CN111855718A - 一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置及其采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其为坐滴上样板或组装的悬滴上样板和树脂结晶板，该坐滴上样板包括集成在一个板上的点样孔和池液孔，悬滴上样板包括点样孔，树脂结晶板包括池液孔，至少一个点样孔和一个池液孔组成一个结晶室，每个结晶室留有共通空间以使得点样孔和池液孔中的液体进行气相相互扩散使点样孔中的蛋白质结晶。根据本发明的采集方法，其利用低X光背景散射薄膜来密封坐滴上样板或悬滴上样板，在点样孔和池液孔中分别加入结晶液和母液以进行蛋白质结晶，利用测角仪进行原位的衍射数据采集。本发明的用于原位衍射数据采集，同时其还具备蛋白结晶条件筛选和不同种类蛋白晶体同时上样的功能。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质晶体结构解析，更具体地涉及一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置及其采集方法。
背景技术
随着蛋白质晶体结构解析技术的发展，如何高效而方便地开展蛋白质晶体衍射实验变得越来越重要，特别是对于只能产生微小晶体的一些小分子蛋白来说，在这种情况下晶体是很难、甚至无法捞取的，只能采用原位数据采集方式，该方法可以使晶体在其生长环境中进行衍射数据的连续收集，蛋白质生长在固定区域，可以通过扫描的方式收集数据，省去了转移样品的过程，避免了人为因素对晶体质量的影响。随着高亮度微聚焦光束线技术的发展和快速探测器等设备的应用，使得晶体学的研究者利用微聚焦同步辐射光束线站或者自由电子激光飞秒串行晶体学光束线站解析微小晶体结构成为可能。
现今原位衍射数据采集主要通过基于固定靶的方式来实现，将晶体原位生长在低背景散射的芯片或者薄膜上，利用电机将晶体样品移动至光路。基于固定靶的原位衍射装置开发，主要存在以下困难：一是现有原位板与常规尼龙上样环相比尺寸过大，在原位衍射数据采集过程中需要加入或改变其它的电机等硬件系统来配合。二是现有原位板不能像常规尼龙上样环一样进行基于测角仪旋转的快速对中即将晶体快速转移到光路上，需要直接改变电机参数来移动原位板，增加了操作复杂性且具有一定安全隐患。
发明内容
为了解决现有技术中的原位衍射数据采集存在困难等问题，本发明提供一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置及其采集方法。
根据本发明的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其为坐滴上样板，该坐滴上样板包括集成在一个板上的坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔，至少一个坐滴上样板点样孔和一个坐滴上样板池液孔组成一个结晶室，每个结晶室留有坐滴上样板共通空间以使得坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔中的液体进行气相相互扩散使坐滴上样板点样孔中的蛋白质结晶。
优选地，坐滴上样板还包括侧向伸出的坐滴上样板底柱，坐滴上样板底柱的底部中心点与坐滴上样板点样孔的底部中心点在坐滴上样板中心线上。
优选地，坐滴上样板点样孔的底面任何一点的位置与坐滴上样板中心线的距离不超过1mm。
根据本发明的上述蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置的采集方法，其利用低X光背景散射薄膜来密封坐滴上样板，在坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔中分别加入结晶液和母液以进行蛋白质结晶，利用测角仪进行原位的衍射数据采集。
优选地，该低X光背景散射薄膜为聚亚酰胺薄膜、迈拉膜、或COC膜。
根据本发明的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其包括组装的悬滴上样板和树脂结晶板，该悬滴上样板包括至少一个悬滴上样板点样孔，树脂结晶板包括至少一个结晶板池液孔，至少一个悬滴上样板点样孔与一个结晶板池液孔组成一个结晶室，在结晶室的密闭空间进行气相相互扩散使悬滴上样板点样孔中的蛋白质结晶。
优选地，悬滴上样板还包括侧向伸出的悬滴上样板底柱，悬滴上样板底柱的底部中心点与悬滴上样板大点样孔的底部中心点在悬滴上样板中心线上。
优选地，悬滴上样板点样孔包括集成在一个板上的悬滴上样板大点样孔和悬滴上样板小点样孔，悬滴上样板大点样孔和悬滴上样板小点样孔的底面任何一点的位置与悬滴上样板中心线的距离不超过1mm。
优选地，树脂结晶板为与悬滴上样板通过盖合的方式组装的盖合结晶板、或与悬滴上样板通过插入的方式组装的抽拉结晶板。
根据本发明的上述蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置的采集方法，其利用低X光背景散射薄膜来密封悬滴上样板和树脂结晶板，在悬滴上样板点样孔中加入结晶液且在结晶板池液孔中加入母液以进行蛋白质结晶，利用测角仪进行原位的衍射数据采集。
根据本发明的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，用于原位衍射数据采集，同时其还具备蛋白结晶条件筛选和不同种类蛋白晶体同时上样的功能。根据本发明的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集方法，利用低X光背景散射薄膜(例如聚亚酰胺薄膜)作为结晶板的晶体原位生长与数据采集，与常规利用尼龙环上样蛋白质晶体并进行低温数据收集的方法相比，无需手动捞取晶体，节省劳力，上样效率高，能一次性将整个样品池上样。根据本发明的方法方便研究者对点样孔中的每一颗晶体的质量进行筛选，从而挑选出质量最佳的晶体进行数据收集，并且晶体筛选效率高。特别地，根据本发明的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，可用于蛋白质晶体的原位生长和在低温或室温条件下的原位数据采集，再配合使用低X光背景散射薄膜来支撑样品并对装置进行密封，树脂上样板底柱通过胶水和磁性螺纹底座相连并固定在测角仪上用于衍射数据的收集。通过在每个结晶室的点样孔与池液孔中加入不同种类的蛋白结晶液及母液，该上样板还可以实现蛋白质结晶条件的筛选及对不同种类的蛋白晶体进行同时上样。
附图说明
图1A是根据本发明的一个优选实施例的坐滴上样板的第一结构示意图；
图1B是图1A的坐滴上样板的第二结构示意图；
图2A是根据本发明的另一个优选实施例的悬滴上样板的第一结构示意图；
图2B是图2A的悬滴上样板的第二结构示意图；
图3A是根据本发明的另一个优选实施例的盖合结晶板的结构示意图；
图3B是图2A-图2B的悬滴上样板与图3A的盖合结晶板的组装示意图；
图4A是根据本发明的又一个优选实施例的抽拉结晶板的结构示意图；
图4B是图2A-图2B的悬滴上样板与图4A的抽拉结晶板的组装示意图。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
实施例1
根据本实施例的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置为适用于蛋白质坐滴法结晶的第一树脂上样板，即坐滴上样板A，其可以直接用于蛋白质结晶，然后手动上样进行原位衍射数据采集。另外，该坐滴上样板A还可以用于蛋白质结晶条件的筛选，或用于不同种类的蛋白晶体同时上样进行原位衍射数据采集。
如图1A-图1B所示，坐滴上样板A包括集成在一个板上的坐滴上样板点样孔1和坐滴上样板池液孔2。应当注意的是，在蛋白质晶体学原位衍射微型装置领域，将点样孔和池液孔集成在一个板上是本发明首次提出。每两个坐滴上样板点样孔1和一个坐滴上样板池液孔2组成一个结晶室，每个结晶室留有坐滴上样板共通空间6，以使得坐滴上样板点样孔1和坐滴上样板池液孔2中的液体进行气相相互扩散，最后使坐滴上样板点样孔1中的蛋白质结晶。在本实施例中，每个结晶室设计两个坐滴上样板点样孔1的目的是为了提高结晶成功率，如果多于两个坐滴上样板点样孔1又会增长坐滴上样板A的长度，受限于X光衍射线站原位衍射数据采集衍射仪的运动电机行程，最终选择两个圆形的坐滴上样板点样孔1。在本实施例中，坐滴上样板A设计共五个结晶室，其同样也是考虑衍射仪设备的行程长度。在本实施例中，坐滴上样板A的长为22mm，高为2mm；坐滴上样板点样孔1的直径为1.4mm，高为1.2mm；坐滴上样板池液孔2的长为3.4mm，宽为2.4mm，高为1.2mm；坐滴上样板共通空间6的长为4.8mm，宽为3.4mm，高为0.8mm。应该理解，坐滴上样板池液孔2的尺寸设计根据不同的蛋白质结晶条件可以做不同的改变，对于蛋白质气相扩散结晶来说，不同的蛋白质需要的结晶条件不同，即坐滴上样板点样孔1中液体的体积与坐滴上样板池液孔2中液体的体积之比不同，有的蛋白比例最低需要1：10，有的甚至更多，根据本实施例的坐滴上样板A设计该比例最大可以达到1：20。对于某些特殊蛋白，可以改变坐滴上样板池液孔2的尺寸设计大小以改变坐滴上样板池液孔2可以容纳的液体体积，最终呈现的就是坐滴上样板A的长度不变而宽度变化，但此变化对于后续操作及数据采集无影响。
如图1A-图1B所示，坐滴上样板A包括相背的坐滴上样板正平面3和坐滴上样板中心面4，坐滴上样板点样孔1和坐滴上样板池液孔2均贯通该坐滴上样板正平面3和坐滴上样板中心面4形成为镂空孔。
如图1A-图1B所示，坐滴上样板A还包括侧向伸出的坐滴上样板底柱5，其位置位于偏向坐滴上样板点样孔1的一侧以确保坐滴上样板底柱5的底部中心点与坐滴上样板点样孔1的底部中心点在一条直线(即坐滴上样板中心线7)上。需要注意的是，为了在后续的数据采集过程中偏转坐滴上样板A时不会让晶体偏离光路，坐滴上样板点样孔1的底面任何一点的位置与坐滴上样板中心线7的距离优选不超过1mm。坐滴上样板底柱5的尺寸设计匹配螺纹磁性底座尺寸以确保能稳定地固定在上面。
根据本实施例的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集方法首先包括对坐滴上样板A使用超声震荡清洗仪进行清洗，然后进行蛋白质结晶实验。
在蛋白质结晶实验中，坐滴上样板A需要使用聚亚酰胺薄膜对坐滴上样板中心面4进行密封，也可使用其它低X光背景散射薄膜如迈拉膜、COC膜等进行密封。然后将坐滴上样板正平面3朝上放置，在坐滴上样板点样孔1和坐滴上样板池液孔2中根据需要加入既定容量的结晶液和母液。根据移液器最小量程和操作人员手法和习惯，常见移液器最小量程0.2微升，设计的坐滴上样板点样孔1可容纳1.8微升，因此在坐滴上样板点样孔1中加入液体的量在0.4-1.8微升之间。最后使用聚亚酰胺薄膜将坐滴上样板正平面3进行密封，待坐滴上样板A长出晶体。
在蛋白质结晶实验结束之后，在坐滴上样板底柱5上涂抹胶水，之后轻轻插入磁性底座，该底座是专用于收集衍射数据的测角仪的底座，等待胶水干燥即可固定。将坐滴上样板中心面4朝下手动放置在测角仪上，以防止结晶液与母液混合，然后进行原位的衍射数据采集。
实施例2
根据本实施例的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置包括适用于蛋白质悬滴法结晶的第二树脂上样板(即悬滴上样板B)和第一树脂结晶板(即盖合结晶板C)，盖合结晶板C与悬滴上样板B组装实现蛋白质结晶，然后使用机械手自动上样进行原位衍射数据采集。另外，该悬滴上样板B还可以用于蛋白质结晶条件的筛选，或用于不同种类的蛋白晶体同时上样进行原位衍射数据采集。
如图2A-图2B所示，悬滴上样板B包括悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9，如图3A所示，盖合结晶板C包括盖合结晶板池液孔14，如图3B所示，悬滴上样板B与盖合结晶板C组装，每一个悬滴上样板大点样孔8和两个悬滴上样板小点样孔9与一个盖合结晶板池液孔14组成一个结晶室，在该密闭空间进行气相相互扩散使坐滴上样板点样孔中的蛋白质结晶。盖合结晶板C与悬滴上样板B组装，悬滴上样板B最大化利用尺寸地设计悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9的数量。悬滴上样板B受限于X光衍射线站原位衍射数据采集中衍射仪等运动电机的行程，悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9在点样中最少需加0.4微升，所以结晶孔起码需要0.4mm3的空间。在本实施例中，蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置设计共六个结晶室。在本实施例中，悬滴上样板B的长为22mm；悬滴上样板大点样孔8的直径为1.4mm，高为1mm；悬滴上样板小点样孔9的直径为0.9mm，高为1mm；盖合结晶板池液孔14的长为3.7mm，宽为2.8mm，高为5mm。
如图2A-图2B所示，悬滴上样板B包括相背的悬滴上样板正平面10和悬滴上样板中心面12，悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9均贯通该悬滴上样板正平面10和悬滴上样板底柱11形成为镂空孔。如图3A所示，盖合结晶板池液孔14形成为镂空孔。使用时将盖合结晶板池液孔14的底部用聚亚酰胺薄膜封闭，这样在前期晶体培养当中对于某些光学可见的微小晶体来说通过显微镜可以提供一个初步的观测，盖合结晶板池液孔14的镂空同样有利于装置的清洗及二次使用。
如图2A-图2B所示，悬滴上样板B还包括侧向伸出的悬滴上样板底柱11。悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9和悬滴上样板底柱11的位置及尺寸同样像坐滴上样板A一样满足对后续收集数据的要求，即悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9的底面任意一点与悬滴上样板中心线13的距离优选小于1mm，以确保在后续原位衍射数据采集过程中偏转悬滴上样板B不会使点样孔偏离光路。应该理解，上部分悬滴上样板小点样孔9所在的直线和下部分悬滴上样板小点样孔9所在的直线并不一定平行，只需要确保悬滴上样板小点样孔9的底面任意一点与悬滴上样板中心线13的距离优选小于1mm即可。
根据本实施例的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集方法首先包括对悬滴上样板B使用超声震荡清洗仪进行清洗，然后进行蛋白质结晶实验。
在蛋白质结晶实验中，悬滴上样板B需要使用聚亚酰胺薄膜对悬滴上样板中心面12进行密封，盖合结晶板C需要使用聚亚酰胺薄膜对其底面进行密封，然后将悬滴上样板正平面10朝上放置，在悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9中根据需要加入既定量的结晶液(悬滴上样板小点样孔9最多可容纳0.6微升，悬滴上样板大点样孔8最多可容纳1.5微升)，在盖合结晶板池液孔14中加入母液，最后将悬滴上样板正平面10朝下，悬滴上样板B通过盖合的方式与盖合结晶板C进行组装，由于液体表面张力，悬滴上样板大点样孔8和悬滴上样板小点样孔9中的结晶液不会向下流入盖合结晶板C中，待悬滴上样板B长出晶体。
在蛋白质结晶实验结束之后，在悬滴上样板底柱11上涂抹胶水，之后轻轻插入磁性底座，等待胶水干燥即可固定。将悬滴上样板B从盖合结晶板C上取下，先使用聚亚酰胺薄膜将悬滴上样板正平面10进行密封，然后放置于晶体样品盒uni-puck中，使用机械手实现晶体的上样与换样，最后进行原位的衍射数据采集。
实施例3
根据本实施例的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置包括适用于蛋白质悬滴法结晶的第二树脂上样板(即悬滴上样板B)和第二树脂结晶板(即抽拉结晶板D)，抽拉结晶板D与悬滴上样板B组装实现蛋白质结晶，然后使用机械手自动上样进行原位衍射数据采集。如图4A所示，抽拉结晶板D包括抽拉结晶板池液孔15。悬滴上样板B与实施例2相同，在此不再赘述。与实施例2不同的是，悬滴上样板B通过插入的方式与抽拉结晶板D进行组装，如图4B所示。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，该蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置为坐滴上样板，该坐滴上样板包括集成在一个板上的坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔，至少一个坐滴上样板点样孔和一个坐滴上样板池液孔组成一个结晶室，每个结晶室留有坐滴上样板共通空间以使得坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔中的液体进行气相相互扩散使坐滴上样板点样孔中的蛋白质结晶。
2.根据权利要求1所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，坐滴上样板还包括侧向伸出的坐滴上样板底柱，坐滴上样板底柱的底部中心点与坐滴上样板点样孔的底部中心点在坐滴上样板中心线上。
3.根据权利要求2所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，坐滴上样板点样孔的底面任何一点的位置与坐滴上样板中心线的距离不超过1mm。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置的采集方法，其特征在于，利用低X光背景散射薄膜来密封坐滴上样板，在坐滴上样板点样孔和坐滴上样板池液孔中分别加入结晶液和母液以进行蛋白质结晶，利用测角仪进行原位的衍射数据采集。
5.根据权利要求4所述的采集方法，其特征在于，该低X光背景散射薄膜为聚亚酰胺薄膜、迈拉膜、或COC膜。
6.一种蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，该蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置包括组装的悬滴上样板和树脂结晶板，该悬滴上样板包括至少一个悬滴上样板点样孔，树脂结晶板包括至少一个结晶板池液孔，至少一个悬滴上样板点样孔与一个结晶板池液孔组成一个结晶室，在结晶室的密闭空间进行气相相互扩散使悬滴上样板点样孔中的蛋白质结晶。
7.根据权利要求6所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，悬滴上样板还包括侧向伸出的悬滴上样板底柱，悬滴上样板底柱的底部中心点与悬滴上样板大点样孔的底部中心点在悬滴上样板中心线上。
8.根据权利要求7所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，悬滴上样板点样孔包括集成在一个板上的悬滴上样板大点样孔和悬滴上样板小点样孔，悬滴上样板大点样孔和悬滴上样板小点样孔的底面任何一点的位置与悬滴上样板中心线的距离不超过1mm。
9.根据权利要求6所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置，其特征在于，树脂结晶板为与悬滴上样板通过盖合的方式组装的盖合结晶板、或与悬滴上样板通过插入的方式组装的抽拉结晶板。
10.一种利用权利要求6-9中任一项所述的蛋白质结晶及晶体原位衍射数据采集装置的采集方法，其特征在于，利用低X光背景散射薄膜来密封悬滴上样板和树脂结晶板，在悬滴上样板点样孔中加入结晶液且在结晶板池液孔中加入母液以进行蛋白质结晶，利用测角仪进行原位的衍射数据采集。
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