆母细胞)，或

·培养的第6天(浆母细胞)

评价：

培养物在添加化合物3天后进行评价，第3天的药物添加在第6天进行评价(浆母细胞)，第6天的药物添加在第9天进行评价(早期浆细胞)(见图38)。

评价包括：

流式细胞仪评估：

·表型(CD19、CD20、CD27、CD38、CD138)。

·活力(7AAD)

·细胞数(珠子计数)

免疫球蛋白的分泌：

·来自各培养物在第6天和第9天收集的大量上清液的总IgM/IgG

进行ELISA分析

结果

细胞表型：

在所有四个供者中，对照DMSO样品显示出从第3天到第6天过渡到浆母细胞状态，并有CD20下调，CD38上调，变化的CD27上调，以及保留CD19的表达和缺乏CD138。在随后转移到浆细胞成熟条件下后，对照细胞表现出CD20的逐渐丧失，CD19的下调和CD138的上调，以及CD38和CD27的进一步上调，表明过渡到早期浆细胞状态。这些研究结果表明，分化程序以与表型相关联的方式起作用，并且所有四个样本都适合作为体外分化系统的参考。

在对表型成熟的影响方面，任何浓度的药物都没有显示出对B细胞表型下调的显著影响，如CD20和CD19表达的相同损失所反映。任何浓度的药物都没有对在第6天或第9天时间点时C27或CD138表达的获得模式显示出显著影响。

所有三种药物对一个供者的CD38表达都有剂量相关的影响。这在第6天时间点是轻微的，但在第9天时间点是显著的，CD38表达有明显的和可重复的改变。然而，这种影响在其他供者中没有观察到与此一致的效果。

细胞数量和活力：

在所有四个供者中，对照DMSO样品在第3天至第6天证明向浆母细胞状态的扩增，并在向浆细胞状态的过渡期间收缩。基于第3天输入的10⁵的活化B细胞数量，在第3天至第6天培养期间观察到的平均扩增是12倍。伴随着成熟为浆细胞状态有5倍的收缩，从在第6天的5x10⁵输入收缩到在第9天的10⁵个活细胞。结论是，分化程序以与细胞数量相关联的方式起作用，所有四个样品都适合作为参考。

任何浓度的药物都没有对第6天或第9天的活细胞数产生显著影响。这不受是否考虑每次输入细胞的总细胞数还是活细胞数的影响。基于相同的活化B细胞输入数量，从第3天到第6天的扩增程度在所有药物和浓度下都是等同的。同样，任何药物在任何浓度下对第9天回收的活细胞数没有任何影响。

免疫球蛋白的分泌：

所有四个供者的对照DMSO样品在第3天至第6天的培养过程中显示出显著的IgM和IgG分泌的证据。该情形持续到第6天至第9天的培养中，预计在这一向浆细胞状态转变的第二培养阶段中有更高的每细胞估计分泌速率。结论是，分化程序以与免疫球蛋白分泌相关联的方式起作用，所有四个样品都适合作为参考。

在免疫球蛋白的分泌方面，供者个体之间有较大的差异，但在响应于三种药物中的任一种的任何剂量时，都没有明确的趋势。以DMSO作为对照进行归一化处理，提供了最简单的数据视图，显示检测到的与IgG相关的免疫球蛋白仅有微小的变化。在观察到改变之处，这些改变在一个供者中遵循与例如去甲氯氮平剂量相关的反向响应。

结论

结果表明，没有任何一种药物对分化的B细胞有直接毒性，也没有任何一种药物在任何浓度下对所得到的分化的抗体分泌细胞的分泌抗体的能力有一致的影响。

在表型响应方面，不同供者之间在CD38表达方面存在差异，特别是一个供者在浆母细胞(第6天)和早期浆细胞(第9天)之间的分化窗口中表现出明显的剂量依赖性下调。然而，这种响应并没有作为一致的特征在其他测试的供者中再现。

因此，总的来说，所测试的化合物对活化B细胞到早期浆细胞状态的功能或表型成熟没有显示出一贯的抑制作用，对抗体分泌细胞的生存能力没有影响。

所采用的体外系统从作为一种“强迫的”的B细胞分化测定(与生理性扩增相反)的角度来说有一定的局限性，焦点在于外周B细胞、有限的培养时间(可能不能反映非常慢性暴露的效果)和缺乏初级(例如骨髓)或次级淋巴组织中B细胞的正常微环境，也没有间接调节(例如通过T滤泡辅助细胞和/或IL-21)。尽管如此，研究结果仍表明，氯氮平不可能直接作用于浆细胞或其前体，体内的免疫表型研究结果反映了更复杂和/或间接的作用。来自这一体外研究的结果与总体B细胞数量没有减少的情况相一致(即，没有证据表明在施用氯氮平的患者中有普遍的B细胞耗竭)。

实施例1-5中所述结果的总结：

上述实施例中列出的结果，包括在长期使用氯氮平治疗的人类中的观察数据，到健康野生型小鼠在免疫学无挑战环境下的短期给药，再到在抗原驱动的主要B细胞组分的自身免疫性疾病的疾病模型(CIA模型)中的评估，突出了氯氮平的几个关键作用：

1.减少总循环免疫球蛋白水平，影响所有被评估的类别(IgG，IgM和IgA)。虽然表现出个体间的变异，但发现氯氮平在这些免疫球蛋白的频率分布曲线中引起左移。在施用氯氮平或其他抗精神病药物的患者的正交队列中的中期结果突出了这一发现的稳健性。

2.与IgG相比，在人类中降低IgA(和IgM)的影响相对更大，在野生型小鼠短期给药中部分地重现。

3.证据表明，在人类中随着氯氮平暴露时间的增加，免疫球蛋白(IgG)渐进性地减少。反之，证据表明在氯氮平停止后IgG逐渐恢复(历经数年)。

4.特异性免疫球蛋白的减少。除了总免疫球蛋白滴度的降低外，氯氮平还发现降低致病性免疫球蛋白(CIA模型)，并已被发明人证明降低人的肺炎球菌特异性抗体(Ponsford等人,2018b)，后者即使在第二次观察队列的中期分析中也显示出很强的向显著更低值的趋势。

5.对总体循环(CD19+)B细胞数量无显著影响。这一观察结果与当前的侵袭性的普遍的B细胞耗竭生物方法的影响形成鲜明对比。

6.循环浆母细胞(B细胞系的短寿命增殖性抗体分泌细胞)和类别转换记忆B细胞的大量减少。这两种细胞类型在即时和次级体液应答中都很关键。类别转换使B细胞从IgM转换到具有不同效应子功能的次级IgH亚型抗体IgG、IgA或IgE的产生(Chaudhuri和Alt,2004)。类别转换和浆细胞分化的增加被认为是与致病性免疫球蛋白产生相关的自身免疫性疾病的一个关键特征(Suurmond等人,2018)。氯氮平抑制这一过程(即减少类别转换记忆B细胞)的能力表明在主要由IgG、IgA或IgE亚类的自身抗体介导的致病性免疫球蛋白介导的疾病的背景下的特别的治疗潜能。

7.对骨髓B细胞前体有微妙的影响，具体包括减少总前B细胞、增殖性前B细胞和未成熟B细胞。这是值得注意的，因为它是B细胞发育的对自身反应性的一个关键的内源性过渡检查点(Melchers,2015)。缺陷的B细胞耐受性，包括早期耐受性，被认为是容易诱发自身免疫的一个基本特征(Samuels等人,2005；Yurasov等人,2005)。因此，虽然是推测的，但有可能氯氮平的这种效果将用于减少自体反应性(IgH链的)的B细胞进一步进展，以调节新出现的B细胞库。

8.减少骨髓长寿命浆细胞，这是一个关键的细胞群，负责通过产生致病性免疫球蛋白来推动持续的自身免疫性疾病，并且基本上对现有的治疗药物抵抗。

9.大幅延迟具有大量B细胞驱动和致病性的自身抗体成分的自身免疫疾病实验模型的发病的能力。

10.通过对其关键细胞成分的影响扰乱生发中心的功能：诱导生发中心B细胞大幅减少，以及减少调节T滤泡辅助细胞功能的关键蛋白(PD1和CXCR5)的表面表达。生发中心是强烈增殖和体细胞突变以引起抗原激活的B细胞分化为高亲和力记忆B细胞或浆细胞的场所。因此，这一发现(在CIA模型中注射抗原后)与氯氮平对远端B细胞系成熟/功能的影响相一致，并与在减少类别转换记忆B细胞、减少浆母细胞和长寿命浆细胞形成的实例中所述的观察结果相符。这些作用共同趋向于减少在自身免疫性疾病环境下的致病性免疫球蛋白的产生。

11.基于体外分化测定，观察到的氯氮平的作用似乎不太可能反映对抗体分泌细胞的直接影响。

因此，氯氮平看起来在体内对涉及B细胞成熟和致病性抗体(特别是致病性IgG和IgA抗体)产生的途径具有显著影响，并因此在治疗致病性免疫球蛋白驱动的B细胞介导的疾病中是有用的。

基于IgE⁺B细胞的个体发生和IgE的产生，这些发现对由分化的B细胞产生IgE的过程具有实质性意义，这是鉴于：IgE记忆B细胞和IgE浆细胞也是经由生发中心途径发育(Talay等人,2012)；IgE转换的记忆B细胞是细胞IgE记忆的主要来源(Talay等人,2012)；IgE⁺B细胞和浆细胞的个体发生遵循与IgG(1)相似的表型阶段，包括IgE⁺生发中心样B细胞、IgE⁺浆母细胞和IgE⁺浆细胞，通过从IgG的依次转换过程发生(Ramadani等人,2017)；B细胞的内在成熟状态决定了它们以最高的源自于生发中心B细胞的IgE⁺细胞比例来经历向IgE类别转换的能力(Ramadani等人,2017)；类别转换取决于细胞分裂的次数，IgE比IgG多(Tangye等人,2002)，这与IgE应答一般需要更长时间的抗原刺激的事实相一致(Hasbold等人,1998)。因此，预期氯氮平在治疗致病性免疫球蛋白E(IgE)驱动的B细胞介导的疾病中是有用的。

实施例6

健康人类志愿者研究

本研究是一项随机非盲的对照试验，调查低剂量氯氮平对健康志愿者在接种疫苗(即抗原激发)后B细胞数量和功能的影响。该研究采用平行臂设计(见图39)，较高剂量的测试延迟开始。在这项研究中，总共多至48名健康志愿者将被招募到4个队列中。所有参与者将在第1天(免疫日)给予Typhi免疫以刺激特异性免疫球蛋白(特别是IgG)的产生，并随访约56天的时期。队列1(n＝12名参与者)将施用25mg氯氮平28天，并再随访28天，而队列2(n＝12名参与者，将与队列1同时招募)将不接受任何氯氮平，但进行疫苗接种。对队列2的随访方式与队列1相同。队列3(100mg氯氮平)将仅在来自队列1的有效氯氮平治疗期的数据(有效治疗的第28天)由安全委员会审查之后才开始。如果数据证明需要进一步评估25至100mg氯氮平的剂量，则有可能启动另外12名健康志愿者的任选队列。

第1和第2队列的参与者将保持在试验中总共60天，不包括他们的首次筛查就诊。队列3的参与者将参加总共70天，不包括他们的首次筛查就诊。

任选队列4的参与者的参与时间将根据所选择的剂量而变化，因为滴度期会相应改变，但不包括他们的首次筛查就诊，参与者将最多参与63天(如果选择100mg剂量的话)。

目标和结果指标

将在健康志愿者研究中收集与观察性研究(实施例2)中类似的免疫生物标志物。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含”和变化形式诸如“包括”和“含有”将被理解为意味着包含所列整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。

本文提及的所有专利和专利申请均以引用方式以其整体并入。

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Claims

1.化合物，选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物，用于治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病，其中所述化合物使所述个体中的成熟B细胞受到抑制。

2.治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病的方法，通过向所述个体施用有效量的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，其中所述化合物使所述个体的成熟B细胞受到抑制。

3.选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物在制备用于治疗或预防个体的致病性IgE驱动的B细胞疾病的药物中的用途，其中所述化合物使所述个体中的成熟B细胞受到抑制。

4.根据权利要求1-3任一项的所述用途的化合物、方法或用途，其中所述化合物是氯氮平或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

5.根据权利要求1-4中任一项的所述用途的化合物、方法或用途，其中成熟B细胞是类别转换记忆B细胞。

6.根据权利要求1-4中任一项的所述用途的化合物、方法或用途，其中成熟B细胞是浆母细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项的所述用途的化合物、方法或用途，其中致病性IgE驱动的B细胞疾病选自下述疾病：特应性哮喘、特应性皮炎、慢性非自身免疫性荨麻疹、变应性肉芽肿性血管炎、变应性鼻炎和变应性眼病，优选特应性皮炎、特应性哮喘、变应性鼻炎和嗜酸细胞性食管炎。

8.根据权利要求1-7中任一项的所述用途的化合物、方法或用途，其中所述化合物具有减少CD19(+)B细胞和/或(-)B浆细胞的作用。

9.药物组合物，包含选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物以及药学上可接受的稀释剂或载体，用于治疗或预防个体中的致病性IgE驱动的B细胞疾病，其中所述化合物使所述个体中的成熟B细胞受到抑制。

10.根据权利要求9的用途的药物组合物，其中药物组合物是口服施用的。

11.根据权利要求9或10的用途的药物组合物，其中药物组合物配制成液体或固体，例如作为糖浆剂、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂或锭剂。

12.根据权利要求9-11任一项的用途的药物组合物，其中成熟B细胞是类别转换记忆B细胞。

13.根据权利要求9-11任一项的用途的药物组合物，其中成熟B细胞是浆母细胞。

14.根据权利要求1和4-8中任一项的用途的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，其与用于治疗或预防致病性IgE驱动的B细胞疾病的第二或其他治疗剂组合。

15.根据权利要求14的用途的选自氯氮平、去甲氯氮平及其前药和其药学上可接受的盐和溶剂化物的化合物，其中所述用于治疗或预防致病性IgE驱动的B细胞疾病的第二或其他治疗剂选自：抗TNFα药物(诸如抗TNFα抗体例如英利昔单抗或阿达木单抗(adalumumab))、神经钙蛋白抑制剂(诸如他克莫司或环孢素)、抗增殖剂(诸如麦考酚酸例如麦考酚酸吗乙酯或钠，或硫唑嘌呤)、一般抗炎药(诸如羟氯喹或NSAIDS如酮洛芬和秋水仙碱)、mTOR抑制剂(诸如西罗莫司)、类固醇(诸如泼尼松)、抗CD80/CD86药物(诸如阿巴西普)、抗CD-20药物(诸如抗CD-20抗体例如利妥昔单抗)、抗BAFF剂(诸如抗BAFF抗体，例如tabalumab或贝利木单抗，或阿塞西普)、免疫抑制剂(诸如甲氨蝶呤或环磷酰胺)、抗FcRn剂(例如抗FcRn抗体)和其他抗体(例如ARGX-113、PRN-1008、SYNT-001、维妥珠单抗、ocrelizumab、奥法木单抗、obinutuzumab、ublituximab、阿仑珠单抗、milatuzumab、依帕珠单抗和blinatumomab)。