CN111856035B - 一种tnc蛋白检测试剂的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备冠状病毒引起的感染检测试剂。TNC蛋白，是一种分泌性的前炎症细胞因子，其在COVID‑19患者中肺泡灌洗液表达量相比非COVID‑19患者平均上调了13.5倍(P<0.01)，意味着TNC蛋白是一种受COVID‑19感染影响显著的细胞因子，很可能成为区分COVID‑19患者和非COVID‑19患者的早期筛查标记物。尤其是，COVID‑19患者血液中的TNC蛋白含量相比健康人平均上调了2.1倍(P<0.0001)，故COVID‑19患者与健康人血液中的TNC蛋白含量表现出显著的差异，可通过检测血液中的TNC含量区分COVID‑19患者与健康人。

Description

一种TNC蛋白检测试剂的应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种TNC蛋白检测试剂的应用。

背景技术

由冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019年新型冠状病毒疾病(COVID-19)，首次报道后的五个月内，全世界出现了400多万例确诊病例，确诊数量急剧增长截至2020年5月16日，全球报告的死亡人数超过30万人。世卫组织宣布COVID-19大流行于2020年3月11日。

冠状病毒病原体，主要针对人类呼吸系统，引起严重的呼吸综合症，尤其以重症肺炎为典型症状。严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)在过去的20年里已导致严重的致命性的感染。SARS-CoV-2与这两种冠状病毒相比，表现出更强的传染性和较低的病死率，但疾病严重程度方面，表现出更多可能性，在引起大量重症肺炎的同时，存在着大量无症状感染者，严重程度可从无症状到致命。另外，高达10-20％的病例(特别是老年人和那些潜在的医疗共同疾病)发展为以间质性肺炎为特征的严重疾病，并迅速发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或脓毒性休克，存在急性期水平高巨噬细胞活化综合征的反应和指征，如高铁蛋白血症，肝功能障碍和弥漫性血管内凝血。同时还体现出淋巴细胞减少症和炎症细胞因子风暴等典型的实验室异常。

目前医学界已达成共识，冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2引起的呼吸综合症的早期医疗介入，对于阻止病情向重症发展、改善预后和降低死亡率有着重要的意义。因此新型冠状病毒的早期筛查至关重要。

目前冠状病毒早期筛查手段仍然比较单一，即检测病毒核酸。然而核酸检测由于采样和检出限的问题，存在假阴性和假阳性的情况，需要通过影像学手段辅助，进行早期筛查。而影像学手段，检测过程中存在电离辐射；同时为了降低假阴性的情况，反复进行核酸采样，增加了医护人员的暴露，导致医护人员的感染风险提高。因此更有效、风险更低的辅助早期筛查手段，对于控制冠状病毒引起的重症肺炎的流行，尤其是感染性强的SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19，有着重要意义。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种TNC蛋白检测试剂的应用及试剂盒，其目的在于通过对TNC蛋白含量的检测，辅助判断肺炎症状发展情况，辅助冠状病毒感染导致的重症肺炎早期筛查，由此解决现有的冠状病毒感染早期核酸检测不准，而反复检测增加医护人员暴露风险的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备冠状病毒引起的感染检测试剂。

优选地，所述TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备冠状病毒引起的肺炎检测试剂。

优选地，所述TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备冠状病毒引起的肺炎早期筛查试剂。

优选地，所述TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备COVID-19引起的重症肺炎早期筛查试剂。

优选地，所述TNC蛋白检测试剂的应用，其所述TNC蛋白检测试剂为半定量或定量检测试剂。

优选地，所述TNC蛋白检测试剂的应用，其所述TNC蛋白检测试剂为血液样本检测试剂。

按照本发明的另一个方面，提供了一种冠状病毒引起的肺炎检测试剂盒，其包括TNC蛋白检测试剂。

优选地，所述冠状病毒引起的肺炎检测试剂盒，其所述TNC蛋白检测试剂为TNC蛋白半定量或定量检测试剂。

优选地，所述冠状病毒引起的肺炎检测试剂盒，其所述TNC蛋白检测试剂为血液样本检测试剂。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

TNC蛋白，是一种分泌性的前炎症细胞因子，其在COVID-19患者中肺泡灌洗液表达量相比非CODIV-19患者平均上调了13.5倍(P<0.01)，意味着TNC蛋白是一种受COVID-19感染影响显著的细胞因子，很可能成为区分健康人和COVID-19感染者的早期筛查标记物。尤其是，COVID-19患者血液中的TNC蛋白含量相比健康人平均上调了2.1倍(P<0.0001)，故COVID-19患者与健康人血液中的TNC蛋白含量表现出显著的差异，可通过检测血液中的TNC含量区分COVID-19患者与健康人。因此TNC蛋白检测试剂，包括半定量和定量检测试剂，能够用作制备新型冠状病毒引起的肺炎检测试剂。

采用ELISA技术检测血液样本中的TNC蛋白含量，作为辅助筛查COVID-19患者的方法，作为核酸检测技术的辅助手段，由于实验操作更简单，耗时更短，规模化后成本更低，相较于影像学手段(如CT检测)更易于推广大规模的筛查；由于TNC蛋白为炎症早期反应蛋白，感染初期起会持续明显上调，因此相较于抗体检测，检测窗口更长，早期检测更敏感，结果更准确；同时血液采样相较于鼻咽拭子采样大大降低了医护人员采样时的感染风险。结合现有的COVID-19诊断和筛查方法，本发明提供的辅助筛查可以有效提高在大规模人群中筛查COVID-19患者的效率，降低假阳性或假阴性诊断的概率，提高感染早期诊断结果的可靠性。因此，检测TNC蛋白含量是一种有效的、值得推广的辅助筛查COVID-19乃至于新型冠状病毒引起的肺部感染的方法。

附图说明

图1是健康人、COVID-19轻症患者、COVID-19重症患者血清样品中TNC蛋白浓度对比图；

图2是根据COVID-19感染情况对血清样品中TNC蛋白浓度进行ROC分析的结果图；其中图2A是COVID-19患者和健康人分类的ROC曲线；图2B是轻症患者和健康人分类的ROC曲线；图2C是重症患者和健康人分类的ROC曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供了一种TNC蛋白检测试剂的应用，其应用于制备冠状病毒引起的肺炎检测试剂，尤其是肺炎早期筛查试剂，例如COVID-19引起的重症肺炎早期筛查试剂。

所述TNC蛋白检测试剂，为TNC蛋白半定量或定量检测试剂，优选为血液样本中TNC蛋白半定量或定量检测试剂。

本发明提供的冠状病毒引起的肺炎检测试剂盒，包括TNC蛋白检测试剂，优选为TNC蛋白半定量或定量检测试剂，优选为血液样本检测试剂。

TNC，即细胞黏合素Tenascin-C，是一种免疫调控的分泌性的细胞外基质蛋白，通常在胚胎形成或器官形成过程、尤其是肺组织发育形成过程中高表达，而在正常成人体内表达较低。但病毒感染或其他病理因素导致的肺组织或呼吸系统异常也可能会影响TNC的表达。我们通过实验证实，新型冠状病毒的感染，尤其是其导致的重症肺炎和严重的肺组织病变，与TNC蛋白表达量上调具有十分显著的相关性。作为分泌性的细胞外基质蛋白，TNC蛋白表达的变化可以方便快捷的在相关的体液，如肺灌洗液、血液等中检测出来。因此即使是轻症的早期COVID-19患者，其血液中的TNC蛋白表达量相比健康人也有了显著的提升。故TNC蛋白检测试剂，尤其是TNC蛋白定量或半定量检测试剂，能应用于制备新型冠状病毒尤其是COVID-19患者检测试剂。

以下为实施例：

实施例1TNC蛋白在COVID-19患者和非COVID-19患者肺泡灌洗液差异表达实验

本实施例采集了COVID-19患者和非COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液样品，通过基于质谱的蛋白质组学技术对各样品中的蛋白成分进行了定量比较。两种患者均为胸透显示斑片状密度阴影、以呼吸机进行呼吸支持的ICU肺部感染病人，前者咽拭子检测和血清抗体检测均为SARS-CoV-2阳性，且未检测到其他病原菌，后者咽拭子检测和血清抗体检测均为SARS-CoV-2阴性。具体实验步骤如下：

1.在肺部感染患者进行支气管肺泡灌洗过程中采集肺泡灌洗液样本。

2.肺泡灌洗液离心去除细胞沉淀后，加入6倍体积预冷丙酮-20℃孵育过夜，沉淀蛋白。

3.蛋白沉淀以8M Urea/100mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液复溶后，依次以10mM DTT进行蛋白还原，以40mM碘乙酰胺进行烷基化。反应后以4倍体积100mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液稀释蛋白溶液，以1：50比例加入胰蛋白酶，37℃酶解反应过夜。

4.向反应后的肽段溶液中加入三氟乙酸至pH小于6，以C18固相萃取柱对肽段溶液进行脱盐，脱盐后的肽段溶液真空抽干后-80℃保存待检测。

5.以EASY-nLC 1200液相串联的Q Exactive HF-X质谱仪对上一步所得的肽段样品进行检测。液相系统设置为120分钟分离梯度，流速300nL/min。质谱采用DDA扫描模式，一级质谱全扫描参数R＝120K,AGC＝3e6,max IT＝50ms,scan range＝350–1800m/z，每次一级质谱扫描伴随25次二级质谱扫描，参数R＝15K,AGC＝1e5,max IT＝50ms。母离子以HCD模式进行破碎，碰撞能量28eV。

6.质谱采集的原始数据通过MaxQuant(V1.6.6)软件进行分析，匹配Uniprot人蛋白质组数据库进行检索。分析计算获得的蛋白LFQ intensity作为检测到蛋白的相对定量信息。

检测结果显示：75％的非COVID-19患者样品中未检测到TNC蛋白信号，而COVID-19患者样品中均检测到了高强度的TNC蛋白信号。相比非COVID-19患者，COVID-19患者肺泡灌洗液中TNC蛋白含量平均提升了13.5倍(P<0.01)，表明此差异具有显著性。

实施例2TNC蛋白在COVID-19患者和正常人血液中含量差异实验

本实施例采集了39位志愿者的血液样本，通过ELISA技术对这些血液样本中的TNC蛋白进行了定量检测。根据《新冠肺炎诊疗指南》，其中12位志愿者诊断为COVID-19重症患者，20位志愿者为COVID-19轻症患者，7位志愿者确认为非COVID-19的健康人。

具体实验操作如下：

1.向ELISA反应板各孔分别加入100μL血清样品或标准溶液，37℃孵育90分钟。

2.吸去各孔残余液体，加入100μL生物素化抗体，37℃孵育60分钟。

3.300μL 0.01M PBS溶液清洗各孔3次。

4.向各孔加入100μL ABS反应溶液，37℃孵育30分钟。

5.300μL 0.01M PBS溶液清洗各孔5次，加入90μL TMB试剂，37℃避光孵育20分钟。

6.向各孔加入100μL TMB终止反应液，30分钟内测量各孔460nm吸光度。根据标准溶液绘制的标准曲线，计算各样品中TNC蛋白浓度。

各血液样品的TNC蛋白定量结果如图1所示。

相比非COVID-19感染的健康人，轻症患者血清样品中TNC蛋白浓度提高了2.2倍(P<0.0001)，重症患者血清样品中TNC蛋白浓度提高了1.9倍(P<0.01)。表明血液中的TNC蛋白浓度，在COVID-19患者，尤其是轻症患者与健康人间表现出了显著的差异。

对各样品中TNC蛋白定量信息进行ROC分析，结果如下图2所示。COVID-19患者与非感染健康人相比，AUC＝0.987；轻症患者与健康人相比，AUC＝1；重症患者与健康人相比，AUC＝0.911。该结果表明血液中的TNC蛋白含量可作为区分COVID-19患者与非感染健康人，尤其是轻症患者与非感染健康人的有效指标，且该指标具有良好的灵敏度和特异性。因此检测血液中的TNC蛋白含量，可作为辅助诊断COVID-19感染的一种有效方法。

实施例3TNC蛋白的代谢通路及用作早期筛查标记物的实验证据

本实施例对TNC蛋白进行了生物信息学分析，结果表明，TNC蛋白参与细胞前炎症反应，是一种分泌性的前炎症细胞因子，与TLR天然免疫信号通路密切相关。在病毒感染支气管上皮细胞后，经TLR3受体激活相关信号通路，TNC蛋白表达激活并被释放到细胞外。

天然免疫是人体内针对病毒感染的快速反应机制，在病毒感染后数小时即可被激活。因此，在新型冠状病毒感染支气管上皮细胞后，TNC蛋白很快就会被激活从细胞中释放，进而在肺泡灌洗液、血液等体液中被检测到。因此，TNC蛋白在病毒感染早期即可发生显著的表达变化，可作为COVID-19早期的一种有效的筛查标记物。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种TNC蛋白检测试剂的应用，其特征在于，应用于制备冠状病毒引起的感染检测试剂；所述TNC蛋白检测试剂为半定量或定量检测试剂。

2.如权利要求1所述的TNC蛋白检测试剂的应用，其特征在于，应用于制备冠状病毒引起的肺炎检测试剂。

3.如权利要求1所述的TNC蛋白检测试剂的应用，其特征在于，应用于制备冠状病毒引起的肺炎早期筛查试剂。

4.如权利要求3所述的TNC蛋白检测试剂的应用，其特征在于，应用于制备COVID-19引起的重症肺炎早期筛查试剂。

5.如权利要求1所述的TNC蛋白检测试剂的应用，其特征在于，所述TNC蛋白检测试剂为血液样本检测试剂。

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