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CN111849964A - 一种提取精液基因组dna的试剂盒及方法 - Google Patents

一种提取精液基因组dna的试剂盒及方法 Download PDF

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CN111849964A
CN111849964A CN202010634998.6A CN202010634998A CN111849964A CN 111849964 A CN111849964 A CN 111849964A CN 202010634998 A CN202010634998 A CN 202010634998A CN 111849964 A CN111849964 A CN 111849964A
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CN
China
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solution
kit
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semen
supernatant
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CN202010634998.6A
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谭燕芳
赵萱
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Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd
Original Assignee
Carrier Gene Technology Suzhou Co ltd
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract

本发明适用于核酸分离纯化技术领域，提供了一种提取精液基因组DNA的试剂盒及方法，该试剂盒包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、纯化柱、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D。其中，溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液；溶液K包括氯化钠溶液、氯化钾溶液和无水乙醇；溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍和第二缓冲液；溶液D为二硫苏糖醇溶液。该试剂盒可充分裂解精子的细胞核与染色质，DNA得率高，重复性好，其可用于从人类以及动物的精液样本中提取基因组DNA，适合PCR、定量PCR、数字PCR、一代DNA测序、二代DNA测序、三代DNA测序、基因芯片分析、核酸质谱等各类分子生物学检验。

Description

一种提取精液基因组DNA的试剂盒及方法
技术领域
本发明属于核酸分离纯化技术领域，尤其涉及一种提取精液基因组DNA的试剂盒及方法。
背景技术
哺乳动物的有核细胞都可以用于制备基因组DNA。除了特殊要求外，白细胞、肝组织或脾组织是DNA提取最常用的材料。原始材料较少或较难获得时(如羊水细胞)，还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞。有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如口腔上皮脱落细胞、发根的毛囊细胞等。
有些类型的样本由于其本身的特殊性，DNA提取存在困难，得率偏低。比如成熟精子的细胞核染色质高度致密，染色质中的DNA与组蛋白裂解、分离困难，导致DNA得率低。因此，研发优质的精子DNA提取试剂盒和生产工艺具有重要意义。
市场上已有的精子DNA提取产品虽然可以去除高浓度的金属离子和有机溶剂，以及可以降低蛋白质、多糖、多酚等生物大分子残留；但是这些产品存在价格较贵以及检测性能仍然不足的问题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种提取精液基因组DNA的试剂盒，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种提取精液基因组DNA的试剂盒，包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液和纯化柱，以及还包括：
溶液S；所述溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为12.5～25mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为12.5～25mmol/L；
溶液K；所述溶液K包括氯化钠溶液、氯化钾溶液和无水乙醇；
溶液N；所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍和第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.4～0.8mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.1～0.3mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.3～0.7mol/L；
溶液D；所述溶液D为二硫苏糖醇溶液；其中，二硫苏糖醇的浓度1～2mol/L。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述第一缓冲液为0.5～1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5；每升所述溶液S中包含6.25～18.75mL的第一缓冲液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述第二缓冲液为40～60mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5。
作为本发明实施例的另一种优选方案，每升所述溶液K包括以下组分：氯化钠溶液10～15mL、氯化钾溶液0.5～1.5mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为0.1～3.5mol/L，氯化钾溶液的浓度为40～60mmol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述蛋白酶溶液包括蛋白酶K，蛋白酶K的浓度为10～30mg/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述清洗液为70％～90％的乙醇水溶液。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述洗脱液包括乙二胺四乙酸和第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.05～0.15mol/L。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述第三缓冲液为0.05～0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述纯化柱包括EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述的试剂盒进行提取精液基因组DNA的方法，其包括以下步骤：
将待提取精液样本与所述溶液N进行混合后，再与所述蛋白酶溶液和溶液D进行涡旋混匀，得到混合物；
将混合物置于56～65℃的温度下进行孵育后，再与溶液S进行混合，并进行离心处理，收集溶液，得到第一上清液；
将第一上清液置于68～72℃的温度下进行孵育后，再进行离心处理，收集溶液，得到第二上清液；
将第二上清液与无水乙醇进行混匀后，再进行离心处理，收集溶液，得到第三上清液；
将第三上清液转移到所述纯化柱中，并进行离心处理，弃液体；接着，往纯化柱中加入所述溶液K，并进行离心处理，弃液体；然后，往纯化柱中加入清洗液，并进行离心处理，弃液体，得到清洗后的纯化柱；
往清洗后的纯化柱中加入所述洗脱液，并进行离心处理，收集洗脱出的液体，得到待提取精液样本中的基因组DNA。
本发明实施例提供的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，可充分裂解精子的细胞核与染色质，DNA得率高，重复性好，其可用于从人类以及动物的精液样本中提取基因组DNA，适合PCR、定量PCR、数字PCR、一代DNA测序、二代DNA测序、三代DNA测序、基因芯片分析、核酸质谱等各类分子生物学检验。其中，本发明实施例通过采用独特的细胞裂解溶液系统和特异性结合核酸的离心吸附柱，精液样品经过细胞裂解后，DNA分子在高盐条件下与硅胶膜结合，离心去除杂质；然后在低盐高pH条件下，用洗脱液把DNA分子从硅胶膜上洗脱下来，从而可以得到纯化的精子基因组DNA，以适于辅助生殖技术、男性不育分子生物学研究等领域的应用。
相比于现有技术，本发明实施例提供的试剂盒和方法的优势如下：
1、可快速、充分地裂解精子细胞核，裂解力强，适合染色体缠绕紧密、DNA提取困难的精液样本。
2、无需使用苯酚、氯仿等腐蚀性试剂，安全性好。
3、特异性结合核酸的纯化柱吸附、分离DNA分子，操作便捷。
4、成本低。
附图说明
图1为5个正常人精液样本分别用本发明实施例5提供的方法提取得到的基因组DNA的2％琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、纯化柱、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D。
其中，溶液S包括十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和第一缓冲液，余量为无核酸酶的水；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为25mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为12.5mmol/L；第一缓冲液为1mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8；每升溶液S中包含12.5mL的第一缓冲液。具体的，溶液S的制备方法如下：
S1、0.5M EDTA的配制：称取18.6g EDTA·2Na·2H2O加入洁净烧杯中，加入80mL去离子水，充分溶解后用NaOH调pH至8.0，加水定容至100mL。
S2、1M Tris-HCl配制：称取12.1g Tris加入洁净烧杯中，加入80mL去离子水，充分溶解后冷却至室温，用浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL。
S3、20％SDS配制：称取20g SDS加入洁净烧杯中，加入90mL去离子水，磁力搅拌充分溶解后冷却至室温，用浓盐酸调pH至7.2，定容至100mL。
S4、溶液S配制：将0.5M EDTA 2mL，1M Tris-HCl 1mL，20％SD S 10mL混合后，再用去离子水定容至80mL。
每升溶液K包括以下组分：氯化钠溶液12mL、氯化钾溶液1mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为0.1mol/L，氯化钾溶液的浓度为50mmol/L。具体的，溶液K的制备方法如下：
S1、0.1M NaCl配制：称取0.6g NaCl加入洁净烧杯中，加入90mL去离子水，充分溶解后定容至100mL。
S2、50mM KCl配制：称取3.7g KCl加入洁净烧杯中，加入90mL去离子水，充分溶解后定容至100mL。
S3、溶液K配制：将3.5M NaCl 12mL，50mM KCl 1mL，用100％EtOH定容至30mL，混匀后使用；后续使用无需再加入无水乙醇。
所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍，余量为第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.6mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.2mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.4mol/L；第二缓冲液为50mmol/L的Tri s-HCl缓冲液，其pH值为8。具体的，溶液N的制备方法如下：
S1、0.5％脱氧胆酸钠配制：称取0.5g脱氧胆酸钠加入洁净烧杯中，加入90mL去离子水，磁力搅拌充分溶解后冷却至室温，定容至100mL。
S2、1％NP-40配制：取10mL 10％NP-40溶液，加入90mL去离子水，磁力搅拌充分溶解后冷却至室温。
S3、50mM Tris-HCl配制：取1M Tris-HCl 5mL，加入95mL去离子水，磁力搅拌充分溶解后冷却至室温，用浓盐酸调pH至8.0。
S4、4M硫氰酸胍的配制：称取47g硫氰酸胍加入洁净烧杯中，加入80mL去离子水，磁力搅拌充分溶解后冷却至室温，定容至100mL。
S5、溶液N配制：将1％NP-40 3mL，0.5％脱氧胆酸钠2mL，4M硫氰酸胍5mL，用50mMTris-HCl定容至50mL。
洗脱液包括乙二胺四乙酸，余量为第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.1mol/L，第三缓冲液为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8。具体的，洗脱液的制备方法如下：
称取3.72g EDTA·2Na·2H2O、1.2g Tris加入洁净烧杯中，加入80mL去离子水，充分溶解后冷却至室温，用浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL。
溶液D为1.5mol/L的二硫苏糖醇溶液，其溶剂为无核酸酶的水；蛋白酶溶液为20mg/mL的蛋白酶K溶液，其溶剂为无核酸酶的水；清洗液为80％的乙醇水溶液，其溶剂为无核酸酶的水；纯化柱为市售的EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
实施例2
该实施例提供了一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、纯化柱、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D。
其中，溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液，余量为无核酸酶的水；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为12.5mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为12.5mmol/L；第一缓冲液为0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8；每升溶液S中包含6.25mL的第一缓冲液。
每升溶液K包括以下组分：氯化钠溶液10mL、氯化钾溶液0.5mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为0.1mol/L，氯化钾溶液的浓度为40mmol/L。
所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍，余量为第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.4mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.1mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.3mol/L；第二缓冲液为40mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8。
洗脱液包括乙二胺四乙酸，余量为第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.05mol/L，第三缓冲液为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8。
溶液D为1mol/L的二硫苏糖醇溶液；蛋白酶溶液为10mg/mL的蛋白酶K溶液；清洗液为70％的乙醇水溶液；纯化柱为市售的EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
需要说明的是，蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D的制备方法均可参考上述实施例1，在此就不作赘述。
实施例3
该实施例提供了一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、纯化柱、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D。
其中，溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液，余量为无核酸酶的水；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为25mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为25mmol/L；第一缓冲液为1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.5；每升溶液S中包含18.75mL的第一缓冲液。
每升溶液K包括以下组分：氯化钠溶液15mL、氯化钾溶液1.5mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为3.5mol/L，氯化钾溶液的浓度为60mmol/L。
所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍，余量为第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.8mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.3mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.7mol/L；第二缓冲液为60mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.5。
洗脱液包括乙二胺四乙酸，余量为第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.15mol/L，第三缓冲液为0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.5。
溶液D为2mol/L的二硫苏糖醇溶液；蛋白酶溶液为30mg/mL的蛋白酶K溶液；清洗液为90％的乙醇水溶液；纯化柱为市售的EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
需要说明的是，蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D的制备方法均可参考上述实施例1，在此就不作赘述。
实施例4
该实施例提供了一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、纯化柱、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D。
其中，溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液，余量为无核酸酶的水；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为18.75mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为18.75mmol/L；第一缓冲液为1mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.2；每升溶液S中包含12.5mL的第一缓冲液。
每升溶液K包括以下组分：氯化钠溶液12.5mL、氯化钾溶液1mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为1.8mol/L，氯化钾溶液的浓度为50mmol/L。
所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍，余量为第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.6mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.5mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.5mol/L；第二缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.2。
洗脱液包括乙二胺四乙酸，余量为第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.1mol/L，第三缓冲液为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8.2。
溶液D为1.5mol/L的二硫苏糖醇溶液；蛋白酶溶液为20mg/mL的蛋白酶K溶液；清洗液为80％的乙醇水溶液；纯化柱为市售的EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
需要说明的是，蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液、溶液S、溶液K、溶液N和溶液D的制备方法均可参考上述实施例1，在此就不作赘述。
实施例5
该实施例提供了一种采用上述实施例1提供的试剂盒进行提取精液基因组DNA的方法，其具体包括以下步骤：
S1、将低温保存的精液样品在室温静置至完全解冻后，涡旋混匀，瞬时离心，得到待提取精液样本，备用。
S2、取100μL待提取精液样本到1.5mL离心管中，加入300μL溶液N，必要时用去离子水补足总体积到400μL；接着，往离心管中加入蛋白酶溶液20μL和溶液D 20μL，涡旋混匀，得到混合物。
S3、将上述混合物置于56℃的温度下进行孵育1h后，并每隔5min拿出轻轻摇晃，再与300μL溶液S进行充分颠倒混匀，并进行短暂离心处理，收集溶液，得到第一上清液。
S4、将上述第一上清液置于70℃的温度下进行孵育10min，每隔3min拿出轻轻摇晃，孵育结束后，再进行短暂离心处理，收集溶液，得到第二上清液。
S5、将上述第二上清液与175μL无水乙醇进行轻轻颠倒混匀后，再置于室温放置5min，接着，进行短暂离心处理，收集溶液，得到第三上清液。
S6、把纯化柱安装到收集管上，将上述第三上清液分两次转移到纯化柱中，并置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；接着，将纯化柱安装到一个新的收集管上，并往纯化柱中加入500μL溶液K，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体。
S7、将上述纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往纯化柱中加入600μL清洗液，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；然后，重复该步骤，并将纯化柱放到一个新的1.5mL离心管中，置于室温开盖放置5min，以彻底风干吸附膜上残余的溶液，得到清洗后的纯化柱。
S8、将上述清洗后的纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往清洗后的纯化柱的吸附膜上加入30μL洗脱液，避免沾到管壁，然后置于12000rpm条件下进行离心处理2min，收集洗脱出的液体，并重复该步骤，即可得到待提取精液样本中的基因组DNA。
需要说明的是，在使用前，若溶液S和溶液N中出现沉淀，需将其于37℃加热溶解，冷却至室温后方可使用。另外，上述的所有离心步骤均可在室温(15℃～25℃)下进行。
实施例6
该实施例提供了一种采用上述实施例1提供的试剂盒进行提取精液基因组DNA的方法，其具体包括以下步骤：
S1、将低温保存的精液样品在室温静置至完全解冻后，涡旋混匀，瞬时离心，得到待提取精液样本，备用。
S2、取10μL待提取精液样本到1.5mL离心管中，加入300μL溶液N，必要时用去离子水补足总体积到400μL；接着，往离心管中加入蛋白酶溶液20μL和溶液D 10μL，涡旋混匀，得到混合物。
S3、将上述混合物置于56℃的温度下进行孵育1h后，并每隔5min拿出轻轻摇晃，再与300μL溶液S进行充分颠倒混匀，并进行短暂离心处理，收集溶液，得到第一上清液。
S4、将上述第一上清液置于68℃的温度下进行孵育10min，每隔3min拿出轻轻摇晃，孵育结束后，再进行短暂离心处理，收集溶液，得到第二上清液。
S5、将上述第二上清液与175μL无水乙醇进行轻轻颠倒混匀后，再置于室温放置5min，接着，进行短暂离心处理，收集溶液，得到第三上清液。
S6、把纯化柱安装到收集管上，将上述第三上清液分两次转移到纯化柱中，并置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；接着，将纯化柱安装到一个新的收集管上，并往纯化柱中加入500μL溶液K，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体。
S7、将上述纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往纯化柱中加入600μL清洗液，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；然后，重复该步骤，并将纯化柱放到一个新的1.5mL离心管中，置于室温开盖放置5min，以彻底风干吸附膜上残余的溶液，得到清洗后的纯化柱。
S8、将上述清洗后的纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往清洗后的纯化柱的吸附膜上加入30μL洗脱液，避免沾到管壁，然后置于12000rpm条件下进行离心处理2min，收集洗脱出的液体，并重复该步骤，即可得到待提取精液样本中的基因组DNA。
需要说明的是，在使用前，若溶液S和溶液N中出现沉淀，需将其于37℃加热溶解，冷却至室温后方可使用。另外，上述的所有离心步骤均可在室温(15℃～25℃)下进行。
实施例7
该实施例提供了一种采用上述实施例4提供的试剂盒进行提取精液基因组DNA的方法，其具体包括以下步骤：
S1、将低温保存的精液样品在室温静置至完全解冻后，涡旋混匀，瞬时离心，得到待提取精液样本，备用。
S2、取100μL待提取精液样本到1.5mL离心管中，加入300μL溶液N，必要时用去离子水补足总体积到400μL；接着，往离心管中加入蛋白酶溶液40μL和溶液D 20μL，涡旋混匀，得到混合物。
S3、将上述混合物置于65℃的温度下进行孵育2h后，并每隔15min拿出轻轻摇晃，再与300μL溶液S进行充分颠倒混匀，并进行短暂离心处理，收集溶液，得到第一上清液。
S4、将上述第一上清液置于72℃的温度下进行孵育30min，每隔3min拿出轻轻摇晃，孵育结束后，再进行短暂离心处理，收集溶液，得到第二上清液。
S5、将上述第二上清液与350μL无水乙醇进行轻轻颠倒混匀后，再置于室温放置5min，接着，进行短暂离心处理，收集溶液，得到第三上清液。
S6、把纯化柱安装到收集管上，将上述第三上清液分两次转移到纯化柱中，并置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；接着，将纯化柱安装到一个新的收集管上，并往纯化柱中加入500μL溶液K，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体。
S7、将上述纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往纯化柱中加入600μL清洗液，接着置于12000rpm条件下进行离心处理30s，弃去收集管连同收集到的液体；然后，重复该步骤，并将纯化柱放到一个新的1.5mL离心管中，置于室温开盖放置5min，以彻底风干吸附膜上残余的溶液，得到清洗后的纯化柱。
S8、将上述清洗后的纯化柱安装到另一个新的收集管上，并往清洗后的纯化柱的吸附膜上加入30μL洗脱液，避免沾到管壁，然后置于12000rpm条件下进行离心处理2min，收集洗脱出的液体，并重复该步骤，即可得到待提取精液样本中的基因组DNA。
需要说明的是，在使用前，若溶液S和溶液N中出现沉淀，需将其于37℃加热溶解，冷却至室温后方可使用。另外，上述的所有离心步骤均可在室温(15℃～25℃)下进行。
实验例：
取5个正常人精液样本分别利用上述实施例5提供的方法进行基因组DNA的提取，并分别取1μL所得的基因组DNA(共5组)进行2％琼脂糖凝胶电泳测试，以检测DNA的完整性，其测试结果如附图1所示，说明本发明实施例提供的试剂盒和方法可以提取得到较完整的基因组DNA。另外，分别取1μL所得的基因组DNA(共5组)，用NanoDrop测定DNA的纯度指标OD260/280，其测定结果如表1所示；分别取1μL所得的基因组DNA(共5组)，用Qubit测定DNA的浓度，其测定结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002569281490000131
Figure BDA0002569281490000141
从表1可以看出，本发明实施例提供的试剂盒和方法可以从精液样本中提取得到较高收率和较高纯度的基因组DNA。
本发明实施例提供的试剂盒和方法的提取原理如下：
本发明实施例采用独特的细胞裂解溶液系统和特异性结合核酸的离心吸附柱，精液样品里面的细胞经过裂解后，释放出DNA分子；DNA分子在高盐条件下与硅胶膜结合，通过离心去除杂质；然后在低盐、高pH条件下，用洗脱液把DNA分子从硅胶膜上洗脱下来，从而得到高分子量的、高纯度的精子基因组DNA。
综上所述，本发明实施例提供的从人类精液样本中提取精子基因组DNA的技术方法可以解决现有从人类精液中提取精子基因组DNA的方法所提取的基因组DNA得率较低、质量不高的问题。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种提取精液基因组DNA的试剂盒，包括蛋白酶溶液、清洗液、洗脱液和纯化柱，其特征在于，还包括：
溶液S；所述溶液S包括十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸和第一缓冲液；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为12.5～25mg/mL，乙二胺四乙酸的浓度为12.5～25mmol/L；
溶液K；所述溶液K包括氯化钠溶液、氯化钾溶液和无水乙醇；
溶液N；所述溶液N包括乙基苯基聚乙二醇、脱氧胆酸钠、硫氰酸胍和第二缓冲液；其中，乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.4～0.8mg/mL，脱氧胆酸钠的浓度为0.1～0.3mg/mL，硫氰酸胍的浓度为0.3～0.7mol/L；
溶液D；所述溶液D为二硫苏糖醇溶液；其中，二硫苏糖醇的浓度1～2mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液为0.5～1.5mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5；每升所述溶液S中包含6.25～18.75mL的第一缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述第二缓冲液为40～60mmol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5。
4.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，每升所述溶液K包括以下组分：氯化钠溶液10～15mL、氯化钾溶液0.5～1.5mL，余量为无水乙醇；其中，氯化钠溶液的浓度为0.1～3.5mol/L，氯化钾溶液的浓度为40～60mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶溶液包括蛋白酶K，蛋白酶K的浓度为10～30mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述清洗液为70％～90％的乙醇水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括乙二胺四乙酸和第三缓冲液；其中，乙二胺四乙酸的浓度为0.05～0.15mol/L。
8.根据权利要求7所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述第三缓冲液为0.05～0.15mol/L的Tris-HCl缓冲液，其pH值为8～8.5。
9.根据权利要求1所述的一种提取精液基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述纯化柱包括EZ-10核酸纯化吸附柱套件。
10.一种采用如权利要求1～9中任一项所述的试剂盒进行提取精液基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待提取精液样本与所述溶液N进行混合后，再与所述蛋白酶溶液和溶液D进行涡旋混匀，得到混合物；
将混合物置于56～65℃的温度下进行孵育后，再与溶液S进行混合，并进行离心处理，收集溶液，得到第一上清液；
将第一上清液置于68～72℃的温度下进行孵育后，再进行离心处理，收集溶液，得到第二上清液；
将第二上清液与无水乙醇进行混匀后，再进行离心处理，收集溶液，得到第三上清液；
将第三上清液转移到所述纯化柱中，并进行离心处理，弃液体；接着，往纯化柱中加入所述溶液K，并进行离心处理，弃液体；然后，往纯化柱中加入清洗液，并进行离心处理，弃液体，得到清洗后的纯化柱；
往清洗后的纯化柱中加入所述洗脱液，并进行离心处理，收集洗脱出的液体，得到待提取精液样本中的基因组DNA。
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